CN102507824A - 聚乙二醇修饰蛋白质的修饰位点分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药领域，涉及聚乙二醇修饰蛋白质修饰位点的分析方法，至少包括蛋白质组学工具酶酶解、高效液相色谱分离使序列上只包括含量上占绝对优势的实际修饰位点残基且不包括可能但非实际修饰位点残基且连接聚乙二醇部分的酶解片段与各序列上只包括一个含量上次要的实际修饰位点残基且不包括可能但非实际修饰位点残基且连接聚乙二醇部分的酶解片段彼此分离、峰面积归一法确定占绝对优势修饰位点比例、N端序列测定确定占绝对优势修饰位点位置等步骤。采用这一分析方法，可更加方便、快捷、准确、低成本的确定聚乙二醇修饰蛋白质中占修饰位点的分布与比例。
Description
技术领域
本发明一般的涉及聚乙二醇修饰蛋白质的结构分析方法，特别的涉及聚乙二醇修饰蛋白质的聚乙二醇修饰位点分析方法，更加特别的涉及聚乙二醇修饰蛋白质中占优势的聚乙二醇修饰位点的分析方法。
背景技术
蛋白质是维持生命结构与功能的重要生物活性分子，更是一种重要的药理活性分子，可用于人类各种疾病的治疗。尽管蛋白质类药物与传统化学药物相比有许多特点与优点，但其半衰期短、稳定性差、免疫原性强等一系列缺点也限制了其在临床实践中的进一步推广应用。针对这些缺点，产生与发展了蛋白质的化学修饰技术，其中最成功的是蛋白质的聚乙二醇(Polyethylene Glycol，PEG)修饰技术，并已开发出了一系列的已上市药物与待上市药物，代表性的如瑞士罗氏(Roche)公司的商品名为“Pegasys”的聚乙二醇修饰干扰素α2a产品，美国先灵葆雅(ScheringPlough)公司(现已被默沙东公司并购)的商品名为“PegIntron”的聚乙二醇修饰干扰素α2b产品，美国安进(Amgen)公司的商品名为“Pegfilgrastim”的聚乙二醇修饰G-CSF产品等。
尽管聚乙二醇修饰的蛋白质药物产品较对应未修饰的蛋白质药物产品在临床上取得了更好的疗效，在商业上取得了更大的成功，有逐渐在临床实践中取代未修饰蛋白质药物产品的趋势，但聚乙二醇在修饰蛋白质过程中普遍存在的多位点性和位点异构性，会造成修饰产物组成的不均一性，而不同修饰程度与修饰位点的修饰产物又具有不同的理化性质、药理活性与安全性特征，因此会影响到该类药物的质量控制与安全有效性。
为了保证聚乙二醇修饰蛋白质药物的安全有效与质量可控性，更在可能的情况下为进一步研究聚乙二醇修饰蛋白质药物的构效关系，从而为从聚乙二醇修饰产物混合物中分离出结构单一、药理活性最高、毒性最低的修饰产物异构体作为临床使用的进一步技术更新的药物做准备，有必要对聚乙二醇修饰蛋白质的结构进行分析与确证，尤其是要对聚乙二醇修饰蛋白质的修饰位点分布与各修饰位点所占比例进行分析与控制。
现有技术对聚乙二醇修饰蛋白质修饰位点进行分析的方法主要是酶解质谱法和酶解液质联用法，具体原理如下。
酶解质谱法的原理是选择一种蛋白质组学常用的工具酶或几种工具酶的组合，如胰蛋白酶(Trypsin)、糜蛋白酶(Chymotrypsin)、Glu-C、Asp-N等，在各自适宜的酶解条件下对蛋白质先后或同时进行酶解，以使可能的不同修饰位点氨基酸残基分布于不同的理论酶解片段(如一般的氨基聚乙二醇修饰剂可能的修饰位点是蛋白质中所有的赖氨酸残基；N端氨基聚乙二醇修饰剂理论上只修饰蛋白质N端的氨基酸残基，但由于特异性不高，也有可能修饰蛋白质非N端的赖氨酸残基；巯基聚乙二醇修饰剂可能的修饰位点是蛋白质中所有的半胱氨酸残基)。在终止酶解反应并进行适宜质谱仪检测的适当处理后加酶解样到质谱仪，如Q-TOF质谱仪或MALDI-TOF质谱仪进行酶解片段的质谱分子量检测。将检测结果与对应的未修饰蛋白质药物的理论酶解片段序列及其分子量分布结果对比(利用各种蛋白质组学分析软件，或者上蛋白质组学分析网站，如 www.expasy.org均可分析获得理论酶解片段序列及其分子量分布结果)，查找检测结果中缺失的片段，此缺失片段序列中具有的可能的修饰位点氨基酸残基就是聚乙二醇实际修饰蛋白质药物的修饰位点。此方法的缺点是对质谱检测的精度要求高，如果质谱检测结果中有漏检酶解片段或酶解片段检测分子量不准确，均会严重影响结果的判定或使结果无法判定；另外由于连接聚乙二醇部分的酶解片段在质谱检测结果中缺失，所以此法也无法确定不同修饰位点产物在全部修饰位点产物中所占的比例。
酶解液质联用法的原理也是先用一种或多种适宜的蛋白质组学工具酶，选择各自适宜的酶解条件先后或同时对蛋白质进行酶解。在终止酶解反应并进行适宜液质联用检测的适当处理后加酶解样到液质联用仪，在选择适宜的液相色谱分离条件使各酶解片段彼此分离后用与液相色谱相连接的质谱检测器检测各酶解片段的分子量。由于连接聚乙二醇部分的酶解片段分子量超出质谱检测器的检测范围检测不到，所以同样可以将检测结果与对应的未修饰蛋白质的理论酶解片段序列及其分子量分布结果对比，查找未检测到对应分子量的缺失片段，从而确定实际存在的修饰位点。然后对照液相色谱峰面积检测结果，对所有代表只含同一个实际修饰位点残基且不包括可能但非实际修饰位点残基且连接聚乙二醇部分的酶解片段的色谱峰进行峰面积归一化法处理，以确定各同一个实际修饰位点的修饰产物在全部修饰产物中所占的比例，也即确定各修饰位点的比例。此方法虽然客服了上述酶解质谱法只能定性不能定量的缺点，但依然存在质谱检测器漏检酶解片段或酶解片段检测分子量不准确影响定性结果分析的缺点，还存在高效液相 色谱分离较难能使各含同一个实际修饰位点且连接聚乙二醇部分的酶解片段完全分离的缺点。
基于对上述方法的改进，中国专利CN200380103341.1公开了一种聚乙二醇修饰干扰素α2a(氨基聚乙二醇修饰剂修饰产物)异构体的分离方法，也即聚乙二醇修饰干扰素α2a修饰位点的分析方法。该方法首先在弱阳离子交换的制备型液相色谱上初步分离聚乙二醇修饰干扰素α2a位置异构体(即修饰位点异构体)，然后在强阳离子交换的制备型高效液相色谱上进一步分离位置异构体。对分离开的各异构体分别用只在赖氨酸C端特异性酶解，而不在精氨酸C端酶解的Trypsin进行酶解，酶解产物进行MALDI-TOF质谱检测。由于连接聚乙二醇部分的赖氨酸残基位点在酶解过程中不能被酶解，所以造成包括该赖氨酸残基位点在内的理论酶解片段与氨基酸序列上与此理论酶解片段紧连的理论酶解片段，连同聚乙二醇部分连接在一起不能被酶解开形成一个大的实际酶解片段，从而造成整个大的实际酶解片段分子量过大超出MALDI-TOF质谱检测限而检测不到。这样，只要与理论酶解片段序列及分子量分布对比，在MALDI-TOF检测结果中查找蛋白质一级序列上连接在一起的两个缺失的理论酶解片段，便可确定其中一个片段C端的赖氨酸，也即另一个片段N端氨基酸前的一个赖氨酸便是实际修饰位点。在确定每一个高效液相色谱上分离的异构体峰的修饰位点后，便可根据高效液相色谱的峰面积检测结果，利用峰面积归一化法确定各修饰位点在全部修饰产物中所占的比例。这一方法虽然对前述方法作出了较大改进，得到的结果更可靠，但操作较为繁琐(如果有多种高效液相色谱分离异构体，则每一种异构体都需进行酶解质谱分析，工作量较大)，成本较高(赖氨酸C端特异性酶解Trypsin价格贵，且由于步骤多，分析对聚乙二醇修饰的干扰素α2a需要量也大)，依旧对高效液相色谱分离与质谱检测有较高要求，且只能解决氨基修饰蛋白质的修饰位点分析问题，并不能解决巯基修饰蛋白质的修饰位点分析问题，因此实际应用具有很大的局限性。
发明内容
本发明的目的是提供一种聚乙二醇修饰蛋白质的修饰位点分析方法，以克服现有采用质谱或液质联用检测的技术中存在的因质谱理论酶解片段检测不全、高效液相色谱分离酶解片段不完全而影响结果判定，以及在大多数情况下不能对各修饰位点产物在全部修饰产物中所占比例进行定量的缺点，同时尽可能克服检测过程步骤多、时间长、成本高的缺点。
为克服这些缺点，本发明提供至少包括如下步骤的技术方案：
1)酶解：至少一次酶解，以在完全酶解与不存在非特异性酶解的条件下使各可能的修饰位点分布于不同的理论酶解片段中；
2)高效液相色谱分离：在每次酶解后至少一次高效液相色谱分离，以最终使实际连接聚乙二醇部分的酶解片段比较实际未连接聚乙二醇部分的酶解片段分布于不同的色谱峰中，且最终至少使序列上只包括含量上占优势的实际修饰位点残基且不包括可能但非实际修饰位点残基且连接聚乙二醇部分的酶解片段(以下简称A片段)比较各序列上只包括同一个含量上次要的实际修饰位点残基且不包括可能但非实际修饰位点残基且连接聚乙二醇部分的酶解片段(以下简称B片段)，分布于不同的色谱峰中；
3)确定修饰位点比例：对A片段与B片段在2)的色谱分离中最终对应的色谱分离峰进行峰面积加和处理，不同次色谱分离得到的色谱峰的峰面积需按同一次色谱分离的峰面积进行折算后再加和，并确定其中峰面积最大的色谱分离峰占峰面积加和的比例，以确定占优势的实际修饰位点在全部修饰位点中所占比例；
4)确定修饰位点位置：收取A片段所最终对应的色谱分离峰的样品进行N端序列测定，与理论酶解序列进行比对确定占优势的修饰位点在蛋白质序列中的位置。
在上述技术方案的酶解中，优选通过一次酶解使可能的修饰位点分布于不同的理论酶解片段中。酶解过程可选择的蛋白质组学工具酶不限于但优选Trypsin、Chymotrypsin、Glu-C、Asp-N中的一种或几种的组合。但由于Chymotrypsin酶解位点过多，酶解过程容易不完全和非特异，Asp-N的价格高，所以更优选的工具酶是Trypsin、Glu-C中的一种或两种的组合。又由于Glu-C的酶解受缓冲液种类、pH与时间的影响较大，所以最优选的工具酶是Trypsin。在酶解过程中优选用变性剂尿素对蛋白质进行处理，更加优选在酶解前用变性剂对蛋白质进行处理，以使酶解过程更加完全。酶解的缓冲液、pH、温度、时间、酶与底物的比例可以参考工具酶制造商的产品使用说明，但对于Trypsin优选2-20mmol/L的碳酸氢铵酶解缓冲液(pH8.0)，37℃的酶解温度，18-24小时的酶解时间，质量比1∶10-1∶40的酶与底物的比例。
在上述技术方案的高效液相色谱分离中，至少要求通过一步或多步高效液相 色谱分离最终使A片段与各B片段之间彼此分离，但不同实际修饰位点的B片段之间分离与否没有关系。高效液相色谱优选反相高效液相色谱与分子排阻高效液相色谱，在A片段与各B片段分子量差异较大的情况下更加优选分子排阻色谱，因为分子排阻高效液相色谱分离的影响因素较少，分离条件的研究获得更容易，色谱图更加直观，便于结果的分析判断。但由于酶解混合物中的含聚乙二醇部分的酶解片段分子量较大，所以应选择大孔径的高效液相色谱填料进行分离，其中分子排阻高效液相色谱可以选择的填料包括但不限于TSK-GEL G2000SW、TSK-GEL G2000SWXL、TSK-GEL Super G2000、TSK-GEL G3000SW、TSK-GELG3000SWXL、TSK-GEL Super G3000、Protein-Pak 125、Protein-Pak 200SW、Protein-Pak 300SW。
在上述技术方案的高效液相色谱分离获得的图谱中，实际连接聚乙二醇部分的各酶解片段的出峰位置的判断，可以采用如下三种方法之一：
1)保留时间比对法
在每次分子排阻高效液相色谱分离后，在同样的色谱分离系统与色谱分离条件下分别在高效液相色谱柱上上未修饰的蛋白质纯品与分子量均一的聚乙二醇修饰蛋白质纯品，确定两者的保留时间，则该聚乙二醇修饰蛋白质酶解后连接聚乙二醇部分的酶解片段在同样的色谱分离系统与色谱分离条件下的保留时间应该在此两者之间。
2)电泳染色法
无论是在每次分子排阻高效液相色谱分离后，还是在每次反相高效液相色谱分离后，还是在每次其他类型的高效液相色谱分离后，对收集的各色谱峰分别进行SDS-PAGE电泳检测，电泳后先后进行考马斯亮蓝R250染色与碘染色。其中考马斯亮蓝R250对蛋白质或多肽进行染色的方法是本领域技术人员公知的方法，而碘染色的方法也可以参考相关文献的报道，或采用如下的方法：
将电泳后的凝胶取下，浸入电泳脱色液中浸泡30分钟，然后取出放入5％(w/v)氯化钡溶液中浸泡约10分钟，再放入碘染色液中(固体碘与30％酒精水溶液配制成的饱和溶液)染色3-5分钟。最后需将染色后的凝胶放入脱色液中再浸泡1-2分钟漂洗去凝胶上的浮色后才能进行照相与扫描分析。
同一条带只有在两种染色时均能显色的才代表连接聚乙二醇部分的酶解片段，否则若只在考马斯亮蓝R250染色时显色而不在碘染色时显色的代表不连接聚乙二醇部分的酶解片段。若某一泳道有在两种染色时均显色的条带，则此泳道 所代表的色谱峰中含有连接聚乙二醇部分的酶解片段。
3)质谱法
无论是在每次分子排阻高效液相色谱分离后，还是在每次反相高效液相色谱分离后，还是在每次其他类型的高效液相色谱分离后，对收集的各色谱峰分别脱盐脱有机溶剂后进行质谱分子量检测，测得分子量大于聚乙二醇修饰剂分子量的峰为连接聚乙二醇部分的酶解片段峰。
在上述技术方案的峰面积加和处理中，如果A片段与B片段间在一次色谱分离中得到完全分离，则只要将只分别含有它们的色谱峰的峰面积简单加和便可以。但若不能完全分离，则需对经过多次酶解与色谱分离后才得到的只含有A片段或B片段(不同实际修饰位点的B片段间分离与否没有关系)的色谱峰的峰面积进行折算处理，所有的加和峰面积应折算为同一次色谱分离中的峰面积。下面对折算处理方法举例进行说明，本领域技术人员在理解如下例子后无需创造性劳动便可对其他相似或更复杂的情况进行折算处理。应当指出的是，不含实际修饰位点的酶解片段的峰面积在折算时不用考虑。
例1：
1)酶解高效液相色谱分离情况
各次酶解高效液相色谱分离后所得的色谱峰的情况如下表1所示，表中代号表示的含义为：
x1：第几次酶解及其后对应的高效液相色谱分离；
x2：本次酶解高效液相色谱分离的第a次酶解高效液相色谱分离所得的色谱峰b，表示为a，b；
y1：该峰含有的酶解片段中含有的实际修饰位点；
y2：该峰含有的酶解片段中含有的可能但非实际修饰位点；
z1：该峰对应的各酶解片段是否各连接有一个聚乙二醇分子(一个酶解片段不可能连接有两个以上聚乙二醇分子；各酶解片段要么都连接有一个聚乙二醇分子，要么都不连接聚乙二醇分子)；
z2：该峰中是否只含有一个酶解片段。
表1各次酶解高效液相色谱分离后所得的色谱峰的情况
2)修饰位点比例计算结果：按第一次酶解色谱分离所得的色谱峰的峰面积进行折算
a修饰位点所占的比例为：A11/(A11+A12)
b修饰位点所占的比例为：A12/(A11+A12)
其中Aab表示第a次酶解色谱分离后所得的峰b的峰面积。
例2：
1)酶解高效液相色谱分离情况
各次酶解高效液相色谱分离后所得的色谱峰的情况如下表2所示，表中代号含义如例1。
表2各次酶解高效液相色谱分离后所得的色谱峰的情况
2)修饰位点比例计算结果：按第一次酶解色谱分离所得的色谱峰的峰面积进行折算
a修饰位点所占的比例为：A11/(A11+A12)
b修饰位点所占的比例为：A12×A21/(A21+A22)/(A11+A12)
c修饰位点所占的比例为：A12×A22/(A21+A22)/(A11+A12)
其中Aab表示第a次酶解色谱分离后所得的峰b的峰面积。
当A11/(A11+A12)＞0.5时，可以直接确定a为占绝对优势的实际修饰位点，并可以不考虑其他实际修饰位点的比例而确定占绝对优势的实际修饰位点a在全部实际修饰位点中所占的比例为A11/(A11+A12)。
例3：
1)酶解高效液相色谱分离情况
各次酶解高效液相色谱分离后所得的色谱峰的情况如下表3所示，表中代号含义如例1。
表3各次酶解高效液相色谱分离后所得的色谱峰的情况
2)修饰位点比例计算结果：按第一次酶解色谱分离所得的色谱峰的峰面积进行折算
a修饰位点所占的比例为：A11/(A11+A12+A13)
b修饰位点所占的比例为：A12×A21/(A21+A22)/(A11+A12+A13)
c修饰位点所占的比例为：A12×A22/(A21+A22)/(A11+A12+A13)
e修饰位点所占的比例为：A13×A31/(A31+A32)/(A11+A12+A13)
f修饰位点所占的比例为：A13×A32/(A31+A32)/(A11+A12+A13)
其中Aab表示第a次酶解色谱分离后所得的峰b的峰面积。
当A11/(A11+A12+A13)＞0.5时，可以直接确定a为占绝对优势的实际修饰位点，并可以不考虑其他实际修饰位点的比例而确定占绝对优势的实际修饰位点a在全部实际修饰位点中所占的比例为A11/(A11+A12+A13)。
例4：
1)酶解高效液相色谱分离情况
各次酶解高效液相色谱分离后所得的色谱峰的情况如下表4所示，表中代号含义如例1。
表3各次酶解高效液相色谱分离后所得的色谱峰的情况
2)修饰位点比例计算结果：按第一次酶解色谱分离所得的色谱峰的峰面积进行折算
a修饰位点所占的比例为：A11×A21/(A21+A22)×A31/(A31+A32)/(A11+A12+A13)
b修饰位点所占的比例为：A11×A21/(A21+A22)×A32/(A31+A32)/(A11+A12+A13)
c修饰位点所占的比例为：A11×A22/(A21+A22)/(A11+A12+A13)
e修饰位点所占的比例为：A12×A41/(A41+A42)/(A11+A12+A13)
f修饰位点所占的比例为：A12×A42/(A41+A42)×A51/(A51+A52)/(A11+A12+A13)
g修饰位点所占的比例为：A12×A42/(A41+A42)×A52/(A51+A52)/(A11+A12+A13)
k修饰位点所占的比例为：A13×A71/(A71+A72)/(A11+A12+A13)
l修饰位点所占的比例为：A13×A72/(A71+A72)/(A11+A12+A13)
其中Aab表示第a次酶解色谱分离后所得的峰b的峰面积。
在上述技术方案的的N端序列测定中，优选测定N端3-8个氨基酸，更加优选测定N端4-6个氨基酸，因为测定的氨基酸个数少不利于酶解片段全序列的判定，而测定的氨基酸个数多则不但测定时间延长，而且后续测定氨基酸的准确性与可信度也得不到保证。
作为对上述技术方案改进的优选技术方案，对如下步骤进一步要求：
1)高效液相色谱分离：在每次酶解后至少一次高效液相色谱分离，以最终使各B片段分布于不同的色谱峰中；
2)确定修饰位点比例：对各B片段所在的色谱峰的峰面积进行加和处理，计算各B片段所在的色谱峰的峰面积占全部B片段所在的色谱 峰的峰面积加和的比例，以确定各实际修饰位点在全部修饰位点中所占比例；
3)确定修饰位点位置：收取各B片段所在的色谱分离峰的样品进行N端序列测定，与理论酶解序列进行比对确定各实际修饰位点在蛋白质序列中的位置。
在上述优选的技术方案中，在高效液相色谱分离时，不但要求通过一步或多步高效液相色谱分离最终使A片段与各B片段之间彼此分离，而且要求B片段之间彼此分离。因此，对高效液相色谱分离的要求更高。
在上述优选技术方案的峰面积加和处理中，如果A片段与各B片段之间，以及各B片段彼此之间在一次色谱分离中得到完全分离，则只要将它们所在色谱峰的峰面积简单加和便可以。但若不能完全分离，则需对经过多次酶解与分离后才得到的A片段或各B片段的峰面积进行折算处理，具体方法如前举例所述。
采用上述基础技术方案和优选技术方案，由于A片段及各B片段与不包括实际修饰位点残基且连接聚乙二醇部分的酶解片段相比在分子量和疏水性上有较大差异，在数量上明显更少，所以选择适宜的高效液相色谱分离条件一定能使A片段与各B片段之间彼此分离；而通过进一步增加高效液相分离步数或优化高效液相分离条件，还可进一步使各B片段之间彼此分离，分布于不同的色谱峰中。又由于N端测序不同于质谱检测，只要去除有机溶剂、保证上样量，上样中的蛋白质或其片段的序列一定可以测定得到。因此，一旦A片段与B片段之间彼此分离，收集只含A片段的色谱峰并经适当的处理后再进行N端测序，就一定能确定占优势的修饰位点的位置与比例；而一旦B片段之间彼此进一步分离，收集只含各B片段的色谱峰并经适当处理后再进行N端测序，就可进一步确定其他修饰位点的位置与比例。故本发明可更加方便、快捷、准确、低成本的确定聚乙二醇修饰蛋白质中修饰位点的分布与比例。
本发明中使用的术语“蛋白质序列”或“片段序列”，如无特别指出是指蛋白质或其酶解片段的一级结构或一级序列，也即组成蛋白质或其酶解片段的各氨基酸的排列顺序。
本发明中使用的术语“聚乙二醇修饰剂”，也即“PEG修饰剂”，是指单甲氧基聚乙二醇修饰剂，也即用甲氧基封闭聚乙二醇分子一端的一个羟基，而用适宜的活化方法活化另一端的一个羟基后所得的活化聚乙二醇分子。由于羟基自身的反应活性很低，所以经过活化后的聚乙二醇分子的反应活性有了很大的提高， 才可被称为“聚乙二醇修饰剂”。关于活化基团的选择、活化的机理以及活化所得的聚乙二醇修饰剂的修饰反应机理在现有技术中有很多报道，如美国Nektar公司(原Shearwater公司)申请并获得授权了多篇有关聚乙二醇修饰剂的专利。
本发明中使用的术语“聚乙二醇修饰蛋白质”(pegylated protein，PEG modified protein)，也称为“聚乙二醇偶联蛋白质”(PEG coupled protein，PEG conjugated protein)、“聚乙二醇化蛋白质”、“聚乙二醇长效蛋白质”，是指将聚乙二醇修饰剂分子与蛋白质分子化学偶联到一起形成的产物。参与偶联反应的聚乙二醇修饰剂的基团是其在活化过程中引入的活化基团，蛋白质的基团主要是其中游离的氨基基团、巯基基团、羧基基团或羟基基团，优选的是氨基基团或巯基基团。
本发明中使用的术语“聚乙二醇单修饰体”或“聚乙二醇单修饰蛋白质”是指一个蛋白质分子只连接一个聚乙二醇分子形成的聚乙二醇修饰蛋白质产物；对应的“聚乙二醇多修饰体”或“聚乙二醇多修饰蛋白质”是指一个蛋白质分子连接多个聚乙二醇分子形成的聚乙二醇修饰蛋白质产物。本发明进行修饰位点分析针对的都是“聚乙二醇单修饰体”或“聚乙二醇单修饰蛋白质”。如果所分析聚乙二醇修饰蛋白质中有“聚乙二醇多修饰体”或“聚乙二醇多修饰蛋白质”，需事先分离除去，除去基于的原理主要是单修饰体与多修饰体在分子量上的差异或亲疏水性上的差异。
本发明中使用的术语“修饰位点”是指聚乙二醇修饰剂所连接的蛋白质序列中的氨基酸残基位点。
本发明中使用的术语“可能的修饰位点”是指蛋白质序列中所有可能但不一定实际被聚乙二醇修饰剂修饰或连接的氨基酸残基位点，这主要由修饰反应的类型与修饰剂的种类决定。具体来说，氨基聚乙二醇修饰剂(如mPEG-SPA、mPEG-NHS、mPEG-ALD、mPEG-SS、mPEG-SC)修饰蛋白质时可能的修饰位点是蛋白质序列中所有的赖氨酸(Lys)残基，而巯基聚乙二醇修饰剂(如mPEG-MAL、mPEG-VS、mPEG-IA、mPEG-OPSS)修饰蛋白质时可能的修饰位点是蛋白质序列中所有的半胱氨酸(Cys)残基。
本发明中使用的术语“实际的修饰位点”是指蛋白质序列中实际被聚乙二醇修饰剂修饰或连接的氨基酸残基位点，它包括在可能的修饰位点范围内，也由修饰反应的类型与修饰剂的种类决定，但数量小于或等于可能的修饰位点数。
本发明中使用的术语“占优势的实际修饰位点”是指实际某一修饰单一修饰 位点的聚乙二醇修饰蛋白质分子在全部聚乙二醇修饰蛋白质分子中所占分子百分数为最大比例的修饰位点。
本发明中使用的术语“占绝对优势的实际修饰位点”是指实际单一修饰某一修饰位点的聚乙二醇修饰蛋白质分子在全部聚乙二醇修饰蛋白质分子中所占分子百分数超过50％的修饰位点。
本发明中使用的术语“次要实际修饰位点”是指实际单一修饰某一修饰位点的聚乙二醇修饰蛋白质分子在全部聚乙二醇修饰蛋白质分子中所占分子百分数不是最大比例的修饰位点。
本发明中使用的术语“不同的色谱峰”既包括在一次高效液相色谱分离中保留时间不同的色谱峰，也包括不同次高效液相色谱分离中的色谱峰。
本发明中使用的术语“最终对应的色谱分离峰”是指如果多次高效液相色谱分离中的不同的色谱峰均包含含同一实际修饰位点的酶解片段，此外还可能包含含其它实际修饰位点的酶解片段，则此时选择的最后一次色谱分离中对应只含有该同一实际修饰位点的酶解片段的色谱峰。
附图说明
图1是IIFNm纯品上TSK-GEL G3000SWXL(7.8mm×30cm)分子排阻高效液相色谱柱后获得的色谱图。
图2是PEG-IIFNm1纯品上TSK-GEL G3000SWXL(7.8mm×30cm)分子排阻高效液相色谱柱后获得的色谱图。
图3是Trypsin酶解PEG-IIFNm1产物经TSK-GEL G3000SWXL(7.8mm×30cm)分子排阻高效液相色谱柱分离后得到的色谱图，图中保留时间为7.142min的峰为连接聚乙二醇部分的酶解片段峰T1，保留时间为7.561min的峰为连接聚乙二醇部分的酶解片段峰T2。
图4是连接聚乙二醇部分的PEG-IIFNm185-121片段经Chymotrypsin酶解后再经TSK-GEL G3000SWXL(7.8mm×30cm)分子排阻高效液相色谱柱分离得到的色谱图，图中保留时间为7.597min的峰为连接聚乙二醇部分的酶解片段峰C1。
图5是Trypsin酶解PEG-IIFNm1产物经Waters Symmetry 300C18(4.6×150mm)反相高效液相色谱柱分离后得到的色谱图，图中保留时间为33.250min的峰为连接聚乙二醇部分的酶解片段峰T1，保留时间为42.433min的峰为连接聚乙二醇部分的酶解片段峰T2，保留时间为60.458min的峰为连接聚 乙二醇部分的酶解片段峰T3，保留时间为64.098min的峰为连接聚乙二醇部分的酶解片段峰T4。
图6是连接聚乙二醇部分的PEG-IIFNm185-121片段经Chymotrypsin酶解后再经Waters Symmetry 300C18(4.6×150mm)反相高效液相色谱柱分离得到的色谱图，图中保留时间为10.825min的峰为连接聚乙二醇部分的酶解片段峰C1。
图7是G-CSF纯品上Protein-Pak 200SW(8.0mm×30cm)分子排阻高效液相色谱柱后获得的色谱图。
图8是PEG-G-CSF纯品上Protein-Pak 200SW(8.0mm×30cm)分子排阻高效液相色谱柱后获得的色谱图。
图9是Trypsin酶解PEG-G-CSF产物经Protein-Pak 200SW(8.0mm×30cm)分子排阻高效液相色谱柱分离后得到的色谱图，图中保留时间为7.058min的峰为连接聚乙二醇部分的酶解片段峰T1，保留时间为7.560min的峰为连接聚乙二醇部分的酶解片段峰T2。
图10是Trypsin酶解PEG-VEGF产物经Waters Symmetry 300C18(4.6×150mm)反相高效液相色谱柱分离后得到的色谱图，图中保留时间为19.845min的峰为连接聚乙二醇部分的酶解片段峰T1，保留时间为29.373min的峰为连接聚乙二醇部分的酶解片段峰T2，保留时间为43.052min的峰为连接聚乙二醇部分的酶解片段峰T3，保留时间为58.278min的峰为连接聚乙二醇部分的酶解片段峰T4，保留时间为78.452min的峰为连接聚乙二醇部分的酶解片段峰T5。
具体实施方式
通过如下的实施例对本发明的实施作进一步说明，但本发明的实施方式并不局限于如下的实施例。
实施例1：复合干扰素86位点半胱氨酸突变体聚乙二醇单修饰产物修饰位点分析(方法一)
1、IIFNm及PEG-IIFNm1的获得
复合干扰素86位点半胱氨酸突变体(integrated interferon site 86 mutant，IIFNm)的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。先后用PCT/CN2007/003711中实施例1A、实施例2A、实施例3A公开的原料与方法获得IIFNm(也即PCT/CN2007/003711中公开的MIFNCys86)纯品，并进一步用实施例4、实施例5 公开的原料与方法获得分子量均一的复合干扰素86位点半胱氨酸突变体聚乙二醇单修饰产物(PEG-IIFNm1)纯品，为分子量20kDa的mPEG-MAL(修饰Cys的巯基聚乙二醇修饰剂)修饰IIFNm后分离纯化所得的产物(也即PCT/CN2007/003711中公开的mPEG(20KD)-MIFNCys86)。
2、第一次酶解
将上述得到的PEG-IIFNm1纯品用截留分子量为3000Da的Millipore超滤离心管进行浓缩和换溶液处理，使PEG-IIFNm1的浓度达到2mg/ml以上，所处的溶液环境转换为1％碳酸氢铵溶液(pH8.0)。用Lowry法测定超滤浓缩后的PEG-IIFNm1的浓度，并进一步用1％碳酸氢铵溶液(pH8.0)调整其浓度为2.00±0.05mg/ml。
取1mg上述浓缩并调整浓度的样品，先加入8mol/L尿素0.5ml与0.5mol/LDTT 0.1ml处理2小时，然后加入SIGMA公司商品化的蛋白质组学级的Trypsin25μg 37℃酶解反应18小时，最后加入100μl 50％醋酸溶液终止酶解反应。在还原条件下Trypsin酶解PEG-IIFNm1后理论连接PEG的含半胱氨酸片段的情况如下表1所示。
表1还原条件下Trypsin酶解PEG-IIFNm1后理论连接PEG的含半胱氨酸片段的情况
3、第一次酶解产物分离
酶解反应液上TSK-GEL G3000SWXL(7.8mm×30cm)高效液相色谱柱，10mmol/LPB，20mmol/LNaCl，pH7.0溶液洗脱，流速1.0ml/min，检测波长215nm，每次上样100μl。
在与酶解片段相同的高效液相色谱分离系统与分离条件下，分别上IIFNm与PEG-IIFNm1纯品，结果分别如图1和图2所示，确定保留时间分别为9.564min和7.032min，根据本发明发明内容部分所述的“保留时间比对法”确定连接聚乙 二醇部分的酶解片段的出峰位置，确定在7.032-9.564min之间的出峰为连接聚乙二醇部分的酶解片段峰。
上述酶解产物的高效液相色谱分离中在保留时间7.032-9.564min之间共有两峰，如图3所示，均为连接聚乙二醇部分的酶解片段峰，收集保留时间为7.142min，峰面积占两峰面积总和85％的出峰T1。
4、第二次酶解
将3-5次高效液相色谱分离收集的T1峰用截留分子量为3000Da的Millipore超滤离心管进行浓缩处理，并换溶液为25mmol/L Tris-HCl，pH7.8溶液。
取上述浓缩换溶液处理T1样一半，用Applied Biosystem公司PROCISE 491型N端序列测定仪进行N端序列测定。测序结果为FCTEL，说明T1峰对应的是连接聚乙二醇部分的85-121片段，但由于该片段中有两个Cys，所以不能确定到底是Cys86还是Cys99连接了聚乙二醇部分，或两者都连接了聚乙二醇部分。
另一半加入Roche公司商品化的测序级Chymotrypsin 5μg 25℃酶解反应18小时后加入30μl 50％醋酸溶液终止酶解反应。在还原条件下Chymotrypsin酶解PEG-IIFNm185-121片段后理论连接PEG的含半胱氨酸片段的情况如下表2所示。
表2还原条件下Chymotrypsin酶解PEG-IIFNm185-121片段后理论连接PEG的含半胱氨酸片段的情况
| 片段位置 | 片段序列 | 质荷比 | 说明 |
| 97-111 | EACVIQEVGVEETPL | 1615.79 | Cys99所在片段 |
| 86-89 | CTEL | 465.20 | Cys86所在片段 |
5、第二次酶解产物分离及收样的N端序列测定
第二次酶解反应液再次上TSK-GEL G3000SWXL(7.8mm×30cm)高效液相色谱柱，10mmol/LPB，20mmol/LNaCl，pH7.0溶液洗脱，流速1.0ml/min，检测波长215nm，每次上样100μl，在保留时间7.032min至9.564min之间只有一个保留时间为7.597min左右的出峰C1，如图4所示，为连接聚乙二醇部分的酶解片段峰，收集该峰。
对C1峰用Applied Biosystem公司PROCISE 491型N端序列测定仪进行N端序列测定。测序结果为CTE，说明在T1峰对应的连接聚乙二醇部分的酶解片 段中聚乙二醇只连接了Cys86，没有连接Cys99，也既在PEG-IIFNm1的全部实际修饰位点中不包括Cys99。
结合两次高效液相色谱分离的结果，确定Cys86是占绝对优势的修饰位点，单一修饰该位点的PEG-IIFNm1在全部修饰位点的PEG-IIFNm1中所占的比例为85％。
实施例2：PEG-IIFNm1修饰位点分析(方法二)
IIFNm及PEG-IIFNm1的获得、第一次酶解、第二次酶解及N端序列测定的步骤方法同实施例1，但两次酶解产物分离时均将酶解反应液上WatersSymmetry 300C18(4.6×150mm)反相色谱柱，流速1.0ml/min，检测波长215nm，每次上样100μl，梯度洗脱A液为0.1％TFA水溶液，B液为0.1％TFA的乙腈溶液，第一次酶解产物分离时90分钟内由70％B(30％A)升至90％B(10％A)线性梯度洗脱，第二次酶解产物分离时15分钟内由30％B(70％A)升至90％B(10％A)线性梯度洗脱。通过本发明发明内容部分所述的“电泳染色法”确定连接聚乙二醇部分的酶解片段的出峰位置。第一次酶解产物分离得到的色谱图如图5所示，第二次酶解产物分离得到的色谱图如图6所示。在每次反相高效液相色谱分离后用旋转蒸发器除去收样中的有机溶剂乙腈，然后再进行后续的超滤浓缩处理或N端测序处理，结果如下表3所示。
表3PEG-IIFNm1两次酶解后各一次反相高效液相色谱分离收集峰的测序结果及分析
通过上述方法同样可确定Cys86是占绝对优势的修饰位点，单一修饰该位点 的PEG-IIFNm1在全部修饰位点的PEG-IIFNm1中所占的比例为85％，而Cys99不是实际修饰位点，并可进一步确定Cys1在全部修饰位点中所占的比例为6％，Cys29在全部修饰位点中所占的比例为6％，Cys139在全部修饰位点中所占的比例为3％。
实施例3：粒细胞集落刺激因子聚乙二醇单修饰产物修饰位点分析
1、G-CSF及PEG-G-CSF的获得
1)G-CSF表达工程菌构建
粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor，G-CSF)的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，利用商品化的质粒pET-23b与商品化的大肠杆菌BL21(DE3)，用本领域技术人员公知的基因工程方法构建表达G-CSF的重组工程菌(例如，表达G-CSF的基因序列插入到质粒pET-23b的Nde I与EcoR I酶切位点之间)。
2)G-CSF表达工程菌的发酵
将按上述方法构建的G-CSF表达工程菌经涂平板活化后挑选单菌落接种于含氨苄青霉素的LB培养基中37℃、220转/分摇床摇瓶培养至OD600nm为0.6-0.8。然后以5％的体积接种量接种于装有50L LB培养基的80L发酵罐中进行发酵培养，培养温度为37℃，培养过程中用氨水调节pH在6.5-7.5之间，调节搅拌转速控制溶氧值在3-5％之间。在OD600nm达到1.0后按质量体积比1∶5000的比例加入IPTG 10g继续诱导培养4小时，诱导培养温度为35℃，并在此过程中向发酵罐中适当的补加LB培养基。诱导培养时间到后放罐室温5000转/分离心20分钟收集菌体，所得菌体用TE溶液(50mmol/L Tris-HCl，5mmol/L EDTA，pH8.0)洗涤离心两次以除去发酵液中的主要杂质。
3)G-CSF的纯化
取上述处理得到的菌体40g以1∶15的质量体积比加入600ml TE溶液置超声波破碎仪上进行超声破碎，条件为打5秒，歇5秒，共60分钟，所得破碎混悬液室温6000转/分离心20分钟弃上清，沉淀以1∶10的质量体积比加入TE溶液洗涤离心两次得分离包涵体。
所得10g包涵体以1∶10的质量体积比加入100ml 7mol/L盐酸胍后在适度搅拌条件下变性处理2小时，待包涵体完全溶解后室温8000转/分离心20分钟弃沉淀，上清以稀释复性法进行复性处理，复性液组成为：0.15mol/L硼酸-硼酸钠，3mmol/L氧化型谷胱甘肽，1mmol/L还原型谷胱甘肽，调节pH为9.5。复 性过程在2-8℃低温进行，首先用复性液将上清稀释4倍，放置8小时后再用复性液稀释5倍继续复性6小时，然后再用复性液稀释5倍，最后复性6小时以达到最终的复性效果。复性完成后4℃8000转/分离心复性液30分钟，取上清按1∶10的体积比对25mmol/L Tris-HCl，pH8.0溶液进行透析处理，透析时间为12-24小时，中间换透析液1-2次。
透析后的复性液经4℃8000转/分离心30分钟后上用25mmol/L Tris-HCl，pH8.0溶液平衡的DEAE Sepharose FF色谱柱，用含有0.3mol/L NaCl的25mmol/LTris-HCl，pH8.0溶液洗脱并收集含有目的蛋白的峰。整个过程中的线性流速应控制在50-200cm/h之间。
DEAE Sepharose FF洗脱收集含有目的蛋白的峰用50mmol/L醋酸-醋酸钠，pH4.5溶液以1∶10的体积比稀释后上用同样溶液平衡的CM Sepharose FF色谱柱，用含有0.1-0.15mol/L NaCl的25mmol/L醋酸-醋酸钠，pH4.5溶液洗脱除去主要杂质峰后用含有0.3-0.5mol/L NaCl的25mmol/L醋酸-醋酸钠，pH4.5溶液洗脱目的收集蛋白，收集到的G-CSF的SDS-PAGE纯度在95％以上。整个过程中的线性流速应控制在50-200cm/h之间。
CM Sepharose FF洗脱收集含有目的蛋白的峰用25mmol/L Tris-HCl，pH8.5溶液稀释10倍后再次上用25mmol/L Tris-HCl，pH8.5溶液平衡的填料装填较少(10ml以下)的DEAE Sepharose FF色谱柱，用含有0.5mol/L NaCl的25mmol/LTris-HCl，pH8.5溶液洗脱以使G-CSF得到PEG修饰前的浓缩与换缓冲液处理。
4)PEG修饰与修饰产物的分离
用北京键凯科技有限公司或北京凯正生物工程发展有限责任公司商品化的分子量为20kDa的聚乙二醇修饰剂mPEG-SPA(氨基聚乙二醇修饰剂)修饰上述方法获得的G-CSF纯品，具体修饰反应条件为：G-CSF浓度5mg/ml(可用25mmol/L Tris-HCl，pH8.5溶液调整上步得到的G-CSF的浓度至此浓度)，G-CSF与mPEG-SPA质量比1∶5，室温进行修饰反应2小时，静置不搅拌。
修饰反应液用20mmol/L醋酸-醋酸钠，pH4.5溶液稀释20倍后上SPSepharose FF离子交换层析，冲洗后先用含70mmol/L NaCl的20mmol/L醋酸-醋酸钠，pH4.5溶液洗脱杂质蛋白质，再用含0.2mol/L NaCl的20mmol/L醋酸-醋酸钠，pH4.5溶液洗脱目的收集蛋白，最后用含0.75mol/L NaCl的20mmol/L醋酸-醋酸钠，pH4.5溶液洗脱未被修饰的G-CSF。整个过程中的线性流速应控制在30-100cm/h之间。
2、酶解
将上述得到的粒细胞集落刺激因子聚乙二醇单修饰产物(PEG-G-CSF)用截留分子量为3000Da的Millipore超滤离心管进行浓缩和换溶液处理，使PEG-G-CSF的浓度达到2mg/ml以上，所处的溶液环境转换为1％碳酸氢铵溶液(pH8.0)。用Lowry法测定超滤浓缩后的PEG-G-CSF的浓度，并进一步用1％碳酸氢铵溶液(pH8.0)调整其浓度为2.00±0.05mg/ml。
取1mg上述浓缩并调整浓度的样品，先加入8mol/L尿素0.5ml与0.5mol/LDTT 0.1ml处理2小时，然后加入Promega公司商品化的测序级的Trypsin 25μg 37℃酶解反应24小时，最后加入100μl 50％醋酸溶液终止酶解反应。在还原条件下Trypsin酶解PEG-G-CSF后理论连接PEG的含赖氨酸片段的情况如下表4所示。
表4还原条件下Trypsin酶解PEG-G-CSF后理论连接PEG的赖氨酸片段的情况
3、酶解产物分离收样的N端序列测定
酶解反应液上Protein-Pak 200SW(8.0mm×30cm)高效液相色谱柱，10mmol/LPB，20mmol/LNaCl，pH7.0溶液洗脱，流速1.0ml/min，检测波长215nm，每次上样100μl。
按照本发明发明内容部分所述的“保留时间比对法”，在同样的高效液相色谱分离系统与分离条件下分别上G-CSF与PEG-G-CSF纯品记录保留时间，所得 色谱图分别如图7和图8所示，表明两者的保留时间为别为9.432min和6.954min，从而确定连接聚乙二醇部分的酶解片段的保留时间应该在6.954-9.432min之间。
上述酶解产物的色谱分离中在保留时间6.954-9.432min之间共有两峰，色谱图如图9所示，均为连接聚乙二醇部分的酶解片段峰，收集保留时间为7.560min左右，峰面积占两峰面积总和80％的出峰T2，用Applied Biosystem公司PROCISE 491型N端序列测定仪进行N端序列测定。
测序结果为KVQAD，说明T2峰对应的是连接聚乙二醇部分的44-55片段，由于该片段中只有一个可连接聚乙二醇部分的氨基酸残基Lys44，所以Lys44是PEG-G-CSF中占绝对优势的修饰位点，所占比例为80％。
实施例4：血管内皮生长因子聚乙二醇单修饰产物修饰位点分析
1、VEGF及PEG-VEGF的获得
1)VEGF表达工程菌构建
血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，利用商品化的质粒pET-23b与商品化的大肠杆菌BL21(DE3)，用本领域技术人员公知的基因工程方法构建表达VEGF的重组工程菌(例如，表达VEGF的基因序列插入到质粒pET-23b的Nde I与EcoR I酶切位点之间)。
2)VEGF表达工程菌的发酵
将按上述方法构建的VEGF表达工程菌经涂平板活化后挑选单菌落接种于含氨苄青霉素的LB培养基中37℃、220转/分摇床摇瓶培养至OD600nm为0.6-0.8。然后以6％的体积接种量接种于装有140L LB培养基的200L发酵罐中后进行发酵培养，条件如实施例3，但诱导培养温度为36℃。诱导培养时间到后放罐室温5000转/分离心20分钟收集菌体，所得菌体用上述TE溶液洗涤两次以除去发酵液中的主要杂质。
3)VEGF的纯化
菌体超声破碎与包涵体的变性处理方法同实施例3。
所得10g包涵体以1∶15的质量体积比加入150ml含5mmol/L巯基乙醇，8mol/L尿素的50mol/L Tris-HCl，pH8.0溶液后在适度搅拌条件下变性处理4小时，待包涵体完全溶解后室温8000转/分离心20分钟弃沉淀，上清以柱上复性法在室温进行复性与纯化处理。具体方法为：上清上用同变性溶液相同的溶液平衡处理的DEAE Sepharose FF色谱柱，冲洗后先用50mol/L Tris-HCl，5mmol/L EDTA，4M尿素，pH8.0溶液洗脱3-5个柱体积，再用50mol/L Tris-HCl，5mmol/LEDTA，2M尿素，pH8.0溶液洗脱3-5个柱体积，再用50mol/L Tris-HCl，5mmol/LEDTA，1M尿素，pH8.0溶液洗脱3-5个柱体积，再用50mol/L Tris-HCl溶液，3mmol/L氧化型谷胱甘肽，1mmol/L还原型谷胱甘肽，5mmol/L EDTA，50mmol/L精氨酸，pH 8.0溶液洗脱5-8个柱体积，在用50mmol/L Tris-HCl，pH8.0溶液洗脱3-5个柱体积后用含有0.3mol/L NaCl的50mmol/L Tris-HCl，pH8.0溶液洗脱并收集含有目的蛋白的峰。整个过程中的线性流速应控制在50-200cm/h之间。
DEAE Sepharose FF洗脱收集含有目的蛋白的峰按2∶3的体积比与50％硫酸铵(质量体积浓度)混合，在用1mol/L Tris-HCl调节pH为8.0后上用含20％硫酸铵的50mmol/L Tris-HCl，pH8.0溶液平衡的Phenyl Sepharose 6FF(Low sub)色谱柱，用50mmol/L Tris-HCl，pH8.0溶液洗脱目的收集蛋白，收集到的VEGF的SDS-PAGE纯度在95％以上。整个过程中的线性流速应控制在50-200cm/h之间。
Phenyl Sepharose 6FF(Low sub)洗脱收集含有目的蛋白的峰上用50mmol/LTris-HCl，pH8.0溶液平衡的填料装填较少(10ml以下)的DEAE Sepharose FF色谱柱，用含有0.5mol/L NaCl的50mmol/L Tris-HCl，pH8.0溶液洗脱以使VEGF得到PEG修饰前的浓缩处理。
4)PEG修饰与修饰产物的分离
用北京键凯科技有限公司或北京凯正生物工程发展有限责任公司商品化的分子量为40kDa的Y型聚乙二醇修饰剂mPEG-NHS(氨基聚乙二醇修饰剂)修饰上述方法获得的VEGF纯品，修饰反应条件为VEGF浓度4mg/ml(可用50mmol/L Tris-HCl，pH8.0溶液调整上步得到的VEGF的浓度至此浓度)，VEGF与mPEG-NHS质量比1∶6，室温进行修饰反应2小时，搅拌速度10转/分。
修饰反应液用20mmol/L醋酸-醋酸钠，pH4.5溶液稀释20倍后上ToyopearlSP650M离子交换色谱柱，冲洗后先用含50mmol/L NaCl的20mmol/L醋酸-醋酸钠，pH4.5溶液洗脱杂质蛋白质，然用含0.14mol/LNaCl的20mmol/L醋酸-醋酸钠，pH4.5溶液洗脱目的收集蛋白，最后用含0.75mol/LNaCl的20mmol/L醋酸-醋酸钠，pH4.5溶液洗脱未被修饰的VEGF。整个过程中的线性流速应控制在30-100cm/h之间。
2、酶解
将上述得到的血管内皮生长因子聚乙二醇单修饰产物(PEG-VEGF)用截留 分子量为3000Da的Millipore超滤离心管进行浓缩和换溶液处理，使PEG-VEGF的浓度达到2mg/ml以上，所处的溶液环境转换为1％碳酸氢铵溶液(pH8.0)。用Lowry法测定超滤浓缩后的PEG-VEGF的浓度，并进一步用1％碳酸氢铵溶液(pH8.0)调整其浓度为2.00±0.05mg/ml。
取1mg上述浓缩并调整浓度的样品，先加入8mol/L尿素0.5ml与0.5mol/LDTT 0.1ml处理2小时，然后加入罗氏(Roche)公司商品化的测序级的Trypsin50μg 37℃酶解反应24小时，最后加入100μl 50％醋酸溶液终止酶解反应。在还原条件下Trypsin酶解PEG-VEGF后理论连接PEG的含赖氨酸片段的情况如下表5所示。
表5还原条件下Trypsin酶解PEG-VEGF后理论连接PEG的含赖氨酸片段的情况
3、酶解产物分离收样的N端序列测定
将酶解反应液上Waters Symmetry 300C18(4.6×150mm)反相色谱柱，流速 1.0ml/min，检测波长215nm，每次上样100μl，梯度洗脱A液为0.1％TFA水溶液，B液为0.1％TFA的乙腈溶液，90分钟内由70％B(30％A)升至90％B(10％A)线性梯度洗脱。所得色谱图如图10所示，通过本发明发明内容部分所述的“电泳染色法”确定连接聚乙二醇部分的各酶解片段的出峰位置。在反相高效液相色谱分离后用旋转蒸发器除去收样中的有机溶剂乙腈，然后再进行后续的N端测序处理，结果如下表6所示。
表6PEG-VEGF酶解后的反相高效液相色谱分离收集峰的测序结果及分析
通过上述方法可确定Lys42是占绝对优势的修饰位点，单一修饰该位点的PEG-VEGF在全部修饰位点的PEG-VEGF中所占的比例为62％，并可进一步确定Lys22在全部修饰位点中所占的比例为9％，Lys133在全部修饰位点中所占的比例为8％，Lys162在全部修饰位点中所占的比例为9％，Lys173在全部修饰位点中所占的比例为12％。
实施例5：PEG-IIFNm2修饰位点分析(方法三)
1、IIFNm及PEG-IIFNm2的获得
IIFNm的获得方法同实施例1。将获得的IIFNm用25mmol/L Tris-HCl，pH8.5溶液稀释10倍后上用25mmol/L Tris-HCl，pH8.5溶液平衡的填料装填较少(10ml以下)的DEAE Sepharose FF色谱柱，用含有0.5mol/L NaCl的25mmol/L Tris-HCl，pH8.5溶液洗脱以使IIFNm得到PEG修饰前的浓缩与换缓冲液处理。
用北京键凯科技有限公司或北京凯正生物工程发展有限责任公司商品化的分子量为5kDa的聚乙二醇修饰剂mPEG-SPA(氨基聚乙二醇修饰剂)修饰IIFNm，具体修饰反应条件为：IIFNm浓度5mg/ml(可用25mmol/L Tris-HCl，pH8.5溶液调整上步得到的IIFNm的浓度至此浓度)，IIFNm与mPEG-SPA质量比1∶8，室温进行修饰反应2小时，静置不搅拌。
修饰反应液用20mmol/L醋酸-醋酸钠，pH4.5溶液稀释20倍后上SPSepharose FF离子交换层析，冲洗后先用含0.1mol/L NaCl的20mmol/L醋酸-醋酸钠，pH4.5溶液洗脱杂质蛋白质，再用含0.25mol/L NaCl的20mmol/L醋酸-醋酸钠，pH4.5溶液洗脱目的收集蛋白，最后用含0.75mol/L NaCl的20mmol/L醋酸-醋酸钠，pH4.5溶液洗脱未被修饰的IIFNm。整个过程中的线性流速应控制在30-100cm/h之间。
2、第一次酶解
将上述得到的PEG-IIFNm2用截留分子量为3000Da的Millipore超滤离心管进行浓缩和换溶液处理，使PEG-IIFNm2的浓度达到2mg/ml以上，所处的溶液环境转换为50mmol/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液(pH7.0)。用Lowry法测定超滤浓缩后的PEG-IIFNm2的浓度，并进一步用50mmol/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液(pH7.0)调整其浓度为2.00±0.05mg/ml。
取1mg上述浓缩并调整浓度的样品，先加入8mol/L尿素0.5ml与0.5mol/LDTT 0.1ml处理2小时，然后加入罗氏(Roche)公司商品化的测序级的Glu-C 25μg37℃酶解反应18小时，最后加入100μl 50％醋酸溶液终止酶解反应。在还原条件下磷酸盐缓冲液中Glu-C酶解PEG-IIFNm2后理论连接PEG的含赖氨酸片段的情况如下表7所示。
表7还原条件下磷酸盐缓冲液中Glu-C酶解PEG-IIFNm2后理论连接PEG的含赖氨酸片段的情况
3、第一次酶解产物分离
酶解反应液上Waters Symmetry 300C18(4.6×150mm)反相色谱柱，流速1.0ml/min，检测波长215nm，每次上样100μl，梯度洗脱A液为0.1％TFA水溶液，B液为0.1％TFA的乙腈溶液，120分钟内由50％B(50％A)升至80％B(20％A)线性梯度洗脱。连接聚乙二醇的酶解片段的N端测序及各修饰位点比例分析结果如下表8所示。
表8PEG-IIFNm2第一次酶解与反相高效液相色谱分离后收集峰的测序结果及分析
4、第二次酶解及其后的高效液相色谱分离
将3-5次高效液相色谱分离收集的G3峰用截留分子量为3000的Millipore超滤离心管进行浓缩处理，并换溶液为1％碳酸氢铵溶液(pH8.0)。在浓缩换溶液处理的G3峰收集样中加入SIGMA公司商品化的蛋白质组学级的Trypsin 5μg 37℃酶解反应18小时后加入30μl 50％醋酸溶液终止酶解反应。在还原条件下Trypsin酶解PEG-IIFNm2134-142片段后理论连接PEG的含赖氨酸片段的情况如下表9所示。
表9还原条件下Trypsin酶解PEG-IIFNm2134-142片段后理论连接PEG的含赖氨酸片段的情况
| 片段位置 | 片段序列 | 质荷比 | 说明 |
| 134-135 | KK | 275.21 | Lys134所在片段 |
| 134-142 | KKYSPCAWE | 1111.52 | Lys135所在片段 |
第二次酶解反应液上Waters Symmetry 300C18(4.6×150mm)反相色谱柱，流速1.0ml/min，检测波长215nm，每次上样100μl，梯度洗脱A液为0.1％TFA水溶液，B液为0.1％TFA的乙腈溶液，15分钟内由30％B(70％A)升至90％B(10％A)线性梯度洗脱。连接聚乙二醇的酶解片段的N端测序及各修饰位点比例分析结果如下表10所示。
表10Trypsin酶解PEG-IIFNm2134-142片段经Trypsin酶解与反相高效液相色谱分离后收集峰的测序结果及分析
5、第三次酶解及其后的高效液相色谱分离
将3-5次高效液相色谱分离收集的G6峰用截留分子量为3000的Millipore超滤离心管进行浓缩处理，并换溶液为1％碳酸氢铵溶液(pH8.0)。在浓缩换溶液处理的G6峰收集样中加入SIGMA公司商品化的蛋白质组学级的Trypsin 5μg37℃酶解反应18小时后加入30μl 50％醋酸溶液终止酶解反应。在还原条件下 Trypsin酶解PEG-IIFNm2116-133片段后理论连接PEG的含赖氨酸片段的情况如下表11所示。
表11还原条件下Trypsin酶解PEG-IIFNm2116-133片段后理论连接PEG的含赖氨酸片段的情况
| 片段位置 | 片段序列 | 质荷比 | 说明 |
| 116-122 | SILAVKK | 758.51 | Lys121所在片段 |
| 116-126 | SILAVKKYFQR | 1352.80 | Lys122所在片段 |
第三次酶解反应液上Waters Symmetry 300C18(4.6×150mm)反相色谱柱，流速1.0ml/min，检测波长215nm，每次上样100μl，梯度洗脱A液为0.1％TFA水溶液，B液为0.1％TFA的乙腈溶液，15分钟内由30％B(70％A)升至90％B(10％A)线性梯度洗脱。连接聚乙二醇的酶解片段的N端测序及各修饰位点比例分析结果如下表12所示。
表12Trypsin酶解PEG-IIFNm2116-133片段经Trypsin酶解与反相高效液相色谱分离后收集峰的测序结果及分析
通过如上实验和结果分析表明Lys31是PEG-IIFNm2中占优势的修饰位点，比例为33％，其它次要的修饰位点及比例为：Lys165，15％；Lys122，12.4％；Lys84，11％；Lys50，8％；Lys71，7％；Lys135，5.6％；Lys121，4.6％；Lys134，3.4％。
上述实施例中使用的聚乙二醇修饰剂mPEG-MAL的结构如下：
mPEG-SPA的结构如下：
Y型mPEG-NHS的结构如下：
Claims (10)
1.聚乙二醇修饰蛋白质的修饰位点分析方法，至少包括如下步骤：
1)酶解：至少一次酶解，以在完全酶解与不存在非特异性酶解的条件下使各可能的修饰位点分布于不同的理论酶解片段中；
2)高效液相色谱分离：在每次酶解后至少一次高效液相色谱分离，以最终使实际连接聚乙二醇部分的酶解片段比较实际未连接聚乙二醇部分的酶解片段分布于不同的色谱峰中，且最终至少使序列上只包括含量上占优势的实际修饰位点残基且不包括可能但非实际修饰位点残基且连接聚乙二醇部分的酶解片段比较各序列上只包括同一个含量上次要的实际修饰位点残基且不包括可能但非实际修饰位点残基且连接聚乙二醇部分的酶解片段，分布于不同的色谱峰中；
3)确定修饰位点比例：对序列上只包括含量上占优势的实际修饰位点残基且不包括可能但非实际修饰位点残基且连接聚乙二醇部分的酶解片段与各序列上只包括同一个含量上次要的实际修饰位点残基且不包括可能但非实际修饰位点残基且连接聚乙二醇部分的酶解片段在2)的色谱分离中最终对应的色谱分离峰进行峰面积加和处理，不同次色谱分离得到的色谱峰的峰面积需按同一次色谱分离的峰面积进行折算后再加和，并确定其中峰面积最大的色谱分离峰占峰面积加和的比例，以确定占优势的实际修饰位点在全部修饰位点中所占比例；
4)确定修饰位点位置：收取序列上只包括含量上占优势的实际修饰位点残基且不包括可能但非实际修饰位点残基且连接聚乙二醇部分的酶解片段所最终对应的色谱分离峰的样品进行N端序列测定，与理论酶解序列进行比对确定占优势的实际修饰位点在蛋白质序列中的位置。
2.如权利要求1所述的分析方法，其特征是酶解步骤中各次酶解选择的酶是Trypsin、Chymotrypsin、Glu-C、Asp-N中的一种或几种的组合。
3.如权利要求1所述的分析方法，其特征是每次高效液相色谱分离选择反相高效液相色谱柱或分子排阻高效液相色谱柱中的一种。
4.如权利要求3所述的分析方法，其特征是所述的反相高效液相色谱柱选择Waters Symmetry 300C18色谱柱。
5.如权利要求3所述的分析方法，其特征是所述的分子排阻高效液相色谱柱选择TSK-GEL G3000SWXL色谱柱。
6.如权利要求1所述的分析方法，其特征是所述的蛋白质为复合干扰素86位点半胱氨酸突变体，其具有SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。
7.如权利要求6所述的分析方法，其特征是包括如下步骤：
1)Trypsin一次酶解；
2)一次酶解产物的高效液相色谱分离，以使各实际连接聚乙二醇部分的酶解片段比较各实际未连接聚乙二醇部分的酶解片段分布于不同的色谱峰中，且各在同一位点实际连接聚乙二醇部分的酶解片段也分布于不同的色谱峰中，收集各在同一位点实际连接聚乙二醇部分的酶解片段对应的色谱峰中峰面积占绝对优势的峰的样品，并通过计算该峰的峰面积占全部各在同一位点实际连接聚乙二醇部分的酶解片段对应的色谱峰峰面积的加和的比例，从而确定占绝对优势的实际修饰位点在全部修饰位点中所占比例；
3)对2)中收集的峰样品进行Chymotrypsin二次酶解；
4)二次酶解产物的高效液相色谱分离，并收集连接聚乙二醇部分的酶解片段峰；
5)对两次高效液相色谱分离收集的酶解片段峰进行N末端序列测定，通过与理论酶解序列对比确定占绝对优势的实际修饰位点在复合干扰素86位点半胱氨酸突变体序列中的位置。
8.如权利要求7所述的方法，其特征是步骤2)和/或步骤4)中所述的高效液相色谱分离采用Waters Symmetry 300C18反相高效液相色谱柱。
9.如权利要求7所述的方法，其特征是步骤2)和/或步骤4)中所述的高效液相色谱分离采用TSK-GEL G3000SWXL分子排阻高效液相色谱柱。
10.如权利要求1-6之一所述的分析方法，对如下步骤进一步要求：
1)高效液相色谱分离：在每次酶解后至少一次高效液相色谱分离，以最终使各序列上只包括同一个含量上次要的实际修饰位点残基且不包括可能但非实际修饰位点残基且连接聚乙二醇部分的酶解片段分布于不同的色谱峰中；
2)确定修饰位点比例：对各序列上只包括同一个含量上次要的实际修饰位点残基且不包括可能但非实际修饰位点残基且连接聚乙二醇部分的酶解片段所在的色谱峰的峰面积进行加和处理，计算各序列上只包括同一个含量上次要的实际修饰位点残基且不包括可能但非实际修饰位点残基且连接聚乙二醇部分的酶解片段所在的色谱峰的峰面积占全部各序列上只包括同一个含量上次要的实际修饰位点残基且不包括可能但非实际修饰位点残基且连接聚乙二醇部分的酶解片段所在的色谱峰的峰面积加和的比例，以确定各实际修饰位点在全部修饰位点中所占比例；
3)确定修饰位点位置：收取各序列上只包括同一个含量上次要的实际修饰位点残基且不包括可能但非实际修饰位点残基且连接聚乙二醇部分的酶解片段所在的色谱分离峰的样品进行N端序列测定，与理论酶解序列进行比对确定各实际修饰位点在蛋白质序列中的位置。
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|---|---|
| CN (1) | CN102507824B (zh) |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104991016A (zh) * | 2015-06-25 | 2015-10-21 | 吉林大学 | 一种生物样本中peg化药物的定量测定方法 |
| CN107478839A (zh) * | 2016-06-07 | 2017-12-15 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 赖氨酸氮连接磷酸化翻译后修饰富集和鉴定的方法 |
| CN107589184A (zh) * | 2017-08-17 | 2018-01-16 | 吉林大学 | 一种peg及peg化药物的分析检测方法及其应用 |
| CN108267534A (zh) * | 2016-12-31 | 2018-07-10 | 江苏众红生物工程创药研究院有限公司 | 聚乙二醇修饰蛋白质药物的酶解肽图分析方法 |
| CN110118847A (zh) * | 2019-05-17 | 2019-08-13 | 重庆派金生物科技有限公司 | 确定多位点peg修饰蛋白质修饰位点的分析方法 |
| CN110618229A (zh) * | 2018-06-20 | 2019-12-27 | 成都康弘生物科技有限公司 | 一种蛋白的非还原肽图分析方法 |
| CN111220676A (zh) * | 2019-11-13 | 2020-06-02 | 上海药明生物技术有限公司 | 利用毛细管电泳技术检测含聚乙二醇的蛋白质样品纯度的方法 |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002002132A1 (en) * | 2000-06-30 | 2002-01-10 | Smithkline Beecham Corporation | Chemokine conjugates |
| CN1511848A (zh) * | 2002-12-30 | 2004-07-14 | 北京三元基因工程有限公司 | 支链聚乙二醇-集成干扰素复合物及制剂 |
| CN1687106A (zh) * | 2005-03-25 | 2005-10-26 | 山东格兰百克生物制药有限公司 | 一种聚乙二醇修饰蛋白质α－氨基的方法 |
| US7037896B1 (en) * | 1999-11-08 | 2006-05-02 | Ipf Pharmaceuticals Gmbh | Peptide (VIRIP) which inhibits a circulating virus in humans and the use thereof |
| CN1970572A (zh) * | 2006-12-21 | 2007-05-30 | 北京三元基因工程有限公司 | 干扰素α突变体及其聚乙二醇衍生物 |
| CN101493446A (zh) * | 2009-02-16 | 2009-07-29 | 江苏先声药物研究有限公司 | 一种检测样品或制品中游离聚乙二醇含量的方法 |
| EP1613274B1 (en) * | 2003-04-15 | 2010-03-03 | GlaxoSmithKline LLC | Human il-18 substitution mutants and their conjugates |
-
2011
- 2011-11-01 CN CN 201110339619 patent/CN102507824B/zh active Active
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7037896B1 (en) * | 1999-11-08 | 2006-05-02 | Ipf Pharmaceuticals Gmbh | Peptide (VIRIP) which inhibits a circulating virus in humans and the use thereof |
| WO2002002132A1 (en) * | 2000-06-30 | 2002-01-10 | Smithkline Beecham Corporation | Chemokine conjugates |
| CN1511848A (zh) * | 2002-12-30 | 2004-07-14 | 北京三元基因工程有限公司 | 支链聚乙二醇-集成干扰素复合物及制剂 |
| EP1613274B1 (en) * | 2003-04-15 | 2010-03-03 | GlaxoSmithKline LLC | Human il-18 substitution mutants and their conjugates |
| CN1687106A (zh) * | 2005-03-25 | 2005-10-26 | 山东格兰百克生物制药有限公司 | 一种聚乙二醇修饰蛋白质α－氨基的方法 |
| CN1970572A (zh) * | 2006-12-21 | 2007-05-30 | 北京三元基因工程有限公司 | 干扰素α突变体及其聚乙二醇衍生物 |
| CN101493446A (zh) * | 2009-02-16 | 2009-07-29 | 江苏先声药物研究有限公司 | 一种检测样品或制品中游离聚乙二醇含量的方法 |
Non-Patent Citations (13)
| Title |
|---|
| 《Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications》 20010415 Dong Hee Na et al， Identification of the modifying sites of mono-PEGylated salmon calcitonins by capillary electrophoresis and MALDI-TOF mass spectrometry 259-263 1-10 第754卷, 第1期 * |
| 《Protein Expression and Purification》 20030731 Stefan Foser et al， Isolation, structural characterization, and antiviral activity of positional isomers of monopegylated interferon alpha-2a (PEGASYS) 78-87 1-10 第30卷, 第1期 * |
| A GÁMEZ ET AL，: "Structure-based epitope and PEGylation sites mapping of phenylalanine ammonia-lyase for enzyme substitution treatment of phenylketonuria", 《MOLECULAR GENETICS AND METABOLISM》, vol. 91, no. 4, 31 August 2007 (2007-08-31), pages 325 - 334, XP022432044, DOI: doi:10.1016/j.ymgme.2007.04.015 * |
| CAI YONGQING ET AL，: "Separation of exenatide analogue mono-PEGylated with 40 kDA polyethylene glycol by cation exchange chromatography", 《JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY A》, vol. 1218, no. 39, 28 September 2011 (2011-09-28), pages 6953 - 6960, XP028283918, DOI: doi:10.1016/j.chroma.2011.07.107 * |
| DONG HEE NA ET AL，: "Identification of the modifying sites of mono-PEGylated salmon calcitonins by capillary electrophoresis and MALDI–TOF mass spectrometry", 《JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY B: BIOMEDICAL SCIENCES AND APPLICATIONS》, vol. 754, no. 1, 15 April 2001 (2001-04-15), pages 259 - 263, XP004232013, DOI: doi:10.1016/S0378-4347(00)00599-5 * |
| DONG HEE NA ET AL，: "PEGylation of Octreotide: I. Separation of Positional Isomers and Stability Against Acylation by Poly(D,L-lactide-co-glycolide)", 《PHARMACEUTICAL RESEARCH》, vol. 22, no. 5, 31 May 2005 (2005-05-31), pages 736 - 742, XP019370845, DOI: doi:10.1007/s11095-005-2589-4 * |
| FM VERONESE ET AL，: "New PEGs for peptide and protein modification, suitable for identification of the PEGylation site", 《BIOCONJUGATE CHEM》, vol. 12, no. 1, 17 January 2001 (2001-01-17), pages 62 - 70, XP055119513, DOI: doi:10.1021/bc000061m * |
| HAESHIN LEE ET AL，: "N-Terminal Site-Specific Mono-PEGylation of Epidermal Growth Factor", 《PHARMACEUTICAL RESEARCH》, vol. 20, no. 5, 31 May 2003 (2003-05-31), pages 818 - 825, XP009114507, DOI: doi:10.1023/A:1023402123119 * |
| STEFAN FOSER ET AL，: "Isolation, structural characterization, and antiviral activity of positional isomers of monopegylated interferon α-2a (PEGASYS)", 《PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION》, vol. 30, no. 1, 31 July 2003 (2003-07-31), pages 78 - 87 * |
| WANG YU-SEN ET AL，: "Structural and biological characterization of pegylated recombinant interferon alpha-2b and its therapeutic implications", 《ADVANCED DRUG DELIVERY REVIEWS》, vol. 54, no. 4, 17 June 2002 (2002-06-17), pages 547 - 570, XP002989691, DOI: doi:10.1016/S0169-409X(02)00027-3 * |
| 姜忠义 等，: "药物蛋白的聚乙二醇修饰", 《中国药学杂志》, vol. 37, no. 6, 30 June 2002 (2002-06-30), pages 409 - 412 * |
| 董惠钧 等，: "蛋白药物聚乙二醇修饰技术研究进展", 《中国生化药物杂志》, vol. 30, no. 3, 31 March 2009 (2009-03-31), pages 199 - 203 * |
| 郝素娟，: "非糖基化促红细胞生成素的聚乙二醇定点修饰及修饰产物性质", 《高等学校化学学报》, vol. 31, no. 11, 30 November 2010 (2010-11-30), pages 2239 - 2245 * |
Cited By (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104991016A (zh) * | 2015-06-25 | 2015-10-21 | 吉林大学 | 一种生物样本中peg化药物的定量测定方法 |
| CN104991016B (zh) * | 2015-06-25 | 2017-04-05 | 吉林大学 | 一种生物样本中peg化药物的定量测定方法 |
| CN107478839A (zh) * | 2016-06-07 | 2017-12-15 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 赖氨酸氮连接磷酸化翻译后修饰富集和鉴定的方法 |
| CN108267534A (zh) * | 2016-12-31 | 2018-07-10 | 江苏众红生物工程创药研究院有限公司 | 聚乙二醇修饰蛋白质药物的酶解肽图分析方法 |
| CN107589184A (zh) * | 2017-08-17 | 2018-01-16 | 吉林大学 | 一种peg及peg化药物的分析检测方法及其应用 |
| CN107589184B (zh) * | 2017-08-17 | 2020-10-09 | 吉林大学 | 一种peg及peg化药物的分析检测方法及其应用 |
| CN110618229A (zh) * | 2018-06-20 | 2019-12-27 | 成都康弘生物科技有限公司 | 一种蛋白的非还原肽图分析方法 |
| CN110118847A (zh) * | 2019-05-17 | 2019-08-13 | 重庆派金生物科技有限公司 | 确定多位点peg修饰蛋白质修饰位点的分析方法 |
| CN110118847B (zh) * | 2019-05-17 | 2021-08-10 | 重庆派金生物科技有限公司 | 确定多位点peg修饰蛋白质修饰位点的分析方法 |
| CN111220676A (zh) * | 2019-11-13 | 2020-06-02 | 上海药明生物技术有限公司 | 利用毛细管电泳技术检测含聚乙二醇的蛋白质样品纯度的方法 |
| CN111220676B (zh) * | 2019-11-13 | 2022-11-29 | 上海药明生物技术有限公司 | 利用毛细管电泳技术检测含聚乙二醇的蛋白质样品纯度的方法 |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
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Address after: 102600 Beijing Jinyuan Industrial Development Zone Daxing District Road No. 1 Building No. 4 Patentee after: BEIJING TRI-PRIME GENE PHARMACEUTICAL CO., LTD. Address before: 102600, Beijing, Daxing District, North Village, Beijing biological engineering and pharmaceutical industry base, nine Fu Tian street, Beijing three yuan Gene Engineering Co., Ltd. Patentee before: Beijing Sanyuan Gene Engineering Co., Ltd. |