CN110028581B

CN110028581B - 一种微囊藻毒素抗体Fab片段的制备方法和应用

Info

Publication number: CN110028581B
Application number: CN201910251588.0A
Authority: CN
Inventors: 雷红涛; 焦文阳; 沈兴; 王兰腾; 徐振林; 孙远明
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2019-03-22
Filing date: 2019-03-29
Publication date: 2022-02-11
Anticipated expiration: 2039-03-29
Also published as: CN110028581A

Abstract

本发明公开了一种微囊藻毒素抗体Fab片段的制备方法和应用。本发明首先提供了一种微囊藻毒素抗体Fab片段的氨基酸序列和核苷酸序列，依次如SEQ ID NO：1～4所示。本发明还提供了一种微囊藻毒素抗体Fab片段的制备方法，用蛋白酶酶切微囊藻毒素抗体IgG，酶切产物直接采用凝胶过滤层析进行纯化，即可得到Fab片段。该方法仅使用凝胶过滤层析便可获得生物活性高、纯度高的Fab片段，成功实现了一步法高效纯化Fab片段。另外，该方法步骤少，操作流程简易，使用的凝胶过滤层析介质可再生，大大降低了成本，是一种低成本、高产出的高效制备微囊藻毒素Fab片段的方法，为建立微囊藻毒素的免疫分析检测方法提供了核心材料，具有广阔的应用前景。

Description

一种微囊藻毒素抗体Fab片段的制备方法和应用

技术领域

本发明属于食品安全检测技术领域，更具体地，涉及一种微囊藻毒素抗体Fab片段的制备方法和应用。

背景技术

随着工业化、城市化的发展，大量营养物注入水中造成水体富营养化，致使藻类迅猛生长，我国是世界上藻灾害最为严重的国家之一。藻类代谢产生包括蓝绿藻肝毒素(微囊藻毒素，节球藻毒素)在内的有毒物质，危害着人类健康，其中微囊藻毒素分布最广、毒性最大。微囊藻毒素(Microcystins，MCs)是一类单环七肽肝毒素，其中2位与4位的氨基酸组成主要有亮氨酸(L)、精氨酸(R)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)和苯丙氨酸(F)，目前已经确定的微囊藻毒素有100多种。MCs已被证实对蛋白磷酸酶1和蛋白磷酸酶2A具有抑制作用，是强烈的肝脏肿瘤促进剂，其中MC-LR/RR/YR毒性最强。MCs通过饮用水和积累在水产品中进行人类食物链，严重危害人类和生态安全，因此加强MCs的检测已十分必要。我国生活饮用水卫生标准(GB5749-2006)中将饮用水中微囊藻毒素含量限制为1μg/L，该标准的实施对水源水的质量提出了更高的要求。

在现有的检测方法中，免疫分析方法具备快速、灵敏、准确、操作简便等特点，特别适用于水源地样品的现场快速检测。免疫分析方法的建立需要获得高质量的抗体，其中抗原结合片段(antigen-binding fragment,Fab)由于较好地保持了天然抗体分子的抗原结合部位结构，而且具有分子量小、免疫原性低、穿透性强、不与Fc受体结合等特点，因而被用于临床诊断治疗、食品安全检测和生命科学等领域中，在小分子有害物现场快速免疫检测中具有广泛的应用价值。

目前，以天然抗体IgG为原料，制备Fab片段的主要方法为酶解法。通过蛋白酶作用于IgG铰链区附近的肽键，将完整的IgG水解为Fab片段和可结晶片段(fragmentcrystallized，Fc)，然后对酶解产物进行纯化，获得单一的Fab片段。抗体酶解后产物成分较为复杂，现有纯化方法较难实现Fab片段的一步分离。纯化Fab片段第一步通常是采用亲和层析，常见的亲和层析有蛋白A配体、蛋白G配体。然而，研究表明二者对于酶切反应产物中的Fab片段和Fc片段均有结合作用，无法高效分离二者。蛋白L配体可以通过与Kappa型轻链的Fab片段发生特异性结合，但对于轻链为Lambda型的抗体没有效果。此外，在亲和填料每批纯化过程中，存在配基脱落的风险导致载量降低，在长期生产过程中需要定期更换亲和填料，造成实验成本高昂。亲和色谱较难实现完整的抗体和Fab片段的分离，后续需使用离子交换、疏水层析、凝胶过滤层析等手段进行二步纯化，而多种纯化手段的组合会降低得率。因此，研究Fab片段的高效制备方法，对Fab片段的应用具有重要意义。

有研究发现，由琼脂糖偶联葡聚糖制备的凝胶过滤层析介质，随着葡聚糖偶联数量的增加，层析介质与蛋白质之间的疏水作用也会增加。此外，凝胶过滤层析填料表面存在少量负电荷，由于蛋白是两性物质，缓冲液中当pH>pI时，蛋白表面会携带负电荷，与凝胶过滤层析介质产生离子排阻作用；当pH<pI时，蛋白表面携带正电荷，与凝胶过滤层析介质产生离子交换作用。因此，改变缓冲液中的pH和离子强度可以调节蛋白质与层析介质之间的相互作用。目前，尚未有报道直接单独使用凝胶过滤层析一步纯化法分离纯化Fc片段与Fab片段，获得纯度高、生物活性高的Fab片段的方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服上述现有技术的缺陷和不足，提供一种操作简便，能够通过凝胶过滤层析一步纯化法进行高效纯化，来制备纯度高、生物活性高的微囊藻毒素抗体Fab片段的方法，在此基础上提供一种用于快速简便检测微囊藻毒素的免疫检测方法，为建立微囊藻毒素的免疫学检测方法提供核心材料。

本发明利用微囊藻毒素抗体的Fc片段和Fab片段具有不同的疏水特性的作用原理，将微囊藻单克隆毒素抗体使用蛋白酶酶切后，选择适宜的缓冲液使酶解产物中的Fab片段与Superdex75凝胶柱产生结合，同时使Fc片段及酶解碎片可以根据分子大小先后流穿凝柱，然后改变流动相中的离子强度和pH，将结合的Fab片段进行洗脱，便可达到分离纯化Fab片段的目的。

本发明的第一个目的是提供一种微囊藻毒素抗体Fab片段的氨基酸序列。

本发明的第二个目的是提供一种微囊藻毒素抗体Fab片段的核苷酸序列。

本发明的第三个目的是提供一种微囊藻毒素抗体Fab片段的制备方法。

本发明的第四个目的是提供上述方法制备得到的微囊藻毒素抗体Fab片段在检测微囊藻毒素及在蛋白质三维结构研究中的应用。

本发明的第五个目的是提供一种微囊藻毒素免疫学的检测方法。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明提供了一种微囊藻毒素抗体Fab片段，包括重链和轻链，其重链的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，其轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明还提供了一种编码微囊藻毒素抗体Fab片段的基因，编码其重链的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，编码其轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

本发明还提供了一种微囊藻毒素抗体Fab片段的制备方法，包括以下步骤：

S1.将微囊藻毒素抗体IgG用蛋白酶酶切得到酶切产物；

S2.将步骤S1的酶切产物经凝胶过滤层析柱一步纯化后，先用缓冲液冲洗、再用超纯水或Tris冲洗，透析，即可得到Fab片段。

优选地，步骤S2所述抗体IgG用为单克隆抗体IgG。

优选地，步骤S2所述凝胶过滤层析柱为Superdex75凝胶过滤层析柱。

优选地，步骤S2所述结合缓冲液为PBS结合缓冲液或Tris中的任意一种或两种。

更优选地，步骤S2所述缓冲液为PBS结合缓冲液。

优选地，所述PBS结合缓冲液中PB的摩尔浓度为大于或等于5mM，NaCl的摩尔浓度为大于或等于10mM。

更优选地，所述PBS结合缓冲液中PB的摩尔浓度为15～25mM，NaCl的摩尔浓度为140～160mM。

更进一步优选地，所述PBS结合缓冲液中PB的摩尔浓度为20mM，NaCl的摩尔浓度为150mM。

优选地，所述PBS结合缓冲液的pH为小于或等于8。

更优选地，所述PBS结合缓冲液的pH为7～7.5。

更进一步优选地，所述PBS结合缓冲液的pH为7.2。

优选地，步骤S2所述Tris的摩尔浓度为15～25mM。

更优选地，步骤S2所述Tris的摩尔浓度为20mM。

优选地，步骤S2所述Tris的pH为8.5～10。

优选地，步骤S1所述蛋白酶为木瓜蛋白酶或无花果蛋白酶中的任意一种或两种。

更优选地，步骤S1所述蛋白酶为木瓜蛋白酶。

更进一步优选地，步骤S1所述蛋白酶为固定化木瓜蛋白酶。

优选地，步骤S2所述透析为用PBS结合缓冲液进行透析。

优选地，步骤S2所述透析后得到的片段经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定。

具体优选地，步骤S1所述微囊藻毒素抗体IgG的制备方法为：复苏微囊藻毒素杂交瘤细胞株，培养得到细胞悬液，注射入小鼠腹腔内，解剖小鼠腹部收集腹水；将腹水上protein G亲和柱纯化，用Glycine-HCl缓冲液洗脱，收集洗脱峰，获得高纯度的单克隆抗体IgG组分，用PBS透析缓冲液透析以保存IgG。

优选地，所述Glycine-HCl洗脱缓冲液中Glycine的摩尔浓度为0.05～0.15M。

更优选地，所述Glycine-HCl洗脱缓冲液中Glycine的摩尔浓度为0.1M。

优选地，所述Glycine-HCl洗脱缓冲液的pH为2.5～3。

更优选地，所述Glycine-HCl洗脱缓冲液的pH为2.7。

优选地，所述PBS透析缓冲液的中PB的摩尔浓度为10～30mM，NaCl的摩尔浓度为100～300mM，EDTA二钠盐的摩尔浓度为2～5mM。

更优选地，所述PBS透析缓冲液的中PB的摩尔浓度为20mM，NaCl的摩尔浓度为150mM，EDTA二钠盐的摩尔浓度为2mM。

具体优选地，步骤S1所述用蛋白酶酶切得到酶切产物的方法为：向IgG溶液中加入木瓜蛋白酶和半胱氨酸，混匀，调节反应溶液pH，孵育，离心分离木瓜蛋白酶和酶解产物，收集滤液，获得抗体酶切产物，用PBS结合缓冲液透析以保存酶切产物。

优选地，IgG溶液的浓度为8～12mg/mL。

更优选地，IgG溶液的浓度为10mg/mL。

优选地，木瓜蛋白酶的浓度为0.2～0.3mg/mL。

更优选地，木瓜蛋白酶的浓度为0.25mg/mL。

优选地，半胱氨酸的摩尔浓度为20～30mM。

更优选地，半胱氨酸的摩尔浓度为25mM。

优选地，调节反应溶液pH至6～8。

更优选地，调节反应溶液pH至7。

优选地，所述孵育的温度为37℃。

优选地，所述孵育的时间为5～12h。

更优选地，所述孵育的时间为8h。

优选地，所述离心的条件为：4℃、4000rpm离心1～3min。

本方法旨在提供一种利用抗体IgG，通过凝胶过滤层析一步纯化法进行高效纯化，来制备纯度高、生物活性高的微囊藻毒素抗体Fab片段的制备方法，适用于各种来源的抗体IgG，其制备效果并不依赖于抗体IgG的来源。

本发明还同时保护所述方法制备得到的微囊藻毒素抗体Fab片段。

上述微囊藻毒素抗体Fab片段在检测微囊藻毒素中的应用，也应在本发明的保护范围之内。

上述微囊藻毒素抗体Fab片段在蛋白质三维结构研究中的应用，也应在本发明的保护范围之内。

另外，本发明还提供了一种微囊藻毒素免疫学的检测方法，利用上述微囊藻毒素抗体Fab片段作为抗体，MC-LR-OVA人工抗原作为抗原的组合ELISA检测体系进行检测。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明仅单独使用凝胶过滤层析一步纯化，即可分离获得纯度大于94％的Fab片段，无需再使用其他层析法进行多步纯化，与利用蛋白G亲和层析结合凝胶过滤层析两步纯化法得到Fab片段的方法相比，减少了纯化步骤，且提高了Fab片段的纯度和回收率；

(2)本发明所使用的凝胶过滤层析介质可以使用强碱溶液再生，使用寿命长，且无需使用亲和层析填料亲和纯化，大大降低了成本，可用于长期生产Fab片段；

(3)本发明制备得到的Fab片段对微囊藻毒素-LR的抑制率大于90％，IC₅₀为0.56ng/mL，检测限为0.09ng/mL，IC₂₀～IC₈₀为0.15～2.1ng/mL，可以满足检测要求，为建立微囊藻毒素的免疫分析检测方法提供了核心材料，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1是腹水Protein G亲和层析色谱图及SDS-PAGE电泳图；其中，图a为Protein G纯化腹水色谱图，PFT：流穿蛋白，PE：洗脱蛋白；图b为PFT和PE组分SDS-PAGE电泳图；M为标准分子量蛋白；M左侧为非还原电泳；M右侧为还原电泳。

图2是微囊藻毒素抗体IgG的酶切产物在Hi Load 16/60 Superdex 75凝胶层析柱上的层析色谱图。

图3是Hi Load 16/60 Superdex 75凝胶层析柱纯化产物的SDS-PAGE电泳图；图中，M为标准蛋白分子量；1～5为非还原电泳；其中，1～2为Fc片段、部分酶解碎片和少量未酶解全抗(P2组分)，3～5为Fab片段(P3组分)；6～9为还原电泳，其中，6～7为Fc片段、部分酶解碎片和少量未酶解全抗(P2组分)；8～9为Fab片段(P3组分)。

图4是微囊藻毒素抗体Fab片段的ic-ELISA活性检测结果图。

图5是微囊藻毒素抗体Fab片段ic-ELISA测定微囊藻毒素的标准曲线。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1微囊藻毒素抗体IgG的制备和测序

1、微囊藻毒素抗体IgG的制备和测序

1)腹水的制备

(1)复苏微囊藻毒素杂交瘤细胞株，使用完全培养基扩大培养，提取RNA；

(2)当细胞生长至布满培养皿底部，倒掉完全培养基，抽取3mL基础培养基吹洗培养皿底部的贴壁细胞，使用2.5mL注射器抽取细胞悬液；

(3)选用10～12周龄的雌性小鼠，提前一周向小鼠腹腔注射500μL液体石蜡；

(4)以500μL/只细胞悬液注射小鼠腹腔；

(5)10～12天后可见小鼠腹部隆起，在小鼠将死之前拉颈处死，解剖腹部收集腹水，腹水4℃，12000rpm离心10min，吸取上清于-80℃储存。

2)单克隆抗体IgG的制备

(1)微囊藻毒素腹水从-80℃取出解冻，使用PBS结合缓冲液等倍稀释后，0.22μm膜过滤，收集滤液；

(2)使用蛋白G亲和柱纯化滤液，样品上柱后，用PBS结合缓冲液淋洗2～4个柱体积，再用Glycine-HCl洗脱缓冲液洗脱1～3个柱体积，收集洗脱峰即为微囊藻毒素抗体IgG；

(3)及时将收集的洗脱峰的pH调至中性，用PBS透析缓冲液透析两天，每天4次；

(4)将透析好的溶液用PEG20000浓缩至10mg/mL，液氮速冻，-80℃保存。

2、鉴定结果

将上述RNA反转录为cDNA，用通用引物进行扩增，送公司测序，得到编码微囊藻毒素抗体Fab片段的重链的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，编码其轻链的核苷酸序列如SEQID NO：4所示。翻译得到的微囊藻毒素抗体Fab片段的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，其轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。腹水蛋白G亲和层析色谱图及SDS-PAGE电泳图如图1所示，可以看出，本实施例1得到了高纯度的微囊藻毒素抗体IgG(PE组分)。

实施例2微囊藻毒素抗体IgG的酶解

微囊藻毒素抗体IgG的酶解步骤如下：

(1)取1mL冻存的IgG(10mg/mL)，在水中快速解冻；

(2)取1mL的木瓜蛋白酶(0.25mg/mL)加入离心柱中，4000rpm离心2min，去除储存液，加入2mL PBS结合缓冲液，4000rpm离心2min，弃滤液，重复一次；

(3)抽取2mL PBS结合缓冲液，向其中加入87mg半胱氨酸，混匀，调节pH至7.0；

(4)将柱子下方用堵上，向其中加入2mL上述溶液，37℃摇床活化10min后，4000rpm离心2min，弃滤液；

(5)向抗体中加入44mg半胱氨酸，混匀，调节pH至7.0左右；

(6)柱子下方重新堵上橡胶帽，加入上述抗体，37℃摇床孵育8h；

(7)取出柱子，4000rpm离心2min，收集滤液即为酶解样品；

(8)酶解样品用PBS结合缓冲液透析1天，一共4次。

实施例3微囊藻毒素抗体Fab片段的制备

1、微囊藻毒素抗体Fab片段的制备方法

(1)取微囊藻毒素抗体IgG的酶切产物上Hiload 16/60 Superdex 75pg凝胶层析柱，样品上柱后用PBS结合缓冲液冲洗1个柱体积，再用超纯水冲洗1个柱体积，收集切换超纯水后的目的蛋白峰，即为Fab片段；

(2)将收集溶液用PBS结合缓冲液透析2天，每天4次；

(3)透析好的溶液用PEG 20000浓缩至10mg/mL，液氮速冻，-80℃保存。

2、鉴定方法

目的蛋白峰测定蛋白浓度，将所测浓度乘以体积计算Fab片段的质量。理论上，一个IgG有两个Fab片段和一个Fc片段组成，因此10mg IgG应产生6.67mg Fab片段。将得到的Fab片段质量除以理论质量，即可得到Fab片段的回收率。作SDS-PAGE，用凝胶成像系统扫描，使用Image Lab软件计算目标蛋白纯度。

3、结果

微囊藻毒素抗体IgG的酶切产物在Hi Load 16/60 Superdex 75凝胶层析柱上的层析色谱图如图2所示，PBS缓冲液作为流动相时，展现2个蛋白峰(P1、P2)；流动相切换为超纯水后，在电导下降处出现第3个蛋白峰(P3)。

Hi Load 16/60 Superdex 75凝胶层析柱纯化产物经SDS-PAGE电泳分析结果图如图3所示，可以看出，P2组分(1～2)中约40kDa的条带在还原电泳(6～7)中为25kDa上方的一条带，判断为Fc片段，另外还有少量酶解碎片及未酶解的IgG；P3组分(3～5)为37kDa左右的条带，对应还原泳道(8～9)为25kDa的上下两条带，判断为Fab片段，即P3组分主要为Fab片段。经Image Lab软件分析显示，Fab片段的纯度大于94％。经浓缩、浓度和体积测定，20mgIgG得到了6.3mg Fab片段，其回收率为51％。而利用蛋白G亲和层析结合凝胶过滤层析两步纯化法得到的Fab片段的回收率仅为37％，纯度为90％。可以看出，本发明凝胶过滤层析柱一步纯化法得到的Fab片段的纯度和回收率均高于两步纯化法，本发明的一步纯化法减少了纯化步骤，同时提高了Fab片段的纯度和回收率。

实施例4微囊藻毒素单克隆抗体Fab片段的ELISA活性检测

1、ELISA活性检测方法

(1)将MC-LR-OVA人工抗原用包被液稀释至1μg/mL的浓度，包被96孔酶标板，每孔加入100μL，37℃温育过夜；

(2)弃去包被液，洗涤2次；

(3)每孔加入120μL封闭液(5％脱脂奶粉)，37℃封闭30min；

(4)弃去封闭液，拍板，37℃烘干备用；

(5)用PBST 1：500倍梯度稀释抗体Fab片段，用PBST 1：1000倍梯度稀释腹水，并将微囊藻毒素MC-LR稀释至1000ng/mL；

(6)1列加50μL PBST/孔，另一列加50μL MC-LR稀释液/孔，每行加入50μL抗体Fab片段稀释液，或每行加入50μL腹水稀释液，在37℃温育40min，洗涤5次，拍板；

(7)加入羊抗鼠二抗-HRP(4000倍稀释)，37℃温育30min，洗涤5次，拍板；

(8)加入显色液显色10min；

(9)加入50μL 10％H₂SO₄终止反应，并在450nm处读取OD值。

2、检测结果

微囊藻毒素抗体Fab片段的ic-ELISA活性检测结果如图4所示，结果显示：微囊藻毒素抗体Fab片段对微囊藻毒素-LR的识别性能良好，其抑制率为99％，优于腹水对微囊藻毒素-LR的抑制活性(抑制率91％)。故本发明方法得到的微囊藻毒素抗体Fab片段保持了良好的生物学活性，可为后续建立MC-LR快速免疫分析方法提供材料。

实施例5微囊藻毒素单克隆抗体Fab片段的ELISA免疫检测方法的建立

1、ELISA标准曲线的建立

(1)将MC-LR-OVA人工抗原和微囊藻毒素Fab片段，采用棋盘滴定法确定最优包被原工作浓度和抗体Fab片段稀释倍数，其中包被原用包被液从1μg/mL倍比稀释6个梯度，抗体Fab片段从500倍起倍比稀释7个梯度；

(2)用不同浓度的微囊藻毒素-LR标准品溶液做实验溶液，其浓度从1μg/mL起10倍稀释7个梯度，采用3组平行实验(n＝3)；

(3)采用间接ELISA方法：将包被原用pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释到0.5μg/mL包被酶标板，100μL/孔，37℃温育过夜；弃去包被液，洗涤2次；每孔加入120μL封闭液(5％脱脂奶粉)，37℃封闭30min；弃去封闭液，拍板，37℃烘干备用；用PBST稀释抗体Fab片段至2000倍，从第一孔开始向下依次加入配好的MC-LR标准溶液，然后每孔加入50μL稀释好的Fab片段，37℃孵育40min，洗涤5次；每孔加入100μL HRP-羊抗兔IgG(5000倍稀释)，37℃孵育30min，洗涤5次；每孔加入100μL底物TMB-过氧化氢溶液，37℃显色10min，每孔加入50μL10％的H₂SO₄终止反应；

(4)用酶联免疫检测仪测定各孔A₄₅₀nm的吸收值，以吸光值为纵坐标，以标准品溶液浓度的对数值(Log)为横坐标，应用OriginPro 8.5软件四参数对数函数进行曲线拟合。

四参数对数函数按下式计算：

y＝(A-D)/[1+(x/C)B]+D

其中A和D分别代表吡哌酸标准品浓度最小和最大时的吸光值，C为中点浓度；当标准品浓度等于C时的吸光值为(A+D)/2，正处于曲线的拐点处，半抑制浓度为IC₅₀，B表示曲线的陡峭程度，称斜率因子；以10％的抑制浓度为最低检测限(LOD)，以20％～80％的抑制浓度(IC₂₀～IC₈₀)为检测范围。

2、检测结果

微囊藻毒素抗体Fab片段的标准曲线如图5所示，其IC₅₀为0.56ng/mL，LOD为0.09ng/mL，IC₂₀～IC₈₀为0.15～2.1ng/mL。因此，本发明采用蛋白酶水解、凝胶过滤层析一步纯化得到的微囊藻毒素Fab片段可以满足检测要求，可用于微囊藻毒素快速免疫检测方法的建立。

以上具体实施方式为便于理解本发明而说明的较佳实施例，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 一种微囊藻毒素抗体Fab片段的制备方法和应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 211

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Ala Ser Ala Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Arg Phe Pro Gly Asn Lys Leu

1 5 10 15

Asp Tyr Met Gly Tyr Ile Ser Asn Asn Lys Gly Ser Thr Asp Tyr Asn

20 25 30

Pro Ser Leu Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn

35 40 45

Gln Tyr Tyr Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr

50 55 60

Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Ile Asp Tyr Arg Gly Phe Asp Asn Trp Gly

65 70 75 80

Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser

85 90 95

Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val

100 105 110

Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

115 120 125

Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

130 135 140

Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro

145 150 155 160

Ser Ser Pro Arg Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro

165 170 175

Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly

180 185 190

Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile

195 200 205

Phe Pro Pro

210

<210> 2

<211> 205

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Ala Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Ser Pro Arg Glu Thr

1 5 10 15

Val Thr Leu Thr Cys Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Asn Asn Gln Lys Asn

20 25 30

Tyr Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly Leu Ile Gly

35 40 45

Trp Ala Phe Val Pro Ala Ser Phe Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys

50 55 60

Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala Asn Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys

65 70 75 80

Gln Gln Tyr Tyr Ser Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu

85 90 95

Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ser Thr Pro Thr Leu Thr Val Phe Pro

100 105 110

Pro Ser Ser Glu Glu Leu Lys Glu Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu

115 120 125

Ile Ser Asn Phe Ser Pro Ser Gly Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asn

130 135 140

Gly Thr Pro Ile Thr Gln Gly Val Asp Thr Ser Asn Pro Thr Lys Glu

145 150 155 160

Gly Asn Lys Phe Met Ala Ser Ser Phe Leu His Leu Thr Leu Arg Gln

165 170 175

Trp Arg Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Val Thr His Glu Gly

180 185 190

Asp Thr Val Glu Lys Ser Leu Ser Pro Ala Glu Cys Leu

195 200 205

<210> 4

<211> 633

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gcctccgcct actggacctg gatccggaga ttcccaggga ataaacttga ctacatgggg 60

tacataagta acaacaaagg tagcactgac tacaatccat ctctcaaaag tcgaatctcc 120

atcactcgag acacatccaa aaaccagtac tacctgcagt tgaattctgt gactactgag 180

gacacagcca catattactg tgcaagatat atcgactacc gaggcttcga caactggggc 240

caaggcacca ctctcacagt ctcctcagcc aaaaccacac ctcctagcgt gtaccctctg 300

gctcctggat ctgccgctca gaccaatagc atggtcacac tgggctgcct ggtcaagggc 360

tatttccctg agcctgtgac cgtgacctgg aactctggct ctctgtctag cggcgtgcac 420

acctttccag ccgtgctgca gagcgatctg tacaccctgt ccagcagcgt gaccgtgcct 480

agctctccta gacctagcga gacagtgacc tgcaacgtgg cccatcctgc cagcagcacc 540

aaggtggaca agaaaatcgt gcccagagac tgcggctgca agccctgcat ctgtaccgtg 600

cctgaagtgt ccagcgtgtt cattttccca cct 633

<210> 5

<211> 615

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gctgttgtga ctcaggaatc tgcactcacc acatcacctc gcgaaacagt cacactcact 60

tgtcagagcc ttttatatag taacaatcaa aagaactact gggtccaaga aaaaccagat 120

catttattca ctggtctaat aggttgggca ttcgttcctg cctcattctc aggctccctg 180

attggagaca aggctgccct caccatcaca ggggcgaacg atgaggcaat atatttctgt 240

cagcaatatt atagctttcc gtacacgttc ggtggaggaa ccaaactgac tgtcctaggc 300

cagcctaaga gcacccctac actgaccgtg tttccaccta gcagcgagga actgaaagag 360

aacaaggcca cactcgtgtg cctgatcagc aacttcagcc ctagcggagt gaccgtggcc 420

tggaaggcta atggcacccc tatcacacag ggcgtcgaca ccagcaatcc caccaaagag 480

ggcaacaagt ttatggccag cagcttcctg cacctgaccg tcggacaatg gcggatgagc 540

agcactctga ctctgactaa ggtgacccac gagggcgaca ccgtggaaaa gtctctgtct 600

cctgccgagt gcctg 615

Claims

1.一种微囊藻毒素抗体Fab片段，其特征在于，包括重链和轻链，其重链的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示，其轻链的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。

2.一种编码微囊藻毒素抗体Fab片段的基因，其特征在于，编码其重链的核苷酸序列如SEQIDNO：3所示，编码其轻链的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示。

3.一种权利要求1所述微囊藻毒素抗体Fab片段的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.将包含权利要求1所述微囊藻毒素抗体Fab片段的序列的微囊藻毒素单克隆抗体IgG用木瓜蛋白酶酶切得到酶切产物；

S2.将步骤S1的酶切产物经Superdex75凝胶过滤层析柱进行一步纯化，具体的，样品上柱后先使用PBS缓冲液冲洗，再使用超纯水冲洗，透析，即可得到Fab片段。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤S2所述PBS缓冲液中PB的摩尔浓度为大于或等于5mM，NaCl的摩尔浓度为大于或等于10mM，pH为小于或等于8。

5.权利要求3～4所述方法制备得到的微囊藻毒素抗体Fab片段在检测微囊藻毒素中的应用。

6.一种微囊藻毒素免疫学的检测方法，其特征在于，利用权利要求1所述的微囊藻毒素抗体Fab片段作为抗体，MC-LR-OVA人工抗原作为抗原进行检测。