CN112500490B

CN112500490B - 一种抗左旋氧氟沙星抗体的F(ab)2片段及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN112500490B
Application number: CN202011097526.8A
Authority: CN
Inventors: 沈兴; 鲍虹蕾; 雷红涛; 甘庆庆; 徐振林; 杨金易; 孙远明
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2020-10-14
Filing date: 2020-10-14
Publication date: 2022-05-03
Anticipated expiration: 2040-10-14
Also published as: CN112500490A

Abstract

本发明公开了一种抗左旋氧氟沙星抗体的F(ab)₂片段，所述F(ab)₂片段具有通过二硫键连接在一起的两个Fab部分，每个Fab部分包含轻链和重链Fd部分，所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，所述重链Fd部分如SEQ ID NO:4所示。本发明通过胃蛋白酶酶解，采用两步纯化法纯化酶解产物，首次获得抗左旋氧氟沙星抗体F(ab)₂。本发明方法流程简洁，操作简单，高产出，所述抗左旋氧氟沙星抗体的F(ab)₂片段对左旋氧氟沙星的半抑制浓度为0.33ng/mL，检测限为0.04ng/mL，检测范围为0.05～2.15ng/mL，具有较大的应用前景。

Description

一种抗左旋氧氟沙星抗体的F(ab)2片段及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及食品安全检测技术领域，更具体地，涉及一种抗左旋氧氟沙星抗体的F(ab)₂片段及其制备方法和应用。

背景技术

氧氟沙星(Ofloxacin，OFL)是第三代人工合成的广谱氟喹诺酮类抗菌药，以细菌的脱氧核糖核酸促旋酶为作用靶点，通过抑制其合成，阻断DNA复制，从而对革兰氏阳性菌和大多数的革兰氏阴性菌造成不可逆的损伤，是我国水生环境中最常检测到的氟喹诺酮药物之一。为保障动物食品质量安全和公共卫生安全，农业部第2292号公告规定停止在食品动物中使用包括氧氟沙星在内的4种兽药。现有检测方法中，免疫分析方法以其特有的简单快速、灵敏度高、特异性强、成本低、样品用量少等优势，成功运用于现场快速筛查。

但在免疫分析方法中，经常会出现抗体的恒定区与待测物发生非特异性相互作用的现象，而F(ab)₂片段缺少恒定区的抗原结合片段可以很好地规避了这一现象。F(ab)₂片段由轻链和重链Fd片段(VH-CH1结构域)组成，仅切除抗体恒定区(Fc)，保留了抗体的抗原结合部位和铰链区，维持了抗体原有的构象，在免疫分析方法建立及活性机制研究中有广泛应用价值。

目前制备天然抗体片段的方法主要为酶解法，是利用蛋白酶酶解全抗，将全抗片段化，这种方法具有工艺简便、酶解后片段活性高、得率高的特点。而不同酶解条件会产生大小不同的抗体片段，给实际纯化带来不同程度的困难。而纯化步骤的增加和策略不当会降低蛋白得率以及活性。专利CN108727502A公开了一种蛋白酶酶切和两步纯化制备左旋氧氟沙星抗体Fab片段的方法，但是目前还未见有针对抗左旋氧氟沙星抗体的F(ab)₂片段纯化方法的相关报道，也没有基于 F(ab)₂片段特异性检测左旋氧氟沙星的报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种利用蛋白酶酶解和两步纯化制备抗左旋氧氟沙星抗体F(ab)₂片段的方法。本发明运用一种胃蛋白酶酶解的策略和凝胶过滤层析两步纯化工艺，首次获得抗左旋氧氟沙星抗体F(ab)₂片段，采用该新型纯化工艺制备得到的抗体F(ab)₂片段同时具备高灵敏度的性能，为建立抗左旋氧氟沙星的免疫检测方法和免疫分析机制研究提供了核心原材料，具有广阔的发展前景。

本发明的第一个目的在于提供一种抗左旋氧氟沙星抗体的F(ab)₂片段。

本发明的第二个目的在于提供所述抗左旋氧氟沙星抗体的F(ab)₂片段的制备方法。

本发明的第三个目的在于提供所述抗左旋氧氟沙星抗体的F(ab)₂片段的应用。

本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：

一种抗左旋氧氟沙星抗体的F(ab)₂片段，所述F(ab)₂片段具有通过二硫键连接在一起的两个Fab部分，每个Fab部分包含轻链和重链Fd部分，所述轻链的氨基酸序列如SEQID NO:3所示，所述重链Fd部分如SEQ ID NO:4所示。

一种编码权利要求1所述抗左旋氧氟沙星抗体的F(ab)₂片段的核苷酸序列，其特征在于，编码轻链的序列如SEQ ID NO:1所示，其编码重链Fd部分的序列如SEQ ID NO:2所示。

一抗左旋氧氟沙星抗体的F(ab)₂片段的制备方法，包括以下步骤：

S1.提供抗左旋氧氟沙星单克隆抗体IgG，用胃蛋白酶酶解抗左旋氧氟沙星单克隆抗体IgG；

S2.调节pH至中性，终止酶解反应；

S3.将酶解产物先凝胶过滤层析，再经亲和层析两步纯化后，得到F(ab)₂片段。

本发明采用胃蛋白酶酶解的策略和凝胶过滤层析与蛋白亲和层析结合的两步纯化工艺，首次获得抗左旋氧氟沙星抗体F(ab)₂。

优选地，所述为胃蛋白酶的pH为2.4～2.8。

优选地，步骤S1所述酶解时间为0.5～1.5h。

更优选地，所述胃蛋白酶的pH为2.8，所述酶解时间为0.5h。

优选地，所述胃蛋白酶酶与抗体比例为1:8～12(w/w)。

更优选地，所述胃蛋白酶酶与抗体比例为1:10(w/w)。

优选地，步骤S3中，所述凝胶过滤层析为采用Superdex 200进行凝胶过滤层析。

优选地，步骤S3中，所述亲和层析采用蛋白A进行亲和层析。

具体地，步骤S3中，所述两步纯化法是指通过凝胶过滤层析及蛋白A亲和层析得到高纯度的F(ab)₂片段，包括如下步骤：酶切反应液经过凝胶过滤层析后收集对应峰产物进行蛋白A亲和层析，得到纯度高的F(ab)₂片段。

优选地，步骤S3所述凝胶过滤层析流速为0.7～0.9mL/min(优选0.8 mL/min)，系统压力0.2～0.4MPa(优选0.3MPa)。对于分子量差异较大的的凝胶过滤层析，缓冲液的流速一般设置为1mL/min，即可实现对不同分子量蛋白的分离纯化。但在本发明中，蛋白分子量差异较小，1mL/min的缓冲液流速无法有效将相近分子量蛋白进行分离。因此，降低流速至0.8mL/min可以提高对相近分子量蛋白的分离纯化。

优选地，步骤S3所述亲和层析为采用蛋白A预装柱进行亲和层析。

优选地，步骤S3所述亲和层析流速为0.8～1.2mL/min(优选0.8mL/min)，系统压力0.2～0.4MPa(优选0.3MPa)。

本发明还请求保护所述抗左旋氧氟沙星抗体的F(ab)₂片段在检测喹诺酮类抗生素中的应用。

优选地，所述喹诺酮类抗生素为左旋氧氟沙星。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明首次提供了一种抗左旋氧氟沙星抗体的F(ab)₂片段，本发明采用胃蛋白酶酶解的策略和凝胶过滤层析与蛋白A亲和层析结合的两步纯化工艺，首次获得抗左旋氧氟沙星抗体F(ab)₂。本发明的F(ab)₂片段纯化流程简洁，操作简单，高产出，制得的抗左旋氧氟沙星F(ab)₂片段用于ELISA检测时，灵敏度高，所述抗左旋氧氟沙星抗体的F(ab)₂片段对左旋氧氟沙星的半抑制浓度为0.33ng/mL，检测限为0.04ng/mL，检测范围为0.05～2.15ng/mL，为建立抗左旋氧氟沙星的免疫检测方法提供了核心原材料，具有较大的应用前景。

附图说明

图1为抗左旋氧氟沙星抗体腹水亲和亲和色谱。

图2为抗左旋氧氟沙星抗体腹水亲和纯化SDS-PAGE电泳图。

图3为抗左旋氧氟沙星抗体酶解结果电泳图。(a)各酶解条件非还原 SDS-PAGE结果(b)各酶解条件还原SDS-PAGE结果。

图4为抗左旋氧氟沙星抗体F(ab)₂片段S-200纯化结果。(a)凝胶过滤层析峰图；(b)非还原SDS-PAGE结果；(c)还原SDS-PAGE结果。

图5为抗左旋氧氟沙星抗体F(ab)₂亲和层析结果。(a)亲和柱层析峰图； (b)SDS-PAGE结果。

图6为抗左旋氧氟沙星抗体F(ab)₂片段Elisa标准曲线。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

以下实施例包括抗左旋氧氟沙星抗体IgG的制备及可变区测序，抗体酶切，酶切产物经凝胶过滤层析，以及制备得到的左旋氧氟沙星抗体F(ab)₂片段的间接竞争ELISA工作曲线的建立。

实施例1抗左旋氧氟沙星抗体IgG的制备及可变区测序

一、实验操作

1、腹水制备

(1)复苏抗左旋氧氟沙星杂交瘤细胞株(华南农业大学，食品学院，广东省重点实验室制备)，使用完全培养基(gibco1640基础培养基加入6mL gibco 双抗、6mL gibco谷氨酰胺、100mL依科赛胎牛血清)培养；

(2)当细胞生长至充满培养皿底部时，去掉完全培养基，使用基础培养基(gibco1640基础培养)将细胞悬浮，用1mL注射器吸取悬浮细胞；

(3)选用8～12周大小的雌性小白鼠作为实验用鼠，每只小鼠先腹腔注射 500微升液体石蜡，7天后在腹腔注射细胞悬液；

(4)每只小鼠腹腔注射500微升细胞悬浮液，以制备腹水；

(5)腹腔注射7～14天，密切关注小鼠腹部隆起，在小鼠濒死之际，断颈处置，解剖小鼠腹腔，取出腹水于4℃，10000rpm离心10min，取上清于-20℃冻存。

2、抗左旋氧氟沙星IgG制备

(1)抗左旋氧氟沙星腹水于-20℃解冻，PBS(20mM PB，150mM NaCl) 等倍稀释后，用0.22μm滤膜过滤；

(2)使用5mL蛋白G预装柱，对过滤后腹水进行纯化，用PBS上样及平衡柱子，用0.1MpH 2.7Glycine-HCl进行洗脱，收集流穿组分即杂蛋白和洗脱组分即IgG，并用SDS-PAGE进行验证。

(3)将洗脱组分收集后，立刻调节pH至中性，用PBS透析9次。

(4)将透析好的IgG进行超滤浓缩，并以10mg/mL浓度于-20℃冻存。

二、鉴定结果

当细胞生长至充满培养皿底部时，去掉完全培养基，用细胞裂解液裂解细胞并提取RNA，将所提取的RNA反转录成cDNA，用通用引物进行序列扩增，并送公司测序，得到编码抗左旋氧氟沙星Fab片段的轻链的核苷酸序列，如SEQ ID N:1所示；以及编码重链Fd区的核苷酸序列，如SEQ ID N:2所示。翻译得到的轻链和重链氨基酸分别如SEQ ID NO:3和SEQ IDNO:4所示。腹水的蛋白G亲和色谱及SDS-PAGE电泳结果分别如图1和2所示，可以看出在非还原电泳中洗脱峰对应泳道在150kD附近只有一条带，还原电泳中25kD及50kD附近有明显条带分别代表轻链和重链。表明，本实施例1可以得到高纯度抗左旋氧氟沙星 IgG。

实施例2抗左旋氧氟沙星抗体的酶解

1、实验操作

(1)用pH4.0 HCl溶液将胃蛋白酶配置成4mg/mL母液，于-20℃储存；

(2)根据酶与抗体1:10(w/w)的比例吸取胃蛋白酶与抗体混合，分别用 1M HCl溶液调节pH至(2.0、2.4、2.8)，置于37℃恒温摇床，(0.5、1.0、1.5) h；

(3)用NaOH溶液调节酶解混合物至pH7，使得酶解反应终止；

(4)酶切反应产物与原单克隆抗体经SDS-PAGE电泳鉴定反应产物。

2、实验结果

SDS-PAGE凝胶电泳鉴定结果如图3所示：95％以上的抗左旋氧氟沙星抗体已被胃蛋白酶酶解，酶解主要产物为F(ab)₂、Fab片段。通过计算产物浓度，酶切效率为70％左右。

实施例3抗左旋氧氟沙星抗体F(ab)₂片段的凝胶过滤层析

1、实验操作

为将酶解产物中F(ab)₂片段与其他杂质片段按照分子量大小分离开，使用凝胶过滤层析手段纯化的方法如下：

(1)使用结合缓冲液PBS(20mM PB，150mM NaCl)平衡层析柱(Superdex 200，美国GE公司)1.5个柱体积，使用较低流速使不同组分分离更为彻底，设置流速0.8mL/min，系统压力0.3MPa；

(2)将实施例2的酶解产物过层析柱，根据紫外检测器监控280nm蛋白吸收峰，按峰方式收集样品，按每管1mL体积收集流穿的蛋白组分；

(3)SDS-PAGE电泳鉴定收集到的每管蛋白峰。

2、实验结果

根据凝胶过滤层析结果图4(a)显示，酶解产物经过Superdex 200时只出现一个峰，峰形不对称且后半部分一定拖尾，表明酶解产物经过Superdex 200凝胶柱有一定分离效果但分离效果不高。取蛋白峰所对应收集管中样品进行电泳验，证结果如图4(b)(c)。从非还原电泳结果看出，电泳条带分布随收集管编号变大而分子量逐渐降低，说明峰前后分离出的产物是不同的。还原电泳结果中，条带均分布在25kD处，对应F(ab)₂片段的重链Fd区及轻链分子量。F(ab)₂片段分子量大小在100kD附近，结合非还原电泳结果，收集分子量再100kD左右的收集管中产物，进行后续Protein A亲和纯化。

实施例4左旋氧氟沙星抗体F(ab)₂片段的亲和层析

1、实验操作

(1)使用PBS平衡1mL蛋白A预装柱，设置流速为1mL/min，系统压力 0.3MPa，平衡5个柱体积；

(2)将所述峰1组分收集后，根据电泳结果，收集F(ab)₂对应收集管，超滤浓缩至5mL后，使用5mL上样环上样，结合缓冲液淋洗柱子，经紫外检测器监控280nm的蛋白吸收峰，收集流穿的蛋白组分，即为F(ab)₂组分；

(3)待紫外稳定后，使用洗脱缓冲液(0.1M pH 2.4Glycine-HCl)淋洗柱子，经紫外检测器监控收集洗脱下的蛋白组分，即未能结合柱子的组分。对于蛋白亲和纯化的洗脱液pH为2.4，与实施例1中腹水纯化时用到的0.1M pH 2.7 Glycine-HCl相比需要更低的pH，是为了排除F(ab)₂片段挂柱没有洗脱下来的可能，保证蛋白A的流穿液中为F(ab)₂片段。

2、实验结果

结果如图5所示，图5(a)(b)分别为蛋白A亲和层析色谱结果及电泳结果，结合亲和色谱结果和电泳结果可以看出，经过蛋白A纯化只有流穿组分明显而基本无洗脱组分，且非还原电泳结果表明流穿中蛋白分子量在75～100kD附近，还原电泳果表明流穿中蛋白分子量在25kD附近且为两条带。因此，认为蛋白A 流穿组分为F(ab)₂片段，且F(ab)₂片段的纯度可达95％以上。

实施例5左旋氧氟沙星抗体F(ab)₂片段的ELISA检测

ELISA检测方法

(1)将左旋氧氟沙星-OVA人工抗原用包被液稀释至0.125μg/mL的浓度，包被96孔酶标板，每孔加入100μL，37℃温育12h；

(2)弃去包被液，洗涤2次；

(3)每孔加入120μL封闭液(1％鱼胶)，37℃封闭3h；

(4)弃去封闭液，拍板，37℃烘干2h；

(5)用PBST 1:8000倍稀释抗左旋氧氟沙星抗体F(ab)₂片段，并将左旋氧氟沙星稀释至1000，100，10，1，0.1，0.01，0.001ng/mL；

(6)每行加50μL左旋氧氟沙星稀释液(三组平行)，再加50μL抗体F(ab)₂片段稀释液/孔，在37℃温育40min，洗涤5次；

(7)加入羊抗鼠二抗-HRP(4000倍稀释)，37℃温育30min，洗涤5次，拍板；

(8)加入显色液显色10min；

(9)加入50μL 10％H₂SO₄终止反应，并在450nm处读取OD值。

2、实验结果

抗左旋氧氟沙星抗体F(ab)₂片段的间接竞争ELISA标准曲线如图6所示，所述抗左旋氧氟沙星抗体F(ab)₂片段对左旋氧氟沙星的IC₅₀为0.33(ng/mL)；检测限为0.04(ng/mL)；检测范围为0.05～2.15(ng/mL)。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 一种抗左旋氧氟沙星抗体的F(ab)2片段及其制备方法和应用

<141> 2020-10-14

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 716

<212> DNA

<213> 人工序列(Synthetic sequence)

<400> 1

ggctcttgaa tgggtgagtt gatgtcttgt gagtggcctc acaggtatag ctgttatgtc 60

gttcatactc gtccttggtc aacgtgaggg tgctgctcat gctgtaggtg ctgtctttgc 120

tgtcctgatc agtccaactg ttcaggacgc cattttgtcg ttcactgcca tcaatcttcc 180

acttgacatt gatgtctttg gggtagaagt tgttcaagaa gcacacgact gaggcacctc 240

cagatgttaa ctgctcactg gatggtggga agatggatac agttggtgca gcatcagccc 300

gttttatttc cagcttggtc ccccctccga acgtatacat gacctcatta gtttgctgac 360

agtaataggt ggcaacatca tcagcctcca caggattaat ggtgagggtg aagtctgtcc 420

tagacccact gccactgaac ctggcaggga tcccagattt taggttggaa gcacgataaa 480

tgaggagttt gggtggctgt cctggtttct gctggtacca gtgcataaaa ctattgccat 540

aactatcaat agtttcactg gttctgcaag agatggtggc cctctgccct agagacacag 600

ccaaagaagc tggagattgg gtcagcacaa tgtcacctgt ggaacctgga acccagagca 660

gcagcaccca tagcaggagt gtgtctgtct cctggtgaaa aaaccccaca gtggtg 716

<210> 2

<211> 648

<212> DNA

<213> 人工序列(Synthetic sequence)

<400> 2

ggacctgagc tggtgaagcc tgggacttca gtgaaggtat cctgcaaggc ttctggttat 60

gccctcacca gctacaccat gtactgggtg aaacagagcc atggaaagag ccttgagtgg 120

attggatata ttgatcctta caatggtggt actagctaca accagaagtt caagggcaag 180

gccacattga ctgttgacaa gtcctccagc acagcctaca tgcatctcaa cagcctgaca 240

tctgaggact ctgcagtcta ttactgtgca ggatggaata ggtacgacga ggactggggc 300

caaggcacca ctctcacggt ctcctcagcc aaaacgacac ccccatctgt ctatccactg 360

gcccctggat ctgctgccca aactaactcc atggtgaccc tgggatgcct ggtcaagggc 420

tatttccctg agccagtgac agtgacctgg aactctggat ccctgtccag cggtgtgcac 480

accttcccag ctgtcctgca gtctgacctc tacactctga gcagctcagt gactgtcccc 540

tccagcacct ggcccagcga gaccgtcacc tgcaacgttg cccacccggc cagcagcacc 600

aaggtggaca agaaaattgt gcccagggat tgtataagta agcctaaa 648

<210> 3

<211> 238

<212> PRT

<213> 人工序列(Synthetic sequence)

<400> 3

Thr Thr Val Gly Phe Phe His Gln Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp

1 5 10 15

Val Leu Leu Leu Trp Val Pro Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr

20 25 30

Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile

35 40 45

Ser Cys Arg Thr Ser Glu Thr Ile Asp Ser Tyr Gly Asn Ser Phe Met

50 55 60

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr

65 70 75 80

Arg Ala Ser Asn Leu Lys Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

85 90 95

Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Pro Val Glu Ala Asp

100 105 110

Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Asn Glu Val Met Tyr Thr

115 120 125

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro

130 135 140

Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly

145 150 155 160

Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn

165 170 175

Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn

180 185 190

Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser

195 200 205

Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr

210 215 220

Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr His Pro Phe Lys Ser

225 230 235

<210> 4

<211> 223

<212> PRT

<213> 人工序列(Synthetic sequence)

<400> 4

Glu Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Thr

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Leu Thr Ser Tyr

20 25 30

Thr Met Tyr Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asp Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met His Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Gly Trp Asn Arg Tyr Asp Glu Asp Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu

100 105 110

Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala

115 120 125

Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu

130 135 140

Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly

145 150 155 160

Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp

165 170 175

Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro

180 185 190

Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys

195 200 205

Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Ile Ser Lys Pro Lys

210 215 220

Claims

1.一种抗左旋氧氟沙星抗体的F(ab)₂片段，其特征在于，所述F(ab)₂片段具有通过二硫键连接在一起的两个Fab部分，每个Fab部分包含轻链和重链Fd部分，所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，所述重链Fd部分如SEQ ID NO:4所示。

2.一种编码权利要求1所述抗左旋氧氟沙星抗体的F(ab)₂片段的核酸，其特征在于，编码轻链的序列如SEQ ID NO:1所示，其编码重链Fd部分的序列如SEQ ID NO:2所示。

3.权利要求1所述抗左旋氧氟沙星抗体的F(ab)₂片段的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S2.调节pH至中性，终止酶解反应；

S3.将酶解产物先凝胶过滤层析，再经亲和层析两步步纯化后，得到F(ab)₂片段。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述胃蛋白酶的pH为2.4～2.8。

5.根据权利要求3或4所述的制备方法，其特征在于，步骤S1所述酶解时间为0.5～1.5h。

6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述胃蛋白酶酶与抗体比例为1:8～12(w/w)。

7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤S3凝胶过滤层析流速为0.7～0.9mL/min，系统压力0.2～0.4MPa。

8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述亲和层析为采用蛋白A预装柱进行亲和层析。

9.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述亲和层析流速为0.8～1.2mL/min，系统压力0.2～0.4MPa。

10.权利要求1所述的抗左旋氧氟沙星抗体的F(ab)₂片段或权利要求2所述的抗左旋氧氟沙星抗体的F(ab)₂片段的核酸在检测左旋氧氟沙星中的应用。