CN113061611B - 果蝇myc纳米抗体的编码基因及制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了果蝇MYC纳米抗体的编码基因及制备方法和应用，本发明构建了果蝇MYC纳米抗体文库，利用噬菌体展示技术，从该抗体文库中筛选出果蝇MYC纳米抗体，筛选出的果蝇MYC纳米抗体的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，其对应的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，将MYC纳米抗体基因克隆到改造的表达载体，并导入TOP1菌株中，得到MYC纳米抗体的表达载体和菌株。本发明的果蝇MYC纳米抗体的表达载体可方便对于纳米抗体进行检测，且含有本发明的果蝇MYC纳米抗体的表达载体的菌株易于培养，增殖快，其能够无限稳定扩增，可无限提供功能稳定的纳米抗体，可大规模化生产MYC纳米抗体，大幅度降低生产成本。

Description

果蝇MYC纳米抗体的编码基因及制备方法和应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及果蝇MYC纳米抗体的编码基因及制备方法和应用。

背景技术

MYC作为核蛋白类的调控基因，不仅参与了细胞的重要功能活动，如细胞增殖，分化与凋亡，而且涉及人类肿瘤的形成和演进。大量研究表明，在人类肿瘤中可检测到MYC的异常。可见MYC在肿瘤及其他细胞活动中具有普遍意义，在后续基础研究及临床研究中都有极大需求。目前，应用最广泛的抗体是传统抗体，该类抗体是由两条重链和两条轻链组成的四聚体。传统抗体具有亲和力及特异性高的优点，但分子量大(约为150kDa)，结构复杂，生产工艺繁杂且批次不稳定性的缺点，严重影响了该类抗体在基础研究及临床领域的应用。纳米抗体是天然重链抗体的可变区区域(VHH)，单独克隆并表达出来的VHH结构具有与原重链抗体相当的结构稳定性以及与抗原的结合活性，是已知的可结合目标抗原的最小单位。纳米抗体是由比利时科学家于1993年在自然杂志中首次报道，在羊驼外周血液中存在一种天然缺失轻链的抗体，随后在美洲骆驼和羊驼等其他骆驼科动物以及鲨鱼体内也被发现。这种重链抗体只由两条重链组成，不含轻链，它们重链的单个可变区足以识别并结合抗原。纳米抗体具备分子量小，稳定性高及抗原亲和力高的优点；其结构简单，易折叠，可溶性好，能够在细菌和酵母中大量生产。这些优越特性将提高并拓宽抗体在基础研究领域的应用可能性，并且有望实现纳米抗体在诊断和临床治疗中的广泛应用。

传统的MYC抗体通过免疫动物获得，常常出现稳定性差及生产成本高的问题，影响了MYC抗体的应用。但纳米抗体能在微生物中稳定高效表达，可以克服上述问题，因此开发MYC纳米抗体及其制备方法和应用，在基础研究中对MYC的检测有广阔的前景。

发明内容

因此，基于以上背景，本发明的目的之一是提供果蝇MYC纳米抗体的编码基因及其氨基酸序列，其可应用于基础研究者对MYC的检测。

本发明的技术方案为：

果蝇MYC纳米抗体编码基因，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。

本发明的目的之二，是提供上述果蝇MYC纳米抗体编码基因的制备方法，其包括如下步骤：

S1：用果蝇胚胎蛋白裂解液免疫羊驼，第3次免疫后抽取羊驼外周血，分离血细胞；提取血细胞总RNA，反转录成cDNA，通过PCR技术扩增得到VHH编码基因；

S2：将VHH编码基因克隆到噬菌体展示载体pADL-10b上，构建VHH噬菌体展示文库；

S3：将纯化的MYC蛋白偶联在磁珠上，通过噬菌体展示技术从文库中富集MYC纳米抗体；

S4：通过ELISA方法筛选结合MYC的纳米抗体阳性单克隆；

S5：将阳性单克隆菌落送测序，获得MYC纳米抗体基因序列。

本发明的目的之三，是提供果蝇MYC纳米抗体，其氨基酸序列如序列表SEQ ID：NO2所示。

本发明的目的之四，是提供果蝇MYC纳米抗体的表达载体，所述表达载体含有上述的MYC纳米抗体的编码基因。

进一步地，所述表达载体为pBAD24-Flag-MYC-His。

本发明的目的之五，是提供果蝇MYC纳米抗体的菌株，其含有上述的MYC纳米抗体的表达载体。

进一步地，所述菌株为TOP1菌株。

其通过热激化的方式将质粒转入菌株中制备而来。

采用上述技术方案，具有的有益效果如下：

本发明提供果蝇MYC纳米抗体的编码基因，其通过3次免疫羊驼后构建VHH噬菌体展示文库，通过富集筛选，得到阳性单克隆菌落，具有更高的特异性和亲和性；且本发明的纳米抗体分子量小，其更易穿透组织细胞，且通过氨基酸序列可以更为方便地对抗体分子进行生化化学标记。

本发明的果蝇MYC纳米抗体的表达载体可方便对于纳米抗体进行检测，且含有本发明的MYC纳米抗体的表达载体的菌株易于培养，增殖快，其能够无限稳定扩增，可无限提供功能稳定的纳米抗体，可大规模化生产MYC纳米抗体，大幅度降低生产成本。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明的纯化的MYC蛋白电泳图；

其中泳道M是蛋白marker，泳道MYC为纯化的MYC蛋白

图2为本发明实施例中筛选前后噬菌体的数量对比柱形图；

图3为本发明表达载体pBAD24-Flag-MYC-His的图谱；

图4为本发明实施例中纯化的MYC纳米抗体电泳图；

其中泳道M是蛋白marker，泳道MYC为纯化的MYC纳米抗体。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。下述实施例中所用未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

本发明提供了果蝇MYC纳米抗体的基因编码及其制备和应用，本发明以果蝇胚胎蛋白裂解液免疫羊驼，构建免疫后的羊驼纳米抗体文库，利用噬菌体展示技术，从该抗体文库中筛选得到果蝇MYC纳米抗体，测序得到此MYC纳米抗体的核苷酸序列，如SEQ ID NO：1所示，其对应的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，将MYC纳米抗体基因克隆到改造的表达载体pBAD24-Flag-His，并导入TOP1菌株中，得到MYC纳米抗体的表达载体和菌株。

本发明中用果蝇胚胎蛋白裂解液免疫羊驼，经过3次免疫后，抽取该羊驼的外周血淋巴细胞，构建了免疫后的纳米抗体文库。将MYC蛋白偶联在磁珠上，利用噬菌体展示技术从构建的文库中筛选MYC特异的纳米抗体及其编码基因，将筛选到的纳米抗体基因克隆到原核表达载体中，从而获得能在大肠杆菌中高效表达的纳米抗体株。

下面将结合具体的实施例，对本发明进行进一步地阐述。

实施例1：果蝇MYC免疫后的羊驼纳米抗体文库构建

(1)将果蝇胚胎蛋白裂解液混合等体积佐剂(购自GERBU公司)，免疫一只羊驼，每两周免疫一次，共免疫3次。

(2)3次免疫结束后，抽取羊驼50ml外周血，用密度梯度离心法(葡聚糖-泛影葡胺)分离血淋巴细胞，用Trizol法提取淋巴细胞总RNA。

(3)按照TAKARA公司的PrimerScript^TM 1st Strand cDNA Synthesis Kit的说明书，将提取的RNA反转录成cDNA。

(4)利用巢式PCR(PCR所用酶为TAKARA公司

Max DNA Polymerase)扩增羊驼重链抗体VHH区域。第一轮反应条件为：98℃，3min；98℃，10s，55℃，10s，72℃，1min，30个循环；72℃，10min。切胶回收大小约700bp的PCR产物。

(5)以回收纯化的DNA片段为模版，进行第二轮PCR。第二轮PCR的反应条件：98℃，3min；98℃，10s，55℃，10s，72℃，30s，16个循环；72℃，10min。回收大小约500bp的DNA片段，该片段即纳米抗体基因片段(VHH)。

(6)用限制性内切酶BglII(购自NEB公司)分别酶切10μg噬菌体展示载体pADL-10b和4μg VHH，分别回收两个片段，并用T4连接酶(购自Thermo Fisher ScientificTM公司)连接两个片段，并纯化连接产物。

(7)取100ng连接产物电激转化感受态TOP1细胞，共转化10管，复苏后涂板，构建MYC免疫后的纳米抗体细菌文库，测定库容量，大小约6.7×10⁷。同时随机挑取20个单克隆，通过PCR对所建文库中纳米抗体基因插入率进行检测。

实施例2：果蝇MYC蛋白特异的纳米抗体的富集过程

(1)按照原核纯化的方式纯化融合了His标签的MYC蛋白，结果图1所示。

(2)取1μg纯化的MYC蛋白与30μl偶联His的磁珠室温孵育30min，使MYC蛋白结合在磁珠上，然后用PBST清洗3次，洗去未结合的MYC蛋白。

(3)往磁珠中加入500μl噬菌体文库(含有5×10¹²个展示免疫羊驼纳米抗体的噬菌体)，室温翻转孵育2h。用PBST清洗25次，洗去没有结合或结合力弱的噬菌体。

(4)用500μl胰蛋白酶(0.25mg/ml)将与MYC特异结合的噬菌体解离下来，向解离下来的噬菌体溶液中加入10μl protease inhibitor cocktail(购自Roche公司)进行中和。

(5)取300μl解离下来的噬菌体溶液感染3ml处于对数生长期的TOP1菌株细胞，37℃孵育30min，之后再加入7ml培养基，30℃培养过夜。第二天纯化噬菌体用于下一轮筛选。

(5)重复上述筛选过程3次，第二轮和第三轮筛选时用于孵育的噬菌体数量降为1×10¹²个。在不断筛选过程，展示有特异结合MYC的纳米抗体的噬菌体被不断富集，结果图2所示，解离下来的噬菌体量越来越多，从而达到从文库中富集MYC纳米抗体的目的。

实施例3：酶联免疫吸附方法(ELISA)筛选MYC特异的纳米抗体阳性单克隆

(1)从上述第三轮筛选后得到的培养过夜的纳米抗体细菌文库中随机挑选10个细菌单克隆，分别接种至LB培养基中，培养至细菌生长对数期，加入终浓度为0.2mM的IPTG，30℃培养过夜，诱导纳米抗体表达。

(2)第二天收集菌体，用1/10菌液体积的CelLytic^TMB Cell Lysis Reagent(购自Sigma公司)裂解细菌获得纳米抗体粗提液。取100μl抗体粗提液加入用MYC蛋白包被好并用3％BSA封闭好的ELISA板中，室温孵育1h。

(3)用PBST清洗3次，每次2min，洗去未结合的蛋白。

(4)加入anti-pIII抗体(1：1000，购自NEB公司)，室温孵育1h。

(5)用PBST清洗3次，每次2min，洗去未结合的抗体。

(6)加入碱性磷酸酶偶联的山羊抗小鼠抗体(1:2000，购自Abcam公司)，室温孵育1h。

(7)用PBST清洗3次，每次2min，洗去未结合的抗体。

(8)每孔加入200μl碱性磷酸酶显色液DNPP(购自Sigma公司)，室温避光显色，不超过30min。

(9)加入50μl 3N氢氧化钠终止反应，在酶标仪上，在405nm波长下，测定吸收值。

(10)以不加纳米抗体粗体液或不加anti-pIII抗体的吸收值设为阴性对照，将大于阴性对照组吸收值的2倍的克隆判定为阳性克隆。扩大培养阳性克隆菌，提取质粒，送测序。

(11)利用MegAlign软件，对测序结果进行分析比对，得到DNA序列。这个抗体核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

实施例4：果蝇MYC纳米抗体在大肠杆菌中的原核表达和纯化

(1)利用PCR技术扩增MYC基因，用内切酶Xho I和Not I分别切割PCR片段和表达载体pBAD24-Flag-His，利用T4连接酶将MYC基因片段克隆至pBAD24-Flag-His表达载体中，获得表达载体pBAD24-Flag-MYC-His，图谱如图3所示。

(2)挑取单克隆接种至含相应抗生素的LB培养基中，37℃培养过夜，第二天按1:100转接菌液到300ml LB培养基，37℃培养至OD600约为0.5时，加入终浓度为0.4mM的IPTG诱导MYC表达，28℃培养过夜。

(3)第二天离心收集菌体，用渗透压法破裂细菌，获得抗体粗提液。

(4)将抗体粗体液通过镍柱，亲和层析纯化抗体。

(5)用20mM的咪唑洗去杂蛋白，最后用250mM的咪唑将抗体洗脱下来。

(6)结果如图4所示，泳道M为蛋白marker，泳道MYC为纯化的MYC纳米抗体。

以上对本发明及其实施方式进行了描述，这种描述没有限制性，上述实施例中所示的也只是本发明的实施方式之一，实际的结构并不局限于此。总而言之如果本领域的普通技术人员受其启示，在不脱离本发明创造宗旨的情况下，不经创造性的设计出与该技术方案相似的结构方式及实施例，均应属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 广东省第二人民医院（广东省卫生应急医院）

<120> 果蝇MYC纳米抗体的编码基因及制备方法和应用

<130> 2021

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 354

<212> DNA

<213> Alpaca

<400> 1

atggcagatg tgcagctgca ggagtctggg ggaggcttgg tgcagcctgg ggggtctctg 60

agactctcct gtgcagcctc tggattcacc ttcgaggcgt atacgatgag ctgggtccgc 120

caggctccag gaaaggggct cgaatgggtc tcagcgatta gtcagggtgg tgccaccact 180

gcctatgcag actccgtgaa gggccgattc accatctcca gagacaacgc caagagcacg 240

ctgtatctgc aaatgacgaa cctgaaacct gaggacacgg ccgtatatta ctgtgcgaag 300

tgggtattta caccatcggt tcttggccag gggacccagg tcaccgtctc cagc 354

<210> 2

<211> 118

<212> PRT

<213> Alpaca

<400> 2

Met Ala Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro

1 5 10 15

Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Glu

20 25 30

Ala Tyr Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Val Ser Ala Ile Ser Gln Gly Gly Ala Thr Thr Ala Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Thr Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Lys Trp Val Phe Thr Pro Ser Val Leu Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Gln Val Thr Val Ser Ser

115

Claims (6)

1.果蝇MYC纳米抗体的编码基因，其特征在于，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。

2.果蝇MYC纳米抗体，其特征在于，所述MYC纳米抗体为氨基酸序列如序列表SEQ IDNO：2所示的纳米抗体。

3.果蝇MYC纳米抗体的表达载体，其特征在于，所述表达载体含有权利要求1所述的MYC纳米抗体的编码基因。

4.根据权利要求3所述的果蝇MYC纳米抗体的表达载体，其特征在于，所述表达载体为pBAD24-Flag-MYC-His。

5.重组表达果蝇MYC纳米抗体的菌株，其特征在于，其含有权利要求3或4所述的MYC纳米抗体的表达载体。

6.根据权利要求5所述的重组表达果蝇MYC纳米抗体的菌株，其特征在于，所述菌株为TOP1菌株。

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