CN117305261B - 一种二氢叶酸还原酶纽结及其突变体 - Google Patents

一种二氢叶酸还原酶纽结及其突变体 Download PDF

Info

Publication number
CN117305261B
CN117305261B CN202311626266.2A CN202311626266A CN117305261B CN 117305261 B CN117305261 B CN 117305261B CN 202311626266 A CN202311626266 A CN 202311626266A CN 117305261 B CN117305261 B CN 117305261B
Authority
CN
China
Prior art keywords
dihydrofolate reductase
kink
segment
sheet layer
sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202311626266.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN117305261A (zh
Inventor
孟子逸
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Zhiyuan Artificial Intelligence Research Institute
Original Assignee
Beijing Zhiyuan Artificial Intelligence Research Institute
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Zhiyuan Artificial Intelligence Research Institute filed Critical Beijing Zhiyuan Artificial Intelligence Research Institute
Priority to CN202311626266.2A priority Critical patent/CN117305261B/zh
Publication of CN117305261A publication Critical patent/CN117305261A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN117305261B publication Critical patent/CN117305261B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0026—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on CH-NH groups of donors (1.5)
    • C12N9/0028—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on CH-NH groups of donors (1.5) with NAD or NADP as acceptor (1.5.1)
    • C12N9/003—Dihydrofolate reductase [DHFR] (1.5.1.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y105/00—Oxidoreductases acting on the CH-NH group of donors (1.5)
    • C12Y105/01—Oxidoreductases acting on the CH-NH group of donors (1.5) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.5.1)
    • C12Y105/01003—Dihydrofolate reductase (1.5.1.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site

Abstract

本发明公开了一种二氢叶酸还原酶纽结及其突变体，属于酶分子构建技术领域。二氢叶酸还原酶纽结的氨基酸序列如SEQ ID No:1所示。二氢叶酸还原酶纽结通过在野生型二氢叶酸还原酶的结构中引入连接结构得到。本发明将蛋白质拓扑工程和定向进化策略有机结合，对二氢叶酸还原酶进行纽结拓扑改造，并在纽结拓扑结构的基础上实施定向进化，得到了具有良好生物活性的二氢叶酸还原酶纽结突变体，同时实现了二氢叶酸还原酶的稳定性提升，其中十个突变体的氨基酸序列分别如SEQ ID No:3‑SEQ ID No:12所示。因此，本发明提供的方案实现了二氢叶酸还原酶稳定性和活性的双重提升，具有重要的应用价值。

Description

一种二氢叶酸还原酶纽结及其突变体
技术领域
本发明涉及酶分子构建技术领域，尤其涉及一种二氢叶酸还原酶纽结及其突变体。
背景技术
自然界在不断进化过程中创造了丰富的功能蛋白酶库，并赋予了它们催化各类化学反应的强大能力。蛋白酶所具有的高效催化性能、底物选择性、立体化学选择性和温和的催化条件等特点，使之有望在绿色化学合成和污染物的降解中发挥不同于传统催化剂的巨大作用。然而，天然蛋白酶的内在不稳定性导致其耐受性较差、容易变性失活的特点，极大地限制了功能酶的广泛应用。因此，对酶分子进行设计改造，提高其稳定性和催化活性，进而提升其工业应用属性，是当前的研究热点也是难点。
目前，对酶分子进行改造的方法主要包括定向进化、理性设计和半理性设计等，均是基于酶的氨基酸序列改造以提高其稳定性或催化活性。其中，定向进化通过模拟自然进化机制，对酶基因进行随机突变和重组，人为制造大量的突变体，然后按照特定的需要和目的给予定向的选择压力，最终筛选出具有期望特征的酶突变体，其可在已知或未知目标蛋白质结构信息及功能机理的情况下，对蛋白酶进行针对性的改造。理性设计和半理性设计则需要掌握酶分子的精确结构信息，理解酶分子结构和功能的关系，对关键区域进行定点突变和随机突变，从而以较高的概率获得催化活性提高的正向突变结果。然而，在酶分子的改造过程中，稳定性和催化活性往往相互制约，即一方的提高会导致另一方的降低。因此，为更好地实现热稳定性和催化活性在进化过程中的平衡，需要更加合理地选择突变位点，或者使用多重策略对酶分子的稳定性和活性进行共进化，或者选择高度稳定的酶骨架作为进化起点。总而言之，高稳定性的酶骨架既具有实际应用的强烈需求，又具有更好的可进化性。拓展高稳定性酶骨架的改造方法，并结合现有改造策略进一步改造酶的催化特性，具有重要的研究意义及应用价值。
二氢叶酸还原酶（dihydrofolate reductase，DHFR）是利用NADPH还原二氢叶酸产生四氢叶酸的氧化还原酶，在机体细胞一碳单位转运、胸腺嘧啶合成以及DNA合成中发挥重要作用。因此，提高二氢叶酸还原酶的稳定性和活性具有非常重要的生物学意义。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了如下技术方案。
本发明第一方面提供了一种二氢叶酸还原酶纽结，通过调整野生型二氢叶酸还原酶中各片段之间的连接顺序，并在相邻片段之间引入连接结构得到；所述野生型二氢叶酸还原酶中各片段按照连接顺序依次包括片段一、片段二、片段三和片段四；所述片段一包括依次连接的β-折叠片层1和α-螺旋A，所述片段二包括依次连接的β-折叠片层2和α-螺旋B，所述片段三包括β-折叠片层3，所述片段四包括依次连接的β-折叠片层4、β-折叠片层5、β-折叠片层6、β-折叠片层7、β-折叠片层8、α-螺旋C和α-螺旋D。
优选地，所述连接结构包括连接结构一、连接结构二和连接结构三；所述二氢叶酸还原酶纽结包括依次连接的片段二、连接结构一、片段四、连接结构二、片段一、连接结构三和片段三。
优选地，大肠杆菌野生型二氢叶酸还原酶的氨基酸序列如SEQ ID No:2所示。对应的大肠杆菌二氢叶酸还原酶纽结的氨基酸序列如SEQ ID No:1所示。
优选地，在大肠杆菌野生型二氢叶酸还原酶中，所述片段一的氨基酸序列为2-35位氨基酸，所述片段二的氨基酸序列为38-54位氨基酸，所述片段三的氨基酸序列为57-71位氨基酸，所述片段四的氨基酸序列为72-159位氨基酸。
本发明提供的二氢叶酸还原酶纽结，N端连接有烟草蚀纹病毒蛋白酶的识别序列。
本发明提供的二氢叶酸还原酶纽结，C端连接有转肽酶A的识别序列。
本发明提供的二氢叶酸还原酶纽结，C端还连接有组氨酸纯化标签HHHHHH。
本发明第二方面提供了如第一方面所述的二氢叶酸还原酶纽结的获得方法，将野生型二氢叶酸还原酶氨基酸序列删除部分氨基酸后依次划分为片段一、片段二、片段三和片段四，所述片段一包括依次连接的β-折叠片层1和α-螺旋A，所述片段二包括依次连接的β-折叠片层2和α-螺旋B，所述片段三包括β-折叠片层3，所述片段四包括依次连接的β-折叠片层4、β-折叠片层5、β-折叠片层6、β-折叠片层7、β-折叠片层8、α-螺旋C和α-螺旋D；调整四个片段的连接顺序并利用连接结构连接相邻两个片段。
本发明第三方面提供了如第一方面所述的二氢叶酸还原酶纽结的表达载体。
本发明第四方面提供了如第一方面所述的二氢叶酸还原酶纽结的突变体。
本发明第五方面还提供了如第四方面所述的二氢叶酸还原酶纽结的突变体的表达载体。
优选地，编号为1-10的十个突变体的氨基酸序列分别如SEQ ID No:3- SEQ IDNo:12所示。
更优选地，编号为1-3的三个突变体分别参照野生型二氢叶酸还原酶氨基酸片段连接顺序转变为对应的三个线型对照，该三个线型对照的氨基酸序列分别如SEQ ID No:13- SEQ ID No:15所示。
优选地，还提供了三个线型对照的表达载体。
本发明的有益效果是：本发明提供的二氢叶酸还原酶纽结及其突变体，通过将蛋白质拓扑工程和定向进化策略进行有机结合，对二氢叶酸还原酶进行纽结拓扑改造，并在纽结拓扑结构的基础上实施定向进化，得到了具有良好生物活性的二氢叶酸还原酶纽结突变体，同时实现了二氢叶酸还原酶的稳定性提升。因此，本发明提供的方案实现了二氢叶酸还原酶稳定性和活性的双重提升，具有重要的应用价值。
附图说明
图1为野生型DHFR与DHFR纽结的三维结构模型及二级结构排布示意图；
图2为野生型DHFR、DHFR纽结及相应DHFR纽结线型对照拆分基因片段的连接方式示意图；
图3为DHFR纽结突变体(knot-DHFR-1~ knot-DHFR-6)的SEC纯化谱图；
图4为DHFR纽结突变体(knot-DHFR-1~ knot-DHFR-10)催化DHF转化为THF的反应动力学曲线及计算得到的比活力示意图；
图5为DHFR纽结突变体(knot-DHFR-1~ knot-DHFR-10)催化DHF转化为THF计算得到的比活力示意图；
图6为DHFR纽结突变体的线型对照(linear-DHFR-1~ linear-DHFR-3)催化DHF转化为THF的反应动力学曲线及计算得到的比活力示意图；
图7为DHFR纽结突变体及相应线型对照经TEV酶切及Srt A偶联制备环状产物的示意图；
图8为DHFR纽结突变体(knot-DHFR-1~ knot-DHFR-3)及相应线型对照(linear-DHFR-1~ linear-DHFR-3)经TEV酶切及Srt A偶联制备环状产物的SDS-PAGE表征示意图；
图9为DHFR纽结突变体(knot-DHFR-1~ knot-DHFR-3)及相应线型对照(linear-DHFR-1~ linear-DHFR-3)的圆二色谱表征示意图；
图10为DHFR纽结突变体(knot-DHFR-1~ knot-DHFR-3)及相应线型对照(linear-DHFR-1~ linear-DHFR-3）经65 oC孵育并复性后催化DHF转化为THF的反应动力学曲线及计算得到的比活力示意图。
具体实施方式
为了更好地理解上述技术方案，下面将结合说明书附图以及具体的实施方式对上述技术方案作详细地说明。
虽然大自然中天然蛋白质多为线性结构，但是依然存在一些具有非线性拓扑结构的蛋白质，如环肽、纽结蛋白、套索肽和蛋白质索烃等。这些天然拓扑蛋白质往往具有丰富的生物活性和独特的功能优势，是进化中自然选择的结果。将拓扑作为独立于氨基酸序列调控之外的独特维度，引入蛋白质工程，有望解决目前蛋白酶应用中的稳定性问题。目前，随着人工拓扑蛋白质的研究进展，拓扑调控在提高蛋白质稳定性方面的显著优势已经被初步阐明，为天然蛋白酶的改造提供了全新的思路。
天然纽结蛋白占据蛋白质数据库中蛋白质总数的1%~2%，是已知案例最多的非线性蛋白质拓扑结构，其中大约90%为蛋白酶，表明纽结结构对这些酶的功能至关重要，这可能与纽结的刚性构象及稳定作用有关。本发明通过重新编辑二氢叶酸还原酶(DHFR)二级结构间的连接关系，人为引入链缠结结构，将其线性骨架改造为纽结结构，构建了单结构域的二氢叶酸还原酶纽结，并结合定向进化对其进一步改造，从而获得稳定性和活性双重提升的二氢叶酸还原酶纽结及其突变体。
本发明实施例提供了二氢叶酸还原酶纽结的获得方法，可以通过调整野生型二氢叶酸还原酶中各片段之间的连接顺序，并在相邻片段之间引入连接结构得到；所述野生型二氢叶酸还原酶中各片段按照连接顺序依次包括片段一、片段二、片段三和片段四；所述片段一包括依次连接的β-折叠片层1和α-螺旋A，所述片段二包括依次连接的β-折叠片层2和α-螺旋B，所述片段三包括β-折叠片层3，所述片段四包括依次连接的β-折叠片层4、β-折叠片层5、β-折叠片层6、β-折叠片层7、β-折叠片层8、α-螺旋C和α-螺旋D。
本发明中，所述连接结构包括连接结构一、连接结构二和连接结构三；所述二氢叶酸还原酶纽结包括依次连接的片段二、连接结构一、片段四、连接结构二、片段一、连接结构三和片段三。
在本发明的一个优选实施例中，大肠杆菌野生型二氢叶酸还原酶氨基酸序列如SEQ ID No:2所示；将大肠杆菌野生型二氢叶酸还原酶氨基酸序列删除部分氨基酸后可划分为如下四个片段：片段一为2-35位氨基酸，片段二为38-54位氨基酸，片段三为57-71位氨基酸，片段四为72-159位氨基酸；调整这四个片段的连接顺序并利用连接结构连接相邻两个片段，得到如下氨基酸连接顺序的二氢叶酸还原酶纽结：片段二-连接结构一-片段四-连接结构二-片段一-连接结构三-片段三，其中，所述连接结构为一段氨基酸序列。
其中，本发明实施例中，连接相邻两个片段的连接结构可以为一段氨基酸序列，其可以根据需要进行设计。比如，如图2所示，连接结构一为GGGE的氨基酸序列，连接结构二为GNPSSSGLV的氨基酸序列，连接结构三为GGGK的氨基酸序列。
本发明实施例中，除了引入连接结构外，还在所述二氢叶酸还原酶纽结的N端引入烟草蚀纹病毒蛋白酶(TEV酶)的识别序列，C端依次引入转肽酶A(Srt A)的识别序列/>以及组氨酸纯化标签HHHHHH。本发明实施例通过上述方法获得的二氢叶酸还原酶纽结，其氨基酸序列如SEQ ID No:1所示。
野生型二氢叶酸还原酶(DHFR)与二氢叶酸还原酶纽结(DHFR纽结，knot-DHFR-0)的三维结构模型及二级结构排布如图1所示。
本发明实施例还提供了二氢叶酸还原酶纽结的表达载体。将编码knot-DHFR-0氨基酸序列的基因片段插入表达载体pQE80L中，经测序确认后用于knot-DHFR-0的表达。
本发明实施例还提供了二氢叶酸还原酶纽结的突变体。具体地，对所构建的knot-DHFR-0进行定向进化，总共表达测试了87个突变体的活性。其中活性较好的10个DHFR纽结突变体(knot-DHFR-1~ knot-DHFR-10)序列如SEQ ID No:3- SEQ ID No:12所示。
另外，为证明本发明构建的DHFR纽结的功能优势及独特拓扑结构，本发明通过将部分DHFR纽结突变体重新参照野生型DHFR转变为线型DHFR的连接顺序，构建了3个DHFR纽结的线型对照，其具有与对应的纽结构建完全一致的氨基酸组成。DHFR纽结线型对照(linear-DHFR-1~ linear-DHFR-3）的氨基酸序列如SEQ ID No:13- SEQ ID No:15所示，分别对应于DHFR纽结突变体knot-DHFR-1~ knot-DHFR-3。根据序列信息通过商业公司进行基因合成，所用载体为表达载体pQE80L。野生型DHFR、DHFR纽结及相应DHFR纽结线型对照中拆分基因片段的连接方式分别如图2所示。
实施例一，二氢叶酸还原酶纽结突变体及相应线型对照的表达。
将纽结构建转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，利用含有100 µg/mL氨苄青霉素钠的2×YT平板在37 oC温度下进行过夜培养。随后挑选单克隆菌落接种至5 mL含有相同抗性的2×YT培养基中，在37 oC震荡培养10-12小时制备种子菌液。将该种子菌液按1:100比例接种至200 mL含有相同抗性的2×YT培养基中，在37 oC震荡培养至OD600在0.5-0.7之间，加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷至终浓度为0.5 mM，转至16 oC表达15-20小时。
实施例二，二氢叶酸还原酶纽结突变体及相应线型对照的纯化。
蛋白质表达结束后，用高速冷冻离心机离心收集菌体(5000 g×15 min)，弃去上清液。将菌体用约30 mL裂解缓冲液A(50 mM磷酸二氢钠，300 mM氯化钠，10 mM咪唑，pH8.0)重悬，并加入β-巯基乙醇至终浓度为10 mM。重悬液在冰水浴条件下用超声波细胞破碎仪超声破碎，随后离心收集上清液(12000 g×45 min)。取上清液与Ni-NTA树脂混合均匀并于4 oC孵育1 h。将该混合液倒入纯化用PD-10重力空柱(Bio-rad)中，待裂解缓冲液A流尽后，用5-10倍树脂体积的洗涤缓冲液B(50 mM磷酸二氢钠，300 mM氯化钠，20 mM咪唑，pH8.0)冲洗树脂以减少非特异性吸附。随后用洗脱缓冲液C(50 mM磷酸二氢钠，300 mM氯化钠，250 mM咪唑，pH 8.0)进行洗脱，收集洗脱液。
蛋白质洗脱液利用快速纯化液相色谱系统(ÄKTA pure，GE Healthcare)和尺寸排阻色谱柱(Superdex 200increase 10/300GL，GE Healthcare)进行进一步纯化，流动相为经过0.22 μm滤膜过滤的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)缓冲液(20 mM Tris，150 mM氯化钠，2 mM二硫苏糖醇，pH 8.0)，流速为0.5 mL/min，通过280 nm的紫外吸收监测蛋白质的流出峰，收集样品进行表征。代表性DHFR纽结突变体（knot-DHFR-1~ knot-DHFR-6）的SEC纯化谱图(横坐标为保留体积(Retention volume)，纵坐标为强度(Intensity))如图3所示。
实施例三，二氢叶酸还原酶纽结突变体的活性表征。
配制磷酸缓冲液(40.1 mM K2HPO4，9.9 mM NaH2PO4，5 mM β-巯基乙醇，pH 7.5)，将还原型辅酶II四钠盐(β-NADPH tetrasodium salt，简写为NADPH)和二氢叶酸(DHF)溶于该缓冲液中，配成20 mM的NADPH浓储液和5 mM的DHF浓储液。进一步将NADPH和DHF浓储液用磷酸缓冲液分别稀释成0.5 mM和0.33 mM的工作液。
用NADPH工作液制备NADPH标准溶液，体积为200 μL，分别含有不同摩尔量的NADPH(0 nmol、10 nmol、20 nmol、30 nmol、40 nmol、60 nmol、100 nmol)。用酶标仪测定不同浓度的NADPH溶液在340 nm的吸光度，通过线性拟合成标准曲线，得到斜率。在透明96孔板中，将待测DHFR样品用磷酸缓冲液稀释成20 nM，体积为100 μL，向其中分别加入40 μL NADPH工作液和60 μL DHF工作液，混合均匀后立刻放入酶标仪中实时监测混合溶液在340 nm处的吸光度。将得到的数据点绘制成动力学曲线，取线性区域计算斜率并分析酶活性。DHFR纽结突变体(knot-DHFR-1~ knot-DHFR-10)催化DHF转化为THF的反应动力学曲线(横坐标为时间Time(s)，纵坐标为吸光度OD340 nm)及计算得到的比活力(Activity)分别如图4和图5所示。进化获得的DHFR纽结突变体(knot-DHFR-1~ knot-DHFR-10)的比活力在70-85 U/mgDHFR之间，远高于野生型DHFR的比活力(约为20 U/mg DHFR，可参见公开文献比如，Angew.Chem., Int. Ed. 2016, 55, 3442-3446；Angew. Chem., Int. Ed. 2019, 131, 11214-11221；Nat. Commun. 2023, 14, 3480；不同次文献中测出来的数值会略有波动)。
实施例四，二氢叶酸还原酶纽结突变体相应线型对照的活性表征。
按照上述相同的方法对DHFR纽结突变体的线型对照进行活性表征。DHFR纽结的线型对照(linear-DHFR-1~ linear-DHFR-3)催化DHF转化为THF的反应动力学曲线(横坐标为时间Time(s)，纵坐标为吸光度OD340 nm）及计算得到的比活力(Activity)如图6所示。将纽结转化为线型对照后，其具有比相应的DHFR纽结突变体更高的比活力，在99~110 U/mg DHFR之间。
实施例五，二氢叶酸还原酶纽结突变体的拓扑结构初步证明。
所采取的策略是将纽结构建和相应的线型对照利用TEV酶切和Srt A偶联进行环化，如图7所示，利用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对环化前后的产物进行表征。由于两者具有完全相同的氨基酸组成，其在SDS-PAGE胶图上所表现出来的蛋白条带位置差异主要源于两者拓扑结构的差异。
首先对纽结构建及相应的线型对照进行TEV酶切，暴露出N端的寡聚甘氨酸，底物浓度为50 μM，与0.05摩尔当量的TEV酶进行混合，加入20×酶切缓冲液(1 M Tris-HCl, 2M NaCl, 20 mM EDTA,100 mM DTT, pH 8)，于4 oC酶切过夜。充分酶切后，向上述溶液中加入0.1摩尔当量的转肽酶A以及10 mM CaCl2于16 oC反应3-5 h。反应结束后，加入10 mMEDTA终止反应。将反应体系加入Ni-NTA亲和层析柱中孵育1 h，收集流出液即为环化产物，继续利用Tris-HCl缓冲液淋洗并逐管收集淋洗液，其主成分也是树脂上非特异性吸附的环化产物。将流出液和淋洗液混合浓缩后得到环化产物。
对于待表征样品，将其稀释成10 μM × 20 μL的体系，向其中加入5×SDS上样缓冲液(250 mM Tris，50%甘油，10%SDS，250 mM β-巯基乙醇，0.05%溴酚蓝)至终浓度为1×，并于98 oC加热10 min后，进行SDS-PAGE表征。DHFR纽结突变体及相应线型对照经TEV酶切及Srt A偶联制备环状产物的SDS-PAGE表征如图8所示(其中C代表反应原料对照，T代表TEV酶切后的产物，S代表Srt A偶联后的产物)。环化前，DHFR纽结突变体的表观分子量远高于相应的线型对照，而环化后，闭环的DHFR纽结突变体的表观分子量略低于相应的由线型对照转化而来的环状DHFR。
实施例六，二氢叶酸还原酶纽结突变体及其线型对照的圆二色谱表征。
将经SEC纯化得到的待测样品用ddH2O稀释至约0.02 mg/mL后，取500 μL加入到10mm光程的石英比色池中，室温扫描样品在190~250 nm范围内的椭圆率，步长为1 nm，采集时间为1 s/点。DHFR纽结突变体及相应线型对照的圆二色谱图(横坐标为波长(Wavelength)，纵坐标为椭圆率([θ]))如图9所示。三种线型对照的圆二色谱图基本相同，与相应的DHFR纽结突变体对比略有差异。
实施例七，二氢叶酸还原酶纽结突变体及其线型对照的热稳定性表征。
将待测蛋白质样品用磷酸缓冲液稀释成50 μM × 100 μL的体系，在65 oC下孵育1 h后置于4 oC冰箱复性5 h。复性结束后用磷酸缓冲液将待测蛋白质样品稀释至20 nM，体积为100 μL，加入透明96孔板中，然后向其中分别加入40 μL NADPH工作液和60 μL DHF工作液，混合均匀后立刻放入酶标仪中实时监测混合溶液在340 nm处的吸光度。将得到的数据点绘制成曲线，取线性区域计算斜率并分析酶活性。DHFR纽结突变体(knot-DHFR-1~knot-DHFR-3)及相应线型对照(linear-DHFR-1~ linear-DHFR-3)经65oC孵育并复性后催化DHF转化为THF的反应动力学曲线(横坐标为时间Time(s)，纵坐标为吸光度OD340 nm)及计算得到的比活力(Activity)如图10所示。65oC孵育前，线型对照的比活力均高于相应的DHFR纽结突变体，而孵育复性之后，DHFR纽结突变体的比活力均高于相应的线型对照。
本发明的创新点在于构建了二氢叶酸还原酶纽结结构，拓展了野生型二氢叶酸还原酶线型的骨架结构，另外在二氢叶酸还原酶纽结结构的基础上进行定向进化，而非现有技术中单纯的对氨基酸序列进行突变进化。主要体现在以下几点：
1. 本发明突破蛋白质线型主链的认知范式，将蛋白质拓扑工程用于天然线型二氢叶酸还原酶的设计改造中，创制了一种新型的二氢叶酸还原酶纽结；
2. 现有技术中，对酶的定向进化策略均是针对于线性的前体，而前体的稳定性极大地影响酶的进化潜力，因此现有技术中采用的进化策略无法有效地提高酶的活性或提高的程度有限。本发明采用的方式是：对二氢叶酸还原酶纽结实施定向进化，获得了活性明显提高的二氢叶酸还原酶纽结突变体；
3.相比于二氢叶酸还原酶纽结突变体的线型对照，本发明提供的二氢叶酸还原酶纽结突变体具有更好的热稳定性，其于65 oC孵育1 h后，具有比相应线型对照更高的活性。
本发明中涉及到的各氨基酸序列如下表中所示。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (11)

1.一种二氢叶酸还原酶纽结，其特征在于，通过调整野生型二氢叶酸还原酶中各片段之间的连接顺序，并在相邻片段之间引入连接结构得到；所述野生型二氢叶酸还原酶中各片段按照连接顺序依次包括片段一、片段二、片段三和片段四；所述片段一包括依次连接的β-折叠片层1和α-螺旋A，所述片段二包括依次连接的β-折叠片层2和α-螺旋B，所述片段三包括β-折叠片层3，所述片段四包括依次连接的β-折叠片层4、β-折叠片层5、β-折叠片层6、β-折叠片层7、β-折叠片层8、α-螺旋C和α-螺旋D；
所述连接结构包括连接结构一、连接结构二和连接结构三；所述二氢叶酸还原酶纽结包括依次连接的片段二、连接结构一、片段四、连接结构二、片段一、连接结构三和片段三；
所述二氢叶酸还原酶纽结的氨基酸序列如SEQ ID No:1所示。
2.如权利要求1所述的二氢叶酸还原酶纽结，其特征在于，所述片段一的氨基酸序列为2-35位氨基酸，所述片段二的氨基酸序列为38-54位氨基酸，所述片段三的氨基酸序列为57-71位氨基酸，所述片段四的氨基酸序列为72-159位氨基酸。
3.如权利要求1所述的二氢叶酸还原酶纽结，其特征在于，所述二氢叶酸还原酶纽结的N端连接有烟草蚀纹病毒蛋白酶的识别序列。
4.如权利要求1所述的二氢叶酸还原酶纽结，其特征在于，所述二氢叶酸还原酶纽结的C端连接有转肽酶A的识别序列。
5.如权利要求1所述的二氢叶酸还原酶纽结，其特征在于，所述二氢叶酸还原酶纽结的C端连接有组氨酸纯化标签HHHHHH。
6.如权利要求1-5任一项所述的二氢叶酸还原酶纽结的获得方法，其特征在于，将野生型二氢叶酸还原酶氨基酸序列删除部分氨基酸后依次划分为片段一、片段二、片段三和片段四，所述片段一包括依次连接的β-折叠片层1和α-螺旋A，所述片段二包括依次连接的β-折叠片层2和α-螺旋B，所述片段三包括β-折叠片层3，所述片段四包括依次连接的β-折叠片层4、β-折叠片层5、β-折叠片层6、β-折叠片层7、β-折叠片层8、α-螺旋C和α-螺旋D；调整四个片段的连接顺序并利用连接结构连接相邻两个片段。
7.如权利要求1-5任一项所述的二氢叶酸还原酶纽结的表达载体。
8.如权利要求1-5任一项所述的二氢叶酸还原酶纽结的突变体，编号为1-10的十个突变体的氨基酸序列分别如SEQ ID No:3- SEQ ID No:12所示。
9.如权利要求8所述的突变体的表达载体。
10.一种野生型二氢叶酸还原酶的突变体，其特征在于，所述突变体分别参照野生型二氢叶酸还原酶氨基酸片段连接顺序转变为对应的三个线型对照，该三个线型对照的氨基酸序列分别如SEQ ID No:13- SEQ ID No:15所示。
11.如权利要求10所述的野生型二氢叶酸还原酶突变体的表达载体。
CN202311626266.2A 2023-11-30 2023-11-30 一种二氢叶酸还原酶纽结及其突变体 Active CN117305261B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202311626266.2A CN117305261B (zh) 2023-11-30 2023-11-30 一种二氢叶酸还原酶纽结及其突变体

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202311626266.2A CN117305261B (zh) 2023-11-30 2023-11-30 一种二氢叶酸还原酶纽结及其突变体

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN117305261A CN117305261A (zh) 2023-12-29
CN117305261B true CN117305261B (zh) 2024-02-23

Family

ID=89250361

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202311626266.2A Active CN117305261B (zh) 2023-11-30 2023-11-30 一种二氢叶酸还原酶纽结及其突变体

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN117305261B (zh)

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH05146291A (ja) * 1991-11-26 1993-06-15 Agency Of Ind Science & Technol 新規なジヒドロ葉酸還元酵素及び改変ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子
WO1994024277A1 (en) * 1993-04-13 1994-10-27 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Protection of human bone marrow from high dose antifolate therapy using mutated human dihydrofolate reductase dna
CN1163619A (zh) * 1994-09-20 1997-10-29 日立化成工业株式会社 肺炎衣原体抗原多肽
CN1225945A (zh) * 1997-12-04 1999-08-18 辉瑞产品公司 编码新胞子虫二氢叶酸还原酶－胸苷酸合成酶的dna
CN1439647A (zh) * 2002-02-21 2003-09-03 本元正阳基因技术股份有限公司 一种突变型二氢叶酸还原酶基因及其在哺乳动物细胞基因表达中的应用
US6642043B1 (en) * 1996-03-12 2003-11-04 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Double mutants of dihydrofolate reductase and methods of using same
CN108866019A (zh) * 2018-07-18 2018-11-23 青岛农业大学 一种重组肺炎链球菌二氢叶酸还原酶的制备方法及其应用
CN116240188A (zh) * 2021-12-08 2023-06-09 中国农业大学 一种热稳定性提高的二氢蝶酸合成酶突变体的制备方法
CN116376859A (zh) * 2023-02-21 2023-07-04 江苏海洋大学 一种二氢叶酸还原酶及其应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008148881A1 (en) * 2007-06-07 2008-12-11 Merck Serono S.A. The puro-dhfr quadrifunctional marker and its use in protein production

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH05146291A (ja) * 1991-11-26 1993-06-15 Agency Of Ind Science & Technol 新規なジヒドロ葉酸還元酵素及び改変ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子
WO1994024277A1 (en) * 1993-04-13 1994-10-27 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Protection of human bone marrow from high dose antifolate therapy using mutated human dihydrofolate reductase dna
CN1163619A (zh) * 1994-09-20 1997-10-29 日立化成工业株式会社 肺炎衣原体抗原多肽
US6642043B1 (en) * 1996-03-12 2003-11-04 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Double mutants of dihydrofolate reductase and methods of using same
CN1225945A (zh) * 1997-12-04 1999-08-18 辉瑞产品公司 编码新胞子虫二氢叶酸还原酶－胸苷酸合成酶的dna
CN1439647A (zh) * 2002-02-21 2003-09-03 本元正阳基因技术股份有限公司 一种突变型二氢叶酸还原酶基因及其在哺乳动物细胞基因表达中的应用
CN108866019A (zh) * 2018-07-18 2018-11-23 青岛农业大学 一种重组肺炎链球菌二氢叶酸还原酶的制备方法及其应用
CN116240188A (zh) * 2021-12-08 2023-06-09 中国农业大学 一种热稳定性提高的二氢蝶酸合成酶突变体的制备方法
CN116376859A (zh) * 2023-02-21 2023-07-04 江苏海洋大学 一种二氢叶酸还原酶及其应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Correlated motion and the effect of distal mutations in dihydrofolate reductase;Thomas H. Rod等;《PNAS》;第100卷(第2期);第6980-6985页 *
Effect of Mutation on Enzyme Motion in Dihydrofolate Reductase;James B. Watney等;《JACS》;第3745-3750页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN117305261A (zh) 2023-12-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN113801862A (zh) 一种海洋链霉菌磷脂酶d突变体及其重组表达菌株的制备方法
Sosa-Peinado et al. Overexpression and biosynthetic deuterium enrichment of TEM-1 β-lactamase for structural characterization by magnetic resonance methods
CN117305261B (zh) 一种二氢叶酸还原酶纽结及其突变体
CN112851771A (zh) 连接核酸与蛋白或肽的方法
CN117106738A (zh) 一种可容纳非天然金属卟啉的细胞色素突变体、人工金属酶及应用
CN113061611B (zh) 果蝇myc纳米抗体的编码基因及制备方法和应用
Greimann et al. Reconstitution of RNA exosomes from human and Saccharomyces cerevisiae: cloning, expression, purification, and activity assays
CN113249349B (zh) 突变型醇脱氢酶、重组载体及其制备方法和应用
CN113430184A (zh) 转氨酶及其在制备西他列汀中的应用
CN114214308A (zh) 一种经半理性改造提升活性的腈水解酶突变体
CN111073925B (zh) 一种基于无序蛋白偶联酶的高效多肽-多肽偶联系统和方法
CN115161296A (zh) 一种刺虾荧光素酶Nluc的突变体及其应用
Jiang et al. Bioinspired genetic engineering of supramolecular assembled formate dehydrogenase with enhanced biocatalysis activities
Park et al. Fusion protein system designed to provide color to aid in the expression and purification of proteins in Escherichia coli
CN110904068A (zh) 一种ck-mb型肌酸激酶同工酶、制备方法及应用
CN115216463B (zh) 具有稳定性的重组胰蛋白酶及其制备方法和应用
US20110269940A1 (en) Self-Assembled Proteins and Related Methods and Protein Structures
CN114196658B (zh) 一种腈水解酶突变体及其在催化合成2-氯烟酸中的应用
CN112430258B (zh) 一种可溶性牛樟芝免疫调节蛋白的编码基因、重组表达载体、工程菌及其应用
CN108220268A (zh) 一种禾谷镰胞菌脂肪酶突变体及其编码基因和工程菌
Ma et al. Optimizing the expression and characterization of a thermostable ssDNA ligase from a Thermus scotoductus bacteriophage TS2126
CN110029094B (zh) 一种突变的肌氨酸氧化酶及其在肌酐检测中的应用
Piatesi et al. Optimized production of the Diels-Alderase antibody 1E9 as a chimeric Fab
RU2630302C1 (ru) Способ очистки рекомбинантного белка, содержащего в своем составе последовательности миелопептидов
CN117603932A (zh) 甲醇脱氢酶MDHBs突变体及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant