CN116376859A - 一种二氢叶酸还原酶及其应用 - Google Patents
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本发明公开了一种二氢叶酸还原酶及其应用，所述二氢叶酸还原酶的氨基酸序列选自SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4。所述二氢叶酸还原酶用于体外生物合成6‑S‑四氢叶酸极大降低了生产成本，消除了副产物处理过程中产生的环境影响。且操作简单，条件温和，耗时较短，转化率和产物纯度均在86%以上，适合产业化应用。
Description
技术领域
本发明涉及精细化工技术领域，尤其涉及了一种二氢叶酸还原酶及其在体外生物合成6-S-四氢叶酸中的应用。
背景技术
L-5-甲基四氢叶酸(L-5-MTHF)是一种新型的叶酸类药物，现已逐渐的将其应用到药物以及食品当中。L-5-MTHF目前已经成为国际市场上一种新型的维生素保健产品。它能够作为食品添加剂和一些营养保健品的主要成分，不产生任何副作用，同时还具有很好的疗效和功能。
叶酸在人体的血液和组织中主要以L-5-MTHF的方式存在，参与人体当中的很多生化反应。L-5-MTHF是叶酸在体内发挥作用的主要形式，不需要经过复杂的酶促反应，就可以直接被人体吸收和利用。叶酸主要由小肠上端吸收，由叶酸代谢生成L-5-MTHF。叶酸又分为单谷氨酸型叶酸和多谷氨酸型叶酸，前者不需要代谢就可以被小肠直接吸收利用，而后者则需要先经过小肠上皮细胞分泌的羧肽酶对其进行分解后才能够被小肠所吸收利用。叶酸被小肠吸收后，在辅酶还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADPH)以及二氢叶酸还原酶的共同作用下还原得到二氢叶酸，二氢叶酸再被还原型辅酶Ⅱ和抗坏血酸还原，代谢生成具有生物活性的THF，最后THF在肝脏当中发生甲基化，生成甲基四氢叶酸最终被人体利用。生化途径的生物活性叶酸涉及一系列酶促反应和辅助因子。吸收的叶酸在肠黏膜细胞代谢过程中减少并甲基化为5-MTHF。甲基供体参与了多项生化过程。它还可以作为供体参与核苷酸的合成，支持DNA的生物合成。
关于L-5-MTHF的报道有很多，但由于它本身具有稳定性差，对氧敏感等缺陷，因此在生产上未得到普遍工业化。叶酸的价格相对较低，以其为原料生产L-5-MTHF将会有广阔的前景，而其中6-S-四氢叶酸作为生产过程中最重要中间体的合成方法则成为重中之重。
6-S-甲基四氢叶酸现有的工艺路线是以叶酸为原料，经还原、拆分等步骤合成而得。化学合成L-5-甲基四氢叶酸钙的方法都存在拆分难，收率低，污染大，产业化困难等诸多问题，因此寻找一条化学合成之外的方法就成为非常有现实意义的探索。
发明内容
发明目的：本发明的第一目的是提供一种用于体外合成6-S-四氢叶酸的二氢叶酸还原酶；本发明的第二目的是提供上述二氢叶酸还原酶编码的基因或核酸；本发明的第三目的是提供上述二氢叶酸还原酶在体外生物合成6-S-四氢叶酸中的应用；本发明的第四目的是提供一种用上述二氢叶酸还原酶体外生物合成6-S-四氢叶酸的方法。
技术方案：本发明所述的二氢叶酸还原酶的氨基酸序列选自SEQ ID NO.1、SEQIDNO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4。
氨基酸序列为SEQ ID NO.1的二氢叶酸还原酶命名为DHFR-1，氨基酸序列为SEQID NO.2的二氢叶酸还原酶命名为DHFR-2，氨基酸序列为SEQ ID NO.3的二氢叶酸还原酶命名为DHFR-3，氨基酸序列为SEQ ID NO.4的二氢叶酸还原酶命名为DHFR-4。
本发明所述的编码上述二氢叶酸还原酶的基因或核酸。
进一步地，所述二氢叶酸还原酶的基因或核酸的核苷酸序列选自SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8。
本发明所述的二氢叶酸还原酶、编码其的基因或核酸在体外生物合成6-S-四氢叶酸中的应用。
本发明所述的一种6-S-四氢叶酸体外生物合成方法，包括以下步骤：
构建含有上述的二氢叶酸还原酶的基因的重组载体，并将重组载体转入大肠杆菌内，培养得到重组大肠杆菌菌液；将重组大肠杆菌菌液裂解，得到二氢叶酸还原酶液；将叶酸、氢氧化钠水溶液和还原剂混合得到二氢叶酸；将二氢叶酸、二氢叶酸还原酶液和辅酶因子混合进行酶促反应，反应结束即得6-S-四氢叶酸。
进一步地，步骤(2)中所述大肠杆菌菌液裂解条件为20000-35000g/min，离心时间为30-60min。
进一步地，还包括二氢叶酸还原酶液的纯化处理，或/和固定化酶处理。
进一步地，纯化处理步骤包括：将重组大肠杆菌菌液裂解后得到的粗酶液流经Ni柱后用不同梯度的咪唑溶液进行洗脱，再使所得含酶量最高的Ni柱洗脱液流经Q柱，随后再用不同梯度的盐溶液(主要成分为KCl)进行洗脱，得到初步纯化的含酶溶液，将初步纯化的含酶溶液进行透析，得纯化酶溶液。
进一步地，制作固定化酶的过程中固定化载体可选择但不限于氨基树脂和环氧树脂；反应体系的pH值为4-9反应时间为1-6h。
进一步地，所述还原剂为锌粉或连二亚硫酸钠。
进一步地，所述辅酶因子为NADH或NADPH，酶促反应的温度为20-45℃，酶促反应的pH值为5-9，酶促反应时间为1-24h。
进一步地，所述辅酶因子与二氢叶酸的质量比为0.1-3：1，所述二氢叶酸还原酶液与二氢叶酸的质量比为0.002-0.01：1。
进一步地，所述酶促反应中还包括葡萄糖和葡萄糖脱氢酶，葡萄糖、二氢叶酸和辅酶因子的质量比为0.4-1：1：0.01-1，，葡萄糖和葡萄糖脱氢酶的质量比为0.001-0.01：1。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下突出的显著优点：本发明公开了一种二氢叶酸还原酶，其用于体外生物合成6-S-四氢叶酸极大降低了生产成本，消除了副产物处理过程中产生的环境影响。且操作简单，条件温和，耗时较短，转化率和产物纯度均在86％以上，适合产业化应用。
附图说明
图1为二氢叶酸的高效液相色谱图。
图2为6-S-四氢叶酸的高效液相色谱图。
图3为本发明的生物催化合成方法制备6-S-四氢叶酸过程中的高效液相色谱图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。
下述实施例中所用载体pET28a为江苏海洋大学实验室保藏、大肠杆菌DE3感受态细胞(CB105)均自天根生化科技有限公司。葡萄糖脱氢酶的氨基酸序列为GenBank：KAF2407874.1。PBS缓冲液制备方法：称取40g NaCl、1g KCl、7.2g Na2HPO4、1.2g KH2PO4溶于800mL蒸馏水中，用HCl调节溶液至7.0，最后加蒸馏水定容至1L即可得50mM PBS缓冲液。
实施例1.叶酸还原为二氢叶酸
取9g叶酸溶解于50ml 15％氢氧化钠水溶液，然后加入2g锌粉应，中控至原料叶酸反应完全，再中和PH至7.5，过滤去除沉淀，得到二氢叶酸溶液，HPLC分析粗产品二氢叶酸纯度为95.2％，重结晶后精制二氢叶酸7.31g，纯度99.2％。
实施例2.二氢叶酸还原为6-S-四氢叶酸
2.1二氢叶酸还原酶的构建
将选用的二氢叶酸还原酶SEQ ID NO.5所示核苷酸序列用无缝克隆方式将其与载体pET28a连接得到重组载体pET28a-DHFR-1，对前述的连接载体采取如下操作：取10μl连接产物加入冰浴的100μl大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞，随后冰浴30min，42℃热激60s，再冰浴5min，向管中加入37℃无抗LB培养液300μl，37℃、200rpm摇床修复1h，随后涂在卡那抗性的固体LB平板上37℃培育，长出菌落后用高压灭菌的牙签挑取单菌落，先在含卡那抗性的LB平板上画线保种用，将相应的菌和板子上的画线区做上对应的记号，然后将牙签置于已加入T7通用引物的20μl PCR Mix体系中搅拌均匀，进行PCR扩增，PCR反应条件为：95℃、15min，94℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸1min，进行30个循环，最后72℃，保温5min，PCR扩增后进行电泳观察结果得阳性克隆，即为含目标酶基因的重组大肠杆菌菌株：pET28a-DHFR-1重组大肠杆菌。
2.2二氢叶酸还原酶的表达
将pET28a-DHFR-1重组大肠杆菌挑取到含卡那抗性的LB培养基中，于37℃下培养OD至0.8左右后加入终浓度0.1mM的IPTG，置于28℃诱导表达16h，然后将菌液以7000g/min离心6min收集菌体，倒掉上清培养基后按菌体重量：PBS溶液＝1g：5ml的比例用20mM PBS溶液将菌体重悬，将重悬后的菌体经高压细胞破碎仪破碎得含酶裂解液，35000g/min离心30min后提取上清液，得到二氢叶酸还原酶DHFR-1的粗酶溶液。
2.3二氢叶酸还原酶的纯化
然后使二氢叶酸还原酶DHFR-1的粗酶溶液经Ni柱，随后用150mM咪唑溶液先进行清洗，然后用500mM咪唑溶液进行洗脱，再将所有含目标酶的Ni柱洗脱液流经Q柱，随后再用200mM的盐溶液先进行清洗，再用1M的盐溶液进行洗脱(主要成分为KCL)进行洗脱，得到初步纯化的含酶溶液，将初步纯化的含酶溶液进行12h透析，最终得到纯化的二氢叶酸还原酶DHFR-1酶溶液。
实施例3酶促反应生成6-S-四氢叶酸
以实施例1制得的二氢叶酸为底物，在50mL玻璃反应瓶中，加入1g底物、1.8gNADPH、7ml 20mM PBS溶液，再向反应瓶中加入3ml(16.7mg)2.3步骤所得的纯化的二氢叶酸还原酶DHFR-1酶溶液开始反应；反应液温度为37℃，控制反应液pH在7.5，搅拌均匀后反应8h。
上述反应完成后，将反应后的溶液进行热失活，过0.22μm的滤膜后可取5μl溶液用高效液相色谱检测，计算其转化率＞98.9％，产率>93.9％，ee值>99％。
实施例4.酶促反应生成6-S-四氢叶酸
将1.8g NADPH换为1.8g NADH，其余步骤及条件同实施例3。
计算产物转化率＞86.4％，产率>80.2％，ee值>99％。
实施例5.酶促反应生成6-S-四氢叶酸
将纯化的二氢叶酸还原酶DHFR-1酶溶液换为2.2步骤所得的二氢叶酸还原酶DHFR-1的粗酶溶液。其余步骤及条件同实施例3。
计算产物转化率＞98.7％，产率>81.5％，ee值>99％。经HPLC检测显示，粗酶溶液会将一部分的底物转化为除产物以外的杂质，不仅会降低产率，也加大了后续产物分离纯化的难度。
实施例6.酶促反应生成6-S-四氢叶酸
将反应时间改为2h。其余步骤及条件同实施例3。
计算产物转化率＞97.5％，产率>92.7％，ee值>99％。
实施例7.酶促反应生成6-S-四氢叶酸
将7ml 20mM PBS溶液换为8.5ml 20mM PBS溶液，3ml(16.7mg)2.2步骤所得的纯化的二氢叶酸还原酶DHFR-1酶溶液换为1.5ml(8.35mg)2.2步骤所得的纯化的二氢叶酸还原酶DHFR-1酶溶液。反应时间改为2h。其余步骤及条件同实施例3。
计算产物转化率＞97.3％，产率>92.5％，ee值>99％。
实施例8.酶促反应生成6-S-四氢叶酸
以实施例1制得的二氢叶酸为底物，在1L玻璃反应瓶中，加入70g底物、126gNADPH、550ml 20mM PBS溶液，再向反应瓶中加入100ml(556.7mg)2.2步骤所得的纯化的二氢叶酸还原酶DHFR-1酶溶液开始反应；反应液温度为37℃，控制反应液pH为7.5，搅拌均匀后反应3h。
上述反应完成后，将反应后的溶液进行热失活，过0.22μm的滤膜后可取5μl溶液用高效液相色谱检测计算其转化率＞96.5％，产率>92.1％，ee值>99％。
实施例9.葡萄糖脱氢酶的表达和纯化
9.1将含有葡萄糖脱氢酶序列的大肠杆菌挑取到含卡那抗性的LB培养基中，于37℃下培养OD至0.8左右后加入终浓度0.1mM的IPTG，置于28℃诱导表达16h，然后将菌液以7000g/min离心6min收集菌体，倒掉上清培养基后按菌体重量：PBS溶液＝1g：5ml的比例用20mM PBS溶液将菌体重悬，将重悬后的菌体经高压细胞破碎仪破碎得含酶裂解液，35000g/min离心30min后提取上清液，得到葡萄糖脱氢酶的粗酶溶液。
9.2然后使葡萄糖脱氢酶的粗酶溶液流经Ni柱，随后用150mM咪唑溶液先进行清洗，然后用500mM咪唑溶液进行洗脱，再将所有含目标酶的Ni柱洗脱液流经Q柱，随后再用200mM的盐溶液先进行清洗，再用1M的盐溶液进行洗脱(主要成分为KCL)进行洗脱，得到初步纯化的含酶溶液，将初步纯化的含酶溶液进行12h透析，最终得到纯化的葡萄糖脱氢酶溶液。
实施例10组合酶促反应生成6-S-四氢叶酸
以实施例1制得的二氢叶酸为底物，在50mL玻璃反应瓶中，加入1g底物、0.5g葡萄糖、0.1g NADPH、7.5ml 20mM PBS溶液，再向反应瓶中加入1.5ml 2.2步骤所得的纯化的二氢叶酸还原酶DHFR-1酶溶液和1ml 9.1步骤所得葡萄糖脱氢粗酶溶液开始反应；反应液温度为37℃，控制反应液pH在7.5，搅拌均匀后反应2h。
上述反应完成后，将反应后的溶液进行热失活，过0.22μm的滤膜后可取5μl溶液用高效液相色谱检测计算其转化率＞97.1％，产率>92.3％，ee值>99％。
实施例11组合酶促反应生成6-S-四氢叶酸
将1ml 9.1步骤所得葡萄糖脱氢粗酶溶液改为9.2所得的纯化的葡萄糖脱氢酶溶液。其余步骤及条件同实施例10。
计算产物转化率＞97.2％，产率>92.3％，ee值>99％。
实施例12固定化酶促反应生成6-S-四氢叶酸
12.1二氢叶酸还原酶的固定化
将氨基树脂用20mM PBS缓冲液清洗3次后过滤，用20mM PBS溶液配制2％戊二醛溶液，将氨基树脂与2％戊二醛混合，比例为氨基树脂：2％戊二醛＝1：4(质量/体积比)，随后在20℃条件下搅拌/振摇1小时，然后过滤获得氨基树脂；用20mM PBS缓冲液清洗3次后过滤，再取约含200mg二氢叶酸还原酶的2.2中制得的纯化的酶溶液与4g氨基树脂混合(蛋白浓度由标准的蛋白含量测定方法测得)，混合后在20℃下以80rpm的转速振摇18小时；然后过滤收集氨基树脂(滤液可用于测定酶的固定化率)，用20mM PBS缓冲液清洗3次后过滤即获得固定化的二氢叶酸还原酶DHFR-1，并将固定化酶填装至罐式反应器中。
12.2固定化酶促反应生成6-S-四氢叶酸
以实施例1制得的二氢叶酸为底物，取1g底物、1.8g NADPH，用10ml 20mM PBS溶液溶解后，将溶液倒入10.1中所述含固定化二氢叶酸还原酶DHFR-1的罐式反应器中开始反应；维持反应温度为37℃，控制反应液pH在7.5，搅拌均匀反应2h。
上述反应完成后，将反应后的溶液过0.22μm的滤膜后可取5μl溶液用高效液相色谱检测计算其转化率＞97.1％，产率>92.3％，ee值>99％。
实施例13.固定化酶促反应生成6-S-四氢叶酸
13.1二氢叶酸还原酶的固定化
将环氧基树脂用20mM PBS缓冲液清洗3次后过滤，再取约含200mg二氢叶酸还原酶的2.2中制得的纯化的酶溶液与8g环氧基树脂混合(蛋白浓度由标准的蛋白含量测定方法测得)，混合后在20℃下以200rpm的转速振摇18小时后静置20小时；然后过滤收集环氧基树脂(滤液可用于测定酶的固定化率)，用20mM PBS缓冲液清洗3次后过滤即获得固定化的二氢叶酸还原酶DHFR-1，将固定化酶填装至罐式反应器中。
13.2固定化酶促反应生成6-S-四氢叶酸
以实施例1制得的二氢叶酸为底物，取1g底物、1.8g NADPH，用10ml 20mM PBS溶液溶解后，将溶液倒入11.1中所述含固定化二氢叶酸还原酶DHFR-1的罐式反应器中开始反应；维持反应温度为37℃，控制反应液pH在7.5，搅拌均匀后反应2h。
上述反应完成后，将反应后的溶液过0.22μm的滤膜后可取5μl溶液用高效液相色谱检测计算其转化率＞98.7％，产率>94.3％，ee值>99％。
实施例14.固定化酶促反应生成6-S-四氢叶酸
以实施例1制得的二氢叶酸为底物，取50g底物、90g NADPH，用500ml 20mM PBS溶液溶解后，将溶液倒入13.1中所述含固定化二氢叶酸还原酶DHFR-1的罐式反应器中开始反应；反应温度为37℃，控制反应液pH在7.5，搅拌均匀后反应6h。
上述反应完成后，将反应后的溶液过0.22μm的滤膜后可取10μl溶液用高效液相色谱检测计算其转化率＞92.3％；产率>90.2％，ee值>99％。
实施例15.固定化酶促反应生成6-S-四氢叶酸
15.1二氢叶酸还原酶的固定化
将环氧基树脂用20mM PBS缓冲液清洗3次后过滤，再取约含200mg二氢叶酸还原酶的2.2中制得的粗酶溶液与8g环氧基树脂混合(蛋白浓度由标准的蛋白含量测定方法测得)，混合后在20℃下以200rpm的转速振摇18小时后静置20小时；然后过滤收集环氧基树脂(滤液可用于测定酶的固定化率)，用20mM PBS缓冲液清洗3次后过滤即获得固定化的二氢叶酸还原酶DHFR-1，并将固定化酶填装至柱式反应器中。
15.2固定化酶促反应生成6-S-四氢叶酸
以实施例1制得的二氢叶酸为底物，取1g底物、1.8g NADPH，用10ml 20mM PBS溶液溶解后，调节溶液pH至7.5，使该溶液流经13.1中含固定化二氢叶酸还原酶DHFR-1的柱式反应器，反应过程控制温度为37℃，控制流经总时长(即反应时间)为1h。
上述反应完成后，将反应后的溶液过0.22μm的滤膜后可取5μl溶液用高效液相色谱检测计算其转化率＞96.5％；产率>92.2％，ee值>99％。
实施例16.固定化酶促反应生成6-S-四氢叶酸
以实施例1制得的二氢叶酸为底物，取50g底物、90g NADPH，用500ml 20mM PBS溶液溶解后，调节溶液pH至7.5，使该溶液流经实施例15.1制得的含固定化二氢叶酸还原酶DHFR-1的柱式反应器，反应过程控制温度为37℃，控制流经总时长(即反应时间)为6h。
上述反应过程中取不同时间点的反应液，将反应后的溶液过0.22μm的滤膜后可取5μl溶液用高效液相色谱检测计算其转化率皆＞92.5％；最终产率>89.6％，ee值>99％。
实施例17.组合固定化酶催化二氢叶酸还原为6-S-四氢叶酸
17.1组合酶的固定化
将环氧基树脂用20mM PBS缓冲液清洗3次后过滤，再取约含200mg二氢叶酸还原酶的2.2中制得的纯化的酶溶液与8g环氧基树脂混合(蛋白浓度由标准的蛋白含量测定方法测得)，混合后在20℃下以200rpm的转速振摇18小时后静置20小时；然后过滤收集环氧基树脂(滤液可用于测定酶的固定化率)，用20mM PBS缓冲液清洗3次后过滤即获得固定化的二氢叶酸还原酶DHFR-1，将固定化酶填装至罐式反应器中。
将环氧基树脂用20mM PBS缓冲液清洗3次后过滤，再取约含100mg葡萄糖脱氢酶的8.1中制得的粗酶溶液与4g环氧基树脂混合(蛋白浓度由标准的蛋白含量测定方法测得)，混合后在20℃下以200rpm的转速振摇18小时后静置20小时；然后过滤收集环氧基树脂(滤液可用于测定酶的固定化率)，用20mM PBS缓冲液清洗3次后过滤即获得固定化的葡萄糖脱氢酶，并将固定化酶填装至上述已填装固定化的二氢叶酸还原酶DHFR-1的罐式反应器中。
17.2组合固定化酶催化二氢叶酸还原为6-S-四氢叶酸
以实施例1制得的二氢叶酸为底物，取50g底物、28g葡萄糖、1g NADPH，用500ml20mM PBS溶液溶解后，将溶液倒入15.1中所述含固定化二氢叶酸还原酶DHFR-1和固定化的葡萄糖脱氢酶的罐式反应器中开始反应；反应温度为37℃，控制反应液pH在7.5，搅拌均匀后反应6h。
上述反应完成后，将反应后的溶液进行热失活，过0.22μm的滤膜后可取5μl溶液用高效液相色谱检测计算其转化率＞95.9％，产率>91.7％，ee值>99％。
实施例18.酶促反应还原二氢叶酸为6-S-四氢叶酸
载体构建与克隆、酶的表达和纯化的操作步骤同实施例2相同，不同的是更改二氢叶酸还原酶的种类，分别将SEQ ID NO.5改为SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ IDNO.8，体外酶催化的反应步骤与实施例3相同，最终反应结果如下：
| 二氢叶酸还原酶 | 转化率％ | 产率％ | ee值％ |
| DHFR-2 | ＞93.1％ | ＞89.2％ | ＞99 |
| DHFR-3 | ＞97.8％ | ＞93.1％ | ＞99 |
| DHFR-4 | ＞95.6％ | ＞90.4％ | ＞99 |
实施例19.固定化酶促反应还原二氢叶酸为6-S-四氢叶酸
载体构建与克隆、酶的表达和纯化的操作步骤同实施例2相同，酶的固定化以及的酶催化的反应步骤都同实施例11相同，不同的是更改二氢叶酸还原酶的种类，分别将SEQID NO.5改为SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8，最终反应结果如下：
| 二氢叶酸还原酶 | 转化率％ | 产率％ | ee值％ |
| DHFR-2 | ＞97％ | ＞90.2％ | ＞99 |
| DHFR-3 | ＞98.2％ | ＞95.6％ | ＞99 |
| DHFR-4 | ＞96.8％ | ＞93.5％ | ＞99 |
Claims (10)
1.一种二氢叶酸还原酶，其特征在于，所述二氢叶酸还原酶的氨基酸序列选自SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4。
2.一种编码权利要求1所述的二氢叶酸还原酶的基因或核酸。
3.根据权利要求2所述的二氢叶酸还原酶的基因或核酸，其特征在于，所述二氢叶酸还原酶的基因或核酸的核苷酸序列选自SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7或SEQ IDNO.8。
4.一种权利要求1所述的二氢叶酸还原酶、权利要求2或3所述的基因或核酸在体外生物合成6-S-四氢叶酸中的应用。
5.一种6-S-四氢叶酸体外生物合成方法，其特征在于，包括以下步骤：构建含有权利要求2或3所述的二氢叶酸还原酶的基因的重组载体，并将重组载体转入大肠杆菌内，培养得到重组大肠杆菌菌液；将重组大肠杆菌菌液裂解，得到二氢叶酸还原酶液；将叶酸、氢氧化钠水溶液和还原剂混合得到二氢叶酸；将二氢叶酸、二氢叶酸还原酶液和辅酶因子混合进行酶促反应，反应结束即得6-S-四氢叶酸。
6.根据权利要求5所述的6-S-四氢叶酸体外生物合成方法，其特征在于，还包括二氢叶酸还原酶液的纯化处理，或/和固定化酶处理。
7.根据权利要求5所述的6-S-四氢叶酸体外生物合成方法，其特征在于，所述还原剂为锌粉或连二亚硫酸钠。
8.根据权利要求5所述的6-S-四氢叶酸体外生物合成方法，其特征在于，所述辅酶因子为NADH或NADPH，酶促反应的温度为20-45℃，酶促反应的pH值为5-9，酶促反应时间为1-24h。
9.根据权利要求5所述的6-S-四氢叶酸体外生物合成方法，其特征在于，所述辅酶因子与二氢叶酸的质量比为0.1-3：1，所述二氢叶酸还原酶液与二氢叶酸的质量比为0.002-0.01：1。
10.根据权利要求5所述的6-S-四氢叶酸体外生物合成方法，其特征在于，所述酶促反应中还包括葡萄糖和葡萄糖脱氢酶，葡萄糖、二氢叶酸和辅酶因子的质量比为0.4-1：1：0.01-1，葡萄糖和葡萄糖脱氢酶的质量比为0.001-0.01：1。
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| CN (1) | CN116376859A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117305261A (zh) * | 2023-11-30 | 2023-12-29 | 北京智源人工智能研究院 | 一种二氢叶酸还原酶纽结及其突变体 |
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2023
- 2023-02-21 CN CN202310142831.1A patent/CN116376859A/zh active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117305261A (zh) * | 2023-11-30 | 2023-12-29 | 北京智源人工智能研究院 | 一种二氢叶酸还原酶纽结及其突变体 |
| CN117305261B (zh) * | 2023-11-30 | 2024-02-23 | 北京智源人工智能研究院 | 一种二氢叶酸还原酶纽结及其突变体 |
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