CN111549014A - 一种产酯酶自诱导培养基及其应用 - Google Patents

一种产酯酶自诱导培养基及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种产酯酶自诱导培养基，配方为：甘油5～13g/L，葡萄糖0.3～1.3g/L，乳糖1～6g/L，胰蛋白胨10～30g/L，酵母浸粉3～13g/L，0.0～0.5g/L MgSO4，17～19g/L Na2HPO4，6～8g/L KH2PO4，2～3g/L NH4Cl，0.5～1.0g/L Na2SO4，痕量元素适量。与现有技术相比，本发明培养基组分及培养条件出发，找到一条既能高效表达外源蛋白，又能实现自动诱导的改进型产酯酶大肠杆菌自诱导培养基，利用改进型自诱导培养基，并采用双温度调控方式，对重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET‑21a‑estsit01进行培养和发酵产酶；本发明的自诱导培养基利用乳糖作为底物诱导目的蛋白表达，具有产酶量高，成本低；重组酯酶细胞的酶活可以达到1684U/L的优点。

Description

一种产酯酶自诱导培养基及其应用
技术领域
本发明涉及一种生物工程技术领域，尤其是涉及一种改进型的重组大肠杆菌工程菌自诱导培养基及其在产酯酶发酵中的应用。
背景技术
酯酶(Esterase,EC 3.1.1.1)是一类具有水解酯键能力的酶。酯键在羧酸酯酶的催化下进行断裂，产生甘油和脂肪酸，合成时能把酸的羧基与醇的羟基脱水缩合，形成酯类及其他芳香类物质，且在催化反应过程中不需要任何辅酶的协助。
酯酶的来源广泛，存在于动物、植物和微生物中。其中来源于微生物的酯酶具有广泛的pH值、耐受的温度、对于底物具有高的区域选择性和专一性，被广泛应用于食品加工、农业、制药行业及化工、环境保护等领域。
D-生物素属于B族维生素，又称Vitamin B7或Vitamin H。市场上可作为医药产品和饲料添加剂。对生命有机体也具有重要的作用，人体若缺乏生物素则会引起皮炎、食欲不振、脱发、贫血和精神抑郁病症等营养性疾病。
(3aS,6aR)-内酯是生物素合成的重要关键中间体。1970年Gerecke发现可以通过内酯的方法进一步提高生物素的合成产率(Gerecke M.Helvetica Chimica Acta,1970,53(5):991-999)。2003年陈芬儿通过化学法以内消旋酸酐不对成水解生成(4S,5R)-单甲酯，进而还原得到(3aS,6aR)-内酯，但是因为反应需要低温、且反应时间长，所以限制了此种方法的应用。生物法与化学法相比具有反应步骤简单、反应条件温和、专一性催化且效率高等优势而逐渐被广泛应用。2010年，徐毅等人筛选出一株巧克力微杆菌(Microbacteriumchocolatum SIT101)，该菌株所产的酯酶能够高选择性催化内消旋生物素二甲酯不对称水解生成(4S,5R)-半甲酯，产率为95％，e.e值大于99％(徐毅等.一种巧克力微杆菌及制备(4S,5R)-半酯的方法[P].中国专利.CN102120977A,2010)。并且在大肠杆菌中对该菌株来源的酯酶进行异源表达，构建了大肠杆菌基因工程菌E.coli BL21(DE3)-pET21a-estsit01，同时在摇瓶水平上优化了在诱导剂IPTG诱导下细胞发酵酶活为1072U/L。
在基因工程菌中表达外源目的蛋白，常选用基于强启动子T7的表达系统。在T7启动子有效地表达目标蛋白的时候常常会使用IPTG的诱导，操作比较繁琐。并且IPTG价格昂贵，对细菌潜在一定的毒性，直接影响蛋白的表达率。经研究表明，非目的性表达出来的目的蛋白可能也会导致目的蛋白的不稳定性。
利用自诱导培养基培养细菌使之表达外源蛋白的方法能够很好的解决上述的技术问题。自诱导(auto-induction)是在2005年间Studier等人提出的一种利用培养基中碳源转换而诱导外源基因表达的方法(STUDIER F W.Protein Expr purif.2005,41(1):207-234.)。其首先是以葡萄糖作为速效碳源进行消耗，待大肠杆菌生长至饱和，葡萄糖消耗殆尽，培养基中的另一种碳源成分乳糖作为迟效碳源将被利用。甘油同样作为碳源，在细胞生长中后期阶段提供能量。
中国专利申请201310231607.6公开了一种用于大肠杆菌重组蛋白(pET-ASD和pET-APP)的复合自动诱导培养基，属于微生物培养基领域；通过使用该复合自动诱导培养基，外源重组蛋白的表达量与普通的LB培养基经过诱导剂IPTG诱导相比较提高了10倍以上。与传统的IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导方法相比，自诱导培养基在接种之后不需要对细胞的生长情况进行检测，减少了在培养过程中对培养物的处理，而且使用价格低廉、无毒的乳糖代替价格高昂的IPTG可以大大降低生产成本，在重组蛋白的发酵生产中有着重要的意义。
综上所述，酯酶的生产存在的产酶量低、生产成本高的缺陷，并且细胞发酵酶活也有待进一步提高，目前尚未见采用自诱导培养基培养酯酶的公开报道。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的产酶量低、生产成本高的缺陷而提供一种改进型产酯酶自诱导培养基及其应用；该产酯酶自诱导培养基用于生产酯酶的大肠杆菌工程菌的培养。利用改进型自诱导培养基和双温度调控方式进一步提高重组大肠杆菌产酯酶的能力和产量，从而开发新型重组酯酶的生产工艺和应用价值。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
一种产酯酶自诱导培养基，配方为：甘油5～13g/L，葡萄糖0.3～1.3g/L，乳糖1～6g/L，胰蛋白胨10～30g/L，酵母浸粉3～13g/L，0.0～0.5g/L MgSO4，17～19g/L Na2HPO4，6～8g/L KH2PO4，2～3g/L NH4Cl，0.5～1.0g/L Na2SO4，痕量元素。
优选地，配方为：甘油5～13g/L，葡萄糖0.3～1.3g/L，乳糖1～6g/L，胰蛋白胨10～30g/L，酵母浸粉3～13g/L，0.24g/L MgSO4，17.9g/L Na2HPO4，6.8g/L KH2PO4，2.67g/LNH4Cl，0.71g/L Na2SO4，痕量元素。
进一步优选地，配方为：甘油5～9g/L，葡萄糖0.3～0.7g/L，乳糖1～3g/L，胰蛋白胨10～20g/L，酵母浸粉3～7g/L，0.24g/L MgSO4，17.9g/L Na2HPO4，6.8g/L KH2PO4，2.67g/LNH4Cl，0.71g/L Na2SO4，痕量元素。
作为最终优选，配方为：甘油7g/L，葡萄糖0.5g/L，乳糖2g/L，胰蛋白胨15g/L，酵母浸粉5g/L，0.24g/L MgSO4，17.9g/L Na2HPO4，6.8g/L KH2PO4，2.67g/L NH4Cl，0.71g/LNa2SO4，痕量元素。
所述痕量元素为痕量元素溶液，该痕量元素溶液中含有45～55mM的Fe3+、总量为5～15mM的Mn2+和Zn2+、总量为1～3mM的Co2+、Cu2+、Ni2+、Mo7O24 2+和B4O7 3-，溶剂为蒸馏水。
微量元素溶液为菌体的生长提供微量元素，促进其生长，本发明中痕量元素元素适量即可。
优选地，所述痕量元素溶液中含有50mM的Fe3+、总量为10mM的Mn2+和Zn2+、总量为2mM的Co2+、Cu2+、Ni2+、Mo7O24 2+和B4O7 3-。
本发明还提供了上述产酯酶自诱导培养基的应用，该产酯酶自诱导培养基用于对重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET-21a-estsit01进行培养和发酵生产酯酶；产生的酯酶用于合成(4S,5R)-半酯。
所述的生产酯酶的方法包括以下步骤：
(1)获取重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET-21a-estsit01的单个菌落；
(2)将所述的单个菌落接种于LB液体培养基中培养获得种子培养液；
(3)以0.5～1.0％的接种量将步骤(2)得到的种子培养液接种于产酯酶自诱导培养基中，并放置在摇床上进行培养；培养条件为：设置振荡频率为250～350rpm，先在36.5～37.5℃条件下震荡培养2～4小时；再在29.5～30.5℃条件下震荡培养6～10小时。
优选地，步骤(3)中接种量为1％，培养条件为：设置振荡频率为300rpm，先在37℃条件下震荡培养2～4小时；再在30℃条件下震荡培养6～10小时
步骤(3)中，培养过程中，pH值5.0～8.0。
所述的步骤(2)中，LB液体培养中含有45～55μg/mL的氨苄霉素；培养条件为在36.5～37.5℃、摇床的震动频率为150～250rpm。
优选地，LB液体培养中含有50μg/mL的氨苄霉素；培养条件为在37℃、摇床的震动频率为200rpm。
本发明通过实验考察了分别考察了碳源、氮源浓度对工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-21a-estsit01的生长及产酶的影响，最终确定了一种改进型自诱导培养基组成，本发明的产酯酶自诱导培养基，用乳糖作为底物诱导目的蛋白表达，在细胞的生长和产酶过程中，既作为碳源为细胞的生长提供能量，同时又作为诱导剂在细胞的产酶的过程中发挥着重要的作用。不同的乳糖浓度对于酯酶细胞的生长和产酶会产生不同的影响，本发明通过优化不同的乳糖浓度，进一步提升酯酶细胞的生物量及产酶量；如果乳糖浓度过低，细胞生长受到限制，使得目标蛋白表达不充分，酯酶细胞的生物量及产酶量过低；如果乳糖浓度过高，则自诱导培养基中碳氮源比例失衡，细胞的生长和目标产物的表达将会受到抑制。
本发明得到的这种酯酶大肠杆菌工程菌，在发酵过程中对于氧气的需求是很高的，本发明采用提高转速或者是减少装液量的方法，满足菌体生长需求；并且在基因工程菌表达外源蛋白时，不同外源蛋白的表达所需要的温度是不一样的，本发明采用双温度分阶段的调控策略，如先在37℃条件下培养增加菌体量，然后温度降低来减缓重组蛋白的合成速率以促进目标蛋白的正确表达。采用改进后的自诱导培养基和双温度调控的培养方式，对产酯酶大肠杆菌工程菌进行培养，以提高细胞的产酶量。本发明通过实验优化了起始pH、装液量、温度、培养时间对产酯酶细胞酶活的影响，最终确定最佳的培养条件。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)与传统的IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导方法相比，本发明的自诱导培养基在接种之后不需要对细胞的生长情况进行检测，减少了在培养过程中对培养物的处理，而且使用价格低廉、无毒的乳糖代替价格高昂的IPTG可以大大降低生产成本，在重组蛋白的发酵生产中有着重要的意义；因此降低了发酵生产酯酶的生产成本；
(2)本发明从培养基组分及培养条件出发，找到一条既能高效表达外源蛋白，又能实现自动诱导的改进型产酯酶大肠杆菌自诱导培养基；自诱导培养基利用乳糖作为底物诱导目的蛋白表达，产酶量高，成本低；
(3)采用优化后的改进型产酯酶自诱导培养基和双温度发酵条件后，重组酯酶细胞酶活可达到1684.0U/L，细胞的产酶远远高于使用传统IPTG诱导的产酶量，进一步提高重组大肠杆菌产酯酶的能力和产量，对开发生产重组酯酶发酵工艺和生物素的合成研究具有重要意义。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET-21a-estsit01，该基因工程菌为实验室前期构建。利用常规的PCR技术进行目的基因的扩增，并通过酶切、连接技术将目的基因与载体pET-21a连接，将连接液转化大肠杆菌E.coli DH5α，扩增后，挑阳性克隆子培养，质粒提取，即可得重组质粒pET-21a-estsit01。将重组质粒转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞，挑阳性克隆，得到重组表达转化体E.coli BL21(DE3)/pET21a-estsit01。该菌种的基因序列见序列表。
酶活测定具体方法为：
测活的细胞干重为0.5mg，取相应体积的发酵液离心(4℃，10000rpm，5min)，弃上清液，并以生理盐水洗涤2遍后，加入475μL Tris-HCl缓冲液(0.2M，pH 7.5)重悬，置于恒温混匀仪上预热3min，加入25μL生物素二甲酯(0.2M，DMSO)，继续反应10min，反应结束后加入1mL甲醇淬灭。加入适量的正磷酸调节溶液的pH值，室温离心(10000rpm，5min)，取上清液进行HPLC检测。
本发明各实施例中所用的试剂皆为分析纯或者HPLC纯规格。
本发明的各实施例中对生物素二甲酯不对称水解反应转化率等通过岛津高效液相色谱仪SPD-20A，出自岛津仪器公司，色谱柱采用反向色谱柱C18柱(Diamonsil plus,4.6mm×250mm×5μm，北京迪科马科技有限公司)；具体分析条件如下：
流动相比例是甲醇：水＝65：35(v/v)，流速1.0mL/min，检测波长210nm，柱温为20℃。
产物(4S,5R)-半甲酯的转化率计算如下:
转化率W＝0.60×(X-X0)×B/C×100％
其中，X代表反应液中产物的峰面积，X0代表空白反应液中底物二甲酯自发水解的峰面积，C代表底物二甲酯的浓度，B代表反应液的稀释倍数。0.60为产物峰面积与浓度的系数常数。
本发明各实施例中(4S,5R)-半甲酯的得率根据实际生成产物(4S,5R)-半甲酯的质量除以理论生成(4S,5R)-半甲酯的质量来计算；
本发明实施例中所指的细胞酶活力单位的定义为：在30℃，pH 7.5的条件下，每分钟催化生成1.0μmol的(4S,5R)-半甲酯所需的酶量即为1个活力单位，即1U。
实施例1
采用本发明的产酯酶自诱导培养基，但是采用单一温度控制的诱导方式：
(1)自诱导培养基：甘油5g/L，葡萄糖0.5g/L，乳糖2g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，0.24g/L MgSO4，17.9g/L Na2HPO4，6.8g/L KH2PO4，2.67g/L NH4Cl，0.71g/L Na2SO4，200μg/L痕量元素混合液，用蒸馏水配制；
其中痕量元素元素溶液为：50mM的Fe3+，10mM的Mn2+、Zn2+，2mM的Co2+、Cu2+、Ni2+、Mo7O24 2+、B4O7 3-，用蒸馏水配制；
(2)挑取重组大肠杆菌单菌落接入到装有50mL种子培养基的250mL摇瓶中(含氨苄霉素50μg/mL)，于摇床中37℃、200rpm震荡培养12小时；
(3)将(2)中的种子培养液以1％接种量接种于装有50mL自诱导培养基的250mL三角瓶中，于37℃、300rpm培养12小时；
(4)采用实施例1中步骤(5)的方法获取发酵液并检测酶活，重组酯酶细胞酶活可达186.7U/L。
实施例2
采用本发明的产酯酶自诱导培养基，但是采用单一温度控制的诱导方式：
(1)自诱导培养基：甘油5g/L，葡萄糖0.5g/L，乳糖2g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，0.24g/L MgSO4，17.9g/L Na2HPO4，6.8g/L KH2PO4，2.67g/L NH4Cl，0.71g/L Na2SO4，200μg/L痕量元素混合液，用蒸馏水配制；
其中痕量元素元素溶液为：50mM的Fe3+，10mM的Mn2+、Zn2+，2mM的Co2+、Cu2+、Ni2+、Mo7O24 2+、B4O7 3-，用蒸馏水配制；
(2)挑取重组大肠杆菌单菌落接入到装有50mL种子培养基的250mL摇瓶中(含氨苄霉素50μg/mL)，于摇床中37℃、200rpm震荡培养12小时；
(3)将(2)中的种子培养液以1％接种量接种于装有50mL自诱导培养基的250mL三角瓶中，于30℃、300rpm培养12小时；
(4)采用实施例1中步骤(5)的方法获取发酵液并检测酶活，重组酯酶细胞酶活可达546.0U/L。
实施例3
采用本发明的产酯酶自诱导培养基，并且采用双温控诱导方式：
(1)自诱导培养基：甘油5g/L，葡萄糖0.5g/L，乳糖2g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，0.24g/L MgSO4，17.9g/L Na2HPO4，6.8g/L KH2PO4，2.67g/L NH4Cl，0.71g/L Na2SO4，200μg/L痕量元素混合液，用蒸馏水配制；
其中痕量元素元素溶液为：50mM的Fe3+，10mM的Mn2+、Zn2+，2mM的Co2+、Cu2+、Ni2+、Mo7O24 2+、B4O7 3-，用蒸馏水配制；
(2)挑取重组大肠杆菌单菌落接入到装有50mL种子培养基的250mL摇瓶中(含氨苄霉素50μg/mL)，于摇床中37℃、200rpm震荡培养12小时；
(3)将(2)中的种子培养液以1％接种量接种于装有50mL自诱导培养基的250mL三角瓶中，于37℃、300rpm先培养4小时后30℃继续培养8小时；
(4)采用实施例1中步骤(5)的方法获取发酵液并检测酶活，重组酯酶细胞酶活可达1247.9U/L。
实施例4
采用本发明的产酯酶自诱导培养基，并且采用双温控诱导方式：
(1)自诱导培养基：甘油9g/L，葡萄糖0.5g/L，乳糖2g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，0.24g/L MgSO4，17.9g/L Na2HPO4，6.8g/L KH2PO4，2.67g/L NH4Cl，0.71g/L Na2SO4，200μg/L痕量元素混合液，用蒸馏水配制；
其中痕量元素元素溶液为：50mM的Fe3+，10mM的Mn2+、Zn2+，2mM的Co2+、Cu2+、Ni2+、Mo7O24 2+、B4O7 3-，用蒸馏水配制；
(2)挑取重组大肠杆菌单菌落接入到装有50mL种子培养基的250mL摇瓶中(含氨苄霉素50μg/mL)，于摇床中37℃、200rpm震荡培养12小时；
(3)将(2)中的种子培养液以1％接种量接种于装有50mL自诱导培养基的250mL三角瓶中，于37℃、300rpm先培养4小时后30℃继续培养8小时；
(4)采用实施例1中步骤(5)的方法获取发酵液并检测酶活，重组酯酶细胞酶活可达999.2U/L。
实施例5
采用本发明的产酯酶自诱导培养基，并且采用双温控诱导方式：
(1)自诱导培养基：甘油7g/L，葡萄糖0.3g/L，乳糖2g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，0.24g/L MgSO4，17.9g/L Na2HPO4，6.8g/L KH2PO4，2.67g/L NH4Cl，0.71g/L Na2SO4，200μg/L痕量元素混合液，用蒸馏水配制；
其中痕量元素元素溶液为：50mM的Fe3+，10mM的Mn2+、Zn2+，2mM的Co2+、Cu2+、Ni2+、Mo7O24 2+、B4O7 3-，用蒸馏水配制；
(2)挑取重组大肠杆菌单菌落接入到装有50mL种子培养基的250mL摇瓶中(含氨苄霉素50μg/mL)，于摇床中37℃、200rpm震荡培养12小时；
(3)将(2)中的种子培养液以1％接种量接种于装有50mL自诱导培养基的250mL三角瓶中，于37℃、300rpm先培养4小时后30℃继续培养8小时；
(4)采用实施例1中步骤(5)的方法获取发酵液并检测酶活，重组酯酶细胞酶活可达900.1U/L。
实施例6
采用本发明的产酯酶自诱导培养基，并且采用双温控诱导方式：
(1)自诱导培养基：甘油7g/L，葡萄糖0.7g/L，乳糖2g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，0.24g/L MgSO4，17.9g/L Na2HPO4，6.8g/L KH2PO4，2.67g/L NH4Cl，0.71g/L Na2SO4，200μg/L痕量元素混合液，用蒸馏水配制；
其中痕量元素元素溶液为：50mM的Fe3+，10mM的Mn2+、Zn2+，2mM的Co2+、Cu2+、Ni2+、Mo7O24 2+、B4O7 3-，用蒸馏水配制；
(2)挑取重组大肠杆菌单菌落接入到装有50mL种子培养基的250mL摇瓶中(含氨苄霉素50μg/mL)，于摇床中37℃、200rpm震荡培养12小时；
(3)将(2)中的种子培养液以1％接种量接种于装有50mL自诱导培养基的250mL三角瓶中，于37℃、300rpm先培养4小时后30℃继续培养8小时；
(4)采用实施例1中步骤(5)的方法获取发酵液并检测酶活，重组酯酶细胞酶活可达921.6U/L。
实施例7
采用本发明的产酯酶自诱导培养基，并且采用双温控诱导方式：
(1)自诱导培养基：甘油7g/L，葡萄糖0.5g/L，乳糖1g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，0.24g/L MgSO4，17.9g/L Na2HPO4，6.8g/L KH2PO4，2.67g/L NH4Cl，0.71g/L Na2SO4，200μg/L痕量元素混合液，用蒸馏水配制；
其中痕量元素元素溶液为：50mM的Fe3+，10mM的Mn2+、Zn2+，2mM的Co2+、Cu2+、Ni2+、Mo7O24 2+、B4O7 3-，用蒸馏水配制；
(2)挑取重组大肠杆菌单菌落接入到装有50mL种子培养基的250mL摇瓶中(含氨苄霉素50μg/mL)，于摇床中37℃、200rpm震荡培养12小时；
(3)将(2)中的种子培养液以1％接种量接种于装有50mL自诱导培养基的250mL三角瓶中，于37℃、300rpm先培养4小时后30℃继续培养8小时；
(4)采用实施例1中步骤(5)的方法获取发酵液并检测酶活，重组酯酶细胞酶活可达966.4U/L。
实施例8
采用本发明的产酯酶自诱导培养基，并且采用双温控诱导方式：
(1)自诱导培养基：甘油7g/L，葡萄糖0.5g/L，乳糖3g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，0.24g/L MgSO4，17.9g/L Na2HPO4，6.8g/L KH2PO4，2.67g/L NH4Cl，0.71g/L Na2SO4，200μg/L痕量元素混合液，用蒸馏水配制；
其中痕量元素元素溶液为：50mM的Fe3+，10mM的Mn2+、Zn2+，2mM的Co2+、Cu2+、Ni2+、Mo7O24 2+、B4O7 3-，用蒸馏水配制；
(2)挑取重组大肠杆菌单菌落接入到装有50mL种子培养基的250mL摇瓶中(含氨苄霉素50μg/mL)，于摇床中37℃、200rpm震荡培养12小时；
(3)将(2)中的种子培养液以1％接种量接种于装有50mL自诱导培养基的250mL三角瓶中，于37℃、300rpm先培养4小时后30℃继续培养8小时；
(4)采用实施例1中步骤(5)的方法获取发酵液并检测酶活，重组酯酶细胞酶活可达969.5U/L。
实施例9
采用本发明的产酯酶自诱导培养基，并且采用双温控诱导方式：
(1)自诱导培养基：甘油7g/L，葡萄糖0.5g/L，乳糖2g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，0.24g/L MgSO4，17.9g/L Na2HPO4，6.8g/L KH2PO4，2.67g/L NH4Cl，0.71g/L Na2SO4，200μg/L痕量元素混合液，用蒸馏水配制；
其中痕量元素元素溶液为：50mM的Fe3+，10mM的Mn2+、Zn2+，2mM的Co2+、Cu2+、Ni2+、Mo7O24 2+、B4O7 3-，用蒸馏水配制；
(2)挑取重组大肠杆菌单菌落接入到装有50mL种子培养基的250mL摇瓶中(含氨苄霉素50μg/mL)，于摇床中37℃、200rpm震荡培养12小时；
(3)将(2)中的种子培养液以1％接种量接种于装有50mL自诱导培养基的250mL三角瓶中，于37℃、300rpm先培养4小时后30℃继续培养8小时；
(4)采用实施例1中步骤(5)的方法获取发酵液并检测酶活，重组酯酶细胞酶活可达1012.9U/L。
实施例10
采用本发明的产酯酶自诱导培养基，并且采用双温控诱导方式：
(1)自诱导培养基：甘油7g/L，葡萄糖0.5g/L，乳糖2g/L，胰蛋白胨20g/L，酵母浸粉5g/L，0.24g/L MgSO4，17.9g/L Na2HPO4，6.8g/L KH2PO4，2.67g/L NH4Cl，0.71g/L Na2SO4，200μg/L痕量元素混合液，用蒸馏水配制；
其中痕量元素元素溶液为：50mM的Fe3+，10mM的Mn2+、Zn2+，2mM的Co2+、Cu2+、Ni2+、Mo7O24 2+、B4O7 3-，用蒸馏水配制；
(2)挑取重组大肠杆菌单菌落接入到装有50mL种子培养基的250mL摇瓶中(含氨苄霉素50μg/mL)，于摇床中37℃、200rpm震荡培养12小时；
(3)将(2)中的种子培养液以1％接种量接种于装有50mL自诱导培养基的250mL三角瓶中，于37℃、300rpm先培养4小时后30℃继续培养8小时；
(4)采用实施例1中步骤(5)的方法获取发酵液并检测酶活，重组酯酶细胞酶活可达844.4U/L。
实施例11
采用本发明的产酯酶自诱导培养基，并且采用双温控诱导方式：
(1)自诱导培养基：甘油7g/L，葡萄糖0.5g/L，乳糖2g/L，胰蛋白胨15g/L，酵母浸粉3g/L，0.24g/L MgSO4，17.9g/L Na2HPO4，6.8g/L KH2PO4，2.67g/L NH4Cl，0.71g/L Na2SO4，200μg/L痕量元素混合液，用蒸馏水配制；
其中痕量元素元素溶液为：50mM的Fe3+，10mM的Mn2+、Zn2+，2mM的Co2+、Cu2+、Ni2+、Mo7O24 2+、B4O7 3-，用蒸馏水配制；
(2)挑取重组大肠杆菌单菌落接入到装有50mL种子培养基的250mL摇瓶中(含氨苄霉素50μg/mL)，于摇床中37℃、200rpm震荡培养12小时；
(3)将(2)中的种子培养液以1％接种量接种于装有50mL自诱导培养基的250mL三角瓶中，于37℃、300rpm先培养4小时后30℃继续培养8小时；
(4)采用实施例1中步骤(5)的方法获取发酵液并检测酶活，重组酯酶细胞酶活可达770.2U/L。
实施例12
(1)自诱导培养基：甘油7g/L，葡萄糖0.5g/L，乳糖2g/L，胰蛋白胨15g/L，酵母浸粉7g/L，0.24g/L MgSO4，17.9g/L Na2HPO4，6.8g/L KH2PO4，2.67g/L NH4Cl，0.71g/L Na2SO4，200μg/L痕量元素混合液，用蒸馏水配制；
其中痕量元素元素溶液为：50mM的Fe3+，10mM的Mn2+、Zn2+，2mM的Co2+、Cu2+、Ni2+、Mo7O24 2+、B4O7 3-，用蒸馏水配制；
(2)挑取重组大肠杆菌单菌落接入到装有50mL种子培养基的250mL摇瓶中(含氨苄霉素50μg/mL)，于摇床中37℃、200rpm震荡培养12小时；
(3)将(2)中的种子培养液以1％接种量接种于装有50mL自诱导培养基的250mL三角瓶中，于37℃、300rpm先培养4小时后30℃继续培养8小时；
(4)采用实施例1中步骤(5)的方法获取发酵液并检测酶活，重组酯酶细胞酶活可达996.3U/L。
实施例13
采用本发明的产酯酶自诱导培养基，并且采用双温控诱导方式：
(1)自诱导培养基：甘油7g/L，葡萄糖0.5g/L，乳糖2g/L，胰蛋白胨15g/L，酵母浸粉5g/L，0.24g/L MgSO4，17.9g/L Na2HPO4，6.8g/L KH2PO4，2.67g/L NH4Cl，0.71g/L Na2SO4，200μg/L痕量元素混合液，用蒸馏水配制；
其中痕量元素元素溶液为：50mM的Fe3+，10mM的Mn2+、Zn2+，2mM的Co2+、Cu2+、Ni2+、Mo7O24 2+、B4O7 3-，用蒸馏水配制；
(2)挑取重组大肠杆菌单菌落接入到装有50mL种子培养基的250mL摇瓶中(含氨苄霉素50μg/mL)，于摇床中37℃、200rpm震荡培养12小时；
(3)将(2)中的种子培养液以1％接种量接种于装有30mL自诱导培养基的250mL三角瓶中，于37℃、300rpm先培养4小时后30℃继续培养8小时；
(4)采用实施例1中步骤(5)的方法获取发酵液并检测酶活，重组酯酶细胞酶活可达1684.0U/L。
实施例14
采用本发明的产酯酶自诱导培养基，并且采用双温控诱导方式：
(1)自诱导培养基：甘油13g/L，葡萄糖1.3g/L，乳糖6g/L，胰蛋白胨30g/L，酵母浸粉13g/L，0.5g/L MgSO4，19g/L Na2HPO4，8g/L KH2PO4，3g/L NH4Cl，1.0g/L Na2SO4，200μg/L痕量元素混合液，用蒸馏水配制；
其中痕量元素元素溶液为：55mM的Fe3+，15mM的Mn2+、Zn2+，3mM的Co2+、Cu2+、Ni2+、Mo7O24 2+、B4O7 3-，用蒸馏水配制；
(2)挑取重组大肠杆菌单菌落接入到装有50mL种子培养基的250mL摇瓶中(含氨苄霉素50μg/mL)，于摇床中36.6℃、250rpm震荡培养12小时；
(3)将(2)中的种子培养液以0.5％接种量接种于装有30mL自诱导培养基的250mL三角瓶中，于36.5℃、350rpm先培养4小时后29.5℃继续培养10小时；
(4)采用实施例1中步骤(5)的方法获取发酵液并检测酶活，重组酯酶细胞酶活可达1582.0U/L。
实施例15
采用本发明的产酯酶自诱导培养基，并且采用双温控诱导方式：
(1)自诱导培养基：甘油5g/L，葡萄糖0.3g/L，乳糖1g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉3g/L，17g/L Na2HPO4，6g/L KH2PO4，2g/L NH4Cl，0.5g/L Na2SO4，200μg/L痕量元素混合液，用蒸馏水配制；
其中痕量元素元素溶液为：45mM的Fe3+，5mM的Mn2+、Zn2+，1mM的Co2+、Cu2+、Ni2+、Mo7O24 2+、B4O7 3-，用蒸馏水配制；
(2)挑取重组大肠杆菌单菌落接入到装有50mL种子培养基的250mL摇瓶中(含氨苄霉素50μg/mL)，于摇床中37.5℃、150rpm震荡培养12小时；
(3)将(2)中的种子培养液以1.5％接种量接种于装有30mL自诱导培养基的250mL三角瓶中，于37.5℃、150rpm先培养2小时后30.5℃继续培养6小时；
(4)采用实施例1中步骤(5)的方法获取发酵液并检测酶活，重组酯酶细胞酶活可达1562.0U/L。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。
序列表
<110> 上海应用技术大学
<120> 一种产酯酶自诱导培养基及其应用
<130> 1
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1110
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgaccctgt ttgatggcat tacctctcgt attgtggata ccgatcgcct gaccgttaat 60
attctggaac gcgcagcaga tgatccgcag accccgccgg atcgtaccgt tgtgtttgtt 120
catggtaatg tgtctagcgc cctgttttgg caggaaatta tgcaggatct gccgagcgat 180
ttacgcgcca ttgccgtgga tttacgcggc tttggcggct ctgaacatgc cccggttgat 240
gcaacccgcg gcgttcgtga tttttcagat gatttacatg ccaccttaga agccttagat 300
attccggttg cccatttagt gggctggagt atgggtggcg gcgtggttat gcagtatgca 360
ctggatcatc cggttctgtc actgacctta cagtctccgg ttagtccgta tggctttggc 420
ggtacccgtc gcgatggtag tcgcttaacc gatgatgatg caggctgtgg tggcggcggt 480
gccaatccgg attttattca gcgcttaatt gatcatgata ccagcgatga tgcacagacc 540
tctccgcgta gcgtgtttcg cgcaggctat gttgcctcag attataccac cgatcatgaa 600
gatgtttggg ttgaatcaat gttaaccacc tcaaccgccg atggtaatta tccgggtgat 660
gccgttccga gcgataattg gccgggcttt gccgcaggtc gtcatggtgt gctgaatacg 720
atggccccgc agtattttga tgtgtcaggc attgtggatt tagccgaaaa accgccgatt 780
ctgtggattc atggtaccgc agatgcaatt gtgagcgatg cctcctttta tgatctgaat 840
tatctgggcc agttaggcat tgttccgggt tggccgggcg aagatgttgc cccggcacag 900
gaaatggtga gtcagacccg tgatgtgctg ggtcgctatg cagcaggcgg tggtaccgtg 960
accgaagttg ccgttgaagg tgcaggtcat agtgcacatc tggaacgtcc ggcagtgttt 1020
cgtcatgcac tgctggaaat tattggctat gtgggcgcag cagccgatcc ggccccgccg 1080
accgaagcca ttattattcg tagcgcagat 1110

Claims (10)

1.一种产酯酶自诱导培养基，其特征在于，配方为：甘油5～13g/L，葡萄糖0.3～1.3g/L，乳糖1～6g/L，胰蛋白胨10～30g/L，酵母浸粉3～13g/L，0.0～0.5g/L MgSO4，17～19g/LNa2HPO4，6～8g/L KH2PO4，2～3g/L NH4Cl，0.5～1.0g/L Na2SO4，痕量元素。
2.根据权利要求1所述的一种产酯酶自诱导培养基，其特征在于，配方为：甘油5～13g/L，葡萄糖0.3～1.3g/L，乳糖1～6g/L，胰蛋白胨10～30g/L，酵母浸粉3～13g/L，0.24g/LMgSO4，17.9g/L Na2HPO4，6.8g/L KH2PO4，2.67g/L NH4Cl，0.71g/L Na2SO4，痕量元素。
3.根据权利要求2所述的一种产酯酶自诱导培养基，其特征在于，配方为：甘油5～9g/L，葡萄糖0.3～0.7g/L，乳糖1～3g/L，胰蛋白胨10～20g/L，酵母浸粉3～7g/L，0.24g/LMgSO4，17.9g/L Na2HPO4，6.8g/L KH2PO4，2.67g/L NH4Cl，0.71g/L Na2SO4，痕量元素。
4.根据权利要求3所述的一种产酯酶自诱导培养基，其特征在于，配方为：甘油7g/L，葡萄糖0.5g/L，乳糖2g/L，胰蛋白胨15g/L，酵母浸粉5g/L，0.24g/L MgSO4，17.9g/L Na2HPO4，6.8g/L KH2PO4，2.67g/L NH4Cl，0.71g/L Na2SO4，痕量元素。
5.根据权利要求1～4任一所述的一种产酯酶自诱导培养基，其特征在于，所述痕量元素为痕量元素溶液，该痕量元素溶液中含有45～55mM的Fe3+、总量为5～15mM的Mn2+和Zn2+、总量为1～3mM的Co2+、Cu2+、Ni2+、Mo7O24 2+和B4O7 3-，溶剂为蒸馏水。
6.根据权利要求5所述的一种产酯酶自诱导培养基，其特征在于，所述痕量元素溶液中含有50mM的Fe3+、总量为10mM的Mn2+和Zn2+、总量为2mM的Co2+、Cu2+、Ni2+、Mo7O24 2+和B4O7 3-。
7.一种如权利要求1所述的产酯酶自诱导培养基的应用，其特征在于，该产酯酶自诱导培养基用于对重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET-21a-estsit01进行培养和发酵生产酯酶；产生的酯酶用于合成(4S,5R)-半酯。
8.根据权利要求7所述的一种产酯酶自诱导培养基的应用，其特征在于，所述的生产酯酶的方法包括以下步骤：
(1)获取重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET-21a-estsit01的单个菌落；
(2)将所述的单个菌落接种于LB液体培养基中培养获得种子培养液；
(3)以0.5～1.5％的接种量将步骤(2)得到的种子培养液接种于产酯酶自诱导培养基中，并放置在摇床上进行培养；培养条件为：设置振荡频率为250～350rpm，先在36.5～37.5℃条件下震荡培养2～4小时；再在29.5～30.5℃条件下震荡培养6～10小时。
9.根据权利要求7所述的一种产酯酶自诱导培养基的应用，其特征在于，步骤(3)中，培养过程中，pH值5.0～8.0。
10.根据权利要求7所述的一种产酯酶自诱导培养基的应用，其特征在于，所述的步骤(2)中，LB液体培养中含有45～55μg/mL的氨苄霉素；培养条件为在36.6～37.5℃、摇床的震动频率为150～250rpm。
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