CN101503432B - 5'-脱氧核苷单磷酸的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种5′-脱氧核苷单磷酸的制备方法，所述的方法包括以下步骤：(1)将2′-脱氧核苷、三氯氧磷和磷酸三烷基酯混合，得到含有5′-脱氧核苷酸粗品的溶液；(2)使步骤(1)得到的含有5′-脱氧核苷酸粗品的溶液在pH≥8.0进行水解，得到水解液；(3)将有机溶剂和步骤(2)的水解液混合、萃取，得到有机相和水相；所述的有机溶剂是卤代烃；(4)浓缩水相得到浓缩液；和(5)步骤(4)得到的浓缩液在10至15℃得到固体5′-脱氧核苷单磷酸。

Description

5'-脱氧核苷单磷酸的制备方法

技术领域

本发明涉及化学合成领域，特别涉及化学合成5′-脱氧核苷单磷酸的制备工艺。

背景技术

基于脱氧核苷和脱氧核苷酸及其衍生物的药物是一类新兴的生化药物，近年来在生物医药领域的研究及应用发展迅猛，有研究表明基于此类的生物制药将在未来人类抗肿瘤等方面发挥重要作用。目前在抗癌、抗病毒、抗真菌、抗细菌、治疗心肌梗塞、作为干扰素诱导剂及基因治疗等方面的研究正在不断深入，疗效亦很明显，并在临床上得到广泛应用(例如抗癌药5-FdUR、治疗艾滋病的扎西他宾等)，随着此类药物研究的不断深入，除使用天然脱氧核苷、脱氧核苷酸作为原料外，更大量使用新设计的化合物、经化学修饰的脱氧核苷和脱氧核苷酸为原料。因此5′-脱氧核苷酸作为基础原料，将具有非常广阔的前景。目前常用的制备方法大致有以下几种：

1.微生物发酵法：主要利用微生物菌株的生物合成途径来制备5′-脱氧核苷酸。对于核苷类物质，比较容易透过微生物细胞，因此利用此法生产核苷比较容易。但核苷酸类物质极性较大，较难透过细胞膜，因此增加了菌体发酵制备脱氧核苷酸的难度。目前仅适用于制备部分脱氧核苷酸，国外也有相关的专利公告。但菌种的选择及菌株的培养有较高的技术壁垒，且不适用于规模化大生产，成本高昂。

2.酶解法：是历史悠久、技术最成熟的制备方法。以DNA为底物酶解得到。利用桔青酶发酵得到的核酸P1酶或从麦芽根中提取出的磷酸二酯酶进行酶解反应，得到四种混合的脱氧核苷酸，再通过离子交换树脂分离纯化得到四种脱氧核苷酸的纯品。在酶解过程中，鉴于酶作用的专一性，能高效率地生产出特定的脱氧核苷酸。与此同时正因为它的专一性，它的应用面也受到很大的限制，而且相对的生产成本较高、生产周期较长。

酶催化法：即酶催化核苷磷酸化法。以相应的脱氧核苷为底物，利用各种激酶即磷酸转移酶、核糖磷酸转移酶、5′-核酸酶、酸性转移酶等进行酶催化反应得到。目前国外也有相关的专利公告。

目前使用的获得5′-脱氧核苷单磷酸的方法复杂、专一性强、生产成本高昂、消耗大。

因此，本领域迫切需要提供一种简便、适用性强的化学合成5′-脱氧核苷单磷酸的方法。

发明内容

本发明涉及一种5′-脱氧核苷单磷酸的制备方法。

在本发明中，提供了一种5′-脱氧核苷单磷酸的制备方法，所述的方法包括以下步骤：

(1)将2′-脱氧核苷、三氯氧磷和磷酸三烷基酯混合，得到含有5′-脱氧核苷酸粗品的溶液；

(2)使步骤(1)得到的含有5′-脱氧核苷酸粗品的溶液在pH≥8.0进行水解，得到水解液；

(3)将有机溶剂和步骤(2)的水解液混合、萃取，得到有机相和水相；所述的有机溶剂是卤代烃；

(4)浓缩水相得到浓缩液；和

(5)步骤(4)得到的浓缩液在10至15℃得到固体5′-脱氧核苷单磷酸。

在另一优选例中，步骤(1)中2′-脱氧核苷、三氯氧磷和磷酸三烷基酯的混合比例为：2′-脱氧核苷∶磷酸三烷基酯＝1∶20-30(w/v)、2′-脱氧核苷∶三氯氧磷＝1∶1-3(w/v)。

在另一优选例中，步骤(1)中的混合温度为零下20至0℃。

在另一优选例中，步骤(2)中的水解温度为零下20至零下5℃。

在另一优选例中，步骤(2)中水解在pH8-10进行。

在另一优选例中，步骤(3)中所述的卤代烃选自C1-C4的卤代烷烃；较佳地，为C1-C4的氯取代烷烃；更佳地，为C1-C4的一氯取代烷烃、或C1-C4的二氯取代烷烃。

在另一优选例中，步骤(3)中有机相中磷酸三烷基酯含量10％以下。

在另一优选例中，步骤(4)得到的浓缩液中固体物含量3-15w/v％(即3- 15g核苷酸/100mL(溶液体积)。

在另一优选例中，步骤(5)中使步骤(4)得到的浓缩液pH2-5.5。

在另一优选例中，将步骤(5)得到的固体5′-脱氧核苷单磷酸和水混合，重复步骤(4)至步骤(5)1、2、3、4、5、或6次。

据此，本发明提供了一种简便、适用性强的化学合成5′-脱氧核苷单磷酸的方法。

具体实施方式

发明人经过深入的研究，惊奇地发现，2′-脱氧核苷上磷后，经过一系列简便的纯化步骤，可以得到纯度非常高的5′-脱氧核苷单磷酸。

具体地，所述的纯化步骤包括低温水解、有机溶剂萃取、水相浓缩和结晶，尤其是发明人发现水相浓缩时，如果将目标物的浓度控制在一定范围内，根据不同产品的特性，通过调整各自相应的最佳pH，可以结晶析出纯度非常高的目标物。

如本文所用，“脱氧核苷酸”包含无修饰性脱氧核苷酸和修饰性脱氧核苷酸。所述的修饰性是指在5’-磷酸脱氧核糖中的2’位上有其它化学基团，所述其它化学基团包括但不限于，F、OCH2等；在碱基的5位上有其它化学基团，所述其它化学基团包括但不限于，CH3等。

如本文所用，“2′-脱氧核苷”或“脱氧核苷酸”中的碱基是腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、或尿嘧啶(U)。

如本文所用，“目标物”或“目标产物”可以互换使用，都是指5′-脱氧核苷单磷酸，其中的碱基是腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、或尿嘧啶(U)。

本发明提供的的5′-脱氧核苷单磷酸的制备方法，包括了上磷和纯化步骤，具体地，经过以下步骤：

(1)将2′-脱氧核苷、三氯氧磷和磷酸三烷基酯混合，得到含有5′-脱氧核苷酸粗品的溶液；

(2)使步骤(1)得到的含有5′-脱氧核苷酸粗品的溶液在pH≥8.0进行水 解，得到水解液；

(3)将有机溶剂和步骤(2)的水解液混合、萃取，得到有机相和水相；所述的有机溶剂是卤代烃；

(4)浓缩水相得到浓缩液；和

(5)将步骤(4)得到的浓缩液在10至15℃结晶得到固体5′-脱氧核苷单磷酸。

以2′-脱氧核苷为原料，在磷酸三烷基酯类溶剂中进行磷酸化反应；2’-脱氧核苷和磷酸三烷基酯的重量体积比为1∶20-30，2’-脱氧核苷和三氯氧磷的重量体积比为1∶1-3。通过本领域常用的检测手段，判定该磷酸化反应的进行程度，一般使反应进行至目标物转化率为70-90％以上，即5′-脱氧核苷单磷酸粗品的纯度为70％以上；较佳地转化率为75-90％以上。磷酸化反应的温度为-20℃-0℃。磷酸三烷基酯选自磷酸三甲酯、或磷酸三乙酯。

完成了上述磷酸化反应的溶液调pH≥8.0，并进行低温水解；可以使用本领域熟知的无机碱或有机碱调节pH，例如但不限于，氢氧化钠、氢氧化钾、吗啡啉等。水解液中含目标物、相应杂质类核苷、相应杂质类核苷酸(例如但不限于，3′-脱氧核苷酸、或3′，5′-脱氧核苷酸)、相应杂质类碱基、氯化钠、磷酸盐等物质；优选水解温度为-20℃至-5℃。

用有机溶剂萃取出水解液中的磷酸三烷基酯类溶剂；其中水溶液中含目标产物、相应杂质类核苷、相应杂质类核苷酸、相应杂质类碱基、氯化钠、磷酸盐等物质；有机相中磷酸三烷基酯含量10％以下，从而避免了该种溶剂的残留进而影响结晶的效果。

水溶液浓缩至一定浓度，浓度为3-15％的含固量；较佳地为5-10％。可以使用本领域熟知的方式进行浓缩，例如但不限于，减压浓缩。

将得到的浓缩液pH调至2-5.5；采用低温搅拌后即得目标产物5’-脱氧核苷单磷酸；结晶温度为10℃-15℃。可以使用本领域熟知的无机酸或有机酸调节pH，例如但不限于，盐酸、硝酸、硫酸、乙酸。

本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特 征仅为均等或相似特征的一般性例子。

本发明的主要优点在于：

1、本发明提供了一种适应性强、反应可控、转化率较高(目标物转化率在70-90％)的化学合成方法。

2、本发明提供的方法，参与反应的所有试剂均可回收，不会造成污染，大大降低了生产成本。

3、有机溶剂通过回收可反复使用，减少了有机溶剂的用量，降低了生产成本。

4、采用的后处理方法简单易行，废除了以往需通过离子交换树脂分离纯化的后处理方法，缩短了生产周期、降低了生产强度、节约了生产成本、提高了产量，完全具备投入少、产出高的环保型生物科技产业化的工业化生产模式。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分数、比率、比例、或份数按重量计。

本发明中的重量体积百分比中的单位是本领域技术人员所熟知的，例如是指在100毫升的溶液中溶质的重量。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1

制备5′-脱氧胞苷单磷酸

在反应釜中分别投料1Kg脱氧胞苷和30L磷酸三甲酯，搅拌降温于-10℃后滴加入3L三氯氧磷。滴加完毕后继续反应4hr，取样分析HPLC：目标物转化率87.5％；

加水进行水解，水解过程中控制溶液温度在-10℃左右，加入NaOH调节溶液pH＝8.5；

加入氯乙烷萃取，萃取完成静止后将下层有机相分去，最终有机相中的磷酸三甲酯含量为10％。而所得到的水相减压浓缩至含固量7％；

浓缩液过滤至澄清，用HCl调节至pH＝3.8。将溶液温度控制在13℃左右，搅拌2小时后得到大量颗粒状白色结晶物；

过滤结晶液得到的白色固体为5′-脱氧胞苷单磷酸较纯品(HPLC＝94.3％)，再重复第一次结晶时的操作进行重结晶，最终得到5′-脱氧胞苷单磷酸纯品(HPLC＝99.24％)。

实施例2

制备5′-脱氧鸟苷单磷酸

在反应釜中分别投料1Kg脱氧鸟苷和30L磷酸三甲酯，搅拌降温于-15℃后滴加入2.8L三氯氧磷。滴加完毕后继续反应3.5小时，取样分析HPLC：目标物转化率83.5％；；

加水进行水解，水解过程中控制溶液温度在-8℃左右，加入NaOH调节溶液pH＝8.7；

加入氯乙烷萃取，萃取完成静止后将下层有机相分去，最终有机相中的磷酸三甲酯含量为7.5％。得到的水相减压浓缩至含固量5％；

浓缩液过滤至澄清，用HCl调节至pH＝3.2。将溶液温度控制在12℃左右，搅拌4小时后得到大量粉末状白色结晶物；

过滤结晶液得到的白色固体为5′-脱氧鸟苷单磷酸较纯品(HPLC＝90.3％)，再重复第一次结晶时的操作进行重结晶，最终得到5′-脱氧鸟苷单磷酸纯品(HPLC＝99.04％)。

实施例3

制备2′-F-5′-脱氧胞苷单磷酸

在反应釜中分别投料1Kg2′-F-脱氧胞苷和25L磷酸三甲酯，搅拌降温于-13℃后滴加入1.8L三氯氧磷。滴加完毕后继续反应7.5小时，取样分析HPLC：目标物转化率79.56％；

加水进行水解，水解过程中控制溶液温度在-13℃左右，加入NaOH调节溶 液pH＝8.3；

加入氯乙烷萃取，萃取完成静止后将下层有机相分去，最终有机相中的磷酸三甲酯含量为4.5％。得到的水相减压浓缩至含固量6.5％；

浓缩液过滤至澄清，用HCl调节至pH＝2.8。将溶液温度控制在14℃左右，搅拌6小时后得到大量粉末状白色结晶物；

过滤结晶液得到的白色固体为2′-F-5′-脱氧胞苷单磷酸较纯品(HPLC＝88.31％)，再重复第一次结晶时的操作进行重结晶，最终得到2′-F-5′-脱氧胞苷单磷酸纯品(HPLC＝97.84％)。

实施例4

制备2′-F-5′-脱氧腺苷单磷酸

在反应釜中分别投料1Kg2′-F-脱氧腺苷和28L磷酸三甲酯，搅拌降温于-13℃后滴加入2.1L三氯氧磷。滴加完毕后继续反应10.5小时，取样分析HPLC：目标物转化率82.37％；

加水进行水解，水解过程中控制溶液温度在-10℃左右，加入NaOH调节溶液pH＝8.9；

加入氯乙烷萃取，萃取完成静止后将下层有机相分去，最终有机相中的磷酸三甲酯含量为6.3％。得到的水相减压浓缩至含固量8.3％；

浓缩液过滤至澄清，用HCl调节至pH＝3.4。将溶液温度控制在11℃左右，搅拌8小时后得到大量粉末状白色结晶物；

过滤结晶液得到的白色固体为2′-F-5′-脱氧腺苷单磷酸较纯品(HPLC＝91.01％)，再重复第一次结晶时的操作进行重结晶，最终得到2′-F-5′-脱氧腺苷单磷酸纯品(HPLC＝98.22％)。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用以限定本发明的实质技术内容范围，本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中，任何他人完成的技术实体或方法，若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同，也或是一种等效的变更，均将被视为涵盖于该权利要求范围之中。

Claims (11)

1.一种5′-脱氧核苷单磷酸的制备方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：

(1)将2′-脱氧核苷、三氯氧磷和磷酸三烷基酯混合，得到含有5′-脱氧核苷酸粗品的溶液；

(2)使步骤(1)得到的含有5′-脱氧核苷酸粗品的溶液在pH≥8.0进行水解，得到水解液；

(3)将有机溶剂和步骤(2)的水解液混合、萃取，得到有机相和水相；所述的有机溶剂是卤代烃；

(4)浓缩水相得到浓缩液，浓缩液中固体物含量3-15w/v％；和

(5)步骤(4)得到的浓缩液在10至15℃得到固体5′-脱氧核苷单磷酸。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中2′-脱氧核苷、三氯氧磷和磷酸三烷基酯的混合比例为：2′-脱氧核苷∶磷酸三烷基酯＝1∶20-30(w/v)、2′-脱氧核苷∶三氯氧磷＝1∶1-3(w/v)。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中的混合温度为零下20至0℃。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中的水解温度为零下20至零下5℃。

5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中水解在pH8-10进行。

6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述的卤代烃选自C1-C4的卤代烷烃。

7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述的卤代烃为C1-C4的氯取代烷烃。

8.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述的卤代烃为C1-C4的一氯取代烷烃、或C1-C4的二氯取代烷烃。

9.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中有机相中磷酸三烷基酯含量10％以下。

10.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(5)中使步骤(4)得到的浓缩液pH2-5.5。

11.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，将步骤(5)得到的固体5′-脱氧核苷单磷酸和水混合，重复步骤(4)至步骤(5)1、2、3、4、5、或6次。