CN102876759A

CN102876759A - 尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸的制备方法

Info

Publication number: CN102876759A
Application number: CN2012104212166A
Authority: CN
Inventors: 王波; 孙勇; 文军
Original assignee: SYNCORE LABORATORIES (SHANGHAI) Co Ltd
Current assignee: SYNCORE LABORATORIES (SHANGHAI) Co Ltd
Priority date: 2012-10-29
Filing date: 2012-10-29
Publication date: 2013-01-16

Abstract

本发明涉及一种尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸的制备方法，其以1,2,3,5-四乙酰-β-D-呋喃核糖为起始原料，依次通过缩合反应、氨解反应、磷酸化反应制备尼克酰胺单核苷酸；然后将制得的尼克酰胺单核苷酸与腺嘌呤核苷三磷酸混合，在烟酰胺核苷酸腺苷转移酶和焦磷酸酶存在的条件下发生酶催化反应，制得尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸。与现有技术相比，本发明技术方案采用化学法和酶法联合的方法，整个工艺简洁优化。

Description

尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸的制备方法

技术领域

本发明涉及一种尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸的制备方法。

背景技术

尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸（下简称为NAD）为生物体内非常常见的一种脱氢酶的辅酶。脱氢酶在生物体的新陈代谢中起到了决定性的作用，一些生物体基本的代谢运动，比如蛋白质分解，碳水化合物分解，脂肪分解，离开了脱氢酶，就不能正常进行，生物就会失去生命的体征。由于脱氢酶必须与NAD结合才能促使代谢运作，所以是NAD生物体代谢中不可缺少的物质。

NAD是现代生物催化反应必不可少的辅酶之一。现代的生物催化技术模拟了生物体内利用酶来完成的反应，这种反应的模拟条件是严格根据生物体内的代谢特征来进行的，所以像常见的亮氨酸脱氢酶、甲酸铵脱氢酶、葡萄糖脱氢酶催化的手性还原都需要NAD的帮助来完成整个反应，氧化反应亦是如此。而在材料、化工、食品、制药工业中，氧化还原反应（特别是手性还原）是数目最庞大、研究最深入、工艺最成熟的一类反应，所以工业领域对NAD的需求是巨大的。

关于NAD的制备方法的报道很多，主要有酵母提取和化学合成两类。

从酵母中提取是目前工业上大量使用的NAD的主要来源，此法虽然工艺成熟，但设备庞大，浓缩耗能高，且在提取过程中用到了含银盐或者含Hg(COOCH₃)₂等重金属离子的试剂，因此生产效率低，成本高。

化学合成法由于转化率低，所用试剂昂贵，且有大量的过硅胶柱和凝胶色谱柱的操作，目前还停留在实验室研究阶段，只能进行毫克级或克级制备。

综上所述，现有的各种制备NAD的方法还难以很好地满足商业化生产的要求。

发明内容

本发明提供了一种化学法和酶法相结合制备尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法，其以1,2,3,5-四乙酰-β-D-呋喃核糖为起始原料，依次通过缩合反应、氨解反应、磷酸化反应制备尼克酰胺单核苷酸；然后将制得的尼克酰胺单核苷酸与腺嘌呤核苷三磷酸混合，在烟酰胺核苷酸腺苷转移酶和焦磷酸酶存在的条件下发生酶催化反应，制得尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸。

在本发明的一个具体实施方案中，所述的酶催化反应中，反应物尼克酰胺单核苷酸与腺嘌呤核苷三磷酸的摩尔比为1:1～1:4。

所述的烟酰胺核苷酸腺苷转移酶为酶冻干粉形式的烟酰胺核苷酸腺苷转移酶，其适用浓度为1～10g/L，或者是含酶细胞形式的烟酰胺核苷酸腺苷转移酶，其适用浓度为10～100g/L；

所述的焦磷酸酶为酶冻干粉形式的焦磷酸酶，其适用浓度为1～10g/L，或者是含酶细胞形式的焦磷酸酶，其适用浓度为10～100g/L。

在本发明的一个具体实施方案中，所述的酶催化反应中，尼克酰胺单核苷酸的浓度为6g/L～72g/L，腺嘌呤核苷三磷酸浓度为8g/L～96g/L；

在本发明的一个具体实施方案中，所述酶催化反应所用的烟酰胺核苷酸腺苷转移酶（NMNAT）来源于Methanococcus jannaschii，焦磷酸酶（PPase）来源于Saccharomycescerevisiae，这两个酶可以都通过E.coli克隆表达获得，可通过发酵大量制备，是相对易得和廉价的催化剂，其具体存在形式包括酶液、酶冻干粉、含酶细胞以及各种固定化酶和固定化细胞。

在本发明的一个具体实施方案中，所述的酶催化反应在pH值为4～8的磷酸盐缓冲液中进行。优选的，pH值为5～7。

在本发明的一个具体实施方案中，所述磷酸盐缓冲液的浓度20~200mM。优选的，所述磷酸盐缓冲液的浓度为50~100mM。

在本发明的一个具体实施方案中，所述酶催化反应完成后，尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸的分离纯化包含以下依次进行的步骤：超滤、过LX-90大孔树脂柱、水洗脱、冻干。

在本发明的一个具体实施方案中，所述的缩合反应中，以1,2,3,5-四乙酰-β-D-呋喃核糖为基准，反应物三氟甲磺酸三甲基硅脂的反应当量为2:1～1:2，反应物烟酰乙酯的反应当量为1:1～1:3；所述缩合反应的温度为0~60℃。

在本发明的一个具体实施方案中，所述的缩合反应的时间为4~12小时。

在本发明的一个具体实施方案中，所述氨解反应中，以1,2,3,5-四乙酰-β-D-呋喃核糖为基准，反应物氨气的反应当量为1~10，所述氨解反应的温度为-10~10℃。

在本发明的一个具体实施方案中，所述氨解反应的时间为20~30小时。

在本发明的一个具体实施方案中，所述磷酸化反应中，以1,2,3,5-四乙酰-β-D-呋喃核糖为基准，反应物三氯氧磷的反应当量为1~10，所述磷酸化反应的温度为-20~20℃。

在本发明的一个具体实施方案中，所述磷酸化反应的时间的10~20小时。

在本发明的一个具体实施方案中，参见图1为NAD的制备工艺路线图，该制备工艺包含四个步骤，其中步骤一，起始原料1,2,3,5-四乙酰-β-D-呋喃核糖与烟酰乙酯在三氟甲磺酸三甲基硅脂催化下在二氯甲烷中发生缩合反应生成中间体1；步骤二，中间体1在甲醇中发生氨解反应生成中间体2；步骤三，中间体2与三氯氧磷在磷酸三乙酯中发生磷酸化反应生成中间体3（尼克酰胺单核苷酸）；步骤四，将制得的中间体3（尼克酰胺单核苷酸）与腺嘌呤核苷三磷酸混合，在烟酰胺核苷酸腺苷转移酶和焦磷酸酶存在的条件下发生酶催化反应，制得尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸。

与现有技术相比，本发明技术方案以价格相对低廉的1,2,3,5-四乙酰-β-D-呋喃核糖为起始原料，经化学反应生产出酶反应底物，体现出化学反应合成小分子物质的优势；以可大量生产的克隆表达蛋白为酶催化剂，生产最终产品，体现出生物催化高选择性，提取简单的特点。化学、酶法紧密结合，相得益彰，使得整个工艺简洁优化，解决目前生产尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸工艺繁琐，提取率低，成本高，不适合工业化生产的技术问题。

附图说明

图1为本发明的制备合成工艺路线图；

图2为¹H NMR谱图。

具体实施方式

下面将通过实施例对本发明的技术内容作进一步的阐述，其目的是为了更好的理解本发明的内容。因此，所举的例子并不限制本发明的保护范围。

实施例1

参见图1的制备合成工艺路线图

采用1,2,3,5-四乙酰-β-D-呋喃核糖为起始原料；

步骤一：缩合反应，合成如图1所示的中间体1：

在20L的玻璃反应釜中，设定好搅拌和温度计（量程0-100℃），用三角漏斗加入12L二氯甲烷，开搅拌，搅拌速度设定42.5rpm。投1,2,3,5-四乙酰-β-D-呋喃核糖1.2kg（3.77mol），搅拌溶解。开反应釜夹套循环水（设定12℃），待内温达到12℃，在滴液漏斗中加入0.84kg（3.77mol）三氟甲磺酸三甲基硅脂，并开始缓慢滴加，滴完后加入0.84kg（5.65mol）烟酰乙酯。循环水升温至50℃，内温达48℃，开始保温回流。回流4h后，取样。如果HPLC显示原料剩余≤5%，开始降温；如果HPLC显示原料剩余＞5%，则继续反应至原料剩余≤5%再降温。HPLC显示反应完成后，在-0.09MPa真空度下蒸干溶剂，待物料呈琥珀色透明粘稠状液体（约2.4kg），停止蒸馏。

步骤二：氨解反应，合成如图1所示的中间体2：

把20L玻璃反应釜上的温度计换成量程-50-50℃，从釜口用三角漏斗加入16L预冷至10℃的甲醇，开搅拌，搅拌速度设定30rpm。待步骤一所得物料完全溶解后，开反应釜循环盐水（设定-15℃），待内温达到-5℃，开始通氨气反应，通氨气过程中保持内温＜0℃。待氨气钢瓶减重达0.6kg通氨完毕，循环水开始升温（设定-7.5℃），内温升至0℃并维持稳定，保温反应。反应20h后，取样。如果HPLC显示产物量≥70%，则可停止反应；如果HPLC显示产物量＜70%，则继续反应至产物量≥70%再停止。HPLC显示反应完成后，在-0.09MPa真空度下蒸干溶剂，待物料呈桔红色粘稠状液体（约1.44kg），停止蒸馏。

步骤三：磷酸化反应，合成如图1所示的中间体3（尼克酰胺单核苷酸）

从20L玻璃反应釜的釜口用三角漏斗加入7.2L磷酸三甲酯，搅拌溶解步骤二所得物料，开反应釜循环盐水（设定-20℃）。待内温达到-10℃，开始控温在-5℃至-10℃滴加三氯氧磷1.88kg。三氯氧磷滴加完，循环水设定-10℃，开始保温反应。反应18h后，取样。如果HPLC显示产物量≥60%，则可停止反应；如果HPLC显示产物量＜60%，则继续反应至产物量≥60%再停止。控制体系温度在-5℃至-10℃，于快速搅拌下，加入0.9L乙腈和9L甲叔醚，搅拌30min，有白色沉淀析出。过滤，用1L甲叔醚洗涤滤饼，抽干，得到白色粉末状固体。将固体粉末用2L冰水混合物充分搅拌30min，溶解，分层，放出下层（水层），用1L甲叔醚洗涤一次，再用水冲泵抽掉其中的醚和酸性气体。然后控制温度在0-5℃用D301树脂（预先用4%NaOH转换成OH型）精确中和到pH=7，中和液滴加到10L丙酮中，在-5℃搅拌结晶4h，过滤，得白色固体0.78kg，纯度95%（经鉴定为尼克酰胺单核苷酸），前三步总收率65%。

步骤四：酶催化反应

在20L玻璃反应釜上设定好搅拌和量程0-100℃的温度计，从釜口用三角漏斗加入磷酸二氢钠0.33kg、磷酸氢二钠0.48kg和16L水配成的缓冲溶液，开反应釜循环水（设定30℃）和搅拌，搅拌速度设定42.5rpm。投中间体3尼克酰胺单核苷酸0.78kg(2.32mol)和腺嘌呤核苷三磷酸1.09kg(2.78mol)，待物料完全溶解后，加入NMNAT酶冻干粉0.03kg和PPase酶冻干粉0.06kg，反应10h，取样。如果HPLC显示4.3min原料剩余≤3%，开始降温；如果HPLC显示原料剩余＞3%，则继续反应至原料剩余≤3%再停止反应。放料，超滤，除去反应体系中的细胞壁和游离酶，得20L粗品溶液。将粗品溶液过LX-90大孔树脂柱，水洗脱，HPLC跟踪检测，收集NAD纯度高于98%的洗脱液，冻干得产品743g，收率44%，¹H NMR谱图见附图2。

实施例2

步骤一到三同实施例1。

步骤四：

在20L玻璃反应釜上设定好搅拌和量程0-100℃的温度计，从釜口用三角漏斗加入磷酸二氢钠0.33kg、磷酸氢二钠0.48kg和16L水配成的缓冲溶液，开反应釜循环水（设定30℃）和搅拌，搅拌速度设定42.5rpm。投中间体3尼克酰胺单核苷酸0.78kg(2.32mol)和腺嘌呤核苷三磷酸1.09kg(2.78mol)，待物料完全溶解后，加入NMNAT全细胞0.3kg和PPase全细胞0.6kg，反应10h，取样。如果HPLC显示4.3min原料剩余≤3%，开始降温；如果HPLC显示原料剩余＞3%，则继续反应至原料剩余≤3%再停止反应。放料，超滤，除去反应体系中的细胞壁和游离酶，得20L粗品溶液。将粗品溶液过LX-90大孔树脂柱，水洗脱，HPLC跟踪检测，收集NAD纯度高于98%的洗脱液，冻干得产品728g，收率42%，¹HNMR谱图见附图2。

Claims

1.一种尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸的制备方法，其特征在于：该制备方法以1,2,3,5-四乙酰-β-D-呋喃核糖为起始原料，依次通过缩合反应、氨解反应、磷酸化反应制备尼克酰胺单核苷酸；

然后将制得的尼克酰胺单核苷酸与腺嘌呤核苷三磷酸混合，在烟酰胺核苷酸腺苷转移酶和焦磷酸酶存在的条件下发生酶催化反应，制得尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的酶催化反应中，反应物尼克酰胺单核苷酸与腺嘌呤核苷三磷酸的摩尔比为1:1～1:4。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述的酶催化反应中，尼克酰胺单核苷酸的浓度为6g/L～72g/L，腺嘌呤核苷三磷酸浓度为8g/L～96g/L；

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的酶催化反应在pH值为4～8的磷酸盐缓冲液中进行。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述酶催化反应完成后，尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸的分离纯化包含以下依次进行的步骤：超滤、过LX-90大孔树脂柱、水洗脱、冻干。

6.如权利要求1-5中任意一项所述的方法，其特征在于：所述的缩合反应中，以1,2,3,5-四乙酰-β-D-呋喃核糖为基准，反应物三氟甲磺酸三甲基硅脂的反应当量为2:1～1:2，反应物烟酰乙酯的反应当量为1:1～1:3；所述缩合反应的温度为0~60℃。

7.如权利要求1-5中任意一项所述的方法，其特征在于：所述氨解反应中，以1,2,3,5-四乙酰-β-D-呋喃核糖为基准，反应物氨气的反应当量为1~10，所述氨解反应的温度为-10~10℃。

8.如权利要求1-5中任意一项所述的方法，其特征在于：所述磷酸化反应中，以1,2,3,5-四乙酰-β-D-呋喃核糖为基准，反应物三氯氧磷的反应当量为1~10，所述磷酸化反应的温度为-20~20℃。