CN104862326B - 一种绿僵菌氧甲基转移酶及其应用 - Google Patents

一种绿僵菌氧甲基转移酶及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明发现了一种作用底物广泛的氧甲基转移酶,可用于有机化合物生物合成过程中的氧甲基转移。本发明通过实验证实了该氧甲基转移酶的催化活性，并且发现该酶可以作用于多个底物。本发明还提供了一种苯二酚内酯类化合物的合成方法，是将所述的氧甲基转移酶基因和苯二酚内酯合成基因转化至酵母细胞，经发酵培养后提取产物而得到。

Description

一种绿僵菌氧甲基转移酶及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种从绿僵菌中得到的氧甲基转移酶。本发明还涉及该氧甲基转移酶在苯二酚内酯类化合物生物合成中的应用。
背景技术
聚酮化合物具有抑菌杀虫、抗癌、降血脂、抑制免疫活性等生物活性，苯二酚内酯类化合物是其中一大类，在临床和农用药物等方面具有很大的应用潜力。合成苯二酚内酯类化合物需要两个基因：还原型聚酮合酶基因和非还原型聚酮合酶基因，这两个基因总称为苯二酚内酯类化合物合成基因。
天然的苯二酚内酯聚酮化合物修饰改可以为药物的更新、改造提供一条途径。比如有些苯二酚内酯类物质骨架形成后，其结构需要经过修饰，才能形成最优的药用化合物，氧甲基化修饰就是其中一种修饰作用。苯二酚内酯类化合物合成后修饰已成为了新药开发的热点研究方向。
通过化学反应进行修饰存在很多弊端，比如生产周期长，产物种类较多，分离成本较高，使用的试剂多具有强腐蚀性，环境污染严重。即使是目前研究先进的分子筛催化剂也无法兼具稳定性高、催化活性活性好、选择性特异等优点。化学法修饰的这些不足严重限制了药物更新、改造的速度，生物酶法可以避免这些问题。
绿僵菌(Metarhizium anisopliae)基因组测序后，注释出许多预测基因。但目前尚未有其关于作用底物广泛的氧甲基转移酶方面的报道。
发明内容
本发明的目的是得到一种新的氧甲基转移酶基因，以用于对某些苯二酚内酯类化合物进行修饰。
金龟子绿僵菌(MetarhiziumanisopliaeARSEF23)基因组测序后，注释出许多预测基因。通过信息学分析，本发明从中获得了一个氧甲基转移酶基因，并命名为MaOMT。该基因共999bp，由207个氨基酸缩水形成，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，由MaOMT编码的氧甲基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
本发明通过实验证实了该氧甲基转移酶MaOMT的催化活性，并且发现该酶可以作用于多个底物，这种作用底物广泛的氧甲基转移酶还未见报道。
所述氧甲基转移是用甲基(-CH3)取代羟基(-OH)上的氢原子，形成氧甲基基团(-OCH3)。催化该过程的酶称为氧甲基转移酶(O-methyltransferase)。
具体来讲，本发明应用该氧甲基转移酶已经成功实现了两种化合物的氧甲基化修饰。这两种化合物分别是：14,15-Dehydrozearalenol和Desmethyl-Lasiodiplodin,修饰后分别成为：3-oxymethyl-14,15-Dehydrozearalenol和Lasiodiplodin,见下式:
经实验证实，本发明发现的氧甲基转移酶识别苯二酚内酯类化合物后，能够在特异的位点进行氧甲基修饰。具体内容包括：
1)基因克隆：以绿僵菌基因组为模板，以MaOMT F和MaOMT R为引物扩增MaOMT基因，构建到表达载体PRS425M上，命名为PRS425M-MaOMT；
MaOMT F：5’-CTTCATATGAGATCCTACTCATTGGATATCGTCC-3’
MaOMT R：5’-TCCGTTTAAACTTAACCTCTTTTCAATCTTGCTTC-3’
2)酵母转化：
将合成Desmethyl-lasiodiplodin的还原型聚酮合酶基因、非还原型聚酮合酶基和PRS425M-MaOMT质粒共转化到酵母细胞中；Desmethyl-lasiodiplodin还原型聚酮合酶基因核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，Desmethyl-lasiodiplodin非还原型聚酮合酶基因核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示
将合成14,15-Dehydrozearalenol的还原型聚酮合酶基因、非还原型聚酮合酶基和PRS425M-MaOMT质粒共转化到酵母细胞中；14,15-Dehydrozearalenol还原型聚酮合酶基因核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，14,15-Dehydrozearalenol非还原型聚酮合酶基因核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示
3)酵母转化子培养和提取
在营养缺陷型培养基(-Trp，-Leu，-Ura)中培养。发酵后用乙酸乙酯抽提产物；
4)产物结构分析
产物经HPLC分析发现，除了14,15-Dehydrozearalenol外，还出现了一个峰。
经NMR方法进行进一步结构分析，证明该化合物是在14,15-Dehydrozearalenol的3位碳原子上增加了一个氧甲基。证明MaOMT能对14,15-Dehydrozearalenol进行修饰。
在可可毛色二孢菌中的聚酮合酶合成Desmethyl-lasiodiplodin后，本发明得到的MaOMT识别Desmethyl-lasiodiplodin，在其3位碳原子侧链羟基上引入甲基基团。将MaOMT基因和14,15-Dehydrozearalenol聚酮合酶基因共表达后，发现MaOMT能够识别并作用于14,15-Dehydrozearalenol，在其3位碳原子侧链羟基上引入甲基基团。
本发明的发明效果是：
1)该酶可以在底物所需要的特定位点进行甲基化修饰；
2)底物的范围广泛
以上两个实例的底物结构不同，但用本发明得到的氧甲基转移酶都可以成功进行特异位点甲基化修饰，说明该酶对底物的作用广泛，并且可以在特异的位点进行甲基化修饰，具有开发成特异位点甲基化工具的潜力。
3)操作方便，成本低
实践中，通过发酵工程可以得到大量甲基化的产物；发酵产物只需通过乙酸乙酯抽提，高效液相分离两步就可以分离到高纯度的产物，并且乙酸乙酯抽提操作简单，高效液相分离可以实现自动化操作，节省了大量人力物力，大大降低了生产成本；
4)操作安全，对环境安全
本方法整个过程中不需要使用任何腐蚀性或刺激性的物质参与。
序列表信息
SEQ ID NO:1：MaOMT基因序列；
SEQ ID NO:2:MaOMT氨基酸序列；
SEQ ID NO:3:Desmethyl-lasiodiplodin还原型聚酮合酶基因；
SEQ ID NO:4:Desmethyl-lasiodiplodin非还原型聚酮合酶基因；
SEQ ID NO:5:14,15-Dehydrozearalenol还原型聚酮合酶基因；
SEQ ID NO:6:14,15-Dehydrozearalenol非还原型聚酮合酶基因。
附图说明
图1PRS425M-MaOMT质粒图谱；
图2PRS425M-MaOMT质粒酶切鉴定；
图3、图4是各发酵产物的HPLC分析图，其中：
图3-A：转化pBDL6064、pBDL6065质粒后酵母发酵产物HPLC分析图，化合物1是14,15Dehydrozearaleno，化合物2是3,methyl-14,15-Dehydrozearalenol；
图3-B.转化pBDL6064、pBDL6065、PRS425M-MaOMT质粒后酵母发酵产物HPLC图，化合物2是3-oxymethyl-14,15-Dehydrozearalenol。化合物1完全转化为化合物2；
图4-C：转化pBDL6066、pBDL6067质粒后酵母发酵产物HPLC分析图，化合物3是Desmethyl-Lasiodiplodin；
图4-D.转化pBDL6066、pBDL6067、PRS425M-MaOMT质粒后酵母发酵产物HPLC图，化合物3是Desmethyl-Lasiodiplodin，化合物4是Lasiodiplodin.。大部分化合物3转化为化合物4。
具体实施方式
以下实验中所用的实验材料说明及来源如下：
菌株与载体：
大肠杆菌菌株E.coli JM109购自康为公司；
酵母菌BJ5464：来源于中国农业科学院生物技术研究所；
PRS425M载体：由中国农业科学院生物技术研究所生物合成实验室构建。
酶与试剂盒：
限制性内切酶，连接酶，为NEB公司产品；Taq酶购买自全式金公司；质粒提取和胶回收试剂盒为天根生化公司产品。
实施例中其它未注明具体条件的实验方法，按照常规方法进行，分子克隆按(NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)实验室手册中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例114,15-Dehydrozearalenol的甲基化修饰
1.MaOMT基因克隆：
1)用酚氯仿抽提法提取绿僵菌(Metarhizium robertsii)基因组DNA
2)以绿僵菌的基因组为模板，以MaOMT F和MaOMT R为引物(见附录1)，扩增MaOMT基因。通过引物在MaOMT基因上下游增加两个酶切位点：在起始密码子ATG上游加CAT构成Nde I酶切位点，在终止密码子TAA下游加GTTTAAAC形成Pme I酶切位点
3)用Nde I和Pme I酶切MaOMT PCR产物和PRS425M载体
4)连接两段酶切产物形成PRS425M-MaOMT质粒(图谱见附图1)，转化感受态大肠杆菌，并涂布到含Amp(50μg/ml)的固体LB培养基中，38℃，16h
5)挑取阳性克隆子，转移到含Amp(50μg/ml)的液体LB培养基中，扩大培养。38℃，8h
6)利用碱裂解法提取质粒，然后用Nco I-HF和Pvu II-HF酶切质粒，正确的质粒被切成3条片段：6411bp，1491bp，873bp(见附图2).
7)保存正确的质粒。
2.酵母转化(使用ZYMO公司的酵母转化试剂盒，货号No.T2001)
将合成14,15-Dehydrozearalenol的还原型聚酮合酶基因pBDL6064、非还原型聚酮合酶基因pBDL6065和PRS425M-MaOMT质粒共转化到酵母细胞中，具体步骤是：
1)在固体YPD培养基上，通过划线法分离S.cerevisiae BJ5464-NpgA单菌落，30摄氏度，16h
2)挑取单菌落于YPD液体培养基中，30摄氏度，220rpm，直到OD600＝0.8-1.0
3)500*g，4min离心收集酵母菌，弃上清
4)用10ml EZ1溶液冲洗沉淀，重悬细胞，离心弃上清
5)用1ml EZ2溶液重悬沉淀，以50μl为单位分装成数管，直接进行转化或者-70摄氏度保存
6)分别将0.2-1μg的pBDL6064、pBDL6065、PRS425M-MaOMT和50μl的酵母感受态细胞混合
7)向混合物中加500μl EZ3溶液，混合均匀
8)30℃孵育45min，孵育过程中轻轻用手拨打混匀2-3次
9)吸取100μl转化液涂到固体三缺培养基(-Leu/-Trp/-Ura)中，30摄氏度，培养3天；
3.酵母转化子培养
1)获得酵母转化子后，通过划线法将其涂布到新的固体三缺培养基上，30℃，培养2天
2)收集酵母细胞，接种到50ml液体三缺培养基中，30℃，200rpm，培养16h
3)在锥形瓶中加入50ml YPD低糖培养基，30℃，200rpm，培养48h。
所述三缺培养基是营养缺陷型培养基(-Trp，-Leu，-Ura)为市售品，Clontech公司的-Leu/-Trp/-Ura DO Supplement，货号Lot#3013C204
4、从培养物中抽提产物
1)取上述发酵液2L与乙酸乙酯按1:1体积比混合后，置于旋转蒸发仪中；
2)用旋转蒸发仪蒸出并回收乙酸乙酯，得到的浓缩物为萃取物，干燥萃取物；
3)用1ml甲醇复溶萃取物，收集到EP管中；
4)12000rpm，10min离心，取上清进行HPLC分析。
5、HPLC分析
1)HPLC分析条件如下：
HPLC仪：岛津公司的DGU-20A5R；色谱柱：Kromasil 100-5-C18。
流动相：乙腈-H2O为，进行梯度洗脱；
梯度洗脱条件：0～5min，乙腈10％；5～15min，乙腈从10％→95％；15～25min,，乙腈为95％；25～28min,，乙腈从95％→10％；28～31min,，乙腈为10％；
流速：0.8mLmin-1，检测波长：300nm。
2)HPLC分析
发现除了14,15-Dehydrozearalenol(峰1)外，还出现了一个峰(峰2)(见附图3)。
6、NMR分析
通过NMR进一步结构分析，证明该化合物1是14,15-Dehydrozearalenol，化合物2是3,oxymethyl-14,15-Dehydrozearalenol。证明MaOMT能对14,15-Dehydrozearalenol进行修饰。NMR数据见表1和表2.
表1化合物1NMR谱图分析结果
表2化合物2NMR谱图分析结果
实施例2Desmethyl-Lasiodiplodin的甲基化修饰
与实施例1方法相同，不同之处是酵母转化步骤，将pBDL6066、pBDL6067和PRS425M-MaOMT共转化到感受态酵母细胞中。
HPLC分析发现，在Desmethyl-Lasiodiplodin(峰3)前面出现了一个峰(峰4)，进一步结构分析(NMR)证明，化合物3是Desmethyl-Lasiodiplodin，化合物4是Lasiodiplodin。NMR数据见表3和表4。
表3化合物3NMR谱图分析结果
表4化合物4NMR谱图分析结果

Claims (7)

1.核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的基因在有机化合物生物合成的氧甲基转移步骤中的应用，所述氧甲基转移是用甲基取代羟基上的氢原子，形成氧甲基基团-OCH3。
2.核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的基因在苯二酚内酯类化合物合成中的应用。
3.一种对苯二酚内酯类化合物进行氧甲基转移的方法，其特征是应用了核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的氧甲基转移酶基因。
4.权利要求3所述的方法，是将所述的氧甲基转移酶基因和苯二酚内酯类化合物合成基因转化至酵母细胞，经发酵培养后提取产物。
5.权利要求4所述的方法，所述对苯二酚内酯类化合物进行氧甲基转移，是分别进行14,15-Dehydrozearalenol和Desmethyl-Lasiodiplodin两个化合物的氧甲基修饰，修饰后得到的产物分别为：3-oxymethyl-14,15-Dehydrozearalenol和Lasiodiplodin,如下式:
所用的苯二酚内酯类化合物合成基因的序列分别如下：
SEQ ID NO:3:Desmethyl-lasiodiplodin还原型聚酮合酶基因；
SEQ ID NO:4:Desmethyl-lasiodiplodin非还原型聚酮合酶基因；
SEQ ID NO:5:14,15-Dehydrozearalenol还原型聚酮合酶基因；
SEQ ID NO:6:14,15-Dehydrozearalenol非还原型聚酮合酶基因。
6.权利要求5所述的方法，所述培养是在-Trp，-Leu，-Ura营养缺陷型培养基中培养。
7.权利要求6所述的方法，所述提取是发酵后用乙酸乙酯抽提产物。
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