CN111378008A - 脂肽类化合物Totopotensamides及其制备方法和应用 - Google Patents
脂肽类化合物Totopotensamides及其制备方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111378008A CN111378008A CN202010135816.0A CN202010135816A CN111378008A CN 111378008 A CN111378008 A CN 111378008A CN 202010135816 A CN202010135816 A CN 202010135816A CN 111378008 A CN111378008 A CN 111378008A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- compound
- lividans
- δtotr5i
- gene
- pcsg5549
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 title claims abstract description 78
- 229930184596 totopotensamide Natural products 0.000 title claims abstract description 45
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 11
- 108010028921 Lipopeptides Proteins 0.000 title abstract description 4
- 241000187398 Streptomyces lividans Species 0.000 claims description 77
- 108091008053 gene clusters Proteins 0.000 claims description 48
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 34
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 31
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 27
- 241000970912 Streptomyces pactum Species 0.000 claims description 25
- 108700005075 Regulator Genes Proteins 0.000 claims description 15
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 claims description 14
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 11
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 11
- KRADHMIOFJQKEZ-UHFFFAOYSA-N Tri-2-ethylhexyl trimellitate Chemical compound CCCCC(CC)COC(=O)C1=CC=C(C(=O)OCC(CC)CCCC)C(C(=O)OCC(CC)CCCC)=C1 KRADHMIOFJQKEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 claims description 7
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 claims description 6
- 101150053185 P450 gene Proteins 0.000 claims description 6
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 claims description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 claims 1
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 claims 1
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 abstract description 7
- 229940079593 drug Drugs 0.000 abstract description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 abstract description 4
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 abstract description 3
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 abstract description 3
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 103
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 84
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 81
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 58
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 56
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 52
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 52
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 34
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 31
- 238000005100 correlation spectroscopy Methods 0.000 description 30
- 238000001460 carbon-13 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 29
- 238000001052 heteronuclear multiple bond coherence spectrum Methods 0.000 description 29
- 238000000990 heteronuclear single quantum coherence spectrum Methods 0.000 description 29
- 238000000425 proton nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 29
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 26
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 26
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 25
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 21
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 21
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 20
- 238000011894 semi-preparative HPLC Methods 0.000 description 20
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 19
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 16
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 14
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 13
- UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N spectinomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](NC)[C@@H](O)[C@H]([C@@H]([C@H]1O1)O)NC)[C@]2(O)[C@H]1O[C@H](C)CC2=O UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N 0.000 description 13
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 12
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 12
- IEDVJHCEMCRBQM-UHFFFAOYSA-N trimethoprim Chemical compound COC1=C(OC)C(OC)=CC(CC=2C(=NC(N)=NC=2)N)=C1 IEDVJHCEMCRBQM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 11
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 9
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 9
- 230000008569 process Effects 0.000 description 9
- ZWEHNKRNPOVVGH-UHFFFAOYSA-N 2-Butanone Chemical compound CCC(C)=O ZWEHNKRNPOVVGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 8
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 8
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 8
- 241001045988 Neogene Species 0.000 description 7
- 101150091879 neo gene Proteins 0.000 description 7
- 238000010898 silica gel chromatography Methods 0.000 description 7
- UAOUIVVJBYDFKD-XKCDOFEDSA-N (1R,9R,10S,11R,12R,15S,18S,21R)-10,11,21-trihydroxy-8,8-dimethyl-14-methylidene-4-(prop-2-enylamino)-20-oxa-5-thia-3-azahexacyclo[9.7.2.112,15.01,9.02,6.012,18]henicosa-2(6),3-dien-13-one Chemical compound C([C@@H]1[C@@H](O)[C@@]23C(C1=C)=O)C[C@H]2[C@]12C(N=C(NCC=C)S4)=C4CC(C)(C)[C@H]1[C@H](O)[C@]3(O)OC2 UAOUIVVJBYDFKD-XKCDOFEDSA-N 0.000 description 6
- AOSZTAHDEDLTLQ-AZKQZHLXSA-N (1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-6-[(3-chlorophenyl)methyl]-12,19-difluoro-11-hydroxy-8-(2-hydroxyacetyl)-9,13-dimethyl-6-azapentacyclo[10.8.0.02,9.04,8.013,18]icosa-14,17-dien-16-one Chemical compound C([C@@H]1C[C@H]2[C@H]3[C@]([C@]4(C=CC(=O)C=C4[C@@H](F)C3)C)(F)[C@@H](O)C[C@@]2([C@@]1(C1)C(=O)CO)C)N1CC1=CC=CC(Cl)=C1 AOSZTAHDEDLTLQ-AZKQZHLXSA-N 0.000 description 6
- GLGNXYJARSMNGJ-VKTIVEEGSA-N (1s,2s,3r,4r)-3-[[5-chloro-2-[(1-ethyl-6-methoxy-2-oxo-4,5-dihydro-3h-1-benzazepin-7-yl)amino]pyrimidin-4-yl]amino]bicyclo[2.2.1]hept-5-ene-2-carboxamide Chemical compound CCN1C(=O)CCCC2=C(OC)C(NC=3N=C(C(=CN=3)Cl)N[C@H]3[C@H]([C@@]4([H])C[C@@]3(C=C4)[H])C(N)=O)=CC=C21 GLGNXYJARSMNGJ-VKTIVEEGSA-N 0.000 description 6
- SZUVGFMDDVSKSI-WIFOCOSTSA-N (1s,2s,3s,5r)-1-(carboxymethyl)-3,5-bis[(4-phenoxyphenyl)methyl-propylcarbamoyl]cyclopentane-1,2-dicarboxylic acid Chemical compound O=C([C@@H]1[C@@H]([C@](CC(O)=O)([C@H](C(=O)N(CCC)CC=2C=CC(OC=3C=CC=CC=3)=CC=2)C1)C(O)=O)C(O)=O)N(CCC)CC(C=C1)=CC=C1OC1=CC=CC=C1 SZUVGFMDDVSKSI-WIFOCOSTSA-N 0.000 description 6
- GHYOCDFICYLMRF-UTIIJYGPSA-N (2S,3R)-N-[(2S)-3-(cyclopenten-1-yl)-1-[(2R)-2-methyloxiran-2-yl]-1-oxopropan-2-yl]-3-hydroxy-3-(4-methoxyphenyl)-2-[[(2S)-2-[(2-morpholin-4-ylacetyl)amino]propanoyl]amino]propanamide Chemical compound C1(=CCCC1)C[C@@H](C(=O)[C@@]1(OC1)C)NC([C@H]([C@@H](C1=CC=C(C=C1)OC)O)NC([C@H](C)NC(CN1CCOCC1)=O)=O)=O GHYOCDFICYLMRF-UTIIJYGPSA-N 0.000 description 6
- WWTBZEKOSBFBEM-SPWPXUSOSA-N (2s)-2-[[2-benzyl-3-[hydroxy-[(1r)-2-phenyl-1-(phenylmethoxycarbonylamino)ethyl]phosphoryl]propanoyl]amino]-3-(1h-indol-3-yl)propanoic acid Chemical compound N([C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)O)C(=O)C(CP(O)(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)OCC=1C=CC=CC=1)CC1=CC=CC=C1 WWTBZEKOSBFBEM-SPWPXUSOSA-N 0.000 description 6
- QFLWZFQWSBQYPS-AWRAUJHKSA-N (3S)-3-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[5-[(3aS,6aR)-2-oxo-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]pentanoylamino]-3-methylbutanoyl]amino]-3-(4-hydroxyphenyl)propanoyl]amino]-4-[1-bis(4-chlorophenoxy)phosphorylbutylamino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound CCCC(NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](Cc1ccc(O)cc1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CCCCC1SC[C@@H]2NC(=O)N[C@H]12)C(C)C)P(=O)(Oc1ccc(Cl)cc1)Oc1ccc(Cl)cc1 QFLWZFQWSBQYPS-AWRAUJHKSA-N 0.000 description 6
- IWZSHWBGHQBIML-ZGGLMWTQSA-N (3S,8S,10R,13S,14S,17S)-17-isoquinolin-7-yl-N,N,10,13-tetramethyl-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-dodecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-3-amine Chemical compound CN(C)[C@H]1CC[C@]2(C)C3CC[C@@]4(C)[C@@H](CC[C@@H]4c4ccc5ccncc5c4)[C@@H]3CC=C2C1 IWZSHWBGHQBIML-ZGGLMWTQSA-N 0.000 description 6
- ONBQEOIKXPHGMB-VBSBHUPXSA-N 1-[2-[(2s,3r,4s,5r)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]oxy-4,6-dihydroxyphenyl]-3-(4-hydroxyphenyl)propan-1-one Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CC(O)=CC(O)=C1C(=O)CCC1=CC=C(O)C=C1 ONBQEOIKXPHGMB-VBSBHUPXSA-N 0.000 description 6
- UNILWMWFPHPYOR-KXEYIPSPSA-M 1-[6-[2-[3-[3-[3-[2-[2-[3-[[2-[2-[[(2r)-1-[[2-[[(2r)-1-[3-[2-[2-[3-[[2-(2-amino-2-oxoethoxy)acetyl]amino]propoxy]ethoxy]ethoxy]propylamino]-3-hydroxy-1-oxopropan-2-yl]amino]-2-oxoethyl]amino]-3-[(2r)-2,3-di(hexadecanoyloxy)propyl]sulfanyl-1-oxopropan-2-yl Chemical compound O=C1C(SCCC(=O)NCCCOCCOCCOCCCNC(=O)COCC(=O)N[C@@H](CSC[C@@H](COC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC)C(=O)NCC(=O)N[C@H](CO)C(=O)NCCCOCCOCCOCCCNC(=O)COCC(N)=O)CC(=O)N1CCNC(=O)CCCCCN\1C2=CC=C(S([O-])(=O)=O)C=C2CC/1=C/C=C/C=C/C1=[N+](CC)C2=CC=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C1 UNILWMWFPHPYOR-KXEYIPSPSA-M 0.000 description 6
- YSUIQYOGTINQIN-UZFYAQMZSA-N 2-amino-9-[(1S,6R,8R,9S,10R,15R,17R,18R)-8-(6-aminopurin-9-yl)-9,18-difluoro-3,12-dihydroxy-3,12-bis(sulfanylidene)-2,4,7,11,13,16-hexaoxa-3lambda5,12lambda5-diphosphatricyclo[13.2.1.06,10]octadecan-17-yl]-1H-purin-6-one Chemical compound NC1=NC2=C(N=CN2[C@@H]2O[C@@H]3COP(S)(=O)O[C@@H]4[C@@H](COP(S)(=O)O[C@@H]2[C@@H]3F)O[C@H]([C@H]4F)N2C=NC3=C2N=CN=C3N)C(=O)N1 YSUIQYOGTINQIN-UZFYAQMZSA-N 0.000 description 6
- TVTJUIAKQFIXCE-HUKYDQBMSA-N 2-amino-9-[(2R,3S,4S,5R)-4-fluoro-3-hydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-7-prop-2-ynyl-1H-purine-6,8-dione Chemical compound NC=1NC(C=2N(C(N(C=2N=1)[C@@H]1O[C@@H]([C@H]([C@H]1O)F)CO)=O)CC#C)=O TVTJUIAKQFIXCE-HUKYDQBMSA-N 0.000 description 6
- QBWKPGNFQQJGFY-QLFBSQMISA-N 3-[(1r)-1-[(2r,6s)-2,6-dimethylmorpholin-4-yl]ethyl]-n-[6-methyl-3-(1h-pyrazol-4-yl)imidazo[1,2-a]pyrazin-8-yl]-1,2-thiazol-5-amine Chemical compound N1([C@H](C)C2=NSC(NC=3C4=NC=C(N4C=C(C)N=3)C3=CNN=C3)=C2)C[C@H](C)O[C@H](C)C1 QBWKPGNFQQJGFY-QLFBSQMISA-N 0.000 description 6
- 229940126657 Compound 17 Drugs 0.000 description 6
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- OPFJDXRVMFKJJO-ZHHKINOHSA-N N-{[3-(2-benzamido-4-methyl-1,3-thiazol-5-yl)-pyrazol-5-yl]carbonyl}-G-dR-G-dD-dD-dD-NH2 Chemical compound S1C(C=2NN=C(C=2)C(=O)NCC(=O)N[C@H](CCCN=C(N)N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(N)=O)=C(C)N=C1NC(=O)C1=CC=CC=C1 OPFJDXRVMFKJJO-ZHHKINOHSA-N 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- LJOOWESTVASNOG-UFJKPHDISA-N [(1s,3r,4ar,7s,8s,8as)-3-hydroxy-8-[2-[(4r)-4-hydroxy-6-oxooxan-2-yl]ethyl]-7-methyl-1,2,3,4,4a,7,8,8a-octahydronaphthalen-1-yl] (2s)-2-methylbutanoate Chemical compound C([C@H]1[C@@H](C)C=C[C@H]2C[C@@H](O)C[C@@H]([C@H]12)OC(=O)[C@@H](C)CC)CC1C[C@@H](O)CC(=O)O1 LJOOWESTVASNOG-UFJKPHDISA-N 0.000 description 6
- LNUFLCYMSVYYNW-ZPJMAFJPSA-N [(2r,3r,4s,5r,6r)-2-[(2r,3r,4s,5r,6r)-6-[(2r,3r,4s,5r,6r)-6-[(2r,3r,4s,5r,6r)-6-[[(3s,5s,8r,9s,10s,13r,14s,17r)-10,13-dimethyl-17-[(2r)-6-methylheptan-2-yl]-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthren-3-yl]oxy]-4,5-disulfo Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](COS(O)(=O)=O)O[C@@H]([C@@H]([C@H]1OS(O)(=O)=O)OS(O)(=O)=O)O[C@@H]1[C@@H](COS(O)(=O)=O)O[C@@H]([C@@H]([C@H]1OS(O)(=O)=O)OS(O)(=O)=O)O[C@@H]1[C@@H](COS(O)(=O)=O)O[C@H]([C@@H]([C@H]1OS(O)(=O)=O)OS(O)(=O)=O)O[C@@H]1C[C@@H]2CC[C@H]3[C@@H]4CC[C@@H]([C@]4(CC[C@@H]3[C@@]2(C)CC1)C)[C@H](C)CCCC(C)C)[C@H]1O[C@H](COS(O)(=O)=O)[C@@H](OS(O)(=O)=O)[C@H](OS(O)(=O)=O)[C@H]1OS(O)(=O)=O LNUFLCYMSVYYNW-ZPJMAFJPSA-N 0.000 description 6
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 6
- XRWSZZJLZRKHHD-WVWIJVSJSA-N asunaprevir Chemical compound O=C([C@@H]1C[C@H](CN1C(=O)[C@@H](NC(=O)OC(C)(C)C)C(C)(C)C)OC1=NC=C(C2=CC=C(Cl)C=C21)OC)N[C@]1(C(=O)NS(=O)(=O)C2CC2)C[C@H]1C=C XRWSZZJLZRKHHD-WVWIJVSJSA-N 0.000 description 6
- KGNDCEVUMONOKF-UGPLYTSKSA-N benzyl n-[(2r)-1-[(2s,4r)-2-[[(2s)-6-amino-1-(1,3-benzoxazol-2-yl)-1,1-dihydroxyhexan-2-yl]carbamoyl]-4-[(4-methylphenyl)methoxy]pyrrolidin-1-yl]-1-oxo-4-phenylbutan-2-yl]carbamate Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1CO[C@H]1CN(C(=O)[C@@H](CCC=2C=CC=CC=2)NC(=O)OCC=2C=CC=CC=2)[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)(O)C=2OC3=CC=CC=C3N=2)C1 KGNDCEVUMONOKF-UGPLYTSKSA-N 0.000 description 6
- 229940125904 compound 1 Drugs 0.000 description 6
- 229940125773 compound 10 Drugs 0.000 description 6
- 229940125797 compound 12 Drugs 0.000 description 6
- 229940126543 compound 14 Drugs 0.000 description 6
- 229940125758 compound 15 Drugs 0.000 description 6
- 229940126142 compound 16 Drugs 0.000 description 6
- 229940125782 compound 2 Drugs 0.000 description 6
- 229940125810 compound 20 Drugs 0.000 description 6
- 229940126086 compound 21 Drugs 0.000 description 6
- 229940126208 compound 22 Drugs 0.000 description 6
- 229940125833 compound 23 Drugs 0.000 description 6
- 229940125961 compound 24 Drugs 0.000 description 6
- 229940125846 compound 25 Drugs 0.000 description 6
- 229940125851 compound 27 Drugs 0.000 description 6
- 229940127204 compound 29 Drugs 0.000 description 6
- 229940126214 compound 3 Drugs 0.000 description 6
- 229940125898 compound 5 Drugs 0.000 description 6
- JAXFJECJQZDFJS-XHEPKHHKSA-N gtpl8555 Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)N[C@H](B1O[C@@]2(C)[C@H]3C[C@H](C3(C)C)C[C@H]2O1)CCC1=CC=C(F)C=C1 JAXFJECJQZDFJS-XHEPKHHKSA-N 0.000 description 6
- 238000010829 isocratic elution Methods 0.000 description 6
- ZLVXBBHTMQJRSX-VMGNSXQWSA-N jdtic Chemical compound C1([C@]2(C)CCN(C[C@@H]2C)C[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H]2NCC3=CC(O)=CC=C3C2)=CC=CC(O)=C1 ZLVXBBHTMQJRSX-VMGNSXQWSA-N 0.000 description 6
- 229960000268 spectinomycin Drugs 0.000 description 6
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 6
- 208000025721 COVID-19 Diseases 0.000 description 5
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 description 5
- NSFFHOGKXHRQEW-UHFFFAOYSA-N Thiostrepton B Natural products N1C(=O)C(C)NC(=O)C(=C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(C(C)CC)NC(C(C2=N3)O)C=CC2=C(C(C)O)C=C3C(=O)OC(C)C(C=2SC=C(N=2)C2N=3)NC(=O)C(N=4)=CSC=4C(C(C)(O)C(C)O)NC(=O)C(N=4)CSC=4C(=CC)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C(N=4)=CSC=4C21CCC=3C1=NC(C(=O)NC(=C)C(=O)NC(=C)C(N)=O)=CS1 NSFFHOGKXHRQEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- XZNUGFQTQHRASN-XQENGBIVSA-N apramycin Chemical compound O([C@H]1O[C@@H]2[C@H](O)[C@@H]([C@H](O[C@H]2C[C@H]1N)O[C@@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@H](N)[C@@H](CO)O1)O)NC)[C@@H]1[C@@H](N)C[C@@H](N)[C@H](O)[C@H]1O XZNUGFQTQHRASN-XQENGBIVSA-N 0.000 description 5
- 229950006334 apramycin Drugs 0.000 description 5
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 5
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 5
- 229930188070 thiostrepton Natural products 0.000 description 5
- NSFFHOGKXHRQEW-AIHSUZKVSA-N thiostrepton Chemical compound C([C@]12C=3SC=C(N=3)C(=O)N[C@H](C(=O)NC(/C=3SC[C@@H](N=3)C(=O)N[C@H](C=3SC=C(N=3)C(=O)N[C@H](C=3SC=C(N=3)[C@H]1N=1)[C@@H](C)OC(=O)C3=CC(=C4C=C[C@H]([C@@H](C4=N3)O)N[C@H](C(N[C@@H](C)C(=O)NC(=C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N2)=O)[C@@H](C)CC)[C@H](C)O)[C@](C)(O)[C@@H](C)O)=C\C)[C@@H](C)O)CC=1C1=NC(C(=O)NC(=C)C(=O)NC(=C)C(N)=O)=CS1 NSFFHOGKXHRQEW-AIHSUZKVSA-N 0.000 description 5
- 229940063214 thiostrepton Drugs 0.000 description 5
- NSFFHOGKXHRQEW-OFMUQYBVSA-N thiostrepton A Natural products CC[C@H](C)[C@@H]1N[C@@H]2C=Cc3c(cc(nc3[C@H]2O)C(=O)O[C@H](C)[C@@H]4NC(=O)c5csc(n5)[C@@H](NC(=O)[C@H]6CSC(=N6)C(=CC)NC(=O)[C@@H](NC(=O)c7csc(n7)[C@]8(CCC(=N[C@@H]8c9csc4n9)c%10nc(cs%10)C(=O)NC(=C)C(=O)NC(=C)C(=O)N)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)C(=C)NC(=O)[C@H](C)NC1=O)[C@@H](C)O)[C@](C)(O)[C@@H](C)O)[C@H](C)O NSFFHOGKXHRQEW-OFMUQYBVSA-N 0.000 description 5
- 229960001082 trimethoprim Drugs 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101800000535 3C-like proteinase Proteins 0.000 description 4
- 101800002396 3C-like proteinase nsp5 Proteins 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 101150067314 aadA gene Proteins 0.000 description 4
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 4
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 4
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 4
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 description 4
- XELZGAJCZANUQH-UHFFFAOYSA-N methyl 1-acetylthieno[3,2-c]pyrazole-5-carboxylate Chemical compound CC(=O)N1N=CC2=C1C=C(C(=O)OC)S2 XELZGAJCZANUQH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 241000350481 Pterogyne nitens Species 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 3
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 238000003032 molecular docking Methods 0.000 description 3
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 101150066142 tsr gene Proteins 0.000 description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 3
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 3
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101100288095 Klebsiella pneumoniae neo gene Proteins 0.000 description 2
- 102000016397 Methyltransferase Human genes 0.000 description 2
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 2
- 241000187432 Streptomyces coelicolor Species 0.000 description 2
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 description 2
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 2
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 238000005191 phase separation Methods 0.000 description 2
- 238000012746 preparative thin layer chromatography Methods 0.000 description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 244000153158 Ammi visnaga Species 0.000 description 1
- 235000010585 Ammi visnaga Nutrition 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 101000979117 Curvularia clavata Nonribosomal peptide synthetase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 235000019733 Fish meal Nutrition 0.000 description 1
- 108700032487 GAP-43-3 Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N L-arabinopyranose Chemical compound O[C@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 101150109417 NRPS gene Proteins 0.000 description 1
- 101100397226 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) isp4 gene Proteins 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000004467 fishmeal Substances 0.000 description 1
- XRECTZIEBJDKEO-UHFFFAOYSA-N flucytosine Chemical compound NC1=NC(=O)NC=C1F XRECTZIEBJDKEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004413 flucytosine Drugs 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 1
- 238000003919 heteronuclear multiple bond coherence Methods 0.000 description 1
- 238000005570 heteronuclear single quantum coherence Methods 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- SYHGEUNFJIGTRX-UHFFFAOYSA-N methylenedioxypyrovalerone Chemical compound C=1C=C2OCOC2=CC=1C(=O)C(CCC)N1CCCC1 SYHGEUNFJIGTRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000005065 mining Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- UPSFMJHZUCSEHU-JYGUBCOQSA-N n-[(2s,3r,4r,5s,6r)-2-[(2r,3s,4r,5r,6s)-5-acetamido-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)-6-(4-methyl-2-oxochromen-7-yl)oxyoxan-3-yl]oxy-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-3-yl]acetamide Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](NC(C)=O)[C@H](OC=2C=C3OC(=O)C=C(C)C3=CC=2)O[C@@H]1CO UPSFMJHZUCSEHU-JYGUBCOQSA-N 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 125000003367 polycyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013341 scale-up Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/12—Cyclic peptides with only normal peptide bonds in the ring
- C07K5/126—Tetrapeptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/36—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Actinomyces; from Streptomyces (G)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Virology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了脂肽类化合物Totopotensamides及其制备方法和应用。本发明公开了的抗生素化合物Totopotensamides(TPMs)R1‑1到R1‑6(1‑6)、R2‑1(7)、P3‑1(8)、P3‑2(9)、P2‑1到P2‑7(10‑16)、U5‑1(17)、U5‑2(18)，H1到H8(19‑26)和HM1到HM3(27‑29)。本发明从突变菌株中分离纯化得到具有抗病毒活性的，特别对新型冠状病毒的3CL水解酶具有抑制活性，有望用于制备抗新型冠状病毒药物。
Description
技术领域：
本发明属于工业微生物领域，具体涉及新的抗生素化合物Totopotensamides(TPMs)R1-1到R1-6(1-6)、R2-1(7)、P3-1(8)、P3-2(9)、P2-1到P2-7(10-16)、U5-1(17)、U5-2(18)，H1到H8(19-26)和HM1到HM3(27-29)及其制备方法和应用。
背景技术：
TPMs是一类脂肽类化合物，这一家族的化合物结构多样，具有抗菌、抗肿瘤、抗炎和抗病毒等多种生物活性。众所周知，由于各种因素的影响，没有经过结构修饰的天然产物成药难度很大。随着分子生物学和基因编辑技术的进步，使得从天然产物生物合成基因改造和体外酶学催化角度出发的天然产物结构优化变为可能，而且具有特异性强，催化效率高和绿色环保的优点。
发明内容：
本发明的第一个目的是提供29个新的TPMs类抗生素TPMs R1-1到R1-6(1-6)、R2-1(7)、P3-1(8)、P3-2(9)、P2-1到P2-7(10-16)、U5-1(17)、U5-2(18)，H1到H8(19-26)和HM1到HM3(27-29)。
本发明的29个新的TPMs类抗生素TPMs R1-1到R1-6(1-6)、R2-1(7)、P3-1(8)、P3-2(9)、P2-1到P2-7(10-16)、U5-1(17)、U5-2(18)，H1到H8(19-26)和HM1到HM3(27-29)，其结构如(I)所示：
本发明的第二个目的是提供一种重组菌株Streptomyces pactum SCSIO02999/ΔtotR5i/pPWW50-totR1，其特征在于，是将S.pactum SCSIO 02999菌株中的Totopotensamides生物合成基因簇中的负调控基因totR5进行敲除、同时将正调控基因totR1进行超表达得到。
本发明的第三个目的是提供一种重组菌株S.pactum SCSIO02999/ΔtotR5i/pPWW50-totR2，其特征在于，是将S.pactum SCSIO 02999菌株中的Totopotensamides生物合成基因簇中的负调控基因totR5进行敲除、同时将正调控基因totR2进行超表达得到。
本发明的第四个目的是提供一种重组菌株S.lividans TK64/pCSG5549/ΔtotR5i/ΔtotR3i/ΔtotP3，其特征在于，是将Totopotensamides生物合成基因簇导入到异源宿主S.lividans TK64中，对Totopotensamides生物合成基因簇中的负调控基因totR5和totR3进行同框缺失，再对基因簇中的P450基因totP3进行插入缺失得到。
本发明的第五个目的是提供一种重组菌株S.lividans TK64/pCSG549/ΔtotR5i/ΔtotR3i/ΔtotP2i，其特征在于，是将Totopotensamides生物合成基因簇导入到异源宿主S.lividans TK64中，对Totopotensamides生物合成基因簇中的负调控基因totR5和totR3进行同框缺失，再对基因簇中的P450基因totP2进行同框缺失得到。
本发明的第六个目的是提供一种重组菌株S.lividans TK64/pCSG5549/ΔtotR5i/ΔtotR3i/ΔtotU5i，其特征在于，是将Totopotensamides生物合成基因簇导入到异源宿主S.lividans TK64中，对基因簇中的负调控基因totR5和totR3进行同框缺失，再对基因簇中的甲基转移酶基因totU5进行同框缺失得到。
本发明的第七个目的是提供一种重组菌株S.lividans TK64/pCSG5549/ΔtotR5i/ΔtotR3i/ΔtotHi，其特征在于，是将Totopotensamides生物合成基因簇导入到异源宿主S.lividans TK64中，对基因簇中的负调控基因totR5和totR3进行同框缺失，再对基因簇中的卤化酶基因totH进行同框缺失得到。
本发明的第八个目的是提供一种重组菌株S.lividans TK64/pCSG5549/ΔtotR5i/ΔtotR3i/ΔtotHi/ΔtotMi，其特征在于，是将Totopotensamides生物合成基因簇导入到异源宿主S.lividans TK64中，对基因簇中的负调控基因totR5和totR3进行同框缺失，再对基因簇中卤化酶基因totH和甲基转移酶基因totM进行同框缺失得到。
本发明的第九个目的是提供一种制备TPMs R1-1到R1-6(1-6)、R2-1(7)、P3-1(8)、P3-2(9)、P2-1到P2-7(10-16)、U5-1(17)、U5-2(18)，H1到H8(19-26)和HM1到HM3(27-29)的方法，其特征在于，TPMs R1-1到R1-6(1-6)是从重组菌株S.pactum SCSIO02999/ΔtotR5i/pPWW50-totR1代谢产物中分离得到；R2-1(7)是从重组菌株S.pactum SCSIO02999/ΔtotR5i/pPWW50-totR2代谢产物中分离得到；P3-1(8)和P3-2(9)是从重组菌株S.lividansTK64/pCSG5549/ΔtotR5i/ΔtotR3i/ΔtotP3代谢产物中分离得到；P2-1到P2-7(10-16)是从重组菌株S.lividans TK64/pCSG5549/ΔtotR5i/ΔtotR3i/ΔtotP2i代谢产物中分离得到；U5-1(17)和U5-2(18)是从重组菌株S.lividans TK64/pCSG5549/ΔtotR5i/ΔtotR3i/ΔtotU5i代谢产物中分离得到；H1到H8(19-26)是从重组菌株S.lividans TK64/pCSG5549/ΔtotR5i/ΔtotR3i/ΔtotHi代谢产物中分离得到；HM1到HM3(27-29)是从重组菌株S.lividans TK64/pCSG5549/ΔtotR5i/ΔtotR3i/ΔtotHi/ΔtotMi代谢产物中分离得到。本发明的第十个目的是提供上述脂肽类化合物Totopotensamides(TPMs)R1-6(1-6)、R2-1(7)、P3-1(8)、P3-2(9)、P2-1到P2-7(10-16)、U5-1(17)、U5-2(18)，H1到H8(19-26)和HM1到HM3(27-29)中的任一化合物在制备抗病毒药物中的应用。
优选，所述抗病毒药物是抗COVID-19病毒的药物。
本发明从重组菌株中分离纯化得到具有抗病毒活性的，特别对新型冠状病毒的3CL水解酶具有抑制活性，有望用于制备抗新型冠状病毒药物。
本发明的链霉菌(Streptomyces pactum)SCSIO 02999公开于专利201210146664.X中，其于2012年4月26日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉市武汉大学，其保藏编号为：CCTCC NO：M 2012145。
本发明的Streptomyces lividans TK64公开于文献：Saha,S.,Zhang,W.J.,Zhang,G.T.,Zhu,Y.G.,Chen,Y.C.,Liu,W.,Yuan,C.S.,Zhang,Q.B.,Zhang,H.B.,Zhang,L.P.,Zhang,W.M.,and Zhang,C.S.(2017)Activation and characterization of acryptic gene cluster reveals a cyclization cascade for polycyclic tetramatemacrolactams,Chem.Sci.8,1607-1612.该菌种本申请人也持有，并保证自申请日起20年内向公众提供。
附图说明：
图1是S.pactum SCSIO 02999中totopotensamides生物合成基因簇图；
图2是BAC质粒pCSG5549的末端测序图；
图3是totR5敲除示意图；
图4是totR3敲除示意图；
图5是totP2敲除示意图；
图6是totP3敲除示意图；
图7是质粒pCSG8006的构建图；
图8是质粒pCSG5585的构建图；
图9是质粒pCSG5556的构建图；
图10是质粒pCSG5557的构建图；
图11是totU5敲除示意图；
图12是totH敲除示意图；
图13是totM在totH敲除基础上的敲除示意图；
图14是重组菌株S.lividans TK64/pCSG5549/ΔtotR5i/ΔtotR3i/ΔtotP3的发酵提取物的高效液相色谱图；
图15是重组菌株S.lividans TK64/pCSG5549/ΔtotR5i/ΔtotR3i/ΔtotP2i的发酵提取物的高效液相色谱图；
图16是重组菌株S.lividans TK64/pCSG5549/ΔtotR5i/ΔtotR3i/ΔtotU5i的发酵提取物的高效液相色谱图；
图17是重组菌株S.lividans TK64/pCSG5549/ΔtotR5i/ΔtotR3i/ΔtotHi的发酵提取物的高效液相色谱图；
图18是重组菌株S.lividans TK64/pCSG5549/ΔtotR5i/ΔtotR3i/ΔtotHi/ΔtotMi的发酵提取物的高效液相色谱图；
高效液相色谱(HPLC)条件：色谱柱为Phenomenex C18,150×4.6mm,5μm，流动相包括A相和B相，流动相A相：10％的乙腈/水(v/v)+0.1％的甲酸(v/v)，流动B相：90％的乙腈/水(v/v)；进样程序：0-20min，流动相比例为A相/B相(v/v)：95:5-5:95，20-21min，流动相比例为A相/B相(v/v)：5:95，21-25min，流动相比例为A相/B相(v/v)：5:95-95:5，25-30，流动相比例为A相/B相(v/v)：95:5，检测波长238nm，流速1mL·min-1。
图19是化合物1的1H-NMR谱图
图20是化合物1的13C-NMR谱图
图21是化合物1的DEPT135谱图
图22是化合物1的COSY谱图
图23是化合物1的HSQC谱图
图24是化合物1的HMBC谱图
图25是化合物2的1H-NMR谱图
图26是化合物2的13C-NMR谱图
图27是化合物2的DEPT135谱图
图28是化合物2的COSY谱图
图29是化合物2的HSQC谱图
图30是化合物2的HMBC谱图
图31是化合物3的1H-NMR谱图
图32是化合物3的13C-NMR谱图
图33是化合物3的DEPT135谱图
图34是化合物3的COSY谱图
图35是化合物3的HSQC谱图
图36是化合物3的HMBC谱图
图37是化合物4的1H-NMR谱图
图38是化合物4的13C-NMR谱图
图39是化合物4的DEPT135谱图
图40是化合物4的COSY谱图
图41是化合物4的HSQC谱图
图42是化合物4的HMBC谱图
图43是化合物5的1H-NMR谱图
图44是化合物5的13C-NMR谱图
图45是化合物5的DEPT135谱图
图46是化合物5的COSY谱图
图47是化合物5的HSQC谱图
图48是化合物5的HMBC谱图
图49是化合物6的1H-NMR谱图
图50是化合物6的13C-NMR谱图
图51是化合物6的DEPT135谱图
图52是化合物6的COSY谱图
图53是化合物6的HSQC谱图
图54是化合物6的HMBC谱图
图55是化合物7的1H-NMR谱图
图56是化合物7的13C-NMR谱图
图57是化合物7的DEPT135谱图
图58是化合物7的COSY谱图
图59是化合物7的HSQC谱图
图60是化合物7的HMBC谱图
图61是化合物8的1H-NMR谱图
图62是化合物8的13C-NMR谱图
图63是化合物8的DEPT135谱图
图64是化合物8的COSY谱图
图65是化合物8的HSQC谱图
图66是化合物8的HMBC谱图
图67是化合物9的1H-NMR谱图
图68是化合物9的13C-NMR谱图
图69是化合物9的DEPT135谱图
图70是化合物9的COSY谱图
图71是化合物9的HSQC谱图
图72是化合物9的HMBC谱图
图73是化合物10的1H-NMR谱图
图74是化合物10的13C-NMR谱图
图75是化合物10的DEPT135谱图
图76是化合物10的COSY谱图
图77是化合物10的HSQC谱图
图78是化合物10的HMBC谱图
图79是化合物11的1H-NMR谱图
图80是化合物11的13C-NMR谱图
图81是化合物11的DEPT135谱图
图82是化合物11的COSY谱图
图83是化合物11的HSQC谱图
图84是化合物11的HMBC谱图
图85是化合物12的1H-NMR谱图
图86是化合物12的13C-NMR谱图
图87是化合物12的DEPT135谱图
图88是化合物12的COSY谱图
图89是化合物12的HSQC谱图
图90是化合物12的HMBC谱图
图91是化合物13的1H-NMR谱图
图92是化合物13的13C-NMR谱图
图93是化合物13的DEPT135谱图
图94是化合物13的COSY谱图
图95是化合物13的HSQC谱图
图96是化合物13的HMBC谱图
图97是化合物14的1H-NMR谱图
图98是化合物14的13C-NMR谱图
图99是化合物14的DEPT135谱图
图100是化合物14的COSY谱图
图101是化合物14的HSQC谱图
图102是化合物14的HMBC谱图
图103是化合物15的1H-NMR谱图
图104是化合物15的13C-NMR谱图
图105是化合物15的DEPT135谱图
图106是化合物15的COSY谱图
图107是化合物15的HSQC谱图
图108是化合物15的HMBC谱图
图109是化合物16的1H-NMR谱图
图110是化合物16的13C-NMR谱图
图111是化合物16的DEPT135谱图
图112是化合物16的COSY谱图
图113是化合物16的HSQC谱图
图114是化合物16的HMBC谱图
图115是化合物17的1H-NMR谱图
图116是化合物17的13C-NMR谱图
图117是化合物17的DEPT135谱图
图118是化合物17的COSY谱图
图119是化合物17的HSQC谱图
图120是化合物17的HMBC谱图
图121是化合物18的1H-NMR谱图
图122是化合物18的13C-NMR谱图
图123是化合物18的DEPT135谱图
图124是化合物18的COSY谱图
图125是化合物18的HSQC谱图
图126是化合物18的HMBC谱图
图127是化合物19的1H-NMR谱图
图128是化合物19的13C-NMR谱图
图129是化合物19的DEPT135谱图
图130是化合物19的COSY谱图
图131是化合物19的HSQC谱图
图132是化合物19的HMBC谱图
图133是化合物20的1H-NMR谱图
图134是化合物20的13C-NMR谱图
图135是化合物20的DEPT135谱图
图136是化合物20的COSY谱图
图137是化合物20的HSQC谱图
图138是化合物20的HMBC谱图
图139是化合物21的1H-NMR谱图
图140是化合物21的13C-NMR谱图
图141是化合物21的DEPT135谱图
图142是化合物21的COSY谱图
图143是化合物21的HSQC谱图
图144是化合物21的HMBC谱图
图145是化合物22的1H-NMR谱图
图146是化合物22的13C-NMR谱图
图147是化合物22的DEPT135谱图
图148是化合物22的COSY谱图
图149是化合物22的HSQC谱图
图150是化合物22的HMBC谱图
图151是化合物23的1H-NMR谱图
图152是化合物23的13C-NMR谱图
图153是化合物23的DEPT135谱图
图154是化合物23的COSY谱图
图155是化合物23的HSQC谱图
图156是化合物23的HMBC谱图
图157是化合物24的1H-NMR谱图
图158是化合物24的13C-NMR谱图
图159是化合物24的DEPT135谱图
图160是化合物24的COSY谱图
图161是化合物24的HSQC谱图
图162是化合物24的HMBC谱图
图163是化合物25的1H-NMR谱图
图164是化合物25的13C-NMR谱图
图165是化合物25的DEPT135谱图
图166是化合物25的COSY谱图
图167是化合物25的HSQC谱图
图168是化合物25的HMBC谱图
图169是化合物26的1H-NMR谱图
图170是化合物26的13C-NMR谱图
图171是化合物26的DEPT135谱图
图172是化合物26的COSY谱图
图173是化合物26的HSQC谱图
图174是化合物26的HMBC谱图
图175是化合物27的1H-NMR谱图
图176是化合物27的13C-NMR谱图
图177是化合物27的DEPT135谱图
图178是化合物27的COSY谱图
图179是化合物27的HSQC谱图
图180是化合物27的HMBC谱图
图181是化合物28的1H-NMR谱图
图182是化合物28的13C-NMR谱图
图183是化合物28的DEPT135谱图
图184是化合物28的COSY谱图
图185是化合物28的HSQC谱图
图186是化合物28的HMBC谱图
图187是化合物29的1H-NMR谱图
图188是化合物29的13C-NMR谱图
图189是化合物29的DEPT135谱图
图190是化合物29的COSY谱图
图191是化合物29的HSQC谱图
图192是化合物29的HMBC谱图。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
本发明专利中涉及的Totopotensamides生物合成基因簇中的tot系列基因和orf基因都公开于申请号：201710928251.X，一种环脂肽类化合物生物合成基因簇及其激活方法与应用的专利中，其基因簇图见图1。
1、重组菌株S.pactum SCSIO 02999/ΔtotR5i/pPWW50-totR1的构建
在负调控基因totR5缺失的突变株S.pactum SCSIO 02999/ΔtotR5i(菌株的构建方法参见专利：申请号：201710928251.X，一种环脂肽类化合物生物合成基因簇及其激活方法与应用，即该专利中的突变株ΔtotR5i)中通过接合转移导入构建好的将正调控基因totR1置于强启动子ermE*p下表达的质粒pPWW50-totR1(即将正调控基因totR1置于质粒pPWW50的强启动子ermE*p下)，得到重组菌株S.pactum SCSIO 02999/ΔtotR5i/pPWW50-totR1。
2、重组菌株S.pactum SCSIO 02999/ΔtotR5i/pPWW50-totR2的构建
在负调控基因totR5缺失的突变株S.pactum SCSIO 02999/ΔtotR5i中导入构建好的将正调控基因totR2置于强启动子ermE*P下表达的质粒pPWW50-totR2，得到重组菌株S.pactum SCSIO 02999/ΔtotR5i/pPWW50-totR2。
3、BAC质粒pCSG5549的筛选
根据totopotensamides生物合成基因簇(图1)(参见专利：申请号：201710928251.X，一种环脂肽类化合物生物合成基因簇及其激活方法与应用)的上下游基因orf(-1)和totR5设计引物(表1)对S.pactum SCSIO 02999的BAC文库进行筛选，获得阳性克隆子，对其进行末端测序(图2)，确定该BAC质粒包含了整个tot生物合成基因簇，将其命名为pCSG5549。
4、重组菌株S.lividans TK64/pCSG5549/ΔtotR5i/ΔtotR3i的构建
通过三亲本接合转移的方法将pCSG5549导入到链霉菌S.lividans TK64中，得到重组菌株S.lividans TK64/pCSG5549。随后通过PCR-targeting的方法对tot基因簇中的负调控基因totR5进行敲除，得到S.lividans TK64/pCSG5549/ΔtotR5i(图3)，为进一步提高产量，对tot基因簇中的另外一个负调控基因totR3进行敲除，得到重组菌株S.lividansTK64/pCSG5549/ΔtotR5i/ΔtotR3i(图4)。
5、P450基因totP2和totP3敲除突变株的构建
通过PCR-targeting的方法，对tot生物合成基因簇中的P450基因totP2和totP3进行了体内功能的验证，其敲除的示意图分别如图5和图6所示。即对重组菌株S.lividansTK64/pCSG5549/ΔtotR5i/ΔtotR3i中的totP2和totP3分别进行敲除，得到重组菌株S.lividans TK64/pCSG5549/ΔtotR5i/ΔtotR3i/ΔtotP2i和S.lividans TK64/pCSG5549/ΔtotR5i/ΔtotR3i/ΔtotP3，对这两个突变株进行小发酵检测，其代谢图谱如图14和图15所示，从重组菌株S.lividans TK64/pCSG5549/ΔtotR5i/ΔtotR3i/ΔtotP2i中分离到化合物P2-1到P2-7(10-16)，从重组菌株S.livi dans TK64/pCSG5549/ΔtotR5i/ΔtotR3i/ΔtotP3中分离到P3-1(8)和P3-2(9)。
6、采用CRISPR-cas9的方法对基因簇中其他基因功能进行研究
对pWHU2653(参见文献Zeng,H.,Wen,S.S.,Xu,W.,He,Z.R.,Zhai,G.F.,Liu,Y.K.,Deng,Z.X.,and Sun,Y.H.(2015)Highly efficient editing of the actinorhodinpolyketide chain length factor gene in Streptomyces coelicolor M145 usingCRISPR/Cas9-CodA(sm)combined system,Appl.Microbiol.Biotechnol.99,10575-10585.)进行改造，将介导Cas9蛋白表达的强启动子ermE*p换成了诱导型的启动子tipA*p，另外添加了硫链丝菌素基因tsr，改造后的载体命名为pCSG8006(图7)。基于pCSG8006，构建了用于甲基转移酶totU5敲除的质粒pCSG5585(图8)，用于卤化酶基因敲除的质粒pCSG5556(图9)和用于甲基转移酶totM敲除的质粒pCSG5557(图10)。用pCSG5585对totU5进行敲除得到重组菌株S.lividans TK64/pCSG5549/ΔtotR5i/ΔtotR3i/ΔtotU5i(图11)，从其发酵提取物中(图16)分离到化合物U5-1(17)和U5-2(18)；用pCSG5556对totH进行敲除得到重组菌株S.lividans TK64/pCSG5549/ΔtotR5i/ΔtotR3i/ΔtotHi(图12)，从其发酵提取物中(图17)分离到化合物H1到H8(19-26)；用pCSG5557在重组菌株S.lividans TK64/pCSG5549/ΔtotR5i/ΔtotR3i/ΔtotHi的基础上对totM进行敲除得到重组菌株S.lividans TK64/pCSG5549/ΔtotR5i/ΔtotR3i/ΔtotHi/ΔtotMi(图13)，从其发酵提取物(图18)中分离到化合物HM1(27)，HM2(28)和HM3(29)。
表1.本发明中使用的引物
实施案例1：重组菌株S.lividans TK64/pCSG5549的构建
根据tot生物合成基因簇(图1)的上游基因orf(-1)和下游基因totR5设计引物orf(-1)testF/R和totR5testF/R(引物序列如表1所示)，对菌株S.pactum SCSIO 02999的BAC文库中筛选出克隆子pCSG5549，经末端测序(图2)，确认pCSG5549包含totopotensamides生物合成基因簇的所有基因。通过三亲本接合转移的方法将pCSG5549导入到异源宿主S.lividans TK64中。接合转移过程说明如下：S.lividans TK64在SFM培养基平板中划线培养5-7d，长出的孢子用无菌棉签收集于TSB培养基中，涡旋振荡，使孢子分散；过滤分离菌丝体和孢子，孢子悬浮于5mL的TSB培养基中，50℃热激10min，然后于28℃萌发2h，作为接合转移的受体菌。供体菌E.coli DH 10B/pCSG5549(将质粒pCSG5549转入到E.coli DH10B中获得)在50mL含50μg mL-1阿泊拉霉素的LB液体培养基中于37℃生长至OD600值约为0.8。含穿梭质粒的助体菌E.coli ET12567/pUB307在50mL含50μg mL-1卡那霉素和50μg mL-1氯霉素的LB液体培养基中于37℃生长至OD600值约为0.8，离心收集两种菌体(4000rpm，10min)，用LB清洗3遍，悬浮于300μL LB培养基中，作为接合转移的供体菌。取上述受体菌400μL和供体菌100μL混合均匀，涂布于不含任何抗生素的ISP4固体培养基上，吹干后，于28℃培养18-20h；然后将平板取出，用含有抗生素的水覆盖平板，抗生素终浓度为50μg mL-1阿泊拉霉素和100μg mL-1甲氧苄氨嘧啶，吹干后，置于28℃培养箱中，培养5-7d后观察；当接合转移平板上长出菌落后，用无菌牙签将其转接到含有50μg mL-1阿泊拉霉素和100μg mL-1甲氧苄氨嘧啶的SFM平板上，28℃培养3d后，抽取各个突变株的基因组DNA，利用检测引物orf(-1)testF/R和totR5testF/R(表1)通过PCR检测获得阳性克隆，即pCSG5549异源表达菌株S.lividansTK64/pCSG5549。
实施案例2：重组菌株S.lividans TK64/pCSG5549/ΔtotR5i/ΔtotR3i的构建
通过PCR-targeting的方法对cosmid pCSG4809(totR5基因被同框缺失)中neo基因用oriT/aadA片段置换(图3)。具体说明如下：(1)将质粒pCSG4809(参见文献Chen,R.D.,Zhang,Q.B.,Tan,B.,Zheng,L.J.,Li,H.X.,Zhu,Y.G.,andZhang,C.S.(2017)Genomemining and activation ofa silent PKS/NRPS gene cluster directtheproductionoftotopotensamides,Org.Lett.19,5697-5700.)转入大肠杆菌E.coli BW25113/pIJ790中获得E.coli BW25113/pIJ790/pCSG4809，用10mmol L-1的L-阿拉伯糖诱导λ/red重组系统表达，并将其制备成为电转感受态细胞待用；(2)用内切酶EcoR I和Hind III酶切质粒pIJ778，回收其中约1.4kb含有转移原点和壮观霉素抗性基因的DNA片段，以此作为PCR模板，用引物Neo-tarF/R(表1)通过PCR扩增出1.4kb的PCR产物，50μL的PCR反应体系：高保真DNA聚合酶3U，10×Buffer 5μL，dNTPs 0.5mmol L-1，DMSO 2.5μL，引物各0.5μmol L-1，DNA模板约1ng，加水补至50μL，PCR反应条件为：预变性94℃ 5min；扩增循环为94℃变性35s，58℃退火35s，72℃延伸90s，30个循环；最后72℃延伸10min。将1.4kb的PCR产物回收纯化待用；(3)将PCR产物电转入(1)步骤中制备的感受态细胞使其发生重组，涂布于LB筛选平板(200μg mL-1壮观霉素)上，37℃过夜培养，从平板上挑出阳性单克隆，抽提质粒，得到质粒pCSG5550；(4)将构建好的重组质粒pCSG5550转化到E.coli ET12567/pUZ8002中，构建成E.coli ET12567/pUZ8002/pCSG5550，作为接合转移的供体菌；(5)以S.lividans TK64/pCSG5549作为接合转移的受体菌，接合转移的过程与pCSG5549导入S.lividans TK64中的步骤相同，除了覆盖时用200μg mL-1壮观霉素，50μg mL-1阿泊拉霉素和100μg mL-1甲氧苄氨嘧啶；(6)将长出来的克隆子划线在含有200μg mL-1壮观霉素，50μg mL-1阿泊拉霉素和100μg mL-1甲氧苄氨嘧啶的SFM平板上，28℃生长3d后用totR5testF/R(表1)检测，筛选到的单交换或者双交换突变株划线到无抗的SFM板上产孢，孢子稀释涂布到无抗板上，将生长出来的单克隆分别划线在含200μg mL-1壮观霉素板和无抗板上，对在无抗板上生长在含壮观霉素的平板上面不生长的菌株用totR5testF/R引物验证，得到的阳性克隆子为菌株S.lividansTK64/pCSG5549/ΔtotR5i。
totR3的敲除(图4)是在cosmidpCSG4809上采用PCR-targeting的方法，设计基因敲除引物totR3-tarF/R(表1)，PCR-targeting过程同pCSG4809中neo基因的置换一样，得到totR3被oriT/aadA置换的质粒pCSG5551，质粒用SpeI酶切自连生成质粒pCSG5552，该质粒中的totR3基因被同框缺失。pCSG5552中的neo基因同样被oriT/aadA置换，其置换方法同pCSG4809中neo基因的置换方法一致，最后得到质粒pCSG5553，该质粒被导入到E.coliET12567/pUZ8002中，构建成E.coli ET12567/pUZ8002/pCSG5553，作为接合转移的供体菌，而S.lividans TK64/pCSG5549/ΔtotR5i作为接合转移的受体菌，其接合转移以及筛选的过程同S.lividans TK64/pCSG5549/ΔtotR5i的构建过程一致，最终获得totR3和totR5都被同框缺失的菌株S.lividans TK64/pCSG5549/ΔtotR5i/ΔtotR3i。
实施案例3：重组菌株S.lividans TK64/pCSG5549/ΔtotR5i/ΔtotR3i/ΔtotP2i的构建
采用PCR targeting的方法，设计基因敲除引物totP2-tarF/R(表1)对cosmidpCSG4801(参见文献Chen,R.D.,Zhang,Q.B.,Tan,B.,Zheng,L.J.,Li,H.X.,Zhu,Y.G.,andZhang,C.S.(2017)Genome mining and activation of a silent PKS/NRPS genecluster direct the production of totopotensamides,Org.Lett.19,5697-5700.)中totP2进行敲除(图5)，其构建方法同cosmid pCSG4809中neo基因被oriT/aadA置换一致，得到质粒pCSG5580，将质粒pCSG5580导入E.coli DH5α/BT340在28℃ Kan平板上面生长，划单克隆42℃培养，分别在含有Kan和Spc的LB固体平板上对点筛选，对在含有Kan的LB固体平板上生长，而在含有Spc的LB固体平板上不生长的单克隆，使用验证引物totP2-TestF/R(表1)验证，筛选出成功同框缺失的单克隆，抽取质粒，命名为pCSG5581。pCSG5581中neo基因的置换同pCSG4809中neo基因的置换方法一致，得到质粒pCSG5582，将质粒pCSG5582导入到E.coliET12567/pUZ8002中，构建成E.coli ET12567/pUZ8002/pCSG5582，作为接合转移的供体菌，而S.lividans TK64/pCSG5549/ΔtotR5i/ΔtotR3i作为接合转移的受体菌，其接合转移以及筛选的过程同S.lividans TK64/pCSG5549/ΔtotR5i的构建过程一致，最终获得totP2被同框缺失的菌株S.lividans TK64/pCSG5549/ΔtotR5i/ΔtotR3i/ΔtotP2i。
实施案例4：重组菌株S.lividans TK64/pCSG5549/ΔtotR5i/ΔtotR3i/ΔtotP3的构建
采用PCR targeting的方法，设计基因敲除引物totP3-tarF/R对cosmid pCSG4801中totP3进行敲除(图6)，其构建方法同cosmid pCSG4809中neo基因被oriT/aadA置换一致，最终得到totP3插入缺失的菌株S.lividans TK64/pCSG5549/ΔtotR5i/ΔtotR3i/ΔtotP3。
实施案例5：用于基因敲除的CRISPR-cas9质粒pCSG8006的构建
对pWHU2653(参见文献Zeng,H.,Wen,S.S.,Xu,W.,He,Z.R.,Zhai,G.F.,Liu,Y.K.,Deng,Z.X.,and Sun,Y.H.(2015)Highlyefficient editing of the actinorhodinpolyketide chain length factor gene in Streptomyces coelicolor M145 usingCRISPR/Cas9-CodA(sm)combined system,Appl.Microbiol.Biotechnol.99,10575-10585.)进行改造，将其中启动Cas9蛋白表达的ermE*p强启动子替换为诱导型的tipA*p启动子，另外添加硫链丝菌素抗性基因tsr，其构建步骤如下：设计引物tipA-F/R和tsr-F/R(表1)分别将tipA启动子片段和tsr基因片段从pPM927扩增出来，将两个扩增出来的片段通过融合PCR的方法扩增得到一个片段F1；包含Cas9基因的片段通过引物Cas9-F/R(表1)从pWHU2653中扩增出来得到片段F2；pWHU2653通过Xba I和EcoR I进行酶切，回收9.5kb的片段F3；最后这三个片段F1、F2和F3通过一步克隆试剂盒(Vazyme Biotech Co.,Ltd)进行组装，通过测序确认后得到质粒pCSG8006(图7)。
实施案例6：质粒pCSG5585，pCSG5556和pCSG5557的构建
用于totU5，totH和totM分别敲除的质粒pCSG5585(图8)，pCSG5556(图9)和pCSG5557(图10)的构建是基于pCSG8006。其构建过程以pCSG5585为例说明如下：(1)设计引物totU5-sgRNA-F/R(表1)，以pCSG8006为模板扩正出sgRNA片段；(2)分别设计引物totU5-UHA-F/R和totU5-UHA-F/R，以pCSG4807为模板，PCR扩增出totU5的上游同源臂totU5-UHA和下游同源臂totU5-DHA，最后采用融合PCR的方法扩增出用于totU5敲除的同源臂totU5-HA；(3)用限制性内切酶BamH I和Hind III对pCSG8006进行酶切，回收2.3kb和12.5kb的片段；(4)通过一步克隆的方法将sgRNA，totU5-HA，2.3kb和12.5kb的片段进行组装，得到的质粒通过测序确认后命名为pCSG5585。质粒pCSG5556和pCSG5557的构建方法同pCSG5585的构建方法一致，设计的引物如表1所示。
实施案例7：突变株ΔtotU5i、ΔtotHi和ΔtotHi/ΔtotMi的构建
totU5、totH的敲除以及totH/totM的双敲除都是基于CRISPR-cas9的方法，这三个突变株的构建方法相同，以totU5的敲除(图11)为例说明如下：(1)将用于totU5敲除的质粒pCSG5585导入到E.coli ET12567/pUZ8002中，构建成E.coli ET12567/pUZ8002/pCSG5585，作为接合转移的供体菌，而S.lividans TK64/pCSG5549/ΔtotR5i/ΔtotR3i作为接合转移的受体菌，其接合转移的过程同实施案例2中接合转移的过程一致(除了用25μg mL-1硫链丝菌素和100μg mL-1甲氧苄氨嘧啶覆盖)，将长出来的接合子挑到无抗的SFM板上，28℃培养3d后用验证引物totU5-testF/R进行验证，将得到的单交换或者双交换菌株划线在无抗的SFM平板上，待产孢后将其稀释涂布在含有15μg mL-15-氟胞嘧啶的SFM平板上，长出来的单克隆分别划线在无抗板和含有25μg mL-1硫链丝菌素的SFM平板上，将在无抗板上生长而在硫链丝菌素板上不长的单克隆用PCR验证，得到的双交换菌株命名为S.lividans TK64/pCSG5549/ΔtotR5i/ΔtotR3i/ΔtotU5i。totH同框缺失菌株的构建同totU5同框缺失菌株的构建，得到S.lividans TK64/pCSG5549/ΔtotR5i/ΔtotR3i/ΔtotHi(图12)，而totM是以S.lividans TK64/pCSG5549/ΔtotR5i/ΔtotR3i/ΔtotHi为接合转移的受体菌，其构建方法同totU5的构建，最后得到双敲除突变株S.lividans TK64/pCSG5549/ΔtotR5i/ΔtotR3i/ΔtotHi/ΔtotMi(图13)。
实施案例8:TPMs类化合物的发酵和制备
1、放大发酵培养
菌株S.pactum SCSIO 02999/ΔtotR5i/pPWW50-totR1和S.pactum SCSIO 02999/ΔtotR5i/pPWW50-totR2发酵所采用的种子培养基和发酵培养基为Am6-1(可溶性淀粉20g，甘油10g，甘氨酸0.1g，丙氨酸0.1g，苏氨酸0.1g，异亮氨酸0.1g，酵母浸膏5g，CaCO35g，海盐30g，水1000mL，pH 7.2-7.4，其制备方法是将各成分混合均匀，调pH值，灭菌制得)。突变株S.lividans TK64/pCSG5549/ΔtotR5i/ΔtotR3i/ΔtotP3、S.lividans TK64/pCSG5549/ΔtotR5i/ΔtotR3i/ΔtotP2i、S.lividans TK64/pCSG5549/ΔtotR5i/ΔtotR3i/ΔtotU5i、S.lividans TK64/pCSG5549/ΔtotR5i/ΔtotR3i/ΔtotHi和S.lividans TK64/pCSG5549/ΔtotR5i/ΔtotR3i/ΔtotHi/ΔtotMi发酵所采用的种子培养基和发酵培养基为A1(鱼粉10g，甘油10g，KBr 0.2g,CaCO3 3g，海盐30g，水1000mL，pH 7.2-7.4，其制备方法是将各成分混合均匀，调pH值，灭菌制得)。
所有的突变株活化后，将孢子接入到种子培养基中，28℃，200rpm，培养48h制得种子液；将种子液以10％(v/v)的接种量接入到发酵培养基中(14L)，28℃，200rpm，培养120h，而分别制得各突变株的发酵培养物。
2、发酵液的萃取：
各发酵培养物分别先进行离心分离(3500rpm，8min)，得到上清液(发酵液)和菌丝体。发酵液经大孔树脂XAD16吸附，后用丙酮洗脱，减压浓缩回收丙酮，剩余的水相用丁酮萃取，丁酮萃取物再减压浓缩至干得到浸膏A；菌丝体先用丙酮浸提，减压浓缩回收丙酮，剩余的水相用丁酮萃取，丁酮萃取物减压浓缩至干得到浸膏B，合并浸膏A和B得到粗提物。
3、化合物的分离：
a.菌株S.pactum SCSIO 02999/ΔtotR5i/pPWW50-totR1的粗提物经正相硅胶柱层析分离，用氯仿/甲醇梯度洗脱(100:0、99:1、98:2、96:4、92:8、84:16、68:32和0:100，v/v)得到8馏分(Fr.1-Fr.8)。将Fr.6(氯仿/甲醇体积比84:16洗脱馏分)和Fr.7(氯仿/甲醇体积比68:32洗脱馏分)两个馏分合并，经Sephadex LH-20凝胶柱分离，以氯仿/甲醇1:1(v/v)等度洗脱，每15mL接收1瓶，根据TLC检测(展开剂为氯仿/甲醇10:1，v/v)结果将含有相同Rf值的组分合并得5个亚馏分Fr.6.1-Fr.6.5。
馏分Fr.6.4(Rf＝0.6–0.8的馏分)经中压反相分离(填料为YMC*GEL ODS-A-HG，12nm S-50μm)；流动相为：A相为0.1％的甲酸/水(v/v)，B相为100％乙腈；洗脱程序为：0％B-65％B，0-60min；65％B-100％B，60-80min；100％B，80-100min；流速为20mL·min-1，检测波长为238nm)得到9个组分(Fr.6.4.1-Fr.6.4.9)。Fr.6.4.4(Rt＝25-28min)经半制备HPLC纯化(柱子参数为：Phenomenex Kinetex C18，250×4.6mm，5μm；流动相为：A相为0.1％的甲酸/水(v/v)，B相为90％的乙腈/水(v/v)，采用40％的B相等度洗脱，流速为2.5mL·min-1，检测波长为238nm)得到化合物R1-1(1)(Rt＝25.0min)。Fr.6.4.5(Rt＝29-36min)经半制备HPLC纯化(柱子参数为：Phenomenex Kinetex C18，250×4.6mm，5μm；流动相为：A相为0.1％的甲酸/水(v/v)，B相为90％的乙腈/水(v/v)，采用40％的B相等度洗脱，流速为2.5mL·min-1，检测波长为238nm)得到化合物R1-3(3)(Rt＝30.0min)。Fr.6.4.6(Rt＝37-50min)经半制备HPLC纯化(柱子参数为：Phenomenex Kinetex C18，250×4.6mm，5μm；流动相为：A相为0.1％的甲酸/水(v/v)，B相为90％的乙腈/水(v/v)，采用40％的B相等度洗脱，流速为2.5mL·min-1；检测波长为238nm)得到化合物R1-2(2)(Rt＝20.0min)。
馏分Fr.6.2(Rf＝0.2–0.4)经中压反相分离(填料为YMC*GEL ODS-A-HG，12nm S-50μm)；流动相为：A相为0.1％的甲酸/水(v/v)，B相为100％乙腈；洗脱程序为：0％B-60％，B0-60min；60％B-100％B，60-80min；100％B，80-100min；流速为20mL·min-1，检测波长为238nm)得到8个组分(Fr.6.2.1-Fr.6.2.8)。Fr.6.2.2(Rt＝20-26min)经半制备HPLC纯化(柱子参数为：Phenomenex Kinetex C18，250×4.6mm，5μm；流动相为：A相为0.1％的甲酸/水(v/v)，B相为90％的乙腈/水(v/v)，35％的B相等度洗脱，流速为2.5mL·min-1；检测波长为238nm)得到化合物R1-5(5)(Rt＝6.5min)。Fr.6.2.7(Rt＝55-76min)经半制备HPLC纯化(柱子参数为：Phenomenex Kinetex C18，250×4.6mm，5μm；流动相为：A相为0.1％的甲酸/水(v/v)，B相为90％的乙腈/水(v/v)，50％的B相等度洗脱，流速为2.5mL·min-1；检测波长为238nm)得到化合物R1-4(4)(Rt＝18.5min)。Fr.6.2.8(Rt＝76-100min)经半制备HPLC纯化(柱子参数为：Phenomenex Kinetex C18，250×4.6mm，5μm；流动相为：A相为0.1％的甲酸/水(v/v)，B相为90％的乙腈/水(v/v)，55％的B相等度洗脱，流速为2.5mL·min-1；检测波长为238nm)得到化合物R1-6(6)(Rt＝12.0min)。
b.菌株S.pactum SCSIO 02999/ΔtotR5i/pPWW50-totR2的粗提物经正相硅胶柱层析分离，用氯仿/甲醇梯度洗脱(1:0、8:1、4:1、2:1和0:1，v/v)得到5馏分(Fr.1-Fr.5)。Fr.3(氯仿/甲醇体积比4:1洗脱馏分)经半制备HPLC纯化(柱子参数为：PhenomenexKinetex C18，250×4.6mm，5μm；流动相为：A相为0.1％的甲酸/水(v/v)，B相为90％的乙腈/水(v/v)，采用20％的B相等度洗脱，流速为2.5mL·min-1；检测波长为238nm)得到化合物R2-1(7)(Rt＝7.2min)。
c.菌株S.lividans TK64/pCSG5549/ΔtotR5i/ΔtotR3i/ΔtotP3的粗提物经正相硅胶柱层析分离，用氯仿/甲醇梯度洗脱(100:0、99:1、98:2、96:4、92:8、84:16、68:32和0:100，v/v)得到8馏分(Fr.1-Fr.8)。将Fr.5-Fr.8(氯仿/甲醇体积比92:8、84:16、68:32和0:100洗脱馏分)四个馏分合并，经Sephadex LH-20凝胶柱分离，以氯仿/甲醇1:1(v/v)等度洗脱，每15mL接收1瓶，根据TLC检测(展开剂为氯仿/甲醇10:1，v/v)结果将含有相同Rf值的组分合并得5个亚馏分Fr.5.1-Fr.5.5。Fr.5.1(Rf＝0.15-0.2的馏分)经半制备HPLC纯化(柱子参数为：Phenomenex Kinetex C18，250×4.6mm，5μm；流动相为：A相为0.1％的甲酸/水(v/v)，B相为90％的乙腈/水(v/v)，采用50％的B相等度洗脱，流速为2.5mL·min-1；检测波长为238nm)得到化合物P3-1(8)(Rt＝12.0min)和P3-2(9)(Rt＝14.0min)。
d.S.lividans TK64/pCSG5549/ΔtotR5i/ΔtotR3i/ΔtotP2i的粗提物经正相硅胶柱层析分离，用氯仿/甲醇梯度洗脱(1:0、10:1、5:1、2:1和0:1，v/v)得到5馏分(Fr.1-Fr.5)。将Fr.2-Fr.4(氯仿/甲醇体积比10:1、5:1、2:1洗脱馏分)三个馏分合并，经SephadexLH-20凝胶柱分离，以氯仿/甲醇1:1(v/v)等度洗脱，每15mL接收1瓶，根据TLC检测(展开剂为氯仿/甲醇10:1，v/v)结果将含有相同Rf值的组分合并得4个亚馏分Fr.2.1-Fr.2.4。馏分Fr.2.1(Rf＝0.1–0.2的馏分)经中压反相分离(填料为YMC*GEL ODS-A-HG，12nm S-50μm)；流动相为：A相为0.1％的甲酸/水(v/v)，B相为100％乙腈；洗脱程序为：0％B-100％B，0-100min；流速为20mL·min-1，检测波长为238nm)得到5个组分(Fr.2.1.1-Fr.2.1.5)。Fr.2.1.1(Rt＝1-10min的馏分)经半制备HPLC纯化(柱子参数为：Phenomenex KinetexC18，250×4.6mm，5μm；流动相为：A相为0.1％的甲酸/水(v/v)，B相为90％的乙腈/水(v/v)，50％的B相等度洗脱，流速为2.5mL·min-1；检测波长为238nm)得到Fr.2.1.1.1和Fr.2.1.1.2。Fr.2.1.1.1(Rt＝15.0min)经半制备TLC(氯仿/甲醇7.5:1，v/v)纯化得到化合物P2-1(10)(Rf值为0.60)和P2-7(16)(Rf值为0.70)。Fr.2.1.1.2(Rt＝18.0min)经半制备TLC(氯仿/甲醇7.5:1，v/v)纯化得到化合物P2-2(11)(Rf值为0.55)。Fr.2.1.2(Rt＝11-23min的馏分)经半制备HPLC纯化(柱子参数为：Phenomenex Kinetex C18，250×4.6mm，5μm；流动相为：A相为0.1％的甲酸/水(v/v)，B相为90％的乙腈/水(v/v)，60％的B相等度洗脱，流速为2.5mL·min-1；检测波长为238nm)得到化合物P2-3(12)(Rt＝25.0min)和P2-5(14)(Rt＝20.0min)。Fr.2.1.4(Rt＝30-48min)经半制备HPLC纯化(柱子参数为：Phenomenex Kinetex C18，250×4.6mm，5μm；流动相为：A相为0.1％的甲酸/水(v/v)，B相为90％的乙腈/水(v/v)，70％的B相等度洗脱，流速为2.5mL·min-1；检测波长为238nm)得到化合物P2-4(13)(Rt＝22.0min)和P3-2(9)(Rt＝25.0min)。馏分Fr.2.2(Rf＝0.3–0.5)经半制备HPLC纯化(柱子参数为：Phenomenex Kinetex C18，250×4.6mm，5μm；流动相为：A相为0.1％的甲酸/水(v/v)，B相为90％的乙腈/水(v/v)，40％的B相等度洗脱，流速为2.5mL·min-1；检测波长为238nm)得到化合物P2-6(15)(Rt＝19.0min)。
e.菌株S.lividans TK64/pCSG5549/ΔtotR5i/ΔtotR3i/ΔtotU5i的粗提物经正相硅胶柱层析分离，用氯仿/甲醇梯度洗脱(1:0、8:1、4:1、2:1和0:1，v/v)得到5馏分(Fr.1-Fr.5)。将Fr.3-Fr.4(氯仿/甲醇体积比2:1和0:1洗脱的馏分)两个馏分合并，经SephadexLH-20凝胶柱分离，以氯仿/甲醇1:1(v/v)等度洗脱，每15mL接收1瓶，根据TLC检测(展开剂为氯仿/甲醇10:1，v/v)结果将含有相同Rf值的组分合并得5个亚馏分Fr.3.1-Fr.3.4。将Fr.3.1(Rf＝0.15-2的馏分)经半制备HPLC纯化(柱子参数为：Phenomenex Kinetex C18，250×4.6mm，5μm；流动相为：A相为0.1％的甲酸/水(v/v)，B相为90％的乙腈/水(v/v)，50％的B相等度洗脱，流速为2.5mL·min-1；检测波长为238nm)得到化合物U5-1(17)(Rt＝11.0min)和U5-2(18)(Rt＝12.0min)。
f、菌株S.lividans TK64/pCSG5549/ΔtotR5i/ΔtotR3i/ΔtotHi的粗提物经正相硅胶柱层析分离，用氯仿/甲醇梯度洗脱(1:0、4:1、2:1和0:1，v/v)得到4馏分(Fr.1-Fr.4)。将Fr.2-Fr.4(氯仿/甲醇体积比4:1、2:1和0:1洗脱的馏分)三个馏分合并，经Sephadex LH-20凝胶柱分离，以氯仿/甲醇1:1(v/v)等度洗脱，每15mL接收1瓶，根据TLC检测结果(展开剂为氯仿/甲醇10:1，v/v)将含有相同Rf值的组分合并得4个亚馏分Fr.2.1-Fr.2.4(其中Fr.2.1由第1-6小瓶合并；Fr.2.2由第7-16小瓶合并；Fr.2.3由第17-27小瓶合并；Fr.2.4由第28-36小瓶合并)；其中Fr.2.2经中压反相分离(填料为YMC*GEL ODS-A-HG；12nm S-50μm；流动相为：A相为0.1％的甲酸/水(v/v)，B相为100％乙腈；洗脱程序为：0％B-85％，B 0-80min；85％B-100％B，80-100min；100％B，100-120min；流速为20mL·min-1，检测波长为238nm)得到8个组分(Fr.2.2.1-Fr.2.2.8)。Fr.2.2.3(Rt＝30-35min)经半制备HPLC纯化(柱子参数为：Phenomenex Kinetex C18，250×4.6mm，5μm；流动相为：A相为0.1％的甲酸/水(v/v)，B相为90％的乙腈/水(v/v)，35％的B相等度洗脱，流速为2.5mL·min-1；检测波长为238nm)得到化合物H8(26)(Rt＝10.0min)；Fr.2.2.4(Rt＝35-45min)经半制备HPLC纯化(柱子参数为：Phenomenex Kinetex C18，250×4.6mm，5μm；流动相为：A相为0.1％的甲酸/水(v/v)，B相为90％的乙腈/水(v/v)，40％的B相等度洗脱，流速为2.5mL·min-1；检测波长为238nm)得到化合物H1(19)(Rt＝15.0min)和H3(21)(Rt＝20.0min)；Fr.2.2.5(Rt＝45-55min)经半制备HPLC纯化(柱子参数为：Phenomenex Kinetex C18，250×4.6mm，5μm；流动相为：A相为0.1％的甲酸/水(v/v)，B相为90％的乙腈/水(v/v)，45％的B相等度洗脱，流速为2.5mL·min-1；检测波长为238nm)得到化合物H6(24)(Rt＝15.0min)和H2(20)(Rt＝22.0min)；Fr.2.2.6(Rt＝55-65min)经半制备HPLC纯化(柱子参数为：Phenomenex KinetexC18，250×4.6mm，5μm；流动相为：A相为0.1％的甲酸/水(v/v)，B相为80％的乙腈/水，55％的B相等度洗脱，流速为2.5mL·min-1；检测波长为238nm)得到化合物H4(22)(Rt＝18.0min)和H5(23)(Rt＝24.0min)；Fr.2.2.8(Rt＝70-76min)经半制备HPLC纯化(柱子参数为：Phenomenex Kinetex C18，250×4.6mm，5μm；流动相为：A相为0.1％的甲酸/水(v/v)，B相为90％的乙腈/水(v/v)，65％的B相等度洗脱，流速为2.5mL·min-1；检测波长为238nm)得到化合物H7(25)(Rt＝20.0min)。
g、菌株S.lividans TK64/pCSG5549/ΔtotR5i/ΔtotR3i/ΔtotHi/ΔtotMi的粗提物经正相硅胶柱层析分离，用氯仿/甲醇梯度洗脱(1:0、4:1、2:1和0:1，v/v)得到4馏分(Fr.1-Fr.4)。将Fr.2-Fr.4(氯仿/甲醇体积比4:1、2:1和0:1洗脱的馏分)三个馏分合并，经Sephadex LH-20凝胶柱分离，以氯仿/甲醇1:1(v/v)等度洗脱，每15mL接收1瓶，根据TLC检测结果，将含有相同Rf值的组分合并得4个亚馏分Fr.2.1-Fr.2.4(其中Fr.2.1由第1-7小瓶合并；Fr.2.2由第8-13小瓶合并；Fr.2.3由第14-20小瓶合并；Fr.2.4由第21-36小瓶合并)，将Fr.2.1和Fr.2.2合并经中压反相分离(填料为YMC*GEL ODS-A-HG；12nm S-50μm；流动相为：A相为0.1％的甲酸/水(v/v)，B相为100％乙腈；洗脱程序为：0％B-85％，B 0-80min；85％B-100％B，80-100min；100％B，100-120min；流速为20mL·min-1，检测波长为238nm)得到9个组分(Fr.2.2.1-Fr.2.2.9)。Fr.2.2.2(Rt＝30-35min)经半制备HPLC纯化(柱子参数为：Phenomenex Kinetex C18，250×4.6mm，5μm；流动相为：A相为0.1％的甲酸/水(v/v)，B相为90％的乙腈/水(v/v)，30％的B相等度洗脱，流速为2.5mL·min-1；检测波长为238nm)得到化合物HM3(29)(Rt＝12.0min)；Fr.2.2.4(Rt＝42-48min)经半制备HPLC纯化(柱子参数为：Phenomenex Kinetex C18，250×4.6mm，5μm；流动相为：A相为0.1％的甲酸/水(v/v)，B相为90％的乙腈/水(v/v)，40％的B相等度洗脱，流速为2.5mL·min-1；检测波长为238nm)得到化合物HM1(27)(Rt＝15.0min)和HM2(28)(Rt＝18.0min)。
4、化合物的鉴定：
Totopotensamides(TPMs)R1-1到R1-6(1-6)、R2-1(7)、P3-1(8)、P3-2(9)、P2-1到P2-7(10-16)、U5-1(17)、U5-2(18)，H1到H8(19-26)和HM1到HM3(27-29)的结构经1H、13C、DEPT135、HSQC、HMBC和COSY分析确定(图19-192)。其结构式如下所示：
实施案例9：化合物TPMs R1-1(1)、P2-1(10)，P2-1(15)和H1(19)抑制冠状病毒(COVID-19)3CL水解酶(Mpro)实验
使用PDB蛋白晶体结构数据库中的新型冠状病毒(COVID-19)3CL水解酶(Mpro)的晶体结构(PDB ID：6LU7)作为对接受体，考虑到同源蛋白为二聚体，且纯化过程中的凝胶层析显示新型冠状病毒(COVID-19)3CL水解酶也为二聚体，通过晶体结构的对称操作构建出二聚体的PDB文件，并去掉编号445和446之外的水分子，用Autodocktools生成pdbqt受体文件；用chemdraw 3D软件对待测化合物的构型进行优化，使用AutoDock Vina程序进行对接。能量越低，表明抑制能力越强。
表2化合物1、10、15和19与COVID-193CL水解酶(Mpro)的对接结果
| 化合物名称 | 能量 |
| 1 | -10.583 |
| 10 | -10.289 |
| 15 | -7.363 |
| 19 | -7.209 |
采用文献中所述方法(Yang et al.,2005；Yang et al.,2003)对COVID-193CL水解酶进行表达纯化。采用文献中所述酶活测定方法(Yang et al.,2005)并稍作改动，取5μL稀释好的样品(DMSO溶解，终浓度为10μM和100μM)与5μL COVID-193CL水解酶溶液(20μmolL-1)，80μl 50mM Tris-HCl(pH 7.3，不含DTT)缓冲盐溶液混合，30℃孵育10min，然后加入10μL 1mmol·mL-1荧光底物MCA-AVLQSGFR-Lys(Dnp)-Lys-NH2(纯度为95％,GL BiochemShanghai Ltd)，30℃反应15min，采用FL荧光分析仪测定320和405nm处的荧光强度。同时设：
阴性对照组＝85μL Tris-HCl缓冲盐溶液+5μL酶液+10μL底物；
样品背景组＝5μL样品+5μL酶液+90μL Tris-HCl缓冲盐溶液；
空白对照组＝5μL酶液+95μL Tris-HCl缓冲盐溶液。每个处理3个重复。
采用下公式计算样品酶的抑制率：
抑制率(％)＝(1-(A样品-A样品背景)/(A阴性对照-A空白对照))×100％
表3化合物1、10、15和19对COVID-19 3CL水解酶(Mpro)的抑制活性
Claims (10)
1.化合物Totopotensamides R1-1到R1-6、R2-1、P3-1、P3-2、P2-1到P2-7、U5-1、U5-2，H1到H8和HM1到HM3中的任一化合物，其结构如式(I)所示：
2.一种重组菌株Streptomycespactum SCSIO 02999/ΔtotR5i/pPWW50-totR1，其特征在于，是将S.pactum SCSIO 02999菌株中的Totopotensamides生物合成基因簇中的负调控基因totR5进行敲除、同时将正调控基因totR1进行超表达得到。
3.一种重组菌株S.pactum SCSIO 02999/ΔtotR5i/pPWW50-totR2，其特征在于，是将S.pactum SCSIO 02999菌株中的Totopotensamides生物合成基因簇中的负调控基因totR5进行敲除、同时将正调控基因totR2进行超表达得到。
4.一种重组菌株Streptomyces lividans TK64/pCSG5549/ΔtotR5i/ΔtotR3i/ΔtotP3，其特征在于，是将Totopotensamides生物合成基因簇导入到异源宿主S.lividansTK64中，对Totopotensamides生物合成基因簇中的负调控基因totR5和totR3进行同框缺失，再对基因簇中的P450基因totP3进行插入缺失得到。
5.一种重组菌株S.lividans TK64/pCSG5549/ΔtotR5i/ΔtotR3i/ΔtotP2i，其特征在于，是将Totopotensamides生物合成基因簇导入到异源宿主S.lividans TK64中，对Totopotensamides生物合成基因簇中的负调控基因totR5和totR3进行同框缺失，再对基因簇中的P450基因totP2进行同框缺失得到。
6.一种重组菌株S.lividans TK64/pCSG5549/ΔtotR5i/ΔtotR3i/ΔtotU5i，其特征在于，是将Totopotensamides生物合成基因簇导入到异源宿主S.lividans TK64中，对基因簇中的负调控基因totR5和totR3进行同框缺失，再对基因簇中的甲基转移酶基因totU5进行同框缺失得到。
7.一种重组菌株S.lividans TK64/pCSG5549/ΔtotR5i/ΔtotR3i/ΔtotHi，其特征在于，是将Totopotensamides生物合成基因簇导入到异源宿主S.lividans TK64中，对基因簇中的负调控基因totR5和totR3进行同框缺失，再对基因簇中的卤化酶基因totH进行同框缺失得到。
8.一种重组菌株S.lividans TK64/pCSG5549/ΔtotR5i/ΔtotR3i/ΔtotHi/ΔtotMi，其特征在于，是将Totopotensamides生物合成基因簇导入到异源宿主S.lividans TK64中，对基因簇中的负调控基因totR5和totR3进行同框缺失，再对基因簇中卤化酶基因totH和甲基转移酶基因totM进行同框缺失得到。
9.一种制备权利要求1所述的化合物Totopotensamides R1-1到R1-6、R2-1、P3-1、P3-2、P2-1到P2-7、U5-1、U5-2，H1到H8和HM1到HM3的方法，其特征在于，R1-1到R1-6是从权利要求2所述的重组菌株S.pactum SCSIO 02999/ΔtotR5i/pPWW50-totR1代谢产物中分离得到；R2-1是从权利要求3所述的重组菌株S.pactum SCSIO 02999/ΔtotR5i/pPWW50-totR2代谢产物中分离得到；P3-1和P3-2是从权利要求4所述的重组菌株S.lividans TK64/pCSG5549/ΔtotR5i/ΔtotR3i/ΔtotP3代谢产物中分离得到；P2-1到P2-7是从权利要求5所述的重组菌株S.lividans TK64/pCSG5549/ΔtotR5i/ΔtotR3i/ΔtotP2i代谢产物中分离得到；U5-1和U5-2是从权利要6所述的重组菌株S.lividans TK64/pCSG5549/ΔtotR5i/ΔtotR3i/ΔtotU5i代谢产物中分离得到；H1到H8是从权利要求7所述的重组菌株S.lividans TK64/pCSG5549/ΔtotR5i/ΔtotR3i/ΔtotHi代谢产物中分离得到；HM1到HM3是从权利要求8所述的重组菌株S.lividans TK64/pCSG5549/ΔtotR5i/ΔtotR3i/ΔtotHi/ΔtotMi代谢产物中分离得到。
10.权利要求1所述的化合物Totopotensamides R1-1到R1-6、R2-1、P3-1、P3-2、P2-1到P2-7、U5-1、U5-2，H1到H8和HM1到HM3中的任一化合物在制备抗病毒药物中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010135816.0A CN111378008B (zh) | 2020-03-02 | 2020-03-02 | 脂肽类化合物Totopotensamides及其制备方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010135816.0A CN111378008B (zh) | 2020-03-02 | 2020-03-02 | 脂肽类化合物Totopotensamides及其制备方法和应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN111378008A true CN111378008A (zh) | 2020-07-07 |
| CN111378008B CN111378008B (zh) | 2022-04-12 |
Family
ID=71221420
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202010135816.0A Active CN111378008B (zh) | 2020-03-02 | 2020-03-02 | 脂肽类化合物Totopotensamides及其制备方法和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN111378008B (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2021191305A1 (en) * | 2020-03-26 | 2021-09-30 | Dompe' Farmaceutici Spa | Cxcl8 inhibitors for use in the treatment of covid-19 |
| EP4008325A1 (en) * | 2020-12-02 | 2022-06-08 | Dompe' Farmaceutici S.P.A. | Cxcl8 inhibitors for use in the treatment of covid-19 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1055866A (en) * | 1974-07-27 | 1979-06-05 | Zaidan Hojin Biseibutsu Kagaku Kenkyu Kai | Antitumor antibiotics aclacinomycins from streptomyces galilaeus |
| CN101302531A (zh) * | 2008-06-20 | 2008-11-12 | 南京师范大学 | 一种在大肠杆菌-链霉菌-假单胞菌之间穿梭表达的bac载体及其构建方法 |
| CN102732534A (zh) * | 2012-05-11 | 2012-10-17 | 中国科学院南海海洋研究所 | 厦霉素a和氧厦霉素的生物合成基因簇及其应用 |
| CN107540682A (zh) * | 2017-08-09 | 2018-01-05 | 武汉大学 | 曲张链丝菌素衍生物及其制备方法和应用 |
| CN107794286A (zh) * | 2017-10-09 | 2018-03-13 | 中国科学院南海海洋研究所 | 一种环脂肽类化合物生物合成基因簇及其激活方法与应用 |
-
2020
- 2020-03-02 CN CN202010135816.0A patent/CN111378008B/zh active Active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1055866A (en) * | 1974-07-27 | 1979-06-05 | Zaidan Hojin Biseibutsu Kagaku Kenkyu Kai | Antitumor antibiotics aclacinomycins from streptomyces galilaeus |
| CN101302531A (zh) * | 2008-06-20 | 2008-11-12 | 南京师范大学 | 一种在大肠杆菌-链霉菌-假单胞菌之间穿梭表达的bac载体及其构建方法 |
| CN102732534A (zh) * | 2012-05-11 | 2012-10-17 | 中国科学院南海海洋研究所 | 厦霉素a和氧厦霉素的生物合成基因簇及其应用 |
| CN107540682A (zh) * | 2017-08-09 | 2018-01-05 | 武汉大学 | 曲张链丝菌素衍生物及其制备方法和应用 |
| CN107794286A (zh) * | 2017-10-09 | 2018-03-13 | 中国科学院南海海洋研究所 | 一种环脂肽类化合物生物合成基因簇及其激活方法与应用 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| RUIDONG CHEN等: "Genome Mining and Activation of a Silent PKS/NRPS Gene Cluster Direct the Production of Totopotensamides", 《ORGANIC LETTERS》 * |
| ZHENJIAN LIN等: "Totopotensamides, Polyketide−Cyclic Peptide Hybrids from a Mollusk-Associated Bacterium Streptomyces sp.", 《JOURNAL OF NATURAL PRODUCTS》 * |
| 陈瑞东: "友菌素糖基转移酶AmiG的功能和海洋糖苷类化合物Totopotensamides生物合成机制研究", 《中国科学院学位论文数据库》 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2021191305A1 (en) * | 2020-03-26 | 2021-09-30 | Dompe' Farmaceutici Spa | Cxcl8 inhibitors for use in the treatment of covid-19 |
| EP4008325A1 (en) * | 2020-12-02 | 2022-06-08 | Dompe' Farmaceutici S.P.A. | Cxcl8 inhibitors for use in the treatment of covid-19 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN111378008B (zh) | 2022-04-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102219815B (zh) | 六种台勾霉素类化合物及其制备方法和在制备抗菌药物中的应用 | |
| Dubey et al. | Production of demethylated colchicine through microbial transformation and scale-up process development | |
| CN109897862B (zh) | 庆大霉素b生产菌及其制备方法和应用 | |
| CN102181470A (zh) | 提高链霉菌抗生素产量的方法及其质粒 | |
| CN111170975B (zh) | 抗生素lobophorin及其制备方法和应用 | |
| CN111378008A (zh) | 脂肽类化合物Totopotensamides及其制备方法和应用 | |
| CN102690841B (zh) | 一种获得红豆杉转基因愈伤组织的遗传转化方法 | |
| CN103215281B (zh) | 一种格瑞克霉素和p-1894b的生物合成基因簇及其应用 | |
| CN104073507B (zh) | 一种斑鸠霉素的生物合成基因簇及其应用 | |
| CN102703495A (zh) | 提高链霉菌抗生素产量的方法及其质粒 | |
| CN104387396A (zh) | 源于米曲霉的吲哚萜speradine E及应用 | |
| CN110317765A (zh) | 一种高产香叶醇葡萄糖苷的大肠杆菌表达菌株及其应用 | |
| CN110305881B (zh) | 一种聚酮类化合物neoenterocins的生物合成基因簇及其应用 | |
| CN104370917B (zh) | 源于米曲霉的吲哚萜speradine H及应用 | |
| CN108084205B (zh) | 一种吲哚咔唑类生物碱及其制备方法和应用 | |
| CN111440734A (zh) | 生产黄芩素类化合物的基因工程酵母菌、其构建方法及应用 | |
| CN102719388A (zh) | 提高链霉菌抗生素产量的方法及其质粒 | |
| CN110563783A (zh) | 一种高效低毒四霉素b衍生物及其定向高产代谢工程方法 | |
| CN105018514B (zh) | 一种链霉菌药物高效生物合成的构建方法 | |
| CN114058516B (zh) | 一株海洋来源产布雷菲德菌素a青霉真菌n29及其应用 | |
| CN108486028B (zh) | 一种高产含有L-Val结构单元的化合物的菌株△mfnH | |
| CN110423790B (zh) | 一种抗真菌四霉素b定向高产的代谢工程方法 | |
| CN110343650B (zh) | 一种产两性霉素b的重组结节链霉菌及其应用 | |
| CN103275976B (zh) | 一种海洋咔啉生物碱的生物合成基因簇及其应用 | |
| CN107674058A (zh) | 抗病毒的化合物及其制备方法与应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| CB02 | Change of applicant information |
Address after: No.1119 Haibin Road, Nansha District, Guangzhou City, Guangdong Province Applicant after: SOUTH CHINA SEA INSTITUTE OF OCEANOLOGY, CHINESE ACADEMY OF SCIENCES Address before: 510301 No. 164 West Xingang Road, Guangzhou, Guangdong, Haizhuqu District Applicant before: SOUTH CHINA SEA INSTITUTE OF OCEANOLOGY, CHINESE ACADEMY OF SCIENCES |
|
| CB02 | Change of applicant information | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |