CN108084205B - 一种吲哚咔唑类生物碱及其制备方法和应用 - Google Patents
一种吲哚咔唑类生物碱及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种吲哚咔唑类生物碱及其制备方法和应用，所述吲哚咔唑类生物碱的结构式如下式(I)所示。所述吲哚咔唑类生物碱由放线菌大米固体培养基发酵产生，经乙酸乙酯萃取后所得的发酵物，采用凝胶柱色谱、中压制备色谱、硅胶柱色谱和高效液相色谱分离纯化得到。所述吲哚咔唑类生物碱可制备用于治疗与蛋白激酶、酪氨酸激酶等抑制有关的急、慢性白血病、淋巴癌、乳腺癌、肺癌等癌症，艾滋病，冠心病、糖尿病、老年痴呆症等疾病的药物。本发明吲哚咔唑类生物碱的制备方法。
Description
技术领域
本发明涉及放线菌次级代谢产物制备活性化合物领域，具体涉及一种吲哚咔唑类生物碱及其制备方法和应用。
背景技术
吲哚咔唑类化合物是一类由L-色氨酸衍生而来的双吲哚生物碱类天然产物，因其具有独特的结构特征及其潜在的临床应用引起了广泛的关注。吲哚咔唑类生物碱(如staurosporine、rebeccamycin、K252a等)具有广泛的生物活性，如抗肿瘤、抗高血压、抗细菌、抗真菌、抗疟疾、抗结核、保护神经、抗血小板凝集等。其作用机制主要包括抑制蛋白激酶、酪氨酸激酶、DNA拓扑异构酶、免疫抑制以及DNA嵌入等。
许多吲哚咔唑类生物碱表现出了良好的生物活性并且进入了临床研究，如midostaurin(PKC412)在临床Ⅱ期Ⅲ期试验中对急性髓细胞白血病表现出了良好的治疗效果，现已经美国FDA批准上市；lestauritinib(CEP-701)目前已经进入了临床Ⅱ/Ⅲ期的评估，用于治疗FLT3-ITD阳性急性髓细胞白血病；CT327(一种Trk A激酶抑制剂，K252a的聚乙二醇衍生物)目前正在进行Ⅱ期临床研究，主要用于治疗银屑病。
吲哚咔唑类化合物通常结构相似，主要分为两类：一类是由吲哚咔唑母核衍生而来的不含糖环的结构；另一类是由吲哚咔唑母核和连接在吲哚环上的糖环构成。然而这些化合物选择性较差，对癌细胞及正常体细胞均有抑制作用。
因此，寻找更多的结构新颖、选择性较高的吲哚咔唑衍生物成为一种必然的趋势。
发明内容
本发明提供了一种新型的吲哚咔唑类生物碱及其制备方法和应用，该化合物为由放线菌通过大米发酵及提纯后得到的天然产物，具有明显的抗肿瘤及激酶抑制活性，可用于开发抗肿瘤药物及与激酶有关的治疗相关疾病的药物。
一种吲哚咔唑类生物碱，结构式如下式(I)所示：
所述吲哚咔唑类生物碱的制备方法如下：
1)将放线菌接种于高氏一号培养基中，摇床培养，获得种子液；
所述放线菌，采用中国工业微生物菌种保藏管理中心出售的链霉菌Streptomycessp.CICC 11031；
2)将所述种子液接种于大米培养基中，静置培养，萃取获得发酵产物粗提物；
3)将所述发酵产物粗提物进行分离纯化，获得如式(I)结构的吲哚咔唑类生物碱。
本发明从放线菌次级代谢产物中分离得到一种结构新型的吲哚咔唑类生物碱，由星孢菌素母核及类似打开的糖环连接而成，该结构为天然产物中首次发现。该化合物的成功提取为该类化合物的开发提供了新的资源。同时，放线菌在实验室环境下易于培养，可通过大规模发酵的方式富集该化合物。
作为优选，步骤1)中：
所述摇床培养的条件为：26～30℃下，150～250rpm摇床中培养4～6天；进一步优选在28℃下，180rpm的摇床中培养。
作为优选，步骤2)中：
所述的大米培养基，由大米和海盐水配制而成，大米的质量和海盐水的体积之比为30g～50g:50mL～70mL；进一步优选，所述海盐水的质量浓度为25‰，所述大米的质量和海盐水的体积之比为40g:60mL。按照上述配比将原料混合后经高压湿热灭菌即得。
所述的接种量为：每40g大米接种5～15mL种子液；进一步优选，每40g大米接种10mL种子液。
所述的静置培养的条件为：25～35℃，静置培养50～100天；进一步优选在28℃下静置培养70天。
所述的萃取，采用乙酸乙酯作为萃取剂，具体为：将发酵产物粗提物浸泡在乙酸乙酯中，再经分离、浓缩后得到发酵产物粗提物。
作为优选，步骤3)中，所述分离纯化的方法包括：凝胶柱色谱、中压制备色谱、硅胶柱色谱、高效制备液相色谱中的至少一种。
进一步优选，所述的分离纯化包括凝胶柱色谱、中压制备色谱、硅胶柱色谱和高效制备液相色谱。
所述的凝胶柱色谱，条件为：采用的填料为羟丙基葡聚糖凝胶(LH-20)，采用的洗脱剂为甲醇-水溶液，按照甲醇体积百分数为20％、40％、60％、80％、100％的比例洗脱。
所述的中压制备色谱，条件为：填料为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相为体积百分数40～100％的甲醇+0.05％三氟乙酸(TFA)-水溶液梯度洗脱。
所述的硅胶柱色谱，条件为：采用精制硅胶(300-400目)，洗脱剂为甲醇-二氯甲烷溶液，洗脱体系为甲醇:二氯甲烷＝0:1,100:1,80:1,60:1,40:1,20:1,10:1,1:0。
所述的高效制备液相色谱，条件为：采用的填料为十八烷基硅烷键合硅胶，采用的流动相是乙腈-水溶液，乙腈体积百分数为42％等度洗脱。
采用人前列腺癌细胞株PC3和蛋白激酶PKCα、ROCK2对经上述方法制备得到的吲哚咔唑类生物碱进行活性评价，结果显示：
具有式(I)结构的吲哚咔唑类生物碱能显著抑制PC3的生长，同时具有较好的PKCα、ROCK2激酶抑制活性，这说明该类化合物具有相关蛋白激酶抑制作用以及肿瘤细胞毒作用，因此可用来进一步研发蛋白激酶抑制剂以及抗肿瘤药物。
本发明提供的化合物可用于制备用于治疗与蛋白激酶、酪氨酸激酶等激酶异常表达相关的急、慢性白血病、前列腺癌、淋巴癌、乳腺癌、肺癌等癌症以及艾滋病、冠心病、糖尿病、老年痴呆症等疾病的药物。所述的式I结构的化合物可用于制备蛋白激酶、酪氨酸激酶等抑制剂和抗肿瘤药物，因而具有很好的应用前景。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
本发明公开了一种结构新颖的吲哚咔唑类生物碱，由放线菌通过大米发酵及提纯后得到，由星孢菌素母核及类似打开的糖环连接而成，该结构为天然产物中首次发现；该吲哚咔唑类生物碱具有明显的抗肿瘤及激酶抑制活性，可用于开发治疗与蛋白激酶、酪氨酸激酶等激酶相关的癌症和疾病的药物。
本发明公开的吲哚咔唑类生物碱的制备方法，操作简单，易于扩大生产，具有较好的应用前景。
具体实施方式
实施例1.放线菌的发酵
放线菌采用中国普通微生物菌种保藏管理中心出售的链霉菌Streptomycessp.CICC 11031；
1)将放线菌接种于高氏一号培养基中，培养温度为28℃，180rpm摇床培养4-6天，获得种子液；
2)将步骤1)所得的种子液接种至大米培养基(大米培养基，由以下组分制成：大米质量40g；海盐水60mL，置于500mL锥形瓶后经高压湿热灭菌所得)，每瓶接种量为10mL，28℃下静置培养70天，培养物经乙酸乙酯浸泡萃取、浓缩，得到含有本发明化合物的发酵粗提物。
实施例2.化合物的制备
将所得发酵粗提物进行凝胶柱色谱(填料为羟丙基葡聚糖凝胶LH-20)，洗脱剂为体积百分数20％、40％、60％、80％、100％的甲醇-水体系，每1/4柱体积为一个馏分，TLC分析合并含有目标化合物的馏分。中压制备色谱分离(Sepax Amethyst C-18(10μm,30×400mm)色谱柱，检测波长291nm，填料为十八烷基硅烷键合硅胶)，流动相为体积百分数40％-100％的甲醇+0.05％TFA-水溶液梯度洗脱，TLC分析将含星孢菌素部分与不含星孢菌素部分分别合并，新化合物位于不含星孢菌素部分。将不含星孢菌素部分进行硅胶柱色谱(300-400目)，洗脱剂为甲醇-二氯甲烷体系(甲醇:二氯甲烷＝0:1,100:1,80:1,60:1,40:1,20:1,10:1,1:0)，TLC分析合并所得组分。
所得含有新化合物的组分采用高效制备液相色谱分离(Agilent Pursuit C-18(10μm,21.2×250mm)色谱柱，检测波长291nm，填料为十八烷基硅烷键合硅胶)，采用流动相为体积百分数42％乙腈/水体系以10mL/min洗脱，收集23min的色谱峰，回收溶剂，得到本发明的化合物。
实施例3.化合物的鉴定
本发明化合物为淡黄色粉末，高分辨质谱HR-ESI-MS给出准分子离子峰m/z497.1819[M+H]+(calculated 497.1825)，提示分子式为C28H24N4O5，命名为actinocarbazole B，具体结构分析结果如下表1所示：
表1
实施例4.化合物的抗肿瘤活性实验
采用磺酰罗丹明B(Sulforhodamine B，SRB)比色法检测化合物对人前列腺癌细胞株PC3细胞的增殖抑制作用。取对数生长期的细胞，配置成5×104个/mL，以100μL/孔铺于96孔培养板，CO2培养箱中培养24小时，取出培养板后于每孔中加入不同浓度的待测样品，每个浓度设3个复孔，加药完成后，置于CO2培养箱中继续培养72小时后取出培养板，弃去培养液，每孔加入100μL 4℃冰箱预冷的质量百分数10％的三氯醋酸(TCA)固定，静置5分钟后，再将培养板移至4℃冰箱过夜。倒掉固定液，每孔用去离子水洗涤5遍，甩干，空气干燥。每孔加入70μL SRB溶液，室温25℃放置20分钟，去上清液，用质量百分数1％醋酸洗涤5次，空气干燥。结合的SRB用100μL/孔10mmoL/L Tris碱液(pH＝10.5)振荡溶解。置于酶标仪中测定各孔光吸收，测定波长为515nm。根据各孔OD值计算药物对细胞增殖抑制率：抑制率＝[1－(OD515给药孔/OD515对照孔)]×100％，根据各浓度抑制率计算半数抑制浓度IC50。其结果如表2所示。
实施例5.化合物的激酶抑制实验
本实验采用384孔板，测定所得化合物对PKCα、ROCK2激酶的抑制活性，基于实时分辨荧光技术测定抑制作用。将待测化合物配制所需浓度，由激酶缓冲液稀释，激酶、STK底物生物素、ATP、终止标记物等按照试剂盒说明书配制相应浓度。酶反应阶段，加入4μL待测化合物，2μL激酶，2μLSTL底物生物素，2μLATP在室温或37℃下孵育30min，检测阶段，加入5μLSa-XL665和5μL STK Antibody-Eu(K)，以乙二胺四乙酸(EDTA)为终止液，常温下孵育1h后采用HRTF测定在λ＝665和620nm下的荧光强度，根据相应信号强度比值计算得出各样品浓度下的抑制率，再根据各浓度抑制率计算对各激酶的半数抑制浓度IC50(μM)。其结果如表2所示。
表2
| 化合物 | PC3 | PKCα | ROCK2 |
| actinocarbazole B | 9.48 | 0.67 | 2.70 |
| STA(阳性对照) | 0.04 | 0.002 | 0.015 |
结果表明，本发明提供的化合物能在显著抑制PC3细胞的生长，并且具有很好的PKCα、ROCK2激酶抑制作用，充分说明该类化合物具有明显的激酶抑制活性，因此可用于制备蛋白激酶抑制剂和抗肿瘤药物。
Claims (10)
1.一种吲哚咔唑类生物碱，其特征在于，结构式如下式(I)所示：
2.一种根据权利要求1所述的吲哚咔唑类生物碱的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将放线菌接种于高氏一号培养基中，摇床培养，获得种子液；
所述放线菌，采用中国工业微生物菌种保藏管理中心出售的链霉菌Streptomycessp.CICC 11031；
2)将所述种子液接种于大米培养基中，静置培养，萃取获得发酵产物粗提物；
3)将所述发酵产物粗提物进行分离纯化，获得如式(I)结构的吲哚咔唑类生物碱。
3.根据权利要求2所述的吲哚咔唑类生物碱的制备方法，其特征在于，步骤1)中，所述的摇床培养的条件为：26～30℃下，150～250rpm摇床中培养4～6天。
4.根据权利要求2所述的吲哚咔唑类生物碱的制备方法，其特征在于，步骤2)中，所述的大米培养基，由大米和海盐水配制而成，大米的质量和海盐水的体积之比为30g～50g：50mL～70mL。
5.根据权利要求2所述的吲哚咔唑类生物碱的制备方法，其特征在于，步骤2)中，所述的接种量为：每40g大米接种5～15mL种子液；
所述的静置培养的条件为：25～35℃，静置培养50～100天。
6.根据权利要求2所述的吲哚咔唑类生物碱的制备方法，其特征在于，步骤3)中，所述分离纯化的方法包括：凝胶柱色谱、中压制备色谱、硅胶柱色谱、高效制备液相色谱中的至少一种。
7.一种根据权利要求1所述的吲哚咔唑类生物碱在制备用于治疗与激酶异常表达相关疾病的药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述激酶包括蛋白激酶和/或酪氨酸激酶；
所述疾病为前列腺癌、淋巴癌、乳腺癌或肺癌。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述蛋白激酶包括PKCα和ROCK2。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述疾病为由前列腺癌细胞PC3引起的前列腺癌。
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