CN105018514B - 一种链霉菌药物高效生物合成的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种链霉菌药物高效生物合成的构建方法。首先，基于诱导型启动子O _R O _lac 和强启动子ermEp ^* ，首次在链霉菌中构建了梯度诱导表达体系。其次，通过梯度诱导控制靶基因表达量，偶联分析靶基因表达量与目标药物产量的关系，从而揭示药物生物合成途径中的限速反应及其限速酶的适配性。最后，通过组成型启动子ermEp ^* ，理性串联高表达相关限速酶编码基因，获得了一株恰塔努加链霉菌高产菌株L12，送中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号：CGMCC No.10157。摇瓶发酵结果显示L12中纳他霉素产量是恰塔努加链霉菌L10的3.3倍。50L发酵罐小试中，最高产量达到15.7 g/L。本发明方法高效、准确、操作简单，且普遍适用于其它链霉菌。

Description

一种链霉菌药物高效生物合成的构建方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种链霉菌药物高效生物合成的构建方法，具体涉及链霉菌梯度诱导表达体系的建立，揭示链霉菌药物生物合成途径中的限速反应及其限速酶的适配性，改善链霉菌药物生物合成效率，以提高药物的产量，属于工业微生物技术领域。

背景技术

纳他霉素 (Natamycin)，也称匹马菌素(Pimaricin)，游霉素，是一种多烯大环内酯类抗生素。纳他霉素主要由恰塔努加链霉菌S. chattanoogensis、纳塔尔链霉菌S. natalensis、褐黄孢链霉菌S. gilvosporeus和利迪链霉菌S. lydicus等链霉菌产生。纳他霉素的分子式为 C₃₃H₄₇O₁₃，分子量665.53，其具有26个碳原子的内酯环，内含4个共轭双键的多烯发色团，在C4,5位置有个环氧基团，C12位有个环外羧基，C15位有个海藻氨基糖，纳他霉素结构式如下：

。

纳他霉素是一种多烯大环内酯类广谱抗真菌剂，能有效抑制和杀死霉菌、酵母、丝状真菌。由于其高效、广谱、难溶于水和油脂、安全等优点被广泛用于食品防腐剂和药物。美国FDA（Food and Frug Administrition）已经批准纳他霉素用作食品防腐剂。1997年，我国食品添加剂委员会对纳他霉素进行评价并建议批准使用。纳他霉素还作为高效抗菌剂应用于滴眼液或软膏等药物中，用来治疗真菌性角膜炎、脚藓等真菌性皮肤感染疾病。

微生物来源的天然产物通常属于次级代谢产物，其生物合成过程受到生物体的严密控制。微生物本身的生物经济学原理总是限制每种次级代谢产物的过度合成，特别是野生菌的PKS途径自然设立了许多限速步骤，其发酵产量往往较低，难以直接投入工业生产。微生物来源的天然产物市场需求增大，高产菌株改造工作意义重大。随着代谢调控机制研究的逐步深入和DNA重组技术的发展，基于理性遗传改造代谢途径的代谢工程方法成为一种替代策略。目前代谢工程改造策略主要有改造途径特异性调控基因、高表达限速酶基因、高表达自身抗性基因、增加目标基因簇的拷贝数、敲除竞争基因簇、异源表达靶基因簇等。对于高表达限速酶基因这一策略，揭示合成途径限速步反应，改造关键合成元件的适配性，是建立高效生物合成途径的关键。揭示合成途径限速步反应经常需要多个可独立诱导的启动子来控制不同基因的表达水平。迄今为止，许多诱导型启动子应用于大肠杆菌等细菌。而链霉菌中可用的诱导型的启动子却很少，尤其是能够低表达的诱导型启动子更少。为解决这一问题，本发明基于诱导型启动子O _R O _lac 和强启动子ermEp ^* ，在没有诱导剂IPTG的条件下，O _R O _lac 的表达受到LacI蛋白的阻遏；当加入诱导剂IPTG 时，LacI对O _R O _lac 阻遏得到解除。构建了一系列诱导型质粒，通过分析靶基因的表达量对药物产量的影响，从而揭示药物生物合成途径中的限速步反应及其限速酶的适配性，构建链霉菌药物高效生物合成途径，以提高药物产量。

发明内容

本发明的目的是提供链霉菌梯度诱导表达体系的构建方法，利用该体系分析药物生物合成途径中的限速步反应及其限速酶的适配性，从而理性优化药物的生物合成，为链霉菌药物高效生物合成提供一种新方法。

本发明基于诱导型启动子O _R O _lac 和组成型强启动子ermEp ^* ，增强型绿色荧光蛋白编码基因egfp为报告基因，IPTG为诱导剂，在链霉菌中首次成功建立了梯度诱导表达体系。同时利用该体系，在链霉菌靶基因缺失菌株中偶联分析了靶基因表达量对靶药物生物合成产量的影响，揭示了药物生物合成途径中的限速反应及其限速酶的适配性。最后，通过在链霉菌中组成型串联高表达相关限速酶编码基因，构建了药物高效生物合成菌株。

本发明通过以下步骤实现：

(1) 将报告基因egfp分别置于强启动子和由阻遏蛋白控制的诱导型启动子后，构建梯度诱导表达质粒，通过结合转导整合至宿主链霉菌恰塔努加链霉菌L10基因组中。所述恰塔努加链霉菌L10由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，分类命名：恰塔努加链霉菌(Streptomyces chattanoogensis)，保藏号：CGMCC No.2644，保藏日期：2008年8月27日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

(2) 无菌条件下，将恰塔努加链霉菌L10的突变菌株接种于斜面培养基中，置于培养箱中培养，所述斜面培养基为：酵母提取物 4.0g/L，麦芽提取物 10.0 g/L，葡萄糖 4.0g/L，琼脂糖 15.0-20.0 g/L，其余为水，pH 值调至6.0。

(3) 斜面培养后，将培养好的孢子块接入盛有摇瓶种子培养基的三角瓶中，摇床培养18-22小时，所述种子培养基为：葡萄糖 17.5g/L，蛋白胨15 g/L，NaCl 10 g/L，其余为水，pH自然。

(4) 将步骤(3)所得的种子液转接至4%YEME培养基中，对于诱导型突变株，12小时后加入诱导剂，继续摇瓶培养至48小时。所述4%YEME培养基为酵母提取物3.0g/L，麦芽提取物 3.0 g/L，蛋白胨 5.0 g/L，葡萄糖 40 g/L，其余为水，pH自然。

(5) 吸取适量步骤(4)所得的链霉菌菌液，离心收集菌体，采用PBS缓冲液清洗菌体一次。加入适量的蛋白裂解缓冲液[Tris HCl 50mM (PH 8.0)，NaCl 150mM，EDTA 5mM，Glycerol

5%，Triton X-100 1%]和蛋白水解酶抑制剂PMSF，超声破碎细胞。4 °C、12000 r/min离心10 min，转移上清至新的1.5 ml离心管中；对蛋白进行定量后，取适量蛋白样品分别进行SDS-PAGE和Western blotting检测。与此同时，取少量液体培养的链霉菌菌液，通过激光共聚焦显微镜观察绿色荧光强度。

(6) 分析不同诱导条件下和不同启动子活性下eGFP 的表达变化曲线，初步建立链霉菌梯度诱导表达体系。

(7) 将四个限速酶编码基因scnK、scnJ、scnC和scnD（SEQ ID NO：5-8）分别置于强启动子和诱导型启动子后，构建梯度诱导表达质粒，分别通过结合转导导入对应的靶基因缺失菌株中，构建突变菌株。

(8) 偶联分析目的药物和靶基因的表达量的对应关系，揭示纳他霉素合成途径中的限速反应及其限速酶的适配性。

(9) 将限速酶基因分别置于强启动子后，构建质粒，通过结合转导导入恰塔努加链霉菌L10中，获得恰塔努加链霉菌L12。所述恰塔努加链霉菌株L12 (Streptomyces chattanoogensis) 已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号：CGMCC No.10157，分类命名：恰塔努加链霉菌，保藏日期：2014年12月11日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

(10) 将恰塔努加链霉菌L12接种于种子培养基中，摇瓶培养18-22小时后转接入新鲜的种子培养基中，形成二级种子液；其中的种子培养基同步骤（3）。

(11) 将步骤(10)中的二级种子液转接至50 L发酵罐培养基[大豆蛋白粉20 g/L，酵母粉8 g/L，葡萄糖40 g/L，其余为水, pH自然]中，控制发酵罐温度30°C，溶氧40%，在不同的发酵时间点取样。

(12) 使用甲醇浸提发酵培养液中的纳他霉素，通过高效液相色谱检测其产量。

步骤（1）诱导型的启动子为O _R O _lac ，具有SEQ ID NO：1 的核苷酸序列；强启动子为组成型启动子ermEp ^* ，具有SEQ ID NO：2 的核苷酸序列；报告基因egfp具有SEQ ID NO：3的核苷酸序列。

步骤（1）阻遏蛋白的编码基因及其启动子为P _L tetO1-lacI，具有SEQ ID NO：4 的核苷酸序列。

步骤（1）所述梯度诱导表达质粒为pIJ8630-ermEp ^* -egfp和pIJ8630-O _R O _lac -egfp-P _L tetO1-lacI。

步骤（4）所述诱导剂为IPTG。

步骤（7）靶药物纳他霉素生物合成途径中的限速酶编码基因共有四个：scnK、scnJ、scnC和scnD，具有SEQ ID NO：5-8 的核苷酸序列，其中scnK、scnJ和scnC依次置于强启动子ermEp ^* 后，scnD单独置于强启动子ermEp ^* 后，通过两套整合酶体系整合至恰塔努加链霉菌L10的基因组中。

两套整合酶体系是通过重组质粒pIJ8660-ermEp ^* -scnK-RBS-scnJ-RBS-scnC和pSOK804-ermEp ^* -scnD实现的，其中核糖体结合位点RBS具有SEQ ID NO：9 的核苷酸序列。

本发明的另一个目的是提供所述的所述的一种链霉菌药物高效生物合成的构建方法中涉及的重组质粒pIJ8660-ermEp ^* -scnK-RBS-scnJ-RBS-scnC 和pSOK804-ermEp ^* -scnD及工程菌恰塔努加链霉菌L12在链霉菌构建药物高效生物合成中的应用。

揭示合成途径限速步反应及限速酶的适配性，是理性设计高效生物合成途径，提高链霉菌药物的关键。本发明开发了链霉菌梯度诱导表达体系，利用该体系快速揭示合成途径限速步反应及其限速酶的适配性，从而理性构建链霉菌药物高效生物合成途径的方法。该方法高效、准确、操作方便，为链霉菌药物高效生物合成途径的构建提供了一种新的研究手段。

本发明具有如下优点和效果：

(1) 本发明通过梯度诱导表达体系体内偶联分析链霉菌药物合成靶基因表达量与目标产物产量的关系，无需体外表达各个限速酶，从而克服了有些酶，尤其是酶复合体体外难以表达，表达后无活性或低活性等问题，可行性强；无需额外准备反应底物，克服了有些底物难以制备或购买的问题；避免了体外添加辅因子与体内实际比例不一致或难以购买的缺点；克服了体外无法反应的合成途径代谢物或单个组分提高后的副作用，更准确的反映出体内变化情况；无需摸索体外反应条件，快捷方便。

(2) 本发明通过梯度诱导表达体系分析链霉菌药物生物合成途径中限速酶的适配性，理性构建高效生物合成，避免了限速酶浓度过高抑制催化效率的可能性。

(3) 所构建恰塔努加链霉菌L12应用于纳他霉素生产中，可提高产量3.3倍，最高产量达到15.7g/L， 大大降低了纳他霉素的生产成本。

附图说明

图1是报告基因egfp梯度诱导表达的荧光显微镜图谱。

图2 是L12在50L发酵罐小试纳他霉素产量的变化曲线。

具体实施方式

本发明结合附图和实施例作进一步的说明。本发明的恰塔努加链霉菌L12，如无特殊说明其培养方式和发酵条件均与恰塔努加链霉菌L10（中国发明专利ZL200810162820.5）相同。

实施例中所使用的培养基：

1、斜面培养基：酵母提取物4g/L，麦芽提取物10 g/L，葡萄糖4 g/L，琼脂糖20 g/L，其余为水，pH值调至7.2。

2、种子培养基：葡萄糖17.5 g/L，蛋白胨15 g/L，NaCl 10 g/L，其余为水，pH自然。

3、发酵培养基：大豆蛋白粉20 g/L，酵母粉8 g/L，葡萄糖40 g/L，其余为水, pH自然。

4、MS固体培养基：甘露醇20 g/L，黄豆粉20 g/L，琼脂糖20 g/L，其余为水，10 mMMgCl₂，pH自然。

实施例1 梯度诱导表达质粒的构建

把SEQ ID NO：1、2和4的3个DNA序列分别用聚合酶链式反应(PCR) 扩增，扩增后的NO 1 的DNA片段通过DNA限制性内切酶消化后分别插入质粒pIJ8630中，形成pIJ8630-O _R O _lac ，加上质粒pIJ8630自身携带的egfp，刚好构成pIJ8630-O _R O _lac -egfp。将扩增后的SEQID NO：4 的DNA片段通过DNA限制性内切酶消化后分别插入质粒pIJ8630-O _R O _lac -egfp中获得质粒pIJ8630-O _R O _lac -egfp-P _L tetO1-lacI。

将PCR扩增后的NO 2 的DNA片段通过DNA限制性内切酶消化后插入质粒pIJ8630中，形成pIJ8630-ermEp*，加上质粒pIJ8630自身携带的egfp，刚好构成pIJ8630-ermEp*-egfp。

把SEQ ID NO：5-8的4个DNA序列分别用PCR扩增，扩增后的SEQ ID NO：5 的DNA片段通过DNA限制性内切酶消化后分别插入质粒pIJ8630-O _R O _lac 中，形成pIJ8630-O _R O _lac -scnK，将扩增后的SEQ ID NO：4 的DNA片段通过DNA限制性内切酶消化后分别插入质粒pIJ8630-O _R O _lac -scnK中获得质粒pIJ8630-O _R O _lac -scnK-P _L tetO1-lacI，类似的方法获得其它三个诱导型质粒。

把SEQ ID NO：5~8的4个DNA序列分别用PCR扩增 (其中SEQ ID NO：6和7含有RBS)，扩增后的NO 1-3 的DNA片段通过DNA限制性内切酶消化后分别插入质粒pIJ8660-ermEp*中，扩增后的SEQ ID NO：的DNA片段通过DNA限制性内切酶消化后分别插入质粒pSOK804-ermEp*中，再分别将含有上诉DNA序列的质粒转化到大肠杆菌ET12567 (已含有质粒pUZ8002) 中。

实施例2 恰塔努加链霉菌重组菌株的获得

分别将含有上述重组质粒的大肠杆菌ET12567（已含有质粒pUZ8002）接种到5 mlLB液体培养基（含相应抗生素）中，37 ℃培养至OD₆₀₀为0.6，离心收集菌体，用10 ml LB液体培养基洗涤一次，用0.5 ml的2×YT液体培养基重悬；将20 μl恰塔努加链霉菌的孢子加入0.5 ml的2×YT液体培养基中重悬，45 °C热休克10 min后冰浴冷却2 min；将上诉的大肠杆菌和L10的孢子混合后均匀涂在MS固体培养基上，30 °C培养16 h后，加入20 μg/ml的萘啶酸和相应的抗生素，30 °C继续培养4-5天；将上诉得到的链霉菌转化子在含有相应抗生素的斜面培养基上培养4-5天后收取孢子，通过PCR方法验证。

实施例3 靶基因的诱导表达

(1) 无菌条件下，将恰塔努加链霉菌诱导型菌株接种于斜面培养基中，置于培养箱中培养；

(2) 斜面培养后，将培养好的孢子块接入盛有摇瓶种子培养基的三角瓶中，摇床培养18-22小时；

(3) 将步骤(3)所得的种子液转接至4%YEME培养基中，对于诱导型突变株，12小时后加入诱导剂IPTG，继续摇瓶培养至48小时。所述4%YEME培养基为酵母提取物3.0g/L，麦芽提取物 3.0 g/L，蛋白胨 5.0 g/L，葡萄糖 40 g/L，其余为水，pH自然；

(4) 吸取适量液体培养的链霉菌菌液，离心收集菌体，采用PBS缓冲液清洗菌体一次；

(5) 分析不同诱导条件下和不同启动子活性下靶基因的表达变化，其中报告基因egfp梯度诱导表达结果如图1所示。

实施例4 L12的摇瓶发酵验证

从YMG孢子平板上刮取适量的L12孢子接种到种子培养基中，转速220 rpm，30 °C培养16 h；按4%的接种量将种子培养液接种至发酵培养基中，转速220 rpm，30 °C培养144h，取样测定纳他霉素产量。

实施例5 50L发酵罐小试

种子液培养采用逐级放大培养的方式进行。首先从YMG孢子平板上刮取适量的L12孢子接种到种子培养基中，转速220 rpm，30 °C培养22小时后按3%的接种量接入新鲜种子培养基，转速220 rpm，30 °C培养22 小时后，按3%的接种量接入装有25L新鲜发酵培养基的50L发酵罐中，定时取样进行纳他霉素产量分析 (图2)。

实施例6 纳他霉素产量的测定

将纳他霉素标准品用甲醇配成1 mg/ml的溶液；取5 ml通过发酵培养基发酵的菌液，加入45 ml 甲醇，剧烈涡旋震荡5 min后，离心取上清，用甲醇稀释至一定倍数后，通过高效液相色谱检测，根据标准品得到发酵液中纳他霉素的浓度。发酵产物的HPLC检测条件如下：

流动相：A相为水+1‰甲酸、B相为甲醇+1‰甲酸。

检测波长：UV 304 nm，

柱温：37 °C，

流速：1 ml/min，

洗脱程序：0-3 min，恒梯度50%A相+50%B相，

3-12 min，线性梯度至10%A相+90%B相 ，

12-19 min，恒梯度10%A相+90%B相，

19-20 min，线性梯度至50%A相+50%B相，

20-25 min，恒梯度50%A相+50%B相。

<110> 浙江大学

<120> 一种链霉菌药物高效生物合成的构建方法

<160> 9

<210> 1

<211> 123

<212> DNA

<213> 启动子序列

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<400> 1

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<210> 2

<211> 168

<212> DNA

<213> 恰塔努加链霉菌（Streptomyces chattanoogensis）L12

<223>

<400> 2

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<210> 3

<211> 720

<212> DNA

<213> 基因序列

<223>

<400> 3

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<210> 4

<211> 1239

<212> DNA

<213> 基因序列

<223>

<400> 4

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<210> 5

<211>1377

<212> DNA

<213> 恰塔努加链霉菌（Streptomyces chattanoogensis）L12

<223>

<400> 5

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<213> 恰塔努加链霉菌（Streptomyces chattanoogensis）L12

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<210> 7

<211> 1059

<212> DNA

<213> 恰塔努加链霉菌（Streptomyces chattanoogensis）L12

<223>

<400> 7

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<210> 8

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<212> DNA

<213> 恰塔努加链霉菌（Streptomyces chattanoogensis）L12

<223>

<400> 8

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<210> 9

<211> 15

<212> DNA

<213> 恰塔努加链霉菌（Streptomyces chattanoogensis）L12

<223>

<400> 9

aaaggaggcggacat 15

Claims (4)

1.一种链霉菌药物高效生物合成的构建方法，其特征在于，通过以下步骤实现：

(1) 将报告基因egfp分别置于强启动子和阻遏蛋白控制的诱导型启动子后，构建梯度表达载体，分别通过结合转导整合至宿主链霉菌恰塔努加链霉菌(Streptomyces chattanoogensis)L10基因组中；所述的诱导型启动子为O _R O _lac ，由SEQ ID NO：1 的核苷酸序列组成；强启动子为组成型启动子ermEp ^* ，由SEQ ID NO：2 的核苷酸序列组成；所述恰塔努加链霉菌L10由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，分类命名：恰塔努加链霉菌，保藏号：CGMCC No.2644，保藏日期：2008年8月27日，保藏地址：北京市朝阳西路北展西路1号院3号中国科学院微生物研究所；

(2) 无菌条件下，将步骤（1）处理的恰塔努加链霉菌L10接种于斜面培养基中，置于培养箱中培养，所述斜面培养基为：酵母提取物 4.0g/L，麦芽提取物 10.0 g/L，葡萄糖 4.0g/L，琼脂糖 20.0 g/L，其余为水，pH 值调至6.0；

(3) 斜面培养后，将培养好的孢子块接入盛有摇瓶种子培养基的三角瓶中，摇床培养18-22小时，所述种子培养基为：葡萄糖 17.5g/L，蛋白胨15 g/L，NaCl 10 g/L，其余为水，pH自然；

(4) 将步骤(3)所得的种子液转接至4%YEME培养基中， 12小时后加入诱导剂，继续摇瓶培养至48小时，所述4%YEME培养基为酵母提取物3.0g/L，麦芽提取物 3.0 g/L，蛋白胨5.0 g/L，葡萄糖 40 g/L，其余为水，pH自然；

(5) 吸取步骤(4)所得的链霉菌菌液，离心收集菌体，采用PBS缓冲液清洗菌体一次，加入蛋白裂解缓冲液和蛋白水解酶抑制剂，超声破碎细胞，4 °C、12000 r/min离心10 min，转移上清至新的1.5 ml离心管中，对蛋白进行定量后，取蛋白样品分别进行SDS-PAGE和Western blotting检测，与此同时，取少量液体培养的链霉菌菌液，通过激光共聚焦显微镜观察绿色荧光强度；蛋白裂解缓冲液：PH 8.0的Tris HCl 50mM，NaCl 150mM，EDTA 5mM，Glycerol

5%，Triton X-100 1%；蛋白水解酶抑制剂：PMSF；

(6) 分析不同诱导条件下和不同启动子活性下eGFP 的表达变化曲线，初步建立链霉菌梯度诱导表达体系；

(7) 将四个限速酶编码基因：scnK、scnJ、scnC和scnD分别置于诱导型启动子和强启动子后，构建梯度表达载体，分别通过结合转导导入对应的靶基因缺失菌株中，构建突变菌株；所述四个限速酶编码基因：scnK、scnJ、scnC和scnD由SEQ ID NO：5-8 的核苷酸序列组成，其中scnK、scnJ和scnC依次置于强启动子ermEp ^* 后，scnD单独置于强启动子ermEp ^* 后，通过两套整合酶体系整合至恰塔努加链霉菌L10的基因组中；

(8) 偶联分析目的药物和靶基因的表达量的对应关系，揭示纳他霉素合成途径中的限速反应及其限速酶的适配性；

(9) 将限速酶基因分别置于强启动子ermEp ^* 后，构建载体，通过结合转导导入恰塔努加链霉菌L10中，获得恰塔努加链霉菌(Streptomyces chattanoogensis) L12；所述恰塔努加链霉菌株L12已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号：CGMCCNo.10157，分类命名：恰塔努加链霉菌，保藏日期：2014年12月11日，保藏地址：北京市朝阳西路北展西路1号院3号中国科学院微生物研究所；

(10) 将恰塔努加链霉菌L12接种于种子培养基中，摇瓶培养18-22小时后转接入新鲜的种子培养基中，形成二级种子液，其中的种子培养基同步骤（3）；

(11) 将步骤(10)中的二级种子液转接至发酵罐培养基中，控制发酵罐的各个参数，在不同的发酵时间点取样；发酵罐培养基：大豆蛋白粉20 g/L，酵母粉8 g/L，葡萄糖40 g/L，其余为水, pH自然；

(12) 使用甲醇浸提发酵培养液中的纳他霉素，通过高效液相色谱检测其产量。

2.根据权利要求1所述的一种链霉菌药物高效生物合成的构建方法，其特征在于，步骤（1）报告基因egfp由SEQ ID NO：3 的核苷酸序列组成；所述阻遏蛋白的编码基因及其启动子为P _L tetO1-lacI，由SEQ ID NO：4 的核苷酸序列组成。

3.根据权利要求1所述的一种链霉菌药物高效生物合成的构建方法，其特征在于，步骤（4）所述诱导剂为异丙基硫代半乳糖苷。

4.权利要求1所述的一种链霉菌药物高效生物合成的构建方法中涉及的工程菌恰塔努加链霉菌L12在构建链霉菌药物高效生物合成中的应用。