CN101892186B

CN101892186B - 产表柔红霉素的天蓝淡红链霉菌的基因工程菌及其制备方法

Info

Publication number: CN101892186B
Application number: CN 200910051620
Authority: CN
Inventors: 李继安; 黄佳; 邵雷; 陈代杰; 景兰
Original assignee: Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry
Current assignee: Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry
Priority date: 2009-05-20
Filing date: 2009-05-20
Publication date: 2013-06-05
Anticipated expiration: 2029-05-20
Also published as: CN101892186A

Abstract

本发明公开了一种产表柔红霉素的天蓝淡红链霉菌的基因工程菌及其制备方法和所用的重组穿梭载体和转化体。该工程菌是一种在天蓝淡红链霉菌野生菌株的dnmV基因中插入或者置换为外来基因，使dnmV基因被阻断的基因阻断工程菌，所述的外来基因中包含aveBIV基因使该基因阻断工程菌表达aveBIV，其特征在于，所述的外来基因是启动子和aveBIV基因的连锁片段。本发明所构建的工程菌，不含有任何抗性标记，很方便用于进一步的基因工程改造；表柔红霉素产量大于用已有方法，最好可达45mg/L；通过连续传代，表柔红霉素产量非常稳定，重复性好。

Description

产表柔红霉素的天蓝淡红链霉菌的基因工程菌及其制备方法

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，特别涉及一种生产表柔红霉素的天蓝淡红链霉菌的基因工程菌及其制备方法和所用的重组穿梭载体和转化体。

背景技术

柔红霉素以及以其为原料合成的阿霉素(doxorubin)、表阿霉素(epirubicin)是目前临床上十分重要的抗肿瘤蒽环类抗生素。表阿霉素的心脏毒性和骨髓毒性比阿霉素更低，而抗肿瘤的效果相当或更高。表柔红霉素(epi-daunorubicin)是工业生产表阿霉素的重要前体，其与柔红霉素的差别仅在于分子中脱氧糖C4位羟基构型不同。由化学合成法从柔红霉素到表柔红霉素需要经过多步条件要求苛刻的反应过程，并会造成环境污染。如果采用微生物发酵方法直接生产将会大大节约成本，提高效率。若要柔红霉素的产生菌改造成可以直接在体内合成表柔红霉素的菌株，需要改变TDP-L-柔红糖胺的生物合成过程中的一个步骤。其中dnmV为TDP-6-脱氧糖C4酮基还原酶，它决定了菌株分子中脱氧糖C4位羟基构型反应，使其生成柔红霉素。阿韦菌素酮基还原酶即ave BIV的与dnmV的立体选择性正好相反。威斯康辛大学的Hutchinson教授将aveBIV基因，导入柔红霉素产生菌(波赛链霉菌)，并中断柔红糖胺的产生，构建的工程菌产生表柔红霉素(Krishnamurthy Madduri，Jonathan Kennedy，Giovanni Rivola，et al.Production of the antitumor drug epirubicin(4′-epidoxorubicin)and its precursorby a genetically engineered strain of Streptomyces peucetius[J].NatureBiotechnology，1998，16：69-74)。而本申请人之前在产柔红霉素天蓝色链霉菌(Streptomyces coeruleorubidus)SIPI-1482中，中断了柔红糖胺生物合成基因dnmV，插入了aveBIV基因和阿伯拉霉素(又名安普霉素)的抗性基因，构建了表柔红霉素产生菌(中国专利申请200610146614.6)。这种方法构建的工程菌产表柔红霉素产量较低，经过我们验证其发酵产量不超过20mg/L，且不稳定，连续传代2次以上发酵单位就有明显的降低。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题就是针对现有的生产表柔红霉素的天蓝淡红链霉菌的dnmV基因阻断工程菌产量不高，遗传稳定性低的不足，提供一种改良的天蓝淡红链霉菌的dnmV基因阻断工程菌，该菌表柔红霉素产量大大高于现有的表柔红霉素生产菌，并且传代非常稳定。本发明还提供该生产表柔红霉素的天蓝淡红链霉菌的基因工程菌的制备方法和所用的重组穿梭载体和转化体。

本发明人经过仔细研究和反复试验发现，生产表柔红霉素的天蓝淡红链霉菌的dnmV基因阻断工程菌中的外来插入基因片段过大，影响了工程菌的遗传稳定性和表柔红霉素的产量，其中的外来基因包括抗生素抗性基因和aveBIV基因。抗生素抗性基因有2kb的长度，是筛选标记，aveBIV基因是使天蓝淡红链霉菌产生表柔红霉素的基因。因此，本发明人将外来基因改变为仅由aveBIV基因及其启动子组成，没有加入抗生素抗性基因，大大减小外来基因的长度。本发明人发现，在基因阻断工程菌的制备中增加同源重组双交换的交换臂长度可以大大增加双交换的频率，筛选双交换子的工作量大大减小，从而完成了本发明。

因此，本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之一是：一种生产表柔红霉素的天蓝淡红链霉菌(Streptomyces coeruleorubidus)的基因工程菌，其是一种在天蓝淡红链霉菌野生菌株的dnmV基因中插入或者置换为外来基因，使dnmV基因被阻断的基因阻断工程菌，所述的外来基因中包含aveBIV基因使该基因阻断工程菌表达aveBIV(阿维菌素酮基还原酶)，其中，所述的外来基因是启动子和aveBIV基因的连锁片段。

根据本发明，所述的启动子较佳的是红霉素启动子，更佳的所述的启动子的核苷酸序列是序列表中SEQ ID NO.1的第1525～2198位所示的核苷酸序列。所述的aveBIV基因又称阿维菌素酮基还原酶基因。所述的aveBIV基因的核苷酸序列较佳的是如序列表中SEQ ID NO.1的第2199～3492位所示。所述的dnmV基因又称胸腺嘧啶核苷二磷酸-6-脱氧糖C4酮基还原酶基因。

根据本发明，所述的外来基因插入于天蓝淡红链霉菌野生菌株的dnmV基因中，或者与dnmV基因中的DNA片段置换。所述的天蓝淡红链霉菌野生菌株的dnmV基因序列被外来基因置换的部分最大长度可以是整个dnmV基因，较佳的是dnmV基因的第273位～675位之间的核苷酸片段被置换掉。因此，dnmV基因被阻断而不能表达。而插入的外来基因，即启动子和aveBIV基因的连锁DNA片段可以表达，从而使该被改造了的天蓝淡红链霉菌可以产生表柔红霉素。

根据本发明，所述的天蓝淡红链霉菌野生菌株较佳的选用国内工业用菌株——天蓝淡红链霉菌(Streptomyces coeruleorubidus)SIPI-1482。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之二是：一种重组穿梭载体，其含有由在天蓝淡红链霉菌基因组中与dnmV基因连锁的上游基因或其片段、dnmV基因5’端片段、启动子、aveBIV基因、dnmV基因3’端片段、以及在天蓝淡红链霉菌基因组中与dnmV基因连锁的上游基因或其片段依次连锁组成的DNA片段。

在野生型天蓝淡红链霉菌中，基因dnmZ、dnmU、dnmV、dnmJ和dnmI依次连锁表达，dnmZ和dnmU在dnmV的上游，dnmJ和dnmI在dnmV的下游，该连锁基因的核苷酸序列已公开(GenBank登录号：AF006633)。本发明的重组穿梭载体中含有的重组片段较佳的则是在上述连锁序列的dnmV基因序列中插入或者由部分dnmV基因序列置换成启动子和aveBIV基因的序列。dnmV基因中被置换序列的长度最大可以是整个dnmV基因，较佳的是dnmV基因中间的核苷酸序列。也就是说，本发明的重组穿梭载体含有的重组DNA序列较佳的是由dnmZ基因或其片段、dnmU基因、在天蓝淡红链霉菌基因组中与dnmU基因连锁的dnmV基因片段、启动子、aveBIV基因、在天蓝淡红链霉菌基因组中与dnmJ基因连锁的dnmV基因片段、dnmJ基因和dnmI基因或其片段依次连锁组成的DNA片段。本发明中所述的启动子较佳的是红霉素启动子。较佳的，所述的重组穿梭载体中含有的重组片段，即所述的依次连锁组成的DNA片段，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。其中第1～617位核苷酸序列是所述的dnmZ基因片段；第618～1251位核苷酸序列是所述的dnmU基因；第1252～1524位核苷酸序列是所述的在天蓝淡红链霉菌基因组中与dnmU基因连锁的dnmV基因片段；第1525～2198位核苷酸序列是所述的红霉素启动子；第2199～3492位核苷酸序列是所述的aveBIV基因；第3493～3741位核苷酸是所述的在天蓝淡红链霉菌基因组中与dnmJ基因连锁的dnmV基因片段；第3742～4855位核苷酸是所述的dnmJ基因；第4856～5028位核苷酸是所述的dnmI基因。

该重组穿梭载体可用于与天蓝淡红链霉菌基因组发生同源双交换，从而得到生产表柔红霉素的天蓝淡红链霉菌的基因阻断突变的工程菌。其中，在该重组穿梭载体中，所述的dnmZ、dnmU和与dnmU连锁的dnmV片段的部分是发生同源重组双交换的左臂；与dnmJ连锁的dnmV片段、dnmJ和dnmI的部分是发生同源重组双交换的右臂。启动子和aveBIV基因的部分是发生重组双交换时导入的外来基因。所述的左臂的长度可以是500～2000bp，较佳的是1525bp，即序列表中SEQ ID NO.1第1～1524位所示的序列。所述的右臂的长度可以是500～2000bp，较佳的是1536bp，即序列表中SEQ IDNO.1第3293～5028位所示的序列。

根据本发明，所述的重组穿梭载体的骨架较佳的是质粒pKC1139。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之三是：一种转化子，其含有所述的重组穿梭载体。

根据本发明，所述的转化子的宿主细胞较佳的是大肠杆菌ET12567。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之四是：一种制备生产表柔红霉素的天蓝淡红链霉菌的基因工程菌的方法，其中，包括将如上所述的转化子与产柔红霉素的天蓝淡红链霉菌接合，挑选同源双交换接合子。

根据本发明，所述的产柔红霉素的天蓝淡红链霉菌较佳的选用国内工业用菌株——天蓝淡红链霉菌(Streptomyces coeruleorubidus)SIPI-1482。

本发明所述的天蓝淡红链霉菌的基因工程菌可用于生产表柔红霉素。因此，本发明还提供一种制备表柔红霉素的的方法，包括培养本发明上述天蓝淡红链霉菌的基因工程菌，从培养物中获得表柔红霉素。

本发明所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。

相比于现有技术，本发明的有益效果如下：本发明将产柔红霉素的天蓝色淡红链霉菌进行改造，主要是敲除了其中的部分dnmV基因，置换入aveBIV基因，通过基因置换法得到了生产的表柔红霉素的工程菌。本发明所构建的工程菌，不含有任何抗性标记，很方便用于进一步的基因工程改造。本发明所构建的工程菌，表柔红霉素产量大于用已有方法，最好可达45mg/L。本发明所构建的工程菌，通过连续传代，表柔红霉素产量非常稳定，重复性好。在本发明的制备方法中，增加了双交换双臂的长度。在中国专利申请200610146614.6公开的方法中，交换双臂的长度是700bp，本发明的优选方案中交换双臂的长度是1500bp，增大了双交换发生的几率，加快双交换接合子的筛选。本发明采用PCR来筛选突变株，解决了插入抗性基因作为筛选标记(例如阿伯拉霉素抗性基因)，插入外来基因片段过大所带来的影响上下游基因的转录的问题，从而保持剩下的dnmV基因的两端的碱基和编码氨基酸不变，最大限度的减少中断dnmV和插入aveBIV基因对上下游的基因的影响，大大增加了菌株的稳定性，提高了表柔红霉素产量。

附图说明

以下结合附图说明本发明的特征和有益效果。

图1是含aveBIV基因的重组质粒的构建示意图。

图2是定点插入质粒的构建示意图。

图3是表柔红霉素生产菌的构建策略示意图。

图4是PCR验证的电泳图。M，marker；1，双交换基因型；2，回复基因型。

图5是产表柔红霉素的工程菌的发酵液的HPLC分析图谱。

具体实施方式

下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

所使用的工具酶和DNA分子量标记均购自宝生物公司(Takara)，具体的反应条件和使用的方法均参考商品说明书

所使用的胶回收试剂盒购自北京博大泰克生物基因技术有限责任公司，使用方法参考商品说明书。

大肠杆菌E.coli DH5α、ET12567，购自上海鼎国生物技术有限责任公司。

天蓝淡红链霉菌SIPI-1482可从上海医药工业研究院取得。

实施例1双交换左右臂与aveBIV序列的克隆

在天蓝淡红链霉菌SIPI-1482中，dnmZ和dnmU依次在dnmV的上游，dnmJ和dnmI依次在dnmV的下游，本发明取dnmZ、dmnU加一部分dmnV作为双交换的左臂，dnmI、dnmJ加一部分dmnV作为双交换的右臂来构建双交换质粒。首先根据已经发表的天蓝淡红链霉菌SIPI-1482相应序列(GenBank登录号：AF006633)设计引物：

左臂上游引物为5’-AAAAAGCTTCTGGGACGGAATGGGC-3’，

左臂下游引物为5’-AAATTCGAATCGCACCAGTCGCAGATG-3’；

右臂上游引物为5’-AAATCTAGAGGGCTGGTCGTCAACATC-3’，

右臂下游引物为5’-AAAGGATCCCATCAAACTCCGCAAGACAT-3’。

上述引物由上海英骏生物技术有限公司合成。以天蓝淡红链霉菌SIPI-1482的总基因组为模板。使用宝生物公司的primer star高保真DNA聚合酶来进行片段的克隆。PCR条件为：98℃，10s、66℃，15s、72℃，2min。PCR产物上样电泳后，回收目的条带。回收的片段与质粒进行连接，左臂PCR产物联入质粒pSP72(购自上海生工生物工程技术服务有限公司)，接入位点HindIII和XbaI，命名为pSL-02-3-1并测序；右臂PCR产物联入质粒pSP72，接入位点XbaI和EcoRV，命名为pSL-R15，并测序。左臂序列与GenBank登录号AF006633中的相应序列比对为97.4％的同源性，右臂序列与编号AF006633中的相应序列比对为99.3％的同源性。

在PubMed上查到aveBIV的基因序列，设计相应的引物：上游引物：5’-AAAAGATCTGCACGGGTCAACGGGTAA-3’，下游引物：5’-AAAAGATCTTGATGTCGAGCGGCTACG-3’。以阿维链霉菌S.avermitilis(购自ATCC公司)的总DNA为模板，用primer star高保真DNA聚合酶扩增得到aveBIV的基因。aveBIV基因连入质粒pSP72，连接位点BglII和BglII，得到质粒pSL-02-20-1。

以红霉素生产菌株S.erythraea HL 3168 E3(购自ATCC公司)的基因组为模板，上游引物5’-AAATCTAGAAGCCCGACCCGAGCA-3’，下游引物5’-AAAAAGCTTTCCGGAGGTCGCACC-3’，进行PCR，所得PCR产物纯化后连接在质粒pGEM-3zf(购自上海生工)上，得到质粒pSL-HM-312，即含有红霉素启动子的重组载体。用限制性内切酶EcoRI和BamHI从质粒pSL-HM-312切得红霉素启动子，把红霉素启动子连入质粒pSET152(购自上海生工生物工程技术服务有限公司)得到pSL-02-18-1，接入位点为EcoRI和BamHI。用BglII从pSL-02-20-1切的aveBIV基因正向连入pSL-02-18-1，此质粒即为插入红霉素启动子和aveBIV结构基因的pSET152随机整合质粒，命名为pSL-02-22-1。设计并合成PCR引物，上游引物为5’-AAATCTAGAGGTACCAGCCCGACCCGAGC-3’，下游引物为5’-AAATCTAGATGATGTCGAGCGGCTACG-3’。以质粒pSL-02-22-1为模板，扩增出红霉素启动子和aveBIV基因连锁的DNA片段(ErmEP+aveBIV基因)，联入质粒pSP72，接入位点XbaI和XbaI，得到重组质粒，命名为pSL-02-26-1，测序，所得aveBIV基因的核苷酸序列见序列表中SEQ ID NO.1第2199～3492位所示，与NCBI数据库中的的aveBIV基因序列(序列登录号：AB032523)比对的同源性为100％，质粒构建过程见图1。

实施例2 双交换定点插入质粒的构建、接合转移

实施例1中的右臂联入质粒pKC1139(购自上海生工生物工程技术服务有限公司公司)，接入位点XbaI和EcoRV，得到质粒，命名为pSL-02-7-1。左臂正向联入质粒pSL-02-7-1，接入位点HindIII和XbaI，得到质粒，命名为pSL-02-12-1。采用限制性内切酶XbaI从实施例1中的pSL-02-26-1质粒中切出ErmEP+aveBIV基因正向联入pSL-02-12-1中，此质粒即为双交换敲除dmnV，同时定点插入aveBIV的表柔红霉素表达整合质粒。用此质粒转化大肠DH5α，调取转化子在LB中培养，提取质粒进行酶切和PCR验证，最终构建成双交换定点插入质粒，命名为pSL-02-30-1。构建策略见图2。

从天蓝淡红链霉菌SIPI-1482斜面挑取适量菌体于50ml TSB培养基中培养56小时左右达到对数生长期，1％(v/v)接种量转接于50ml TSB培养基中培养48小时左右使菌体达到对数生长后期，离心倒去上清得到菌丝体，菌丝体用20ml的LB液体培养基洗涤2次(4000rpm，10min，4℃)，最后重悬于20ml LB培养基中，待用。用pSL-02-30-1转化感受态大肠杆菌ET12567，挑转化子至装有4ml LB培养基[含阿伯拉霉素(Am)100μg/ml、卡那霉素(Kn)25μg/ml、氯霉素(Cm)100μg/ml]的小试管中，37℃振荡培养12小时。大肠杆菌ET12567接种于装有50ml LB培养基的250ml三角瓶中，37℃振荡培养4小时左右，使菌液OD值在0.4～0.6之间，将菌液移入50 ml的无菌塑料离心管，离心(4000rpm，10min，4℃)，倒去上清，菌体用20mlLB培养基洗涤2次(4000rpm，10min，4℃)，最后重悬于1～2ml LB培养基中。将该大肠菌液与之前的天蓝淡红链霉菌SIPI-1482菌丝体以1∶1(重悬液体积比)于EP管中混匀。将混合菌液涂MS平板，用涂棒充分混匀菌液，30℃恒温箱培养。培养20小时后，取出平板，涂抗生素，用量为每10个平板涂10ml双蒸水、100μl Am和400μl萘啶酸(NC)的混合液，再于30℃恒温箱培养。培养一周后出现接合子。表柔红霉素产生菌的构建过程见图3。

实施例3双交换工程菌的筛选

挑取实施例2所得的接合子于装有4ml TSB培养基的小试管中(含Am50μg/ml、试管中加入2～3粒直径2～5毫米的玻璃珠)，30℃振荡培养。菌液摇浓后，取1μl菌液稀释于1ml无菌水中，混匀后取100μl涂含Am 50μg/ml的高氏一号平板，37℃培养。因为pKC1139质粒是温敏型质粒，只有整合到染色体上才能存活，所有出来的整合子已经发生过同源重组交换。4至5天后，挑取整合子于无抗生素的TSB培养基中培养，连续传代，促使其发生双交换。取第3代菌液1μl，稀释于10ml的无菌水中，混匀后取100μl涂高氏一号平板(无抗性)，30℃培养。4至5天后，出现单菌落，挑取同一个单菌落分别在有抗性与无抗性的平板上培养，筛选无抗性平板生长，而抗性平板不生长的菌落，得到30个菌落。在无抗性平板生长而在抗性平板不生长的克隆就是发生双交换或者回复的克隆。挑取菌落在液体TSB培养基中培养，然后抽提其总DNA。在左右臂上设计相应的引物，上游引物：5’-ACGGGTGGGACGTGCAC-3’，下游引物：5’-CACATGCTGTGGACGGAG-3’，进行PCR验证。PCR产物的电泳图见图4。扩增出800bp的片段的是回复型的野生菌株基因组，扩增出2400bp的片段的是双交换突变株基因组。我们从30个菌落中筛选到6个双交换突变株，双交换发生几率很高。

实施例4 产表柔红霉素的工程菌的发酵验证

挑取实施例3中能扩增出2400bp片段的双交换突变株于高氏一号斜面30℃培养，培养15天后，接种于种子培养液(淀粉2.0，玉米粉2.0，葡萄糖1.0，麸皮1.0，麸质粉1.0，MgSO₄ 0.1，K₂HP0₄ 0.1(g/100ml))。种子培养液培养2天后转接于发酵培养基(玉米粉7.0，葡萄糖1.0，麸皮1.0，麸质粉0.75，K₂HP0₄ 0.01，(NH₄)₂ SO₄ 0.1(g/100ml))，接种量10％(v/v)。30℃，220r/m培养5天后放瓶，发酵液用草酸调pH值至5左右，再加2倍体积的丙酮混匀浸泡5小时以上，离心后取上清做HPLC分析。HPLC条件，流动相：0.1％(v/v)甲酸的乙腈∶0.1％(v/v)甲酸的水溶液＝72∶28，流速：1ml/min，柱温：35℃，检测波长：254nm，进样量：5μl，分析柱：Agilent C18。HPLC分析结果见图5，可见：通过双交换定点插入的工程菌，发酵产物中已经不存在柔红霉素组分，而表柔红霉素的浓度在45mg/L左右。

序列表

<110>上海医药工业研究院

<120>产表柔红霉素的天蓝淡红链霉菌的基因工程菌及其制备方法

<130>P4-091165C

<160>1

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>5028

<212>DNA

<213>Artificial(人工序列)

<220>

<223>重组DNA

<220>

<221>misc_feature

<222>(62)..(62)

<223>nisa，c，g，ort

<220>

<221>Promoter

<222>(1525)..(2198)

<223>红霉素启动子

<220>

<221>gene

<222>(2199)..(3492)

<223>aveBIV基因

<400>1

ctgggacgga atgggcatgc ggtcgtcggg cagtgtggac atcgtcttcg acggctgtcc 60

gntggaccgg gaccgggtgc tgccgcgacg gcgagccggg cgtcgcgacg acgcggcgct 120

cgccgggcag acgtcagctc gtacgcatgc tggctatcac tcggctacgc cgaggcgctc 180

gaggatcgcc ctcacggaac tgcgcaggcg cggcggggcg ccggccgggg tgcggaccac 240

ggtggccgag atagacgccc ggctgttcgc gctgcacacg gcggtggcga gcgcgttgac 300

caccgccgac cggctcgccg acgacctcag cggcgacctc gccgcccgcg gccgcgccat 360

gatgacgccc ttccagtacg ccaagctgct cgtcaaccgg cactcggtgg gcgtggtgga 420

cgactgcctg atgctcgtgg gaggggccgg atacagcaac tcccacccgc tggcgcgcct 480

gtaccgcgat gtccgggcgg gcgggttcat gcatccatac aacttcacgg acggcgtcga 540

ctacctgagc gaagtggcgt tgggccgatg agcggcgggc gacgcgggac cgggatccct 600

ggagtcggag gacgtggatg aaggcgcggg aactggcggt gcagggggcg tacacgttcg 660

agccggaggt gtttccggac gagcgggggc tgttcgtctc accgttccgg gaggatgcgt 720

tcacggccgc ggtcggccac cccctcttcc cggtgcggca gacgaatcac agccggtcgc 780

ggcgcggggt ggtgcggggc gtgcactaca ccgtgacgcc gccgggctcg gccaagtacg 840

tgtactgcgc ccgtggcagg tcgctggaca tcgtcgtcga cgtgcgggtc ggctccccga 900

cgtacggccg gtgggacgcc gtcgagctgg agccgcgtga gttccgggcg gtgtacttcc 960

cggtcggggt ggggcacgcc ttcgtggccc tggaggacga caccgtcatg tcgtacatgc 1020

tgtccgggga gtacgtgcag gccaacgaac tcgccgtgtc ggtgctggac ccggccctcg 1080

ggctgcccgt gccgggtgac ctggagcctc tgctgtccgg ccgggaccgg gctgcaccgc 1140

ccctggagca ggcccgggcc gccgggaccc ttccggagta cgccgcatgc cgggcggtcg 1200

agtcggagct gtggccgccg gccgggtcac gcggagacgg gtgaggcgga catgcgggtc 1260

gtggttctgg gggcgacggg cagcgtcggt cggcaggtgt gtgcggcgta ccaggcgcac 1320

gggtgggacg tgcacggggt ggcccgccgc ccggcgccgc acctgagcgg gtgcgggttc 1380

acggagctgg acctcgcggc cgccgcgcct gggcggatcg ccacggtgct gggtgatctt 1440

ccggcggacg tcgtggtcaa cgcggcgggc ggctggggcg acaccgagga ggagatgacg 1500

tactcgcatc tgcgactggt gcgagaattc ggtaccagcc cgacccgagc acgcgccggc 1560

acgcctggtc gatgtcggac cggagttcga ggtacgcggc ttgcaggtcc aggaagggga 1620

cgtccatgcg agtgtccgtt cgagtggcgg cttgcgcccg atgctagtcg cggttgatcg 1680

gcgatcgcag gtgcacgcgg tcgatcttga cggctggcga gaggtgcggg gaggatctga 1740

ccgacgcggt ccacacgtgg caccgcgatg ctgttgtggg cacaatcgtg ccggttggta 1800

ggatctgcag ccaagctctg gaccgccccc gactcctgac cgccggccat ccgtgaccac 1860

cgctcagcac gaaggagaac agaccgtggc agccgccgcc aagatcgcca tgtccagtgt 1920

ggcgcccagt caccggcagg ggggcagcac ccgcgccctg ctgacgccgt cgtcggtggg 1980

tgcgacctcc ggagagctcg gtacccgggg atctgcacgg gtcaacgggt aaagccgaga 2040

gccggttccc cccgcgagca cgattccctt catgtcggac tccccgcagt cgacgttata 2100

tatctctgcc gtctgcccga cggtaccaag tggcggaaaa cgcaccagga attcgagcgc 2160

cgctaggggg aagggctcaa gaagataggg gccaccagat ggggcggttt tcggtgtgcc 2220

cgccccggcc gaccggaata ctgaagagca tgctgacgac tgggatgtgc gaccgaccgc 2280

tggtcgtcgt actcggagcc tccggctata tcgggtcggc cgtcgcggcg gaactcgccc 2340

ggtggccggt cctgttgcgg ctggtggccc ggcgaccggg cgtcgttccg ccgggcggcg 2400

ccgcggagac cgagacgcgt acggccgacc tgacggcggc gagcgaggtc gccctcgccg 2460

tgacggacgc cgacgtggtg atccacctgg tcgcgcgcct cacccaggga gcggcatggc 2520

gggcggcgga gagcgatccg gtggccgagc gggtgaacgt cggggtgatg cacgacgtcg 2580

tcgcggccct gcggtccggg cgccgcgccg ggccgccccc ggtggtggtg ttcgccgggt 2640

cggtctacca ggtgggccgc ccgggtcggg tcgacggcag tgagccggac gagcccgtga 2700

cggcctatgc ccgtcagaaa ctcgacgccg aacggacgtt gaagtccgcc acggtcgagg 2760

gtgtcctgcg ggggatctcg ctgcggctgc ccaccgtcta cggcgcgggg ccgggcccgc 2820

agggcaacgg cgtcgtgcag gcgatggtgc tccgggcgct cgccgacgag gccctcaccg 2880

tgtggaacgg aagcgtggtg gagcgtgacc tggtgcatgt ggaggatgtc gcgcaggcct 2940

tcgtgagctg cctggcgcac gcggatgcgc tcgccgggcg gcactggctg ctcggcagcg 3000

gtcgtcctgt gaccgtcccg cacctcttcg gtgccatcgc cgccggcgtg tccgcccgca 3060

ccgggcgccc cgcggtgccc gtgaccgcgg tggaccctcc ggcgatggcg acggcggcgg 3120

acttccacgg gaccgtcgtc gactcctcgg cgttccgcgc ggtcaccggg tggcggccgc 3180

ggctgtcgct tcaggagggc ctggaccaca tggtggcggc ttacgtgtag cgccggggtg 3240

gcggccgggc ccgggcggtg acggcccgga tccgggtcgg ccgtcacagc ttctcgtcga 3300

gggcgcggct cgcgcggtac tccggcaaca tgccgcgtcg cagggcctgc tggagagtcg 3360

gcgcgcgccg gtcgcgctcg gagaggatcg gtgcccgccc gaggtggtgg ccgaggggca 3420

gggcgaggtc cggatcctcg ggcgagaggg cgtgttcgtt ctgcggaacg tagccgctcg 3480

acatcaagat ctgggctggt cgtcaacatc gggcgcgggg acgccgtgcc gatcggtgat 3540

ctggtcggct ggctgctgga ggccgccgcc ttcccggagg accgggtcga ccgccgggag 3600

gcgccggtgc ggagcaaggg cggcgactgg acccggctgg acatcgggcg ggcccggcgg 3660

ttgctgtcct gggcgccgcg catcggcctg cgggactccg tccacagcat gtggcggacc 3720

gcgcacggcg ccccggccta gctcacaggc ttccgacgac ctcccgcacc gcgtcgatca 3780

ccttctcctg cgcgtcggga cgcagcgagg ggtacatcgg cagggagaag atctcgccgg 3840

ccagccgttc ggtcaccggc aggtcgccgg ggccgtagcc gaggtgggcg aatccgctca 3900

tggtgtggac gggccagggg tagctgatgt tgagatggat gtcgtaggcg gtgagcgcct 3960

ccaggatgcg gtcgcgttcg gggtgacgca ccacgtacac gtagtagacg tggtcgttgc 4020

cctcggcgat cgtgggcagc accaggccgt cgaggtcacc gagtccctcc tcgtagcggc 4080

gggcgacggc ccggcggccc tcgacatagg cgtcgaggcg gcgcagtttc cggcgcagga 4140

tctcggcctg cacctcgtcg agcctgctgt tgtgcccggg ggtgtccacg acgtagtagc 4200

gctcccccat gccgtagtag cgcaaccgcc gcagccgccg gtcgacttcc gcgtccggcg 4260

tgacgacggc gccgccgtca ccgtaggcac cgaggacctt ggtcgggtag aaggagaagg 4320

ccgccgcatg cccctgggtg ccgaccagcc gtccgtgacg gcgggcaccg tgggcctggg 4380

cgcagtcctc cagcaccttc aggtcgtgct cggcggcgag ttcgagcacg ggggtcatgt 4440

ccacgctctg tccgtagagg tggacgggca gcaggcaccg ggtgcgcggg ccgatcaccg 4500

accggagccg gccggtgtcc atgaggtagt tctcctcgtg cacgtcgacg aagacggggg 4560

tggcgcccac ggcgtcgatg gccaccacgg tgggggccgc ggtgttggag accgtcacga 4620

cctcgtcccc cgggccgatg ccgagcgccc gcaggccgag gaccagcgcg ttggtgccgt 4680

tgtcgacgcc cgtgcagtac ggcagtccgt gataagcggc gaactcctcc tcgaaagagc 4740

ggacgctggt cccgagaata agctggccgg actcgaatac ggtttccacc gcatcgagaa 4800

tgtcggcgcg ttcttcccgg tattcattga ggtattgcca gacgtaggtg gacacgtgac 4860

tccttgtcgg ggcgcggtca ggcaagcgcg acggacgcgg ctgccgggac ttccggaccg 4920

ttccggtcga tgccggggtc ggcccgcaga atcgcgtgct ggaggtgctg gagacgggcg 4980

gacggttcca cccccagctc gttcaccaat gtcttgcgga gtttgatg 5028

Claims

1.一种产表柔红霉素的天蓝淡红链霉菌的基因工程菌，其是一种天蓝淡红链霉菌野生菌株的dnmV基因被置换为外来基因，使dnmV基因被阻断的基因阻断工程菌，所述的外来基因中包含aveBIV基因使该基因阻断工程菌表达aveBIV，其特征在于，所述的外来基因是启动子和aveBIV基因的连锁片段，所述的天蓝淡红链霉菌野生菌株的dnmV基因的第273位～675位之间的核苷酸片段被置换。

2.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述的启动子的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1的第1525～2198位所示，所述的aveBIV基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1的第2199～3492位所示。

3.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述的天蓝淡红链霉菌野生菌株是天蓝淡红链霉菌Streptomyces coeruleorubidus SIPI-1482。

4.一种重组穿梭载体，其特征在于，含有由在天蓝淡红链霉菌基因组中与dnmV基因连锁的上游基因或其片段、dnmV基因5’端片段、启动子、aveBIV基因、dnmV基因3’端片段、以及在天蓝淡红链霉菌基因组中与dnmV基因连锁的下游基因或其片段依次连锁组成的DNA片段，所述的依次连锁组成的DNA片段的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。

5.如权利要求4所述的重组穿梭载体，其特征在于，所述的重组穿梭载体的骨架是质粒pKC1139。

6.一种转化子，其特征在于，其含有权利要求4或5所述的重组穿梭载体。

7.如权利要求6所述的转化子，其特征在于，所述的转化子的宿主细胞是大肠杆菌ET12567。

8.一种制备如权利要求1所述的产表柔红霉素的天蓝淡红链霉菌的基因工程菌的方法，其特征在于，包括将权利要求6所述的转化子与产柔红霉素的天蓝淡红链霉菌接合，挑选同源双交换接合子。

9.一种制备表柔红霉素的的方法，包括培养如权利要求1～3任一项所述的天蓝淡红链霉菌的基因工程菌，从培养物中获得表柔红霉素。