CN101343630B - 利用基因组改组技术改良多拉菌素生产菌的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用标记质粒制备发生原生质体融合的菌株的方法，所述方法具有易标记，易脱去标记的优点，可方便地用于进行基于基因改组技术的菌株育种和改良。所述方法操作简单、成本低、设备要求低，并且不伤害菌株自身的染色体。

Description

利用基因组改组技术改良多拉菌素生产菌的方法

技术领域

本发明属于细胞生物学领域；更具体地，本发明涉及一种制备原生质体融合的菌株的方法，利用所述方法可进行各种工业菌株(如多拉菌素生产菌)的育种和改良。

背景技术

在工业微生物育种中，原生质体诱变与原生质体融合技术已经被广泛应用，并取得了良好的效果。而将两者相结合的诱变融合技术也被不断应用与发展，尤其是基因组改组(Genome Shuffling)技术的诞生，为工业微生物的育种带来了新的思路。

在一般的原生质体融合中，都会使得两亲本带上可以识别的选择性遗传标记以筛选融合子。然而，目前传统采用的选择性标记主要是整合型标记、抗药性标记、营养缺陷型标记等。利用上述这些传统的标记存在的问题是操作难度大、步骤烦琐、成本高，有些标记可造成对染色体的损害，并且有些标记在加上后无法通过简单的手段脱去标记，而抗性标记的存在经常会造成菌株中目的蛋白产量的下降。

因此，本领域迫切需要找到一种适合用于工业微生物育种的，易于操作的菌株选择标记手段。

发明内容

本发明的目的在于提供一种制备原生质体融合的菌株的方法。

本发明的另一目的在于提供利用所述方法进行多拉菌素生产菌育种和改良的方法。

在本发明的第一方面，提供一种制备原生质体融合的菌株的方法，所述方法包括：

(1)在适合原生质体融合的条件下，将第一亲本菌株与第二亲本菌株进行混合，形成第一亲本菌株与第二亲本菌株的混合物，

其中，第一亲本菌株含有携带第一抗性标记的质粒，第二亲本菌株含有携带第二抗性标记的质粒，并且所述的第一抗性标记和第二抗性标记是不同的；和

(2)从所述混合物中选出耐受第一抗性标记和第二抗性标记的菌株，从而获得原生质体融合的菌株。

在另一优选例中，在步骤(1)之前，还包括步骤：

将携带第一抗性标记的质粒导入一亲本菌株中，获得第一亲本菌株；和/或

将携带第二抗性标记的质粒导入一亲本菌株中，获得第二亲本菌株。

在另一优选例中，在步骤(2)之后，还包括步骤(3)：从所获得的原生质体融合的菌株中，进一步选出性能改良的菌株。

在另一优选例中，在步骤(3)之后，还包括：以选出的性能改良的菌株作为第一亲本菌株和/或第二亲本菌株，重复步骤(1)-(3)1-1000次，从而获得性能优异的菌株。

在另一优选例中，在步骤(2)之后还包括步骤：去除原生质体融合的菌株中携带第一抗性标记的质粒和/或携带第二抗性标记的质粒。

在另一优选例中，所述去除步骤是：在非抗性选择的条件下，继续培养所述原生质体融合的菌株(如培养2-20代)，从而选择出脱去携带第一抗性标记的质粒和/或携带第二抗性标记的质粒的原生质体融合的菌株。

在另一优选例中，所述的第一亲本菌株和/或第二亲本菌株是经诱变处理的。

在另一优选例中，第一抗性标记或第二抗性标记选自(但不限于)：氨苄青霉素抗性标记(Amp)，阿伯拉霉素抗性标记(Apra)，壮观霉素抗性标记(Spc)，硫链丝菌素抗性标记(Tsr)，卡那霉素抗性标记(Kn)，四环素抗性标记(Tetr)，氯霉素抗性基因(Cmr)。

在另一优选例中，所述的第一亲本菌株和第二亲本菌株来自相同的属或种。

在另一优选例中，所述的第一亲本菌株和/或第二亲本菌株选自(但不限于)：链霉菌、细菌、糖多孢菌、刺糖多孢菌等。

更佳地，所述的链霉菌是除虫链霉菌。

在另一优选例中，所述的第一亲本菌株和/或第二亲本菌株是bkdF基因和olmA1基因中断的除虫链霉菌。

在本发明的第二方面，提供一种改良多拉菌素生产菌的方法，所述方法包括步骤：

(a)将除虫链霉菌的bkdF基因中断，获得第一除虫链霉菌；

(b)将除虫链霉菌的olmA1基因中断，获得第二除虫链霉菌；

(c)将步骤(a)获得的第一除虫链霉菌和步骤(b)获得的第二除虫链霉菌进行原生质体融合，获得bkdF基因和olmA1基因中断的除虫链霉菌；

(d)在前一步骤获得的一部分bkdF基因和olmA1基因中断的除虫链霉菌中导入携带第一抗性标记的质粒；在另一部分bkdF基因和olmA1基因中断的除虫链霉菌中导入携带第二抗性标记的质粒，所述的第一抗性标记和第二抗性标记是不同的；

(e)在适合原生质体融合的条件下，将(d)获得的分别含有携带第一抗性标记的质粒和携带第二抗性标记的质粒的除虫链霉菌进行原生质体融合，选择耐受第一抗性标记和第二抗性标记的菌株，即为原生质体融合的菌株；和

(f)鉴定(e)获得的原生质体融合的菌株的多拉菌素产量，选择多拉菌素产量高的菌株。

在另一优选例中，步骤(e)中，在进行原生质体融合前，进行原生质体诱变。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1显示了获得Apra和Spc双抗性且olmA1基因和bkdF基因中断的菌株的融合示意图。

图2显示了pPFMkn质粒的示意图谱。

图3显示了pPFMtsr质粒的示意图谱。

图4显示了不同分子量的PEG对原生质体融合的影响的测试结果。

图5显示了NTG诱变时间对于致死率的影响。

图6显示了第一次融合后获得的融合菌株进行第一批发酵，各菌株的效价分布图。

图7显示了第一次融合后获得的融合菌株进行第二批发酵，各菌株的效价分布图。

图8显示了NTG诱变后发生诱变的菌株的效价分布。

图9显示了第二次诱变融合后获得的融合菌株进行发酵，各菌株的效价分布图。

图10显示了利用链霉菌作为亲本来筛选发生原生质体融合的菌株的示意图。

具体实施方式

本发明人经过长期而广泛的研究，首次公开一种利用标记质粒制备发生原生质体融合的菌株的方法。所述方法具有易标记，易脱去标记的优点，可方便地用于进行基于基因改组技术的菌株育种和改良，操作简单、成本低、设备要求低。在此基础上完成了本发明。

标记质粒

通常工业生产菌株没有标记，无法进行遗传操作与改造。本发明人通过质粒载体对工业生产菌株进行遗传标记，进而对其进行融合等改良。

如本文所用，所述的“标记质粒”是指一种质粒，所述的质粒中含有抗性标记基因，所述的标记质粒在导入到菌株中后，可使得该宿主菌株产生相应的抗性。

本发明对于所采用的抗性标记没有特别的限制，只要其在被连接入质粒且导入到菌株中后，能够使得该菌株与不带有抗性标记的菌株相区分。所述的抗性标记包括但不限于：氨苄青霉素抗性标记(Amp)，阿伯拉霉素抗性标记(Apra)，壮观霉素抗性标记(Spc)，硫链丝菌素抗性标记(Tsr)，卡那霉素抗性标记(Kn)，四环素抗性标记(Tetr)，氯霉素抗性基因(Cmr)等。携带抗性标记的菌株的选择技术是本领域人员所熟知的。

本发明对于可用于制备标记质粒的质粒没有特别的限制，只要其具有可操作的位点，可被连接入抗性标记，并在被导入宿主菌株后能够使该宿主菌株具备与所述抗性标记相应的抗性。通常，所述的标记质粒上还可操作地连接有其它功能性位点。包括但不限于：启动子、终止子、多克隆位点等。应理解，将特定的抗性标记连接入适当的质粒，将该质粒导入到适当的宿主细胞中，以及启动子等的应用均是本领域常规的技术。

与传统的整合型标记，抗药性标记等相比，质粒标记具有易标记，易脱去标记的特点。脱去抗性标记后，可进行后续的遗传操作，如再次融合，基因操作等。与营养缺陷型标记，单亲、双亲灭活等标记方法相比，该方法不伤害菌株染色体，有利于遗传性状的保持。与荧光标记、报告基因标记等方法向比，标记质粒的方法成本低，操作简单，设备要求低。同时，标记质粒易于脱去，可避免因抗性标记表达带来的产量下降问题。

工业生产菌株一般不容易制备原生质体。即使可以，在制备原生质体的过程中，非原生质体化的菌丝仍然占大部分，这些非原生质体在再生过程中会先于原生质体而长出，并抑制原生质体的再生。此外，工业菌株原生质体再生效率低，只有将工业菌株带上标记，才能高效地进行融合育种，防止非原生质体单位及未融合单位的干扰，筛选到真正的融合子。

已发表的基因组改组技术(Genome Shuffling)对于原生质体制备、再生、融合等效率不高的大多数工业生产菌株而言是存在缺陷的，主要由于在原生质体再生的过程中非原生质体单位会先原生质体生长出，并抑制原生质体的再生，因此许多融合子会受到抑制，导致基因组改组的失败。而利用标记质粒，则可通过正选择，去除非原生质体单位，强制选择出融合子。同时，在融合后又可去除标记，进行再一轮的改组。

原生质体融合

通过人为的方法，使两株细胞的原生质体进行融合，以获得兼有双亲遗传性状的稳定重组子的过程，称为原生质体融合。由此法获得的重组子，称为融合子。

原生质体融合的一般操作步骤是：将两株特定的、带有选择性遗传标记的细胞作为亲本菌株置于等渗溶液中，用适当的脱壁酶(如细菌和放线菌可用溶菌酶等处理，真菌可用蜗牛消化酶或其他相应酶处理)去除细胞壁，再将形成的原生质体聚集，加入促融合剂聚乙二醇(PEG)或借电脉冲等因素促进融合，然后用等渗溶液稀释，再涂在能促使它再生细胞壁和进行细胞分裂的基本培养基平板上。待形成菌落后，通过特定的选择方法(如抗性选择)找到发生原生质体融合的菌株。

本发明对原生质体融合的条件、方法和试剂没有特别的限制，可以是本领域技术人员常规用于进行原生质体融合的条件、方法和试剂。

原生质体融合可以实现菌株间的基因重组，可使遗传物质传递更完整，可快速组合性状，加速育种速度，可借助聚合剂同时将几个亲本的原生质体随机地融合在一起，获得综合几个亲本性状的重组体。

制备原生质体融合的菌株的方法

本发明提供了一种制备原生质体融合的菌株的方法，所述方法包括：

(1)在适合原生质体融合的条件下，将第一亲本菌株与第二亲本菌株进行混合，形成第一亲本菌株与第二亲本菌株的混合物，

其中，第一亲本菌株含有携带第一抗性标记的质粒，第二亲本菌株含有携带第二抗性标记的质粒，并且所述的第一抗性标记和第二抗性标记是不同的；

(2)从所述混合物中选出耐受第一抗性标记和第二抗性标记的菌株，从而获得原生质体融合的菌株。

作为本发明的优选方式，在步骤(1)之前，还包括步骤：

将携带第一抗性标记的质粒导入一亲本菌株中，获得第一亲本菌株；和/或

将携带第二抗性标记的质粒导入一亲本菌株中，获得第二亲本菌株。

作为本发明的优选方式，所述的方法还包括步骤：在步骤(2)之后，还包括步骤(3)：从所获得的原生质体融合的菌株中，进一步选出性能改良的菌株。本领域人员可根据所需菌株的用途来进行选择，获得符合要求的改良菌株。

利用本发明的方法，可进行多次的细胞融合以得到符合要求的新菌株。当分别携带两种不同的标记质粒的两种亲本菌株进行混合，选择到同时带有两种标记质粒的融合菌株后，可能会获得某些方面性能改良的菌株。当该菌株还不能达到要求时，可以该菌株为亲本菌株，进行新一轮的选择。因此，作为本发明的优选方式，在步骤(3)之后，还包括：以选出的性能改良的菌株作为第一亲本菌株和/或第二亲本菌株，重复步骤(1)-(3)，直至获得性能优异的菌株。

由于经上述过程获得的融合细胞中同时携带两种标记质粒，因此，当需要使用所述融合细胞进行下一轮选择时，可去除该融合细胞内的一种或两种标记质粒后将之作为亲本菌株用于下一轮选择。当将两种标记质粒均去除后，下轮选择起始时需要分别在两种亲本菌株中重新导入不同的标记质粒；当去除其中一种标记质粒后，可直接用于下轮选择。当然，本领域人员也可选择不去除标记质粒，而在下轮选择中导入新的标记质粒，该标记质粒携带的抗性标记不同于前一轮选择中使用的抗性标记。因此，作为本发明的优选方式，在步骤(2)之后还包括步骤：去除原生质体融合的菌株中携带第一抗性标记的质粒和/或携带第二抗性标记的质粒。

由于本发明的方法采用标记质粒来赋予菌株抗性，其抗性标记并非整合于菌株的染色体上，因而在抗性选择条件下可稳定地选择到携带标记质粒的菌株，而在非抗性条件下，易于选择到丢失标记质粒的菌株。从菌株中去除标记质粒的步骤可以是：在非抗性选择的条件下，继续培养所述原生质体融合的菌株(如培养2-20代)，从而选择出脱去携带第一抗性标记的质粒和/或携带第二抗性标记的质粒的原生质体融合的菌株。

作为本发明的优选方式，在进行原生质体融合前，还可进行原生质体诱变。该步骤是一个可选择的步骤，进行原生质体融合本身即可获得遗传性状改变的菌株；然而，当在融合前进行诱变步骤后，可提高获得遗传性状改变的菌株的数量或遗传性状改变的幅度。本发明对于诱变方法或诱变剂的选择没有特殊的限制，采用的诱变方法比如可以是紫外照射法，采用的诱变剂比如可以是亚硝基胍(NTG)。

本发明的方法对于所用的亲本菌株的种类没有特别的限制，所述方法适用于多种多样的菌株。作为本发明的优选方式，所述的第一亲本菌株和第二亲本菌株可来自相同的属或种。

作为本发明的优选方式，所述的亲本菌株选自(但不限于)：链霉菌、细菌、糖多孢菌、刺糖多孢菌等。更佳地，所述的链霉菌是除虫链霉菌。

作为本发明的优选方式，所述的第一亲本菌株和/或第二亲本菌株是bkdF基因和olmA1基因中断的除虫链霉菌。

作为本发明的具体实施方式，提供了一种利用链霉菌作为亲本来制备发生原生质体融合的菌株的方法，所述方法的示意图见图10。亲本1含有携带Kn抗性的pPFMkn质粒，亲本2含有携带tsr抗性的pPFMtsr质粒，在进行原生质体融合后，染色体发生重组交换，并且融合菌株中同时含有携带Kn抗性的pPFMkn质粒和携带tsr抗性的pPFMtsr质粒，从而可在后续工作中通过tsr和kn双抗性选择来获得融合菌株。

改良多拉菌素生产菌的方法

多拉菌素是一种在阿维菌素基础上开发出的更高效低毒的农用抗生素。

基于所述筛选原生质体融合的菌株的方法，本发明还提供了一种改良多拉菌素生产菌的方法，所述方法包括步骤：

(a)将除虫链霉菌的bkdF基因中断，获得第一除虫链霉菌；

(b)将除虫链霉菌的olmA1基因中断，获得第二除虫链霉菌；

(c)将步骤(a)获得的第一除虫链霉菌和步骤(b)获得的第二除虫链霉菌进行原生质体融合，获得bkdF基因和olmA1基因中断的除虫链霉菌；由于代谢途径的改变，该除虫链霉素可产生多拉菌丝和阿维菌素；

(d)在前一步骤获得的一部分bkdF基因和olmA1基因中断的除虫链霉菌中导入携带第一抗性标记的质粒；在另一部分bkdF基因和olmA1基因中断的除虫链霉菌中导入携带第二抗性标记的质粒，所述的第一抗性标记和第二抗性标记是不同的；

(e)在适合原生质体融合的条件下，将(d)获得的分别含有携带第一抗性标记的质粒和携带第二抗性标记的质粒的除虫链霉菌进行原生质体融合，选择耐受第一抗性标记和第二抗性标记的菌株，即为原生质体融合的菌株；

(f)鉴定(e)获得的原生质体融合的菌株的多拉菌素产量，选择多拉菌素产量高的菌株。

作为本发明的优选方式，在进行原生质体融合前，进行原生质体诱变。

作为本发明的优选方式，步骤(f)中，选择多拉菌素(Dm)产量相对高而阿维菌素(Av)产量相对低的菌株即优选Av：Dm的比值低。

在本发明中，通过对亲本进行标记质粒，然后利用原生质体诱变融合，达到基因组改组的目的。利用该技术成功地提高了多拉菌素产生菌的优良性状，如抗生素产量、抗生素组分等。运用本发明的方法能迅速构建出新的工业生产菌株；能集中各个亲本的优势；能迅速改变工业菌的特性；能在较小的群体中迅速筛选到性状改良的菌株；对菌株无伤害；可进行连续地遗传操作；同时用于标记的质粒具有广泛的宿主范围与良好的相容性，应用范围广，具有较高的应用价值。

本发明的主要优点在于：

本发明首次建立了一种新的制备原生质体融合的菌株——利用标记质粒进行原生质体融合筛选。所述方法具有易标记，易脱去标记的优点，脱去抗性标记后，可方便地进行后续的遗传操作，如再次融合。利用本发明的方法，可方便地用于进行基于基因改组技术的菌株育种和改良，操作简单、成本低、设备要求低。

基于所述制备原生质体融合的菌株的方法，可进行一次或多次的原生质体融合选择，从而获得具有某一优良性状(例如高产多拉菌素)的菌株。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

I.材料和方法

1.菌株

除虫链霉菌高产株MMR78，购自浙江海正药业股份有限公司，或也可购自美国农业研究机构保藏中心(NRRL)。

2.培养基

(1)原生质体菌丝培养基

YEME培养基(每升)：

酵母膏           3g，

蛋白胨           5g，

麦芽膏           3g，

葡萄糖           10g，

蔗糖          250g；

对上述材料进行灭菌，灭菌后再加入：

MgCl₂.6H₂O(2.5M)    0.2ml，

甘氨酸(20％)        2.5ml。

(2)原生质体再生培养基

RM15培养基(每升)：

蔗糖               200g，

K₂SO₄             0.25g，

MgCl₂.6H₂O       10.12g，

糊精                10g，

酪蛋白氨基酸       0.1g，

微量元素溶液        2ml，

酵母膏               5g。

加入2％琼脂粉，高压灭菌。灭菌后，每86.4ml加入：

NaOH(1M)          0.7ml，

KH₂PO₄(0.5％)     1.0ml，

CaCl₂.2H₂O(5M)    0.4ml，

L-pro(20％)       1.5ml，

TES(0.25M，pH6.8) 10ml。

微量元素溶液(每升)：

ZnCl₂             40mg，

FeCl₃.6H₂O        200mg，

CuCl₂.2H₂O        10mg，

MnCl₂.4H₂O        10mg，

Na₂B₄O₇.10H₂O     10mg，

(NH₄)₆Mo₇O₂₄.4H₂O 10mg。

(3)阿维菌素发酵种子培养基

每升中(pH7.2)：

淀粉                 25g，

豆饼粉(热榨)         10g，

酵母粉(东立)         5g，

花生饼粉             10g，

CoCl₂(10％)          0.3ml/L。

(4)阿维菌素发酵培养基

每升中(pH7.2)：

淀粉                 90g，

黄豆饼粉(热榨)       20g，

酵母粉(东立)         12g，

α-淀粉酶            0.2g，

α-CoCl₂(10％)       0.4ml/L。

(5)多拉菌素发酵种子培养基

每升中(pH7.1-7.3)：

淀粉                20g，

黄豆饼粉(热榨)      10g，

葡萄糖              5g，

棉籽饼              10g。

(6)多拉菌素发酵培养基

每升中(pH7.0)：

淀粉                100g，

黄豆粉              10g，

棉籽饼粉            10g，

淀粉酶              0.2g，

NaCl                1g，

K2HPO4              2g，

MgSO4               1g，

CaCO3               7g。

(7)除虫链霉菌产孢培养基

MS培养基(每升)：

黄豆粉              20g，

D-甘露醇            20g，

琼脂粉              20g。

(8)除虫链霉菌生长培养基

YMS培养基(每升)：

麦芽膏             10g，

可溶性淀粉         4g，

酵母粉             4g，

pH7.2-7.4。

3.方法

将标记质粒导入链霉菌

采用接合转移的方法，首先将标记质粒通过电转导入大肠杆菌ET12567(参见美国专利US7217511)中，利用抗性平板选择导入了标记质粒的菌株。挑单菌落于3ml试管过夜培养。次日，以5-10％的量转接25ml LB培养基，培养至OD＝0.4-0.6。离心收菌，6000rpm，10分钟，弃上清。加入25-30ml LB培养基，将菌体打散，洗涤。以6000rpm离心，去上清，并重复一次。以6000rpm离心，去上清，将菌体打散在1ml的LB培养基中。

同时，进行链霉菌孢子预萌，将约10⁸-10⁹量的孢子加入到2×YT培养基中，50℃热激10分钟，完后自然冷却。

取200ml左右用LB打散的大肠杆菌菌液与2×YT孢子悬液混合，以7000rpm离心10分钟，打散在100ul体系中，涂布到MS培养基上。16-20小时后铺上层。其中，每1ml体系中含有：

25mg/ml的萘啶酮酸20-50ul，抗生素：Apra(50mg/ml)25ul；spc(50mg/ml)25ul；tsr(50mg/ml)12.5ul；Kn(50mg/ml)12.5ul。用双蒸水补至1ml。

3至5天后，接受质粒的链霉菌会长出。将转化子在含萘啶酮酸与抗生素的MS板上传一代，彻底杀死剩余的大肠杆菌。

原生质体的制备

接种菌株于50ml添加5mmol/L MgCl₂、0.6％Gly的YEME培养基的250ml摇瓶中。28℃培养30-36小时。离心收集菌丝体(5000r/min，10min)。弃去上清液，将菌丝体悬浮于15ml10.3％的蔗糖溶液中，离心(5000r/min，10min)。重复一次。将菌丝体重悬于10ml含2mg/ml溶菌酶的改良P缓冲液中，37℃处理120min。其间每5分钟轻摇一次。完后用装有脱脂棉的试管过滤，滤液转入离心管中。离心(3000r/min，10min)，温和地沉淀原生质体。弃去上清液，将原生质体悬浮于1ml改良P缓冲液中，待用。

其中，改良P缓冲液(每800ml)含：蔗糖200g，K₂SO₄0.25g，MgCl₂.6H₂O1·22g，微量元素溶液2ml，分装80ml/瓶；灭菌后，每瓶加入0.5％KH₂PO₄1ml，4.4％CaCl₂.2H₂O10ml，0.25mol/L TES(pH6.8)10ml。

原生质体诱变(可选择的步骤)

称取5mg左右的NTG加入到用1ml改良P缓冲液打散的原生质体中，轻轻弹击，上下颠倒，将NTG溶解。放置于30℃水浴处理30-45分钟，立即加入到50ml的改良P缓冲液中稀释，4000rpm离心10分钟，弃上清。加入50ml改良P缓冲液洗涤，反复洗涤3次。完后离心收集，并打散于100-200ul的改良P缓冲液中，混匀，并尽量减小体积。

原生质体融合

将打散于100-200ul中的原生质体溶液加入到用P缓冲液配制的PEG4000溶液中，使得PEG4000的终浓度为45％-50％，并在30℃水浴中放置5分钟。完后铺RM15平板，每板10-200ul。在16-20小时后铺软琼脂培养基上层。每板3ml。

抗生素的用量：Tsr(50mg/ml)10ul，Kn(50mg/ml)10ul。

在抗生素平板上生成的菌落为发生了原生质体融合的菌株。

阿维菌素与多拉菌素的发酵方法

将成熟斜面上的孢子用无菌接种铲接种于种子摇瓶中，种子摇瓶装量40ml/250ml三角瓶，于28℃220r/min培养24-48h。以5％接种量接入发酵培养基，发酵摇瓶装量50ml/250ml摇瓶，于28℃220r/min培养9-12d，最终pH6.6-7.5。Doramectin发酵在24h后每瓶加入225μl无菌的20％环己甲酸钠，阿维菌素的发酵不需要添加任何前体。

阿维菌素与多拉菌素的检测方法

阿维菌素产量的HPLC测定如下：

1.取1ml发酵液加入4ml无水乙醇。

2.28℃静置过夜或超声波破碎0.5-1h。

3.12000r/min离心10min，取上清液直接用于HPLC分析。

HPLC分析条件：

色谱柱：Agilent Zorbax Eclipse XDB-C84.6×12.5(5μm)

检测波长：246nm

流动相：甲醇:水＝85:15

流速：0.85ml/min

多拉菌素产量的HPLC测定如下：

1.取1ml发酵液加入4ml无水乙醇。

2.28℃静置过夜或超声波破碎0.5-1h。

3.12000r/min离心，取上清液直接用于HPLC分析。

HPLC分析条件：

色谱柱：Agilent Zorbax SB-C18460×250mm(5μm)+Agilent Zorbax

Extend-C184.6×150mm(5μm)

检测波长：246nm

流动相：甲醇:乙腈:水＝81:7:12

流速：0.85ml/min

标准品的配制方法：

阿维菌素B1a(由浙江海正药业提供)：1mg/ml，甲醇配制。

多拉菌素标准品(由浙江海正药业提供)：500μg/ml，甲醇配制。

效价与HPLC结果换算如下：本文后续给出的单位均为效价，效价单位为ug/ml，利用HPLC测定产物浓度时，其单位为mg/100ml，而在取样时又稀释了5倍(1ml菌液加入到4ml甲醇溶液中)，所以将HPLC的结果乘以50即得到最终的效价值。

原生质体融合率的测定

原生质体制备完成后，利用血球计数板计算每毫升中原生质体的数量，计作A。

分别用P Buffer与0.01％的SDS水溶液稀释后铺RM15再生板，使用SDS稀释后长出的为非原生质体单位，可计算出每毫升中的非原生质体单位数B。而用P Buffer稀释后长出的为原生质体再生与非原生质体单位的总和，可计算出每毫升的总数C。

融合后，稀释铺板，利用抗性筛选，得出每毫升中的融合子数目D。

融合率R1＝D/(C-B)。

NTG致死率的测定

原生质体制备完成后，利用血球计数板计算每毫升中原生质体的数量，计作A。

分别用P Buffer与0.01％的SDS水溶液稀释后铺RM15再生板，使用SDS稀释后长出的为非原生质体单位，可计算出每毫升中的非原生质体单位数B。而用P Buffer稀释后长出的为原生质体再生与非原生质体单位的总和，可计算出每毫升的总数C。

用NTG处理原生质体后，分别用P Buffer与0.01％的SDS水溶液稀释后铺RM15再生板使用SDS稀释后长出的为非原生质体单位，可计算出每毫升中的非原生质体单位数E。

而用P Buffer稀释后长出的为原生质体再生与非原生质体单位的总和，可计算出每毫升的总合数F。

致死率R2＝1-[(F-E)/(C-B)]。

原生质体化产生的抗性突变率

原生质体制备完成后，利用血球计数板计算每毫升中原生质体的数量，计作A。

分别用P Buffer与0.01％的SDS水溶液稀释后铺RM15再生板，使用SDS稀释后长出的为非原生质体单位，可计算出每毫升中的非原生质体单位数B。而用P Buffer稀释后长出的为原生质体再生与非原生质体单位的总和，可计算出每毫升的总数C。

再生时，铺上含有相应抗性的上层，待生长3-5天后计数G。

突变率R3＝G/(C-B)。

NTG诱变总突变率

原生质体制备完成后，利用血球计数板计算每毫升中原生质体的数量，计作A。

分别用P Buffer与0.01％的SDS水溶液稀释后铺RM15再生板，使用SDS稀释后长出的为非原生质体单位，可计算出每毫升中的非原生质体单位数B。而用P Buffer稀释后长出的为原生质体再生与非原生质体单位的总和，可计算出每毫升的总合数C。

原生质利用NTG诱变相应时间后，再生，铺上含有相应抗性的上层，待生长3-5天后计数H。

NTG诱变总突变率R＝H/C。

质粒稳定性测试

将含有抗性质粒的链霉菌菌株先在非抗性平板上传一代。再利用稀释分单孢的方法，在非抗性平板上分单菌落传一代，并得到单菌落。

将链霉菌单菌落划于抗性平板上生长，检测每100株中非抗性菌落(质粒丢失的菌落)的比例。

II.具体实施例

实施例1

利用融合构建多拉菌素产生菌

1.MMR78的bkdF基因中断株

利用常规的PCR打靶技术，对MMR78的bkdF基因进行中断，中断位置为MMR78染色体第5356308至5357522个碱基。

中断后，该区段被oriT+spc基因替代，序列如SEQ ID NO：1。

利用spc抗性选择获得经过改造的菌株，获得的菌株呈spc抗性。

2.MMR78的olmA1基因中断株

利用常规的PCR打靶技术，对MMR78的olmA1基因进行中断，中断位置为MMR78染色体第3607909至3626345个碱基。

中断后，该区段被oriT+apra基因替代，序列如SEQ ID NO：2。

利用apra抗性选择获得经过改造的菌株，菌株呈apra抗性。

除虫链霉菌(Avermitilis)的相关序列信息可参考网站http://avermitilis.ls.kitasato-u.ac.jp/。

3.融合方法

融合方法的示意图见图1。

将具有apra抗性且olmA1中断的链霉菌MMR78与具有spc抗性且bkdF中断的链霉菌MMR78进行融合，通过apra和spc抗性选择获得具有apra和spc双抗性且olmA1和bkdF中断的融合菌株。

4.融合后结果

融合分平行的两批进行，两次的获得的融合菌株分别是33株和10株，本发明人还测定这些融合菌株的阿维菌素和多拉菌素效价以及它们发酵生产的阿维菌素(Av)和多拉菌素(Dm)的比例，结果发现，在第一批融合后有6株融合菌株的效价较高，且Av/Dm数值较低(即Dm的产量相对比Av较高)；在第二批融合后有2株融合菌株的效价较高，且Av/Dm数值较低，可进一步用于后续选择更优的多拉菌素生产菌。

实施例2

标记质粒的原生质体融合诱变方法的建立

1.标记载体pPFMtsr的构建

以内切酶BclI酶切pIJ702质粒(购自中科院微生物研究所)，获得两端携带BclI酶切位点的tsr-melC基因，将之克隆入经过BglII(BclI的同尾酶)酶切的pSP72质粒内，获得pQC156质粒，该质粒含有t sr位点等。

以天蓝色链霉菌A3(2)(购自中科院微生物研究所)总染色体为模板，以正向引物GAATTCGCAGCGTGAAGTAGTACC(SEQ ID NO：7)和反向引物GAATTCGGCCTCCTACTAGCGACC(SEQ ID NO：8)进行PCR扩增，获得两端携带EcoRI酶切位点的SCP2-oriC基因，将之克隆入经过EcoRI酶切的pQC156质粒内，获得pZR156质粒，该质粒含有tsr位点、SCP2位点等。

以通用载体pIJ773(购自中科院微生物研究所)为模板，以正向引物AAATCTAGAGAGAATAGGAACTTCGGAATA(SEQ ID NO：3)，反向引物CCGTCTAGAAAGTATAGGAACTTCGAAGTTCCC(SEQ ID NO：4)扩增出apra-oriT基因，用XbaI酶切后，克隆入经同样酶切的载体pZR156的XbaI酶切位点中，获得标记载体pPFMtsr，该载体的图谱见图3。

2.标记载体pPFMkn的构建

以通用Cosmid载体Supercos1(购自Stratagene公司)为模板，以正向引物AAATCTAGACACGCTGCCGCAAGCACTCA(SEQ ID NO：5)，反向引物CCGTCTAGAGATTCCGAAGCCCAACC(SEQ ID NO：6)，扩增出卡那霉素抗性基因(Kn)，用XbaI酶切后连接入经同样酶切的载体pKC1139(购自中科院微生物研究所)中，获得标记载体pPFMkn，该载体的质粒图谱见图2。

实施例3

原生质体融合与诱变条件的选择

(1)PEG对于融合的影响

分别在链霉菌MMR78的染色体上带上Apra与Spc标记，获得染色体中同时带有Apra与Spc抗性标记的链霉菌MMR78；此外，将前述制备的标记质粒pPFMkn与pPMFtsr导入链霉菌MMR78中；测试不同标记情况下不同分子量的PEG(分子量见表1)对原生质体融合的影响，融合方法以及融合率的测定如前述。

不同分子量的PEG对原生质体融合的影响的测试结果见表1和图4。从结果可以看出，随着PEG分子量的增大，融合的效率提高。在PEG4000的条件下，染色体标记的融合率高于标记质粒的融合率，这可能是由于在原生质体制备的过程中，有小部分菌株的质粒发生了丢失。

表1

 

PEG分子量	1000(染色体标记)	2000(染色体标记)	4000(染色体标记)	4000(标记质粒)
					融合率	1.67％	6.88％	15.78％	13.96％

(2)NTG诱变时间对于致死率的影响

由于诱变时的致死率与突变率相关，进而本发明人又测试了NTG诱变时的致死率，测试菌为链霉菌MMR78，在其中分别导入pPFMtsr和pPFMtkn。诱变的方法以及NTG致死率的测定如前所述。诱变剂量为5mg/ml，原生质体量为5.0×10⁸-1.0×10⁹。

NTG诱变时间对于致死率的影响见表2和图5。通过诱变致死曲线的绘制，确定了诱变时间与致死率的关系。在放线菌的诱变育种中，致死率高容易产生高产的突变，但整体的正向突变率低；致死率低不容易得到高产突变，但是正向突变率比较高。因此，本发明人分别选择了75％的致死率与90％的致死率进行了融合诱变。同时，本发明人还测定了在NTG作用下产生Kn与tsr突变的概率，见表3，结果发现Kn与t sr的双突变率小于10^-8，因此，在进行诱变融合时挑到假阳性的概率很小。

表2

表3

实施例4

标记系统的测试

对实施例2构建的标记载体进行测试，即带有tsr标记的pPFMtsr与带有kn标记的pPFMkn。pPFMtsr所带的oriC来自于scp2，pPFMkn的oriC来自于pSG5，这两个oriC都具有较广的宿主范围，且pSG5属于滚环复制，两个oriC可以共存。

链霉菌中的质粒，在没有选择压力(如抗性)的条件下传代时很容易丢失，本发明人所选择的标记质粒pPFMtsr(标记1)与pPFMkn(标记2)在非抗性的条件下传代时，都有一定的比例会丢失。同时，在制备原生质体的过程中，这两个质粒又具有很好的稳定性，因此这两个标记适合作为原生质体融合时的标记质粒。该两种标记质粒的特性以及测试结果见表4。

表4

实施例5

第一次诱变融合

(1)第一次融合

从实施例1获得的融合菌株中选择8株为出发菌株，用于融合诱变，这些菌株的效价高，但Av:Dm比例既有高值又有低值。具体的，这些菌株的效价介于145-195之间，平均效价(M)是164；Av:Dm值介于0.38:1-6.33:1之间。以期得到效价提高，组分改善的菌株。

将上述出发菌株分为两组，通过接合转移的方法，一组菌株中转入pPFMtsr，另一组菌株中转入pPFMkn，将这些菌株进行原生质诱变融合，方法同前述。

然后，在涂布有Kn和tsr的平板上筛选具有Kn和tsr抗性的菌株，即为发生融合的菌株。

(2)第一次融合第一批发酵

将(1)选择出的一些发生融合的菌株进行发酵，统计获得的菌株的效价范围、处于该效价范围内的菌株数量，效价的测定结果见表5和图6。

表5

 

效价范围	0-20	21-40	41-60	61-80	81-100	101-120
							菌株数量		10	7	22	34	25
效价范围	121-140	141-160	161-180	181-200	>200
							菌株数量	7	2	0	0	1

由结果可见，获得一株效价高于200的菌株，经测定其效价为231，其产生的阿维菌素和多拉菌素的比例(Av:Dm)为3.39:1。

效价提高幅度如下计算：

效价提高幅度S＝((融合后最高效价H-对照菌株平均效价M)/对照菌株平均效价M)×100％

＝((231-164)/164)×100％

＝40.85％。

但是，尽管融合菌株的效价有明显提高，但没有获得效价高且多拉菌素产量高的菌株，这可能是由于高阿维比例的菌在融合中起到了优势作用。

(3)第一次融合第二批发酵

将(1)选择出的另一些发生融合的菌株进行发酵，统计获得的菌株的效价范围、处于该效价范围内的菌株数量，效价的测定结果见表6和图7。其中有8个菌株的效价大于200。但这些效价高的菌株的阿维菌素和多拉菌素的比例(Av:Dm)介于4.03-6.47之间，均是生产阿维菌素量高于多拉菌素的菌株。

在这些融合菌株中具有两个菌株的Av:Dm比例分别是0.30:1和0.11:1，属于多拉菌素生产占优势的菌株，然而其它们的效价分别是96和45，效价过低。

表6

 

效价范围	0-20	21-40	41-60	61-80	81-100	101-120
							菌株数量	3	5	4	4	2	4
效价范围	121-140	141-160	161-180	180-200	>200
							菌株数量	25	19	18	31	8

经计算该批菌株的效价提高幅度为26.37％。

因此，本批中尽管获得一些效价高的菌株但多拉菌素生产占优势的菌株没有，尽管获得两株菌株的Av:Dm比例较低(生产多拉菌素的量比阿维菌素多)，但它们的效价不是很高。

实施例6

单纯NTG诱变

以实施例1获得的融合菌株为出发菌株(这些出发菌的平均效价是147)，用单纯的NTG诱导突变，方法如下：先按制备原生质体的方法制备突变菌株的原生质体。完成后，用NTG对原生质体诱变，诱变的方法以及NTG的用量与原生质体诱变融合的过程中所提及的方法相同。原生质体诱变后，在RM15培养基上再生，随机挑选菌株进行发酵筛选。然后对选择出的变异菌株进行发酵，统计获得的菌株的效价范围、处于该效价范围内的菌株数量，效价的测定结果见表7。

NTG诱变后发生诱变的菌株的效价分布见图8。

表7

 

效价范围	0-20	21-40	41-60	61-80	81-100	101-120
							菌株数量	4	3	2	4	52	35
效价范围	121-140	141-160	161-180	180-200	>200
							菌株数量	1	0	0	0	0

结果，在诱变后没有效价高于140的菌株，因此单纯使用NTG获得的菌株的效价提高值是负值。

实施例7

第二次诱变融合

(1)第二次融合

从实施例1获得的融合菌株中选择6株菌株为出发菌株，用于融合诱变，该6株菌株的效价较高，且Av:Dm比例较低。具体的，这些菌株的效价介于129-165之间；Av:Dm比例介于0.3:1-0.70:1之间。

将上述出发菌株分为两组，通过接合转移的方法，一组菌株中转入pPFMtsr，另一组菌株中转入pPFMkn，将这些菌株进行原生质诱变融合，方法同前述。

然后，在涂布有Kn和tsr的平板上筛选具有Kn和tsr抗性的菌株，即为发生融合的菌株。

(2)第二次融合发酵

将前述选择出的发生融合的菌株进行发酵，统计获得的菌株的效价范围、处于该效价范围内的菌株数量，效价的测定结果见表8和图9。

结果显示，获得一株效价高于200的菌株(效价为220)和一株效价介于181-200的菌株(效价为181)。测定该两个菌株的Av:Dm比例，分别是0.55:1和0.30:1。经计算，该两株菌的效价提高幅度分别为49.66％％与22.45。

表8

 

效价范围	0-20	21-40	41-60	61-80	81-100	101-120
							菌株数量	15	16	39	40	59	23
效价范围	121-140	141-160	161-180	181-200	>200
							菌株数量	9	0	0	1	1

上述结果可见，获得两株具有较高效价的菌株，并且组分Av:Dm比例值较低，可见相对来说该两个菌株的多拉菌素产量较高。本发明的质粒标记的融合方法可用于其它各种菌株的融合和育种，并非限于链霉菌。

可采用如上方法，或者以选择出的效价高且Av:Dm比例值低的菌株为出发菌株，进行进一步的选择，从而找到效价更高且多拉菌素产量更高的理想菌株。

综上，从前述第一次以及第二次诱变融合结果中可以看出：

1.融合后的菌株的生理代谢情况可发生明显变化，所得到的菌株的效价范围从0到230均有。

2.可选择到效价提高的多拉菌素产生菌，第一次第一批中效价最高的菌上升了40.85％，第一次第二批中效价最高的菌上升了26.37％；在第二次融合所得到的结果中，最高的两株菌分别上升了22.45％与49.66％。各批次中，最高效价均上升到了220-230左右。

在第一次诱变融合中，本发明人将高组分与低组分的同时融合，以期望得到效价提高，组分改善的菌株。但遗憾的是，融合菌株的效价虽有明显提高，但组分并未得到改善，这可能是由于高阿维比例的菌在融合中起到了优势作用(实施例5)。

而在第二次诱变融合中，本发明人选择了组分较好的菌进行融合，终于得到了两株组分改善，产量提高的多拉菌素产生菌。它们的效价与组分已经达到了效价181、组分0.3:1与效价220、组分0.55:1(实施例7)，较为理想。

同时，本发明人也看到由于链霉菌具有细胞壁，在制备原生质体的过程中，可能会存在非原生质体化单位。这些残存的菌体会率先在再生培养基中长成菌落，并抑制周围原生质体的再生，导致融合的失败。而在实际操作中，通过诱变融合，每100个融合子中就有可能有性状优良的融合子，相对于诱变后大量筛选而言，也节省了工作量。

因此，本发明人通过这项工作，建立了一种新的融合方法，并应用于育种中，提高了产量，保持了良好的组分。实践证明，标记质粒的原生质体融合技术在工业育种中有着良好的前景。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>中国科学院上海生命科学研究院

<120>利用基因组改组技术改良多拉菌素生产菌的方法

<130>073422

<160>8

<170>PatentIn version3.3

<210>1

<211>1412

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>oriT基因和spc基因融合基因

<400>1

<210>2

<211>1370

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>oriT基因和apra基因的融合基因

<400>2

<210>3

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>3

<210>4

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>人工序列

<400>4

<210>5

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>5

<210>6

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>6

<210>7

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>7

<210>8

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>8

Claims (4)

1.一种菌株改良的方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)在适合原生质体融合的条件下，将第一亲本菌株与第二亲本菌株进行混合，形成第一亲本菌株与第二亲本菌株的混合物，

其中，第一亲本菌株含有携带第一抗性标记的质粒，第二亲本菌株含有携带第二抗性标记的质粒，并且所述的第一抗性标记和第二抗性标记是不同的；且所述的第一亲本菌株和第二亲本菌株是bkdF基因和olmA1基因中断的除虫链霉菌；和

(2)从所述混合物中选出耐受第一抗性标记和第二抗性标记的菌株，从而获得原生质体融合的菌株；

(2’)去除原生质体融合的菌株中携带第一抗性标记的质粒和/或携带第二抗性标记的质粒；

(3)从所获得的原生质体融合的菌株中，进一步选出性能改良的菌株；

(4)以选出的性能改良的菌株作为第一亲本菌株和/或第二亲本菌株，重复步骤(1)-(3)1-1000次。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(1)之前，还包括步骤：

将携带第一抗性标记的质粒导入一亲本菌株中，获得第一亲本菌株；和/或

将携带第二抗性标记的质粒导入一亲本菌株中，获得第二亲本菌株。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，第一抗性标记或第二抗性标记选自：氨苄青霉素抗性标记，阿伯拉霉素抗性标记，壮观霉素抗性标记，硫链丝菌素抗性标记，卡那霉素抗性标记，四环素抗性标记，氯霉素抗性基因。

4.一种改良多拉菌素生产菌的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：

(a)将除虫链霉菌的bkdF基因中断，获得第一除虫链霉菌；

(b)将除虫链霉菌的olmA1基因中断，获得第二除虫链霉菌；

(c)将步骤(a)获得的第一除虫链霉菌和步骤(b)获得的第二除虫链霉菌进行原生质体融合，获得bkdF基因和olmA1基因中断的除虫链霉菌；

(d)在前一步骤获得的一部分bkdF基因和olmA1基因中断的除虫链霉菌中导入携带第一抗性标记的质粒；在另一部分bkdF基因和olmA1基因中断的除虫链霉菌中导入携带第二抗性标记的质粒，所述的第一抗性标记和第二抗性标记是不同的；

(e)在适合原生质体融合的条件下，将(d)获得的分别含有携带第一抗性标记的质粒和携带第二抗性标记的质粒的除虫链霉菌进行原生质体融合，选择耐受第一抗性标记和第二抗性标记的菌株，即为原生质体融合的菌株；和

(f)鉴定(e)获得的原生质体融合的菌株的多拉菌素产量，选择多拉菌素产量高的菌株。

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