CN102181470B - 提高链霉菌抗生素产量的方法及其质粒 - Google Patents

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Abstract

一种生物医药技术领域的提高链霉菌抗生素产量的方法，通过构建metK基因和/或vgbS基因和/或adpA-c基因的对应整合表达质粒pFMetK、pFVgb、pFAdpA、pFMV、pFMA以及pFMVA，并将所述的整合表达质粒转入链霉菌ZYJ-6中，实现产量的提高。本发明在抗生素生产菌株里同时引入包括调节基因、前体合成基因等外源基因以增加抗生素的产量。

Description

提高链霉菌抗生素产量的方法及其质粒
技术领域
本发明涉及的是一种生物医药技术领域的方法及其质粒，具体是一种提高链霉菌抗生素产量的方法及其质粒。
背景技术
随着细胞生物学以及生物工程技术在微生物尤其是抗生素育种领域的应用，基因工程育种技术已成为主要的菌种改良手段，并且在改良工业生产菌种方面已获得巨大的成功。生物工程育种技术在一定范围内克服了传统育种技术的随机性和盲目性，可以借助对微生物次级代谢生物合成途径的认识，利用基因工程技术构建抗生素高产菌株，有助于次级代谢产物的工业生产。在微生物菌种选育领域中，通过基因工程技术将目的基因与载体在体外连接然后转入受体细胞，使外源基因在受体中稳定表达遗传。主要途径包括有：①通过调节基因的加倍或失活、提高抗生素的主动外排效率等来提高抗生素的产量；②在宿主细胞中引入增加前体物和辅因子的供给的外源基因，提高活性物质的生物合成量；③通过激活或抑制支路代谢以改变生物活性分子的活性成分或比例，提高最佳活性组分的积累、降低或消除低活性次级组分的积累。
AdpA是广泛存在于链霉菌中的一个全局性正调节因子，是A-因子调控网络的中心转录调控因子，可激活形态分化和次级代谢产物所需基因的表达。在天蓝色链霉菌、变铅青链霉菌、抗生链霉菌和阿维链霉菌中，AdpA正调节黑色素的生物合成。目前还没有文献报道adpA基因在抗生素产生菌株里的表达对其抗生素产量的影响。
透明颤菌(Vitreoscilla)是一种专性好氧的丝状革兰氏阴性细菌，vgb基因编码的透明颤菌的血红蛋白具有结合氧的特性可以促进微生物细胞内氧的传输，提高氧的利用率。对许多在溶氧不足的情况下，Vgb表达会促进宿主的生长，蛋白的分泌，代谢物的产生以及增强抗压性。
将透明颤菌血红蛋白基因整合到异源宿主菌中可以增加重组蛋白产量和发酵物产量。经过对现有技术的检索发现，在抗生素生产中，vgb基因可明显促进肉桂地链霉菌的菌体生长和抗生素莫能菌素合成(文莹，宋渊.透明颤菌血红蛋白在肉桂地链霉菌中的表达对其细胞生长及抗生素合成的影响.生物工程学报，2001，17(1)：24-28)。Saccharopolyspora erythraea中vgb基因的表达使红霉素的产量提高60％(Brunker，P.Genetic engineering of an industrialstrain of Saccharopolyspora erythraea for stable expression of the Vitreoscill hemoglobingene(vhb).Microbiology 1998，144(9)：2441-2448)。
S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine，简称SAM)，由三磷酸腺苷和L-甲硫氨酸经SAM合成酶催化反应合成。作为生物合成过程中的重要中间代谢物质，SAM合成酶基因metK在很多链霉菌中的高效表达都能够有效提高其代谢物的产生。在天蓝色链霉菌里，SAM合成酶基因metK的高效表达能够大大提高放线紫红素的产量(Okamoto S，Lezhava A.Enhancedexpression of S-Adenosylmethionine synthetase causes overproduction of actinorhodin inStreptomyces coelicolor A3(2).J Bacteriol，2003，185(2)：601-609)；在Saccharopolysporaerythraea中异源表达S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因可以提高红霉素A的产量(Wang Y，WangYG.Improved production of erythromycin A by expression of a heterologous gene encodingS-adenosylmethionine synthetase.Appl Microbiol Biotechnol，2007，75(4)：837-842)；Streptomyces actuosus中SAM合成酶基因metK的高效表达促进了那西肽的合成(Zhang XC，Fen MQ.Overexpression of yeast S-adenosylmethionine synthetase metK in Streptomycesactuosus leads to increased production of nosiheptide.Appl Microbiol Biotechnol，2008，78(6)：991-995)。
但是上述现有技术仅是单一基因在某些微生物菌株中的表达，其对代谢产物的影响作用还是有限的，对于整个代谢工程仍是非常不充分的。微生物菌株自身复杂的代谢途径以及细胞循环中复杂的调节方式及其特异性，决定了对其代谢流中的某个反应进行定向改变依然是不够的，对微生物代谢途径的生化改造可以多步进行，最大限度的增加代谢产物的积累。近年来，由于DNA重组技术的发展，使得用基因技术改造代谢途径成为可能。本发明根据上述技术的不足，设计了一个全新的提高链霉菌抗生素产量的方法及质粒，将多个与抗生素合成相关的具有广泛正调控作用的基因构建在一个载体上同时表达，构建的质粒可以在不同链霉菌菌株中进行表达，有效提高各种抗生素的产量。
发明内容
本发明针对现有技术存在的上述不足，提供一种提高链霉菌抗生素产量的方法及其质粒，在抗生素生产菌株里同时引入包括调节基因、前体合成基因等外源基因以增加抗生素的产量。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明涉及一种提高链霉菌抗生素产量的方法，通过构建metK基因和/或vgbS基因和/或adpA-c基因的对应整合表达质粒pFMetK、pFVgb、pFAdpA、pFMV、pFMA以及pFMVA，并将所述的整合表达质粒转入链霉菌ZYJ-6中，实现产量的提高。
所述的metK基因，是指S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因，如Seq ID No.1所示；
所述的vgbS基因，是指透明颤菌血红蛋白合成基因，如Seq ID No.2所示；
所述的adpA-c基因，是指链霉菌中的全局性正调节基因，如Seq ID No.3所示；
所述的构建包括以下六种方式中的任意一种：
1)含有天蓝色链霉菌metK基因质粒的构建：PCR扩增天蓝色链霉菌M145中不带原始启动子的metK基因，具体步骤包括：在天蓝色链霉菌的metK基因内部设计引物metKF2/metKR，在ATG密码子处加入了一个NdeI酶切位点；将扩增到的不带原始启动子的1334bp的metK基因插入pBlueScriptII SK(+)的EcoRV位点构建4292bp的克隆pJTU2524；用NdeI和EcoRI将无启动子的metK基因片段从pJTU2524上切下插入到含有红霉素抗性基因强启动子PermE＊的pIB139载体中，得到质粒pFMetK。
所述的引物metKF2/metKR的序列为：
metKF2(5’-CAGGGAGCCATATGTCCCGT-3’)；
metKR (5’-TCGCAAAGGCCACTGACAACA-3’)。
2)含有透明颤菌血红蛋白合成基因vgbS质粒的构建：质粒pJTU4405含有全基因合成vgbS，长度456bp，在基因vgbS两端分别引入了NdeI和EcoRI酶切位点。用NdeI和EcoRI双酶切带有透明颤菌vgbS基因的质粒pJTU4405。将vgbS基因(441bp)插入含有红霉素抗性基因强启动子PermE＊的链霉菌整合型载体pIB139的对应位点，得到质粒pFVgb。
3)含有天蓝色链霉菌adpA-c基因质粒的构建：PCR扩增天蓝色链霉菌中的adpA-c基因，具体步骤包括：设计引物adpAc2F/adpAc1R，在ATG密码子处加入了一个NdeI酶切位点；将1556bp的adpA-c扩增片段插入到pBlueScriptII SK(+)的EcoRV位点，得到质粒pJTU2520；再用NdeI和EcoRI将adpA-c从pJTU2520上切下插入到带有红霉素启动子的质粒pIB139的相应位点，得到质粒pFAdpA。
所述的引物adpAc2F/adpAc1R的序列为：
adpAc2F(5’-GGCTTAGCCATATGAGCCAC-3’)；
adpAc1R (5’-CGTTCATGCGGGCCACTTTA-3’)。
4)含有metK和vgbS两个基因的质粒pFMV的构建：用NdeI和EcoRI将vgbS从pJTU4405上切下插入pJTU968的相应酶切位点，再用MunI和EcoRI将带有红霉素强启动子的vgbS基因片段插入到pFMetK质粒的EcoRI位点，得到质粒pFMV。
5)含有metK和adpA-c两个基因的质粒pFMA的构建：用NdeI和EcoRI将adpA-c从pJTU2520上切下插入到带有红霉素启动子的质粒pJTU968的相应位点，再用MunI和EcoRI将带有红霉素强启动子的adpA-c基因片段插入到pFMetK质粒的EcoRI位点，构建质粒pFMA。
6)含有metK、vgbS和adpA-c的质粒pFMVA的构建：用MunI和EcoRI将带有红霉素启动子的adpA-c从pJTU2522上切下插入到pFMV的EcoRI位点，得到质粒pFMVA。
步骤1)所述的载体pIB139是含有红霉素抗性基因强启动子PermE＊的链霉菌整合型载体，记载于Wilkinson CJ，Hughes-Thomas ZA，Martin CJ，Bohm I，Mironenko T，Deacon M，Wheatcroft M，Wirtz G，Staunton J，Leadlay PF.Increasing the efficiency of heterologouspromoters in actinomycetes.J Mol Microb Biotech，2002，4(4)：417-426。本实施例涉及的载体pIB139由朱冬青博士赠送。
步骤2)中所述的质粒pJTU4405由朱冬青博士赠送，通过以下方式制备得到：将vgb基因在链霉菌中使用频率不高的密码子改为在链霉菌中使用频率最高的密码子，保持氨基酸序列不变，产生新的基因vgbS。在基因vgbS两端分别引入NdeI和EcoRI的酶切位点，其中在vgbS核苷酸序列的5’端添加7个核苷酸，形成限制性内切酶NdeI位点和保护碱基，在vgbS核苷酸序列的3’端添加8个核苷酸，形成限制性内切酶EcoRI位点和保护碱基。将vgbS全基因合成，全长456bp。合成的456bp的vgbS的DNA被插在载体pGH的SmaI位点，产生质粒pJTU4405，测序证明合成无误。其中基因全合成、插入载体、测序验证由上海美季生物技术有限公司完成。
所述的转入是指：将构建的质粒转入大肠杆菌ET12567/pUZ8002中，经水浴热激后置于培养基平板上进行培养，具体步骤包括：将构建的质粒转入大肠杆菌ET12567/pUZ8002中并挑转化子在液体LB培养基中培养携带有转移质粒的大肠杆菌ET12567/pUZ8002，该液体LB培养基内存在有终浓度为25μg/μL的氯霉素，50μg/μL的卡那霉素和30μg/μL的阿泊拉霉素。37℃培养8小时后收集菌体，用新鲜LB培养基洗涤菌体3次备用。将链霉菌孢子悬浮于5ml TES缓冲液中，该缓冲液浓度为0.05mol/L，pH值为8.0。然后在55℃水浴中热激10min，冷却至室温后，按108∶108与大肠杆菌细胞等量混合后涂在SFM培养基平板上，该培养基平板组分为：2％琼脂糖(m/v)，2％甘露醇(m/v)，2％黄豆饼粉(m/v)，培养平板pH值为7.2～7.5，吹干后放在30℃培养箱中进行培养。12小时后用含萘啶酮酸和阿泊拉霉素的1ml无菌水覆盖平板，平板上萘啶酮酸的终浓度为50ng/mL，阿泊拉霉素为30ng/mL，置30℃培养3天后即可看到转移接合子。
所述的大肠杆菌ET12567/pUZ8002公开于Paget，M.S.，Chamberlin，L.，Atrih，A.，Foster，S.J.，and Buttner，M.J..Evidence that the extracytoplasmic function sigma factor σEis required for normal cell wall structure in Streptomyces coelicolor A3(2).J.Bacteriol，1999，181：204-211。
所述的链霉菌ZYJ-6是指：产生杀念菌素D单组分的突变株，通过以下方式制备得到：
(一)确定功能域KR21(存在于聚酮合酶FscF)和DH18(存在于聚酮合酶FscE)的催化活性位点。
(二)设计并构建分别用于对KR21和DH18的催化活性位点进行突变的同源重组载体pJTU573和pJTU572。
(三)把pJTU573通过接合转移转入链霉菌FR-008进行同源重组。
(四)首先通过硫链丝菌素抗性影印筛选，进而通过PCR以及对PCR产物酶切验证和测序验证的方法最终筛选到KR21突变株。
(五)同样方法，把pJTU572转入KR21突变株进行同源重组，最终筛选到KR21和DH18双突变株ZYJ-6。
本发明涉及的定向生产杀念菌素单一组份FR-008-III，其产量是野生型菌株该组份产量的120-130％，而FR-008-III是杀念菌素3个主要组分中最具药用价值的成份。通过该工程菌可以大规模生产高纯度的杀念菌素有效组份，所以具有显著的工业应用价值。
本发明涉及的定向积累杀念菌素单一组份FR-008-III的基因工程菌株，其中的双突变株ZYJ-6公开于Zhou YJ，Li JL，Zhu J，Chen S，Bai LQ，Zhou XF，Wu HM，Deng ZX.Incompleteβ-Ketone Processing  as  a  Mechanism  for  Polyene  Structural  Variation  in theFR-008/Candicidin Complex.Chemistry&Biology，2008，15：629-638。
所述的双突变株ZYJ-6(链霉菌Streptomyces sp.)已于2008年3月7日提交位于北京市朝阳区大屯路，邮编：100101(中国微生物研究所)的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，其保藏登记编号为CGMCC NO.2394。
本发明提供了一种提高链霉菌抗生素产量的方法和质粒，通过对抗生素的生物合成有广泛促进作用的3个基因采取在一个载体上同时进行表达的方式，利用接合转移转入链霉菌中进行高效表达以提高抗生素的产量。
附图说明
图1为表达质粒的构建图。
图2为菌株ZYJ-6/pFMetK，ZYJ-6/pFMV，ZYJ-6/pFMA，ZYJ-6/pFMVA中metK基因的PCR验证。
图3为菌株ZYJ-6/pFVgb，ZYJ-6/pFMV，ZYJ-6/pFMVA菌株中vgbS基因的PCR验证。
图4为菌株ZYJ-6/pFAdpA，ZYJ-6/pFMA，ZYJ-6/pFMVA中adpA-c基因的PCR验证。
图5为分光光度法分析菌株ZYJ-6和ZYJ-6/pFMetK，ZYJ-6/pFVgb，ZYJ-6/pFAdpA，ZYJ-6/pFMV，ZYJ-6/pFMA，ZYJ-6/pFMVA中杀念菌素FR-008-III在不同培养时间的产量变化。
图6为定量分析出发菌株ZYJ-6和高产菌株ZYJ-6/pFMVA中杀念菌素FR-008-III的产量变化。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1制备产生杀念菌素D单组分的突变株
(一)质粒的构建(用于转入宿主并和染色体发生同源重组以便获得目标突变)
(1)用于KR21功能域突变的质粒构建：
EcoRI和KpnI酶解链霉菌FR-008文库柯斯质粒pHZ220后回收3615-bp EcoRI-KpnIDNA片段作为PCR模板，引物P1和P3用来扩增528-bp DNA片段；P4和P2用来扩增618-bpDNA片段。P3和P4有18-bp的重叠，在该重叠区域引入突变位点(Y1526F)，同时引入DNA限制性酶切位点(ApoI)以便该突变的筛选(如图1所示)。通过第二次PCR(引物为P1和P2；模板为琼脂糖胶回收后的两个PCR产物各取1/100加入PCR体系)得到1146-bp DNA片段。1146-bp DNA片段被克隆在T-vector(得到质粒pJTU566)上并经过测序确认正确后又被酶解成849-bp SacI-SfiI DNA片段。849-bp SacI-SfiI DNA片段被用来替换3615-bp EcoRI-KpnIDNA片段(由EcoRI-KpnI酶解pHZ220后回收得到，并克隆在pIJ2925载体上而得到质粒pJTU569)内部对应的区域从而得到质粒pJTU571。重组后的3615-bp EcoRI-KpnI DNA片段包含了目标突变位点和分布于突变位点两边的用于和染色体发生同源交换的两个臂(分别为：1948-bp和1667-bp)。该3615-bp DNA重组片段最终被克隆在pHZ1358(大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒)BamHI位点，从而得到用于和染色体发生同源重组的质粒pJTU573。
PCR反应：
引物：
P1，5′-CCGCCTCACCCAACTGCC-3′
P3，5′-GCGACGAAATTTGCCTGGCCG-3′
P4，5′-CCA GGCAAATTTCGTCGCCGC-3′
P2，5′-GGGGAG CCGCTGTCGTAGA-3′(下划线表示引入的限制性酶切位点ApoI)
PCR反应体系：0.1μg模板DNA，引物各50pmol，4μLDMSO，2μLMg2+，
5μL dNTP，5μL缓冲液和1个单位KOD DNA聚合酶(TOYOTA)，加纯水到50μL。PCR反应的循环条件为：95℃(5分钟)；32个循环的95℃(30秒)，60℃(30秒)和68℃(36秒)；最后是68℃5分钟。(注：引物为P1和P2的第二轮PCR延伸时间为66秒)。
PCR产物末端加A(以便于克隆在T-Vector)碱基的条件为：50μgPCR产物，5μL dATP，2个单位Tag DNA聚合酶，5μL缓冲液，2μL Mg2+，加纯水至50μL.72℃20分钟。
(2)用于DH18功能域突变的质粒构建：
用于DH18功能域活性位点相应编码碱基突变的两个同源交换臂分别由PCR扩增获得。PCR模板为链霉菌FR-008文库柯斯质粒pHZ220的DNA。扩增1475-bp DNA片段所用引物为：DH18P1和DH18P2；扩增1203-bp DNA片段所用引物为：DH18P3和DH18P4。突变位点分别通过引物DH18P2和DH18P3引入，同时又引入限制性酶切位点BsrGI以便于突变筛选(如图1所示)。1475-bp PCR产物插入pBluescript II SK(+)EcoRV位点后得到质粒pJTU568，并进行了测序验证。1203-bp PCR产物克隆在T-Vector上而得到质粒pJTU565，并进行了测序验证。从pJTU565酶解得到的1.2kb BsrGI-KpnI DNA片段被插入到pJTU568相应位点后得到质粒pJTU570，从而使得两个同源交换臂在BsrGI位点拼接.该2.6kb重组片段又被BamHI从pJTU570上切出，进而又插入到pHZ1358载体BamHI位点而得到同源重组质粒pJTU572。
PCR引物：
DH18P1，5′-GACACGGAGTCCCCCGAGCCCCAGG-3′
DH18P2，5′-CCG ACGGTGTACACGGCGAGCCAGG-3′
DH18P3，5′-CCTGGCTCGCCGTGTACACCGTCGG-3′
DH18P4，5′-CGCCCGAGAGCGGACCGAGGAGTTG-3′(下划线表示引入的限制性酶切位点BsrGI)
PCR条件：
1475-bp PCR产物(引物为：DH18P1和DH18P2)由KOD DNA聚合酶(TOYOTA)扩增。PCR反应体系同上。PCR反应的循环条件为：95℃(5分钟)；32个循环的95℃(30秒)，57℃(30秒)和68℃(90秒)；最后是68℃5分钟。
1203-bp PCR产物(引物为：DH18P3和DH18P4)由Tag DNA聚合酶扩增。PCR条件：PCR反应体系：0.1μg模板DNA，引物各40pmol，3μL DMSO，2μL Mg2+，3μL dNTP，4μL缓冲液和1个单位Tag DNA聚合酶，加纯水到40μL。PCR反应的循环条件为：95℃(5分钟)；32个循环的95℃(30秒)，60℃(30秒)和72℃(20秒)；最后是72℃5分钟。
(二)把用于和染色体发生同源重组的质粒转入野生型宿主：
通过电转把pHZ1358衍生质粒(pJTU572或pJTU573)分别转入大肠杆菌ET12567(携带接合转移辅助质粒pUZ8002)中，以便于pJTU572或pJTU573在辅助质粒pUZ8002的协助，通过接合转移进入受体链霉菌FR-008细胞中。先在合适的抗生素存在下培养携带pUZ8002和待转移质粒的大肠杆菌，12小时后收集菌体，用新鲜LB培养基洗涤菌体3次备用。作为受体的链霉菌孢子需经热激和预萌发处理。将链霉菌孢子悬浮于TES缓冲液(5ml0.05mol/L，pH8.0)中，在50℃水浴中热激5min，冷却至室温后加入等体积2×孢子预萌发培养基(Difco酵母粉1％，Difco酪蛋白氨基酸1％，CaCl20.01mol/L)，37℃摇床(250rpm)培养2h，离心收集孢子并重新均匀悬浮于适量的LB培养基中，按108∶108与大肠杆菌细胞等量混合后涂在培养平板(2％琼脂糖，2％甘露醇，2％黄豆饼粉，pH7.2～7.5)上，进行细菌双亲接合转移。11小时后用含萘啶酮酸(抑制大肠杆菌的生长)和硫链丝菌素(转入质粒带有此抗性)的1ml无菌水覆盖平板(终浓度：萘啶酮酸50ng/mL；硫链丝菌素25ng/mL)，置30℃培养3天后即可看到转移接合子。
(三)突变株的筛选和验证：
从覆盖板上挑选单个接合转移子接种到抗性(硫链丝菌素)平板上进一步确认抗性，再转接到不加抗生素(硫链丝菌素)的平板上进行松弛培养，进而通过抗性平板和非抗平板影印实验筛选到若干硫链丝菌素敏感的菌株(突变株的备选株)。以备选株总DNA作为PCR模板；引物P1和P4用于KR21突变的筛选，1146-bp源自于突变株KR21突变的PCR产物可以被ApoI酶解为528-bp和618-bp DNA片段，而源自于野生型的同样大小PCR产物不能被ApoI酶解；引物DH-test-L和DH-test-R用于DH18突变的筛选，706-bp源自于DH18突变的PCR产物可以被BsrGI酶解为244-bp和462-bp DNA片段，而源自于野生型的PCR产物不能被BsrGI酶解。源自于KR21突变和DH18突变的PCR产物被分别克隆在T-Vector上进行测序验证，从而最终确证了目标突变的正确性。
KR21突变株PCR筛选条件：
引物：P1和P4。
PCR反应体系：0.05μg模板DNA，引物各20pmol，1μL DMSO，1μL Mg2+，
2μL dNTP，2μL缓冲液和0.5个单位Tag DNA聚合酶，加纯水到20μL。PCR反应的循环条件为：95℃(5分钟)；32个循环的95℃(30秒)，60℃(30秒)和72℃(22秒)；最后是72℃5分钟。
DH18突变株PCR筛选条件：
引物：DH-test-L，5′-GCTCTACCGTCCGCTTCGCC-3′
DH-test-R，5′-CTGTGTCCAGGTGGCGTCCG-3′
PCR反应条件：复性64℃，延伸15秒.其余同KR21突变株筛选.
(四)双突变株(ZYJ-6)的获得
先把同源重组质粒pJTU573通过接合转移转入链霉菌FR-008细胞中发生同源重组，筛选并得到KR21突变株。再把质粒pJTU572转入KR21突变株细胞内通过同源重组对DH18进行突变，最终筛选得到KR21和DH18双突变菌株ZYJ-6。
(五)突变菌株的发酵培养
平板发酵【2％琼脂糖，2％甘露醇，2％黄豆饼粉(煮沸熬制后过滤去渣)，pH7.2～7.5】，孢子接种，30℃，6天。
(六)抗生素的分离纯化：
刮取平板孢子，称量后用10倍体积甲醇超声萃取3次。合并萃取液40℃旋转蒸干后重溶于少量体积甲醇，0.25uM滤膜过滤后-20℃避光保存以备检测。
(七)LC-MS对发酵产物检测：
高压液相色谱-质谱联用(LC-MS)检测结果表明突变株ZYJ-6仅生产FR-008-III(Candicidin D)，而不再积累原始组份：FR-008-V和FR-008-VI。HPLC检测结果如图2所示。
LC-MS是在安捷伦公司的Agilent 1100series LC/MSD Trap system上进行。高压液相工作条件为：柱子(agilent Eclipse XDB-C18，4.6×250mm)；流速0.6ml/min；流动相：45％乙晴和55％5.5mM NH4AC(pH 4.5)；检测波长：380nm；柱温：25℃。
质谱工作条件：负离子模式；干燥气流：10l/min；喷雾器压力：50psi；干燥气温：350℃；轰击电压：1.0-1.8V。
实施例2
先把同源重组质粒pJTU572通过接合转移转入链霉菌FR-008细胞中发生同源重组，筛选并得到DH18突变株。再把质粒pJTU573转入DH18突变株细胞内通过同源重组对KR21进行突变，最终筛选得到KR21和DH18双突变菌株ZYJ-6。
实施例3链霉菌抗生素产量的提高
步骤一，表达质粒的构建。
本实施例涉及的基因表达载体pIB139是一个含有红霉素抗性基因强启动子PermE＊的链霉菌整合型载体，可以通过大肠杆菌和链霉菌之间的两亲本接合转移进入链霉菌，发生位点特异性重组后整合在链霉菌的染色体上，随着染色体一起复制和遗传。图1为本实施例中涉及的所有表达质粒构建图。
步骤二，把质粒转入链霉菌宿主以及接合转移子的筛选和验证
将构建的质粒转入大肠杆菌ET12567/pUZ8002中，挑转化子在液体LB培养基中培养携带有转移质粒的大肠杆菌ET12567/pUZ8002，该液体LB培养基内存在有终浓度为25μg/μL的氯霉素，50μg/μL的卡那霉素和30μg/μL的阿泊拉霉素。37℃培养8小时后收集菌体，用新鲜LB培养基洗涤菌体3次备用。将链霉菌孢子悬浮于5ml TES缓冲液中，该缓冲液浓度为0.05mol/L，pH值为8.0。然后在55℃水浴中热激10min，冷却至室温后，按108∶108与大肠杆菌细胞等量混合后涂在SFM培养基平板上，该培养基平板组分为：2％琼脂糖(m/v)，2％甘露醇(m/v)，2％黄豆饼粉(m/v)，培养平板pH值为7.2～7.5，吹干后放在30℃培养箱中进行培养。12小时后用含萘啶酮酸和阿泊拉霉素的1ml无菌水覆盖平板，平板上萘啶酮酸的终浓度为50ng/mL，阿泊拉霉素为30ng/mL，置30℃培养3天后即可看到转移接合子。
从覆盖板上挑选单个接合转移子接种到阿泊拉霉素抗性平板上进一步确认抗性。以备选菌株的总DNA作为PCR模板，pFMetK，pFMA，pFMV，pFMVA四个质粒中都含有metK基因，质粒经转化获得的ZYJ-6/pFMetK，ZYJ-6/pFMV，ZYJ-6/pFMA，ZYJ-6/pFMVA菌株用PCR验证使用的引物为metKTF/metKTR，PCR产物为986bp(见图2)。图2中1为marker，2、3、4、5分别为菌株ZYJ-6/pFMetK，ZYJ-6/pFMV，ZYJ-6/pFMA，ZYJ-6/pFMVA的染色体为模板可以扩增得到986bp扩增带。pFVgb，pFMV，pFMVA三个质粒中都含有vgbS基因，质粒经转化获得的ZYJ-6/pFVgb，ZYJ-6/pFMV，ZYJ-6/pFMVA菌株用PCR验证使用的引物为vgbTF/vgbTR，PCR产物为436bp(见图3)。图3中1为marker，2、3、4分别为菌株ZYJ-6/pFVgb，ZYJ-6/pFMV，ZYJ-6/pFMVA的染色体为模板可以扩增得到436bp扩增带。pFAdpA，pFMA，pFMVA三个质粒中都含有adpA基因，质粒经转化获得的ZYJ-6/pFAdpA，ZYJ-6/pFMA，ZYJ6-/pFMVA菌株用PCR验证使用的引物为adpATF/adpATR，PCR产物为620bp(见图4)。图4中1为marker，2、3、4分别为菌株ZYJ-6/pFAdpA，ZYJ-6/pFMA，ZYJ-6/pFMVA的染色体为模板可以扩增得到620bp扩增带。
引物序列：
metKTF：5′GAACAGACCCACGGGCTCGG  3′
metKTR：5′TGTCCCGTCGCCTGTTCACC  3′
vgbTF：5′GTGGACCAGCAGACCATCAA 3′
vgbTR：5′ACTCGACCGCCTGGGCGTAC 3′
adpATF：5′CGCAGGGACTGGAGGCGATC 3′
adpATR：5′CACCCGCTGGGTGATCAGCC 3′
PCR反应体系：0.1μg模板DNA，引物各50pmol，4μL DMSO，4μL dNTP，5μL PCR缓冲液和1个单位Tag DNA聚合酶，该聚合酶为日本TOYOBO公司产品，加纯水到50μL。PCR反应的循环条件为：94℃，5min；94℃，30s；57℃，30s；72℃，80s(30个循环)；72℃延伸5min，4℃结束反应。
步骤三，菌株发酵以及抗生素的提取和检测。
将出发菌株ZYJ-6和获得的ZYJ-6/pFMetK，ZYJ-6/pFVgb，ZYJ-6/pFAdpA，ZYJ-6/pFMV，ZYJ-6/pFMA，ZYJ-6/pFMVA六个菌株依次进行液体发酵及抗生素检测。以菌株ZYJ-6作为宿主，以FR-008III组分的产量作为检测标准。
首先将菌株在SFM平板上活化，30℃培养3天。然后接种在25ml液体培养基TSBY(10.3％蔗糖)中，其中液体培养基TSBY的制备方法为：胰蛋白胨(TSB)30g，Difco酵母粉5g，蔗糖340g(34％)或103g(10.3％)，定容至1000ml，分装灭菌。30℃摇床培养24小时，取样，离心，收菌体，烘干，称干重，确定各菌种之间菌体密度的差异，调整到一致。按大约1/100体积比接种到50ml液体培养基YEME中，30℃摇床培养84小时。其中液体培养基YEME的制备方法为：取Difco酵母粉3g，Difco蛋白胨5g，Oxoid麦芽粉3g，蔗糖103g，葡萄糖10g，然后定容至1000ml，灭菌，使用前补加2ml的无菌2.5M MgCl2·6H2O溶液。
在不同的培养时间取发酵液进行抗生素的提取和检测。分别在36h，48h，60h，72h和84h取发酵液，然后加入2倍体积的正丁醇，振荡萃取，离心取上清，重复三次，将菌液中的抗生素萃取出来，合并萃取液，在波长380nm处用分光光度计检测，同时以链霉菌FR-008的不产抗生素的突变株HJ-5(Yirong Zhang，Linquan Bai and Zixin Deng.Functional characterization of the first two actinomycete 4-amino-4-deoxychorismate lyasegenes.Microbiology，2009，155：2450-2459)的发酵液作为空白对照。实验重复三次。
图5为菌株ZYJ-6和构建的六个菌株ZYJ-6/pFMetK，ZYJ-6/pFVgb，ZYJ-6/pFAdpA，ZYJ-6/pFMV，ZYJ-6/pFMA，ZYJ-6/pFMVA产生的杀念菌素的产量分析。六个菌株与出发菌株同时进行平行发酵检测，结果表明，前五个菌株使杀念菌素的产量依次提高了90％(pFMetK)、130％(pFVgb)、80％(pFAdpA)、130％(pFMV)、150％(pFMA)(见图5)；图6表示三个基因的整合型质粒pFMVA在ZYJ-6中的表达最终将杀念菌素的产量提高了2.1倍，产量从424ug/ml(ZYJ-6)提高到1301ug/ml(ZYJ-6/pFMVA)。
Figure IDA0000049168660000011
Figure IDA0000049168660000021

Claims (5)

1.一种提高链霉菌抗生素产量的方法，其特征在于，通过构建metK基因、metK基因和vgbS基因、metK基因和adpA-c基因以及metK基因和vgbS基因以及adpA-c基因的对应整合表达质粒pFMetK、pFMV、pFMA以及pFMVA，并将所述的整合表达质粒转入链霉菌ZYJ-6中，实现产量的提高；
所述的metK基因，是指S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因，如Seq ID No.1所示；
所述的vgbS基因，是指透明颤菌血红蛋白合成基因，如Seq ID No.2所示；
所述的adpA-c基因，是指霉菌中的全局性正调节基因，如Seq ID No.3所示；
所述的构建包括以下任意一种：
1）含有天蓝色链霉菌metK基因质粒的构建，具体步骤包括：PCR扩增天蓝色链霉菌M145中不带原始启动子的metK基因，即在天蓝色链霉菌的metK基因内部设计引物metKF2/metKR，在ATG密码子处加入了一个NdeI酶切位点；将扩增到的不带原始启动子的1334bp的metK基因插入pBlueScriptII SK（+）的EcoRV位点构建4292bp的克隆pJTU2524；用NdeI和EcoRI将无启动子的metK基因片段从pJTU2524上切下插入到含有红霉素抗性基因强启动子PermE*的pIB139载体中，得到质粒pFMetK；
所述的引物metKF2/metKR的序列为：
metKF2 （5’-CAGGGAGCCATATGTCCCGT-3’）；
metKR(5’-TCGCAAAGGCCACTGACAACA-3’）；
2）含有metK和vgbS两个基因的质粒pFMV的构建，具体步骤包括：用NdeI和EcoRI将vgbS从pJTU4405上切下插入pJTU968的相应酶切位点，再用MunI和EcoRI将带有红霉素强启动子的vgbS基因片段插入到pFMetK质粒的EcoRI位点，得到质粒pFMV；
所述的pJTU4405通过以下方式获得：将vgb基因在链霉菌中使用频率不高的密码子改为在链霉菌中使用频率最高的密码子，保持氨基酸序列不变，产生新的基因vgbS，在基因vgbS两端分别引入NdeI和EcoRI的酶切位点，其中在vgbS核苷酸序列的5’端添加7个核苷酸，形成限制性内切酶NdeI位点和保护碱基，在vgbS核苷酸序列的3’端添加8个核苷酸，形成限制性内切酶EcoRI位点和保护碱基，将vgbS全基因合成，全长456bp，合成的456bp的vgbS的DNA被插在载体pGH的SmaI位点，产生质粒pJTU4405；
3）含有metK和adpA-c两个基因的质粒pFMA的构建，具体步骤包括：用NdeI和EcoRI将adpA-c从pJTU2520上切下插入到带有红霉素启动子的质粒pJTU968的相应位点，再用MunI和EcoRI将带有红霉素强启动子的adpA-c基因片段插入到pFMetK质粒的EcoRI位点，构建质粒pFMA；
所述的pJTU2520通过以下方式获得：PCR扩增天蓝色链霉菌中的adpA-c基因，具体步骤包括：设计引物adpAc2F/adpAc1R，在ATG密码子处加入了一个NdeI酶切位点；将1556bp的adpA-c扩增片段插入到pBlueScriptII SK（+）的EcoRV位点，得到质粒pJTU2520；
所述的引物adpAc2F/adpAc1R的序列为：
adpAc2F（5’-GGCTTAGCCATATGAGCCAC-3’）；
adpAc1R (5’-CGTTCATGCGGGCCACTTTA-3’）；
4）含有metK、vgbS和adpA-c的质粒pFMVA 的构建，即用MunI和EcoRI将带有红霉素启动子的adpA-c从pJTU2522上切下插入到pFMV的EcoRI位点，得到质粒pFMVA。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述的转入是指：将构建的质粒转入大肠杆菌ET12567/pUZ8002中，经水浴热激后置于培养基平板上进行培养。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征是，所述的转入是指：
1）将构建的质粒转入大肠杆菌ET12567/pUZ8002中并挑转化子在液体LB培养基中培养携带有转移质粒的大肠杆菌ET12567/pUZ8002，该液体LB培养基内存在有终浓度为25μg/μL的氯霉素，50μg/μL的卡那霉素和30μg/μL的阿泊拉霉素，37℃培养8小时后收集菌体，用新鲜LB培养基洗涤菌体3次备用，将链霉菌孢子悬浮于5ml TES缓冲液中，该缓冲液浓度为0.05 mol/L， pH值为8.0；
2）然后在55℃水浴中热激10 min，冷却至室温后，按108 : 108与大肠杆菌细胞等量混合后涂在SFM培养基平板上，该培养基平板组分为：2 %琼脂糖（m/v），2 % 甘露醇（m/v），2 % 黄豆饼粉（m/v），培养平板pH值为7.2～7.5，吹干后放在30℃培养箱中进行培养12小时；
3）用含萘啶酮酸和阿泊拉霉素的1 ml无菌水覆盖平板，平板上萘啶酮酸的终浓度为50ng/mL，阿泊拉霉素为30ng/mL，置30℃培养3天后即可看到转移接合子。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述的链霉菌ZYJ-6是指：产生杀念菌素D单组分的突变株。
5.根据权利要求1或2或4所述的方法，其特征是，所述链霉菌ZYJ-6，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏登记编号为CGMCC NO. 2394。
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