CN116478878A - 一种高产核黄素的枯草芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株高产核黄素的枯草芽孢杆菌突变株及其构建方法，其保藏编号为：CGMCC NO.24396；本发明还公开了一株高产核黄素的枯草芽孢杆菌工程菌株及其构建方法。本发明从采自农田土壤的样品中筛选得到核黄素含量最高的一个菌株，进一步通过诱变和液滴微流控分选，获得了一株高产核黄素的突变株，其保藏编号为CGMCC NO.24396；最后在该突变株的基础上组成型强表达核黄素操纵子，获得了高产核黄素的工程菌株。本发明还公开了枯草芽孢杆菌发酵生产核黄素的方法，以及高产核黄素的枯草芽孢杆菌菌株在生产核黄素中的应用和高产核黄素的枯草芽孢杆菌菌株在饲料、医药、食品中的应用。

Description

一种高产核黄素的枯草芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种高产核黄素的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株及其生产核黄素的方法。
背景技术
核黄素又名维生素B2，是一种水溶性B族维生素，大多数微生物和植物可自主合成，而人和动物只能从食物中摄取。核黄素在生物体内主要以黄素单核苷酸(FMN)和黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)的形式存在，它作为黄素蛋白的辅酶或辅基参与机体组织呼吸链电子传递及氧化还原反应，是维持机体正常代谢和生理功能所必需的营养素。核黄素被广泛应用于医药、食品和饲料等领域，由于核黄素的广泛用途，国内外对核黄素的需求量仍呈现日益增加的趋势。
核黄素的工业化生产有化学合成法和微生物发酵法。化学合成法一般以D-核糖为主要原料，具有原料成本高、工艺复杂、副产物多、能耗高和纯化成本高等缺陷。微生物发酵法具有原料来源丰富、生产成本低、反应条件温和、生产周期短、工艺流程易于控制、产品纯度较高和环境污染小等优点，是一种最具前景的高效经济且大规模工业化生产的方法，并且通过菌种选育及发酵调控技术，可定向提高菌株的单位产量，已完全取代化学合成法成为核黄素的主要生产方法。
核黄素的生物合成需要经过由磷酸戊糖途径、嘌呤合成途径、核黄素合成途径催化的二十多步反应才能将葡萄糖转化为核黄素，核黄素的生物合成途径长、代谢节点多、代谢调控复杂，通常从自然界中筛选到的产核黄素的天然菌，其核黄素的发酵水平低，需要经过诱变、高通量筛选及代谢工程改造才能获得高产核黄素的菌株，从而满足工业大规模发酵生产的要求。
传统的诱变育种，工作量大、缺乏高效、快速的筛选方法。液滴微流控技术近年来在微生物领域受到较多关注，其最主要的优势就在于每一个形态稳定的液滴均可视为独立的微反应器，可以对单细胞进行包裹和分析，其速度快、通量大、能够创造独立内环境的特性，已经应用于细胞和酶的定向进化、高通量分选等领域。核黄素是天然的荧光物质，微流控分选系统特有的功能单元，使得对液滴中核黄素荧光强度的鉴别以及高荧光信号液滴的分离操作成为可能。
发明内容
本发明的目的在于提供一株高产核黄素的枯草芽孢杆菌菌株及其发酵生产核黄素的方法。本发明首先从采自农田土壤表层下10cm处的土样中分离得到一株产核黄素的枯草芽孢杆菌菌株V5(实验室编号)，随后，在菌株V5的基础上，通过诱变育种结合液滴微流控高通量分选技术，成功选育出一株高产核黄素的枯草芽孢杆菌突变株TIB.RF8M(保藏编号为CGMCC NO.24396)，然后，对突变株TIB.RF8M进行代谢工程改造，获得一株高产核黄素的工程菌株M2。最后，阐述了突变株和工程菌株发酵生产核黄素的方法。
第一方面，本发明提供了一株高产核黄素的枯草芽孢杆菌突变株，该菌株已于2022年02月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮政编码：100101)，保藏编号为CGMCC NO.24396。
本发明提供了一株高产核黄素的枯草芽孢杆菌工程菌株，在所述的枯草芽孢杆菌突变株中导入并过表达核黄素操纵子基因ribDEAHT。优选地，所述过表达是使用强启动子和强RBS来实现组成型强表达。更优选地，所述强启动子和强RBS的核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示。
本发明提供了一种高产核黄素的枯草芽孢杆菌工程菌株的构建方法，其包括如下步骤：
(1)构建大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒，用做过表达基因的载体骨架；
(2)在步骤(1)载体骨架的基础上分别构建核黄素操纵子组成型强表达质粒和核黄素操纵子过表达质粒；
(3)将步骤(1)和步骤(2)获得的质粒转化入突变株CGMCC NO.24396中；
(4)获得含有步骤(1)和步骤(2)质粒的工程菌株；
(5)对步骤(4)获得的含质粒工程菌进行发酵，检测核黄素产量，筛选获得核黄素产量最高的工程菌株；
其中，所述步骤(2)中的核黄素操纵子组成型强表达为使用强启动子和强RBS来实现组成型强表达，优选为人工合成的强启动子和强RBS，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；
优选地，所述步骤(3)中的转化方法为化学转化，优选为spizizen转化；
优选地，所述步骤(5)中核黄素产量最高的工程菌株是在突变株CGMCC NO.24396中组成型强表达了核黄素操纵子。
本发明提供了一种生产核黄素的方法，发酵培养所述枯草芽孢杆菌突变株或如权利要求2所述的枯草芽孢杆菌工程菌株，从发酵液中收集核黄素。
更具体地，其包括如下步骤：
(1)在一定温度条件下培养权利要求1所述的枯草芽孢杆菌突变株或权利要求2所述的枯草芽孢杆菌工程菌株，以获得单菌落；
(2)步骤(1)中的单菌落接种斜面，在一定温度条件下培养一定时间；
(3)刮取步骤(2)中斜面上的一定量的菌苔接种发酵培养基并振荡培养一定时间获得发酵液，发酵过程中定时补加一定量的补料液；
(4)离心收集步骤(3)中的发酵液，可见分光光度计检测核黄素。
其中，所述步骤(1)的一定温度为30-40℃，优选为37℃；
优选地，所述步骤(2)中的一定温度为30-40℃，优选为37℃，培养一定时间的时间为24-48h，优选为36h；
优选地，所述步骤(3)中一定量的菌苔为1/3斜面的菌苔，振荡培养时的转速为180-220rpm，优选为200rpm，振荡培养一定时间的时间为36-48h，优选为41h，定时补加补料液为每隔4-8h补加一次补料液，优选为每隔6h补加一次补料液，一定量的补料液为1-3mL，优选为2mL。
本发明还提供所述的突变株和所述的工程菌株在生产核黄素中的应用，以及在制备含有核黄素的饲料、医药、食品中的应用。
附图说明
图1.富集分离得到的5株菌核黄素的产量。
图2.致死率曲线。
图3.不同突变株产核黄素的能力。
图4.不同突变株的生物量。
图5.大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒图谱。
图6.含质粒菌株产核黄素的能力。
图7.含质粒菌株的生物量。
生物材料保藏信息：本发明的枯草芽孢杆菌突变株TIB.RF8M，已于2022年02月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。保藏编号为CGMCC NO.24396，分类命名为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis。
具体实施方式
本发明的实施方案已公开如下，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，这些方案和附图不可以理解为对本发明的限制，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域。对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改。因此，任何在不脱离本发明的原理和实质的情况下所做的任何改变，均落在本发明的保护范围之内。
本实施例中所用到的实验技术与实验方法，如无特殊说明均为常规技术方法。本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过正规商业渠道获得。
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
培养基配方：
LB(g/L)：蛋白胨10，酵母抽提物5，氯化钠10，固体培养基加琼脂粉18，pH通过NaOH控制在7.0。
发酵培养基(g/L)：蔗糖30、玉米浆干粉10、酵母抽提物3、硫酸铵7、硫酸镁2、磷酸氢二钾3、磷酸二氢钾1，pH通过NaOH控制在6.8-7.2。
补料培养基(g/L)：葡萄糖500，玉米浆干粉25，磷酸氢二钾1.5，磷酸二氢钾0.6，pH通过NaOH控制在6.8-7.2。
10×Spizizen-基本盐培养基(g/L)：(NH4)2SO4 20，K2HPO4 18.03，KH2PO4 60，柠檬酸钠12。
GMI培养基(mL/L)：10×Spizizen盐100，2％酸水解酪素20，5％酵母提取物20，44％一水葡萄糖20，36％MgSO4.7H2O 1，0.5％L-色氨酸10。
GMII液体培养基(mL/L)：10×Spizizen盐100，2％酸水解酪素10，44％一水葡萄糖20，36％ MgSO4.7H2O 8。
OD600的检测方法：
发酵液混匀，用0.8％ NaCl溶液将其稀释到适当的倍数，充分混匀，以0.8％ NaCl溶液做空白，用可见分光光度计在600nm下测吸光度(显示值控制在0.2-0.8)，按以下公式计算OD600值：OD600＝稀释倍数*吸光度。
核黄素的检测方法：
发酵液混匀，用0.01mol/L NaOH将其稀释到适当的倍数后，混匀，避光碱溶20min，12000rpm离心2min，取上清液以0.01mol/L NaOH做空白，用可见分光光度计在444nm下测定吸光度(显示值控制在0.2-0.8之间)，按以下公式计算核黄素的含量：FB(mg/L)＝(稀释倍数*吸光度)/0.0321。
实施例1：产核黄素芽孢杆菌的富集与分离
将采自农田土壤表层下10cm处的10g土样置于100mL无菌水中，振荡混匀后，90℃水浴20min，以杀死非芽孢菌体。取经过热处理的菌悬液1mL接种到含有9mL LB培养液的100mL三角瓶中，37℃、200rpm富集培养6h。
取1mL菌液进行10倍梯度稀释，分别取稀释倍数为10-1、10-2、10-3的菌悬液各100μL，分别涂布含有终浓度为10ug/mL、20ug/mL、30ug/mL玫瑰黄素(Roseoflavin，以下缩写为ROF，玫瑰黄素为核黄素结构类似物)的LB平板上，37℃倒置培养24h后，统计平板上长出的菌落数如表1：
由于玫瑰黄素是核黄素的结构类似物，菌株抗玫瑰黄素浓度越高，其核黄素生产能力越强，因此，将LBROF20平板上长出的5株菌，分别在LBROF20平板上进行多次划线分离纯化，得到产核黄素芽孢杆菌的纯培养物，将富集分离得到的5株纯种产核黄素芽孢杆菌分别命名为V1、V2、V3、V4、V5，进行菌种保藏，备用。
实施例2：纯培养物核黄素含量的测定
1、摇瓶发酵
将分离得到的5株纯种产核黄素芽孢杆菌，稀释合适的倍数后分别涂布于LB培养基中，37℃倒置培养24h，以获得单菌落。挑选状态一致、大小居中(菌落直径约3.0-4.0mm)的单菌落接种LB斜面，37℃培养36h。
用900μL发酵培养基冲洗下斜面上的所有菌苔，取300μL接种于含有30mL发酵培养基的250mL挡板三角瓶中，37℃、200rpm振荡培养41h后获得发酵液，检测发酵液中核黄素的产量。摇瓶发酵每株菌做3个平行。
2、发酵液中核黄素含量的测定
样品经处理后进行检测，比较得到的各组数据，筛选出核黄素含量最高的一个。结果表明(见图1)，分离得到的5株纯种产核黄素芽孢杆菌中，菌株V5的核黄素含量最高，为128.6mg/L。
实施例3：菌株形态特征的观察
1、菌落形态特征的观察
富集分离得到的核黄素含量最高的菌株V5，其在LB培养基上培养24h后，单菌落微微泛黄，单菌落呈圆形、边缘锯齿，单菌落直径在3.0-5.0mm之间，适宜生长温度为35-40℃，适宜生长pH为6.8-7.2。
2、菌株个体形态特征的观察
富集分离得到的核黄素含量最高的菌株V5，通过革兰氏染色和显微镜镜检观察菌株的个体形态。革兰氏染色结果表明，V5菌株为革兰氏阳性菌；显微镜油镜目镜和物镜均放大100倍后观察，菌株个体形态大部分为杆状，单细胞大小为0.6～0.8×2～4μm。
实施例4：菌株V5种属的鉴定
1、菌株16S rRNA基因序列测定
按照实施例2中摇瓶发酵的方法进行菌株V5的扩大培养。按照天根公司的细菌基因组DNA提取试剂盒上的操作说明进行菌株V5基因组DNA的提取。以天津擎科生物技术有限公司合成的16S rRNA基因通用引物(8F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)进行PCR扩增；PCR反应体系(50μL)：包括 MaxDNAPolymerase 25μL，8F和1492R引物(10μM)各1μL，V5基因组DNA1μL，无菌ddH2O 22μL；PCR反应条件：98℃、2min，1个循环；98℃、10s，55℃、15s，72℃、30s，30个循环；72℃、5min，1个循环；4℃、forever。测序由苏州金唯智生物科技有限公司完成，测序引物为8F和1492R。
2、16S rRNA基因序列分析
菌株V5扩增出的16S rRNA基因片段条带单一，大小约为1.4kb。将菌株V5测序获得的16S rRNA基因序列与GenBank数据库中的序列进行同源性比对，发现菌株V5与芽孢杆菌属的16S rRNA序列自然聚类；将菌株V5测序获得的16S rRNA基因序列进行Lineage Report分析，结果显示，枯草芽孢杆菌的Number of Hits数最高，表明菌株V5与枯草芽孢杆菌的亲缘关系最近。
实施例5：菌株V5常压室温等离子体(ARTP)诱变时间的确定
为了获得一个比较广的突变体库，对菌株V5进行了常压室温等离子体(ARTP)诱变。对常压室温等离子体诱变条件下菌株V5的致死率进行测定，气源：高纯氦气，气体流量：10SLM，功率：100w，样品距等离子体发生器出口的距离：4mm。将种子培养至对数中期的细胞用0.8％ NaCl溶液稀释成108个细胞/mL的悬液，取10μL悬液均匀的涂布在铁片上，进行ARTP诱变，诱变时间分别为0s、5s、10s、15s、20s、25s、30s、35s，每个诱变时间点2个重复，每个时间点的涂板3个重复。诱变后带有细胞的铁片置于1mL无菌水中漩涡振荡洗下细胞，将细胞悬液10倍稀释至10-2，取稀释后的细胞悬液100μL涂板，37℃培养24h后统计菌落数。根据下列公式计算不同诱变时间下的致死率，以诱变时间为横坐标，不同诱变时间下的致死率为纵坐标，绘制致死率曲线。致死率的计算公式为：致死率(％)＝[(诱变0s菌落数－诱变Ns菌落数)/诱变0s菌落数]×100％，其中N＝5、10、15、20、25、30、35。
从图2中可知，诱变20s时的致死率为78.65％，诱变35s时的致死率达到99.72％以上，致死率为70％-80％时，诱变后发生正突变的概率最高，因此选择20s作为最终构建突变体库的诱变时间。
实施例6：菌株V5突变体库的构建及液滴微流控分选
核黄素是天然的荧光物质，专利号为ZL201910604170.3的专利文件中验证了不同浓度的核黄素标品通过液滴微流控能够显示出不同强度的荧光信号，且液滴中核黄素浓度与荧光信号强度呈一定的线性关系。因此，荧光值的强弱可以作为后续核黄素产量高低筛选的参数。
取浓度为108个/mL的细胞悬液10μL涂布于铁片上进行ARTP诱变，诱变时间为20s，共对10个铁片上的细胞进行诱变处理，诱变结束后，将这10个铁片上的细胞在同一个含有1mL发酵培养基的EP管中涡旋振荡重悬。
将重悬后的细胞悬液进行液滴包埋，包埋后在37℃静置培养18h，以允许细胞在液滴中产生核黄素，由于核黄素是天然的荧光物质，使用两步连续的液滴微流控分选技术来富集荧光强度高的细胞进行后续的初筛和复筛。第一轮液滴微流控分选，从2.1×106个阳性液滴(总共2.1×107个液滴，约10％细胞装载)中收集了约5000个高荧光的液滴。将第一轮筛选出的高荧光液滴破乳后接种发酵培养基进行液滴包埋，包埋后静置培养18h，进行第二轮液滴微流控分选，从5×104个阳性液滴(总共5×105个液滴，约10％细胞装载)中收集到的约500个高荧光信号的液滴，液滴不破乳涂布LB琼脂平板，37℃倒置培养24h长出428个单菌落，单菌落均发黄，其中有12个单菌落发黄明显。我们知道核黄素即是一种黄色物质，菌落颜色越黄核黄素产量越高，且核黄素会被分泌到胞外，当菌落颜色相当(即用肉眼无法分辨)且菌落直径大小相差无几时，菌落周围的黄色圈越大，表明菌株的核黄素生产能力越强。因此将单菌落明显发黄的12株菌分别命名为RF1、RF2、RF3、RF4、RF5、RF6、RF7、RF8、RF9、RF10、RF11、RF12，分别进行菌种保藏后备用。
实施例7：高产核黄素突变株的筛选
1、摇瓶发酵条件
将ARTP诱变出发菌株V5和液滴微流控分选获得的单菌落明显发黄的12株菌(RF1-RF12)，稀释合适的倍数后分别涂布于LB培养基中，37℃倒置培养24h，以获得单菌落。挑选状态一致、大小居中(菌落直径约3.0-4.0mm)的单菌落接种LB斜面，37℃培养36h。
用900μL发酵培养基冲洗下斜面上的所有菌苔，取300μL接种于含有30mL发酵培养基的250mL挡板三角瓶中，37℃、200rpm振荡培养41h后获得发酵液，摇瓶发酵每株菌做3个平行。
2、不同突变株产核黄素能力和生物量的比较
液滴微流控分选获得的单菌落明显发黄的12株菌(RF1-RF12)与对照菌V5相比生产核黄素的能力均得到较大幅度的提升(参见下表2和图3)。
其中RF8的核黄素产量为436.5mg/L，相较于对照菌株V5产量提高了3.5倍，且发现单菌落颜色越黄，核黄素的产量越高。突变株相较于对照菌株V5生物量无明显差异，表明突变后未对菌体的生长造成影响(见图4)。
实施例8：突变株RF8的诱变和高产核黄素菌株的筛选
在突变株RF8的基础上重复实施例6和实施例7三次，最后获得一株高产核黄素的菌株TIB.RF8M，摇瓶中核黄素的产量达到1624.8mg/L，菌株TIB.RF8M核黄素的产量是RF8的3.7倍，是菌株V5的12.9倍。菌株TIB.RF8M已于2022年02月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮政编码：100101)，保藏编号为CGMCC NO.24396。
实施例9：突变株TIB.RF8M与对照菌株V5进行比较基因组分析
将突变株TIB.RF8M和对照菌株V5送金唯智生物科技有限公司进行全基因组重测序。以菌株V5的基因组为参考基因组，对突变株TIB.RF8M的重测序结果进行了差异性分析，部分解析了突变株TIB.RF8M高产核黄素的机理。通过序列比对分析，发现突变株TIB.RF8M发生了多个突变，不在葡萄糖到核黄素生物合成途径中的基因突变包括非同义突变和基因间突变，其中非同义突变包括：信号肽酶I编码基因sipW的氨基酸序列89位由异亮氨酸突变为缬氨酸，过氧化物反应性转录抑制因子编码基因perR的氨基酸序列71位由亮氨酸突变为缬氨酸，多糖脱乙酰酶家族产孢蛋白编码基因pdaB的氨基酸序列35位由缬氨酸突变为亮氨酸；基因间突变包括：天冬氨酰磷酸磷酸酶与细胞色素c型生源蛋白编码基因ynzD-ccdA之间发生的突变，TetR/AcrR家族转录调节因子/核转运因子2家族蛋白编码基因yezE-yesE之间发生的突变，DUF4885含结构域蛋白质/氨基酸渗透酶编码基因ybdO-ybxG之间发生的突变。
此外，去除同义突变以及未知基因功能的基因突变，检索由葡萄糖到核黄素生物合成涉及到的代谢途径，确定了两个重要的对核黄素产量有贡献的正向突变：
1、腺苷琥珀酸合成酶编码基因purA发生了突变，其第725位核苷酸由C突变为T。purA基因第725位核苷酸由C突变为T后，相应的第242位氨基酸由脯氨酸突变为亮氨酸。与王光路报道的一致(基于比较基因组学和转录组学的枯草芽孢杆菌过量积累核黄素遗传机理研究)，该突变使purA基因编码的腺苷酸琥珀酸合成酶活性丧失，导致IMP向AMP合成受阻，菌体过量合成GMP/GDP/GTP，提高了核黄素合成前体物的供给，进而提高了核黄素的产量。
2、双功能的核黄素激酶/FAD合成酶编码基因ribC发生了突变，其第596位核苷酸由G突变为A。ribC基因第596位核苷酸由G突变为A后，相应的第199位氨基酸由甘氨酸突变为天冬氨酸。推断该突变与Coquard等报道的类似(Molecular cloning andcharacterisation of the ribC gene from Bacillussubtilis:a point mutation inribC results in riboflavin overproduction)，可导致RibC蛋白的黄素激酶活性下降，一方面降低核黄素的分解，增加核黄素在代谢途径中的积累，另一方面降低细胞内的FMN水平，从而解除FMN对核黄素操纵子的转录弱化调控，增加核黄素操纵子的表达量。
突变株TIB.RF8M葡萄糖到核黄素生物合成途径的一些关键基因还没有被过表达，为了进一步提高核黄素的产量，需要对突变株TIB.RF8M进行代谢工程改造。
实施例10：过表达质粒的构建
1、大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒的构建
以pHP13质粒为模板，用引物oriE-F、oriE-R扩增能在大肠杆菌中自主复制的质粒复制子DNA片段oriE，用引物oriB-F、oriB-R扩增能在枯草芽孢杆菌中自主复制的质粒复制子DNA片段oriB；以pDG1730质粒为模板，用引物spc-F、spc-R扩增壮观霉素抗性基因DNA片段spc。
片段oriE、片段spc、片段oriB用购买自南京诺唯赞生物科技股份有限公司的多片段一步组装试剂盒“Clone ExpressTM MultiS One Step Cloning Kit”进行Gibson组装，Gibson组装体系和反应条件参照试剂盒中的说明书，取10μL组装产物热激转化大肠杆菌DH5α中，涂布于含有100ug/mL壮观霉素的LB平板上，培养20h后进行菌落PCR检测，送金唯智测序。测序正确后，将得到的阳性菌命名为E.coli/pHD。用质粒试剂盒提取质粒pHD备用，质粒图谱如图5所示。
2、核黄素操纵子组成型强表达质粒pHD-P-rib operon的构建
以质粒pHD为模板，用引物pHD-F、pHD-R扩增质粒pHD的线性化DNA片段pHDX，该片段用于后续构建所有过表达质粒的载体骨架。
对突变株TIB.RF8M全基因组重测序的基因组组装结果进行了分析，突变株TIB.RF8M的核黄素操纵子启动子-35区和-10区与枯草芽孢杆菌一致的序列“TTGACA”、“TATAAT”有所差别，可能影响RNA聚合酶的识别效率；此外，核黄素操纵子的mRNA前导区受到以FMN为小分子效应物的转录弱化调控，有必要对核黄素操纵子的mRNA前导区进行修饰，去除原有的riboswitch调控机制，使核黄素操纵子组成型表达，细胞才能源源不断的合成核黄素。
枯草芽孢杆菌的gsiB基因编码应激蛋白，gsiB mRNA前导区很短，且含有强RBS，其与核糖体高效结合并覆盖整个前导区，阻碍了核酸酶的袭击，导致gsiB mRNA的超稳定性。
人工合成了两条133bp序列反向互补的长引物P-F和P-R，其含有枯草芽孢杆菌一致的启动子-35区、-10区及gsiB mRNA前导区的强RBS序列，该段序列可使核黄素操纵子组成型强表达，长引物P-F和P-R通过PCR仪退火获得DNA片段P；以突变株TIB.RF8M的基因组为模板，用引物rib-F、rib-R扩增核黄素操纵子的结构基因DNA片段rib。
片段pHDX、片段P、片段rib用购买自南京诺唯赞生物科技股份有限公司的多片段一步组装试剂盒“Clone ExpressTM MultiS One Step Cloning Kit”进行Gibson组装，取10μL组装产物热激转化大肠杆菌DH5α中，涂布于含有100ug/mL壮观霉素的LB平板上，培养20h后进行菌落PCR检测，送金唯智测序，测序正确后，将得到的阳性菌命名为E.coli/pHD-P-rib operon。用质粒试剂盒提取质粒pHD-P-rib operon备用。
3、核黄素操纵子过表达质粒pHD-Prib-rib operon的构建
以突变株TIB.RF8M的基因组为模板，用引物Prib-F、Prib-R扩增核黄素操纵子的启动子、mRNA前导区和结构基因DNA片段rib operon。
片段pHDX、片段rib operon用购买自南京诺唯赞生物科技股份有限公司的单片段一步组装试剂盒“Clone ExpressTM II One Step Cloning Kit”进行Gibson组装，取10μL组装产物热激转化大肠杆菌DH5α中，涂布于含有100ug/mL壮观霉素的LB平板上，培养20h后进行菌落PCR检测，送金唯智测序，测序正确后，将得到的阳性菌命名为E.coli/pHD-Prib-rib operon。用质粒试剂盒提取质粒pHD-Prib-rib operon备用。
本部分所用引物如下表3：
实施例11：含质粒菌株的构建
将实施例10中的3个质粒pHD、pHD-P-rib operon和pHD-Prib-rib operon按照如下方法转入突变株TIB.RF8M(CGMCC NO.24396)中：
1、取菌株TIB.RF8M(CGMCC NO.24396)-80℃冻存管的菌液5μL于LB平板上划线，37℃培养箱中倒置培养24h获得新鲜活化的单菌落。
2、挑取新活化的单个菌落接入装有5mL GMI培养基的试管中，37℃、200rpm振荡培养14-16h。
3、取500μL菌液转接于装有4.5mL GMI培养基的试管中，37℃、200rpm振荡培养4.5h。
4、取750μL GMI菌液接种于装有4.25mL GMII培养基的试管中，37℃、200rpm振荡培养1.5h，制得感受态细胞。
5、每毫升感受态细胞中加入1-2μg供体质粒，37℃、200rpm振荡培养1-1.5h。
6、12000rpm离心1min，弃去大部分清夜，细胞沉淀用剩余清液(约50-100μL)悬浮，涂布于含有100ug/mL壮观霉素的LB平板上，37℃倒置培养约24h，至单菌落长出。
7、从抗性平板上挑取长出的克隆，进行菌落PCR验证，将验证正确的阳性菌命名为TIB.RF8M/pHD(含有空质粒，命名为M1)、TIB.RF8M/pHD-P-rib operon(含有核黄素操纵子组成型强表达质粒，命名为M2)和TIB.RF8M/pHD-Prib-rib operon(含有核黄素操纵子过表达质粒，命名为M3)，分别进行菌种保藏后备用。
实施例12：含质粒菌株的摇瓶发酵评价
1、摇瓶发酵条件
将含有空质粒的菌株M1、含有核黄素操纵子组成型强表达质粒的菌株M2、含有核黄素操纵子过表达质粒的菌株M3，稀释合适的倍数后分别涂布于含有100ug/mL壮观霉素的LB平板中，37℃倒置培养24h，以获得单菌落。挑选状态一致、大小居中(菌落直径约3.0-4.0mm)的单菌落接种含有100ug/mL壮观霉素的LB斜面，37℃培养36h。
用900μL发酵培养基冲洗下斜面上的所有菌苔，取300μL接种于含有60mL发酵培养基(发酵培养基中含有100ug/mL的壮观霉素)的500mL挡板三角瓶中，37℃、200rpm振荡培养41h，发酵过程中每隔6h补补料培养基2mL，摇瓶发酵每株菌做3个平行。
2、含不同质粒菌株产核黄素能力和生物量的比较
核黄素操纵子过表达的两个菌株M2、M3与含有空质粒的菌株M1相比生产核黄素的能力均得到提高(参见下表4和图6)。
其中含有核黄素操纵子组成型强表达质粒的菌株M2核黄素产量为11750.2mg/L，相较于含有空质粒的菌株M1核黄素产量提高了5.5倍，相较于含有核黄素操纵子过表达质粒的菌株M3核黄素产量提高了3.2倍，表明核黄素操纵子的组成型强表达对于核黄素产量的提高至关重要。含有核黄素操纵子过表达质粒的菌株M3核黄素产量为3658.4mg/L，相较于含有空质粒的菌株M1核黄素产量提高了1.7倍，表明野生型核黄素操纵子的过表达对于核黄素产量的提高有一定的贡献。三个菌株生物量变化不大，说明质粒的存在及核黄素操纵子的过表达未对菌体的生长造成影响(见图7)。

Claims (10)

1.一种高产核黄素的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)突变株，其特征在于，其保藏编号为CGMCC NO. 24396。
2.一种高产核黄素的枯草芽孢杆菌工程菌株，其特征在于，在如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌突变株中导入并过表达核黄素操纵子基因ribDEAHT。
3.如权利要求2所述的枯草芽孢杆菌工程菌株，其特征在于，所述过表达是使用强启动子和强RBS来实现组成型强表达。
4.如权利要求3所述的枯草芽孢杆菌工程菌株，其特征在于，所述强启动子和强RBS的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
5.一种生产核黄素的方法，其特征在于，包括如下步骤：发酵培养如权利要求1所述枯草芽孢杆菌突变株或如权利要求2所述的枯草芽孢杆菌工程菌株，从发酵液中收集核黄素。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述培养时间为36-48h；发酵时振荡转速为180-220rpm。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述培养时间为41h；发酵时振荡转速为200rpm。
8.如权利要求5至7任一项所述的方法，其特征在于，定时补加补料液，每隔4-8h补加一次补料液。
9.如权利要求1所述枯草芽孢杆菌突变株或如权利要求2所述的枯草芽孢杆菌工程菌株在生产核黄素中的应用。
10.如权利要求1所述枯草芽孢杆菌突变株或如权利要求2所述的枯草芽孢杆菌工程菌株在生产含核黄素的饲料、医药、食品中的应用。
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