CN104946552B - 安全高效生产申嗪霉素的基因工程菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一株安全高效生产申嗪霉素的基因工程菌株及其应用；基因工程菌株为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)CCTCC NO:M 2015040：通过对菌株PA1201致病性基因敲除、申嗪霉素代谢基因敲除、分支酸代谢基因敲除、点突变法降低PheA生物活性、同工酶替代法降低分支酸丙酮酸裂解酶生物活性、在基因组增加phzC基因拷贝数、aroG启动子替换为强启动子P_tac增强DAHP合酶基因表达水平、启动子置换法增强申嗪霉素生物合成基因簇表达水平和申嗪霉素外排泵MexGHI‑OpmD表达水平，即得；该菌株能安全、经济、超高产申嗪霉素。

Description

安全高效生产申嗪霉素的基因工程菌株及其应用

技术领域

本发明涉及一株安全高效生产申嗪霉素的基因工程菌株及其应用，具体为一株安全、超高产绿色农药申嗪霉素的基因工程菌株及其应用。

背景技术

我国是农业大国，粮食作物的高产稳产是国民安居乐业、国家经济发展的重中之重。由植物病原菌引起的农经作物病害可导致农经作物减产，造成巨大的经济损失。目前，用于防治植物病害的主要方法包括培育抗病品种、栽培防治、化学防治和生物防治等。农药的合理应用能够极大程度上保障我国农业的可持续性性发展。近些年来，生物技术的飞速发展大力推进了生物农药的研发工作。与传统化学农药相比，生物农药具有高效、安全、经济及对环境友好等特点，现已成为我国现代农药开发的一个重要方向。

水稻根际假单胞菌PA1201，能有效抑制水稻纹枯病菌和水稻白叶枯病菌的生长，其主要抑菌成分为两种农用抗生素申嗪霉素，即吩嗪-1-羧酸，和吩嗪-1-酰胺。其中，申嗪霉素能有效防治水稻纹枯病、西瓜蔓枯病和甜椒疫病等多种真菌性病害，于2011年正式获得农药登记证(登记号：PB20110314和PB20110315),并被全国农技推广服务中心列为“十二五”重点推广产品(证书号：TG2011-002)。在黄豆粉发酵培养液中，PA1201菌株的申嗪霉素发酵效价可达800毫克/升发酵液，吩嗪-1-酰胺发酵效价为350～450毫克/升发酵液。该菌株PA1201已于2013年9月23日在中国专利局指定的保藏单位：中国典型培养物保藏中心(地址：中国武汉，武汉大学，邮编：430072)保藏，保藏号为CCTCC NO.M 2013441，并于2013年10月提交了名为“高产吩嗪-1-羧酸和吩嗪-1-酰胺的根际假单胞菌”的专利申请(专利申请号：201310511796.2)。

虽然水稻根际菌株PA1201的申嗪霉素发酵效价显著优于现有申嗪霉素生产菌株的出发菌株M18(约为200毫克/升发酵液)，但并不适宜应用到农业生产领域，主要包括以下两方面的原因：1)菌株PA1201的申嗪霉素发酵效价通常为0.8克/升发酵液，生产成本较高，缺乏市场竞争力；2)经鉴定水稻根际拮抗菌PA1201为铜绿假单胞菌，而临床分离的铜绿假单胞菌多是条件致病菌，在发酵过程中能产生多种毒性因子，具有感染人 体的潜在危险，因此，有必要对PA1201基因组中与致病相关的基因进行敲除，降低PA1201安全隐患。

发明内容

本发明针对现有技术缺陷，提供一株安全高效生产申嗪霉素的基因工程菌株及其应用；首先，本发明针对现有菌株PA1201的安全隐患，系统敲除PA1201基因组中的主要致病性相关基因/基因簇，从而大幅提高该菌株的安全性；其次，本发明针对现有菌株PA1201发酵效价低，申嗪霉素生产成本高，不利于工业化生产和大规模推广使用的问题，本着“开源节流”的原则，利用基因工程和蛋白质工程手段，对原始菌株PA1201进行大幅基因改造和代谢改造，从而提高申嗪霉素产量，包括：1)阻止申嗪霉素向吩嗪-1-酰胺和绿脓菌素的转化；2)对申嗪霉素合成前体分支酸的代谢相关基因trpE、pabB和pch基因簇进行敲除，并降低分支酸代谢蛋白UbiC和PheA的生物活性，提高分支酸的水平；3)通过增强DAHP合酶PhzC和AroG的表达水平，增加菌体内碳源向申嗪霉素生物合成途径的代谢流通量；4)增强两个申嗪霉素生物合成基因簇phzA1-G1和phzA2-G2的表达水平，进一步提高申嗪霉素的产量；5)增强申嗪霉素外排泵MexGHI-OpmD的表达水平，加速申嗪霉素向体外排放的速度，提高申嗪霉素产量。

本发明所涉的生产申嗪霉素的基因工程菌株已提交中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏单位地址：湖北省武汉市，洪山区八一路，武汉大学中国典型培养物保藏中心，430072；保藏日期为20150118；保藏编号为CCTCC NO:M 2015040；分类名称为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)PA-Ⅲ。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

第一方面，本发明提供一株生产申嗪霉素的基因工程菌株，所述基因工程菌株为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)CCTCC M 2015040。

本发明所得基因工程菌株是一株安全性优越并超高产申嗪霉素的工程菌株，其申嗪霉素的发酵效价可达7.0～7.4克/升发酵液，是原始菌株PA1201申嗪霉素产量的7～9倍，且优于现有申嗪霉素高产菌株(专利名称：利用工程菌株M18G携带质粒pME6032Phz生产吩嗪-1-羧酸的方法(专利CN200910198664.2))，可用于绿色微生物农药申嗪霉素的制备，大规模地防治植物病害。

第二方面，本发明提供一种所述生产申嗪霉素的基因工程菌株的构建方法，所述构建方法包括如下步骤：

步骤一、敲除野生菌株PA1201中致病性相关基因/基因簇，得工程菌株PA1201Δ6；

步骤二、敲除所述工程菌株PA1201Δ 6中申嗪霉素代谢基因，得工程菌株PA1201MSHΔ 6；

步骤三、敲除所述工程菌株PA1201MSHΔ 6中分支酸代谢相关基因，得工程菌株PA1201MSHΔ 9；

步骤四、通过点突变法，将所述工程菌株PA1201MSHΔ 9中芳香族氨基酸生物合成相关蛋白进行突变，得到工程菌株PA1201MSHΔ 9pheA(W323L)；

步骤五、将所述工程菌株PA1201MSHΔ 9pheA(W323L)的辅酶Q生物合成途径中分支酸丙酮酸裂解酶编码基因ubiC替换为生物活性较低的基因，得到工程菌株PA1201MSHΔ9pheA(W323L)Rv2949c；

步骤六、利用基因组整合载体将在强启动子控制下的phzC基因整合入所述工程菌株PA1201MSHΔ 9pheA(W323L)Rv2949c的基因组，并将基因组上aroG基因的启动子置换为强启动子，得工程菌株PA-I；

步骤七、敲除所述工程菌株PA-I中申嗪霉素合成基因簇phzA1-phzG1上转录抑制区域(5’-UTR)，得到工程菌株PA-IΔ UTR；将所述工程菌株PA-IΔ UTR中申嗪霉素合成基因簇phzA2-G2的启动子置换为强启动子，得工程菌株PA-Ⅱ；

步骤八、置换所述工程菌株PA-Ⅱ中mexGHI-opmD基因簇的启动子为强启动子，即得所述生产申嗪霉素的基因工程菌株铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)CCTCCM2015040，即基因工程菌株PA-Ⅲ。

优选地，所述生产申嗪霉素的基因工程菌株的构建方法中，敲除的方法包括如下：

(1)根据需要敲除基因/基因簇的DNA序列，每个基因/基因簇设计引物两对，以铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)PA1201基因组DNA为模板，利用高保真聚合酶KOD-plus-neo扩增该基因两段侧翼序列(flanking sequences)；其中，扩增上游侧翼序列需使用引物(敲除基因名)-FOR-1和引物(敲除基因名)-REV-1，扩增下游侧翼序列需使用引物(敲除基因名)-FOR-2和引物(敲除基因名)-REV-2。

(2)以所述两段侧翼序列为模板，以扩增上游侧翼序列使用的正向引物(敲除基因名)-FOR-1和扩增下游侧翼序列使用的反向引物(敲除基因名)-REV-2，通过重叠延伸PCR(Overlap PCR)克隆得到基因敲除融合片段；

(3)自杀质粒pEX18Gm和所述基因敲除融合片段经限制性内切酶双酶切后，将基因敲除融合片段插入到自杀质粒pEX18Gm，构建重组自杀质粒，用于基因敲除；

(4)通过双亲杂交法，将所述重组自杀质粒转化至PA1201或其衍生菌株中，具体包括：用无菌接种环，在LB平板上充分混合PA1201或其衍生菌株与含有重组自杀质粒的大肠杆菌S17-1菌株的菌落，在28～37℃条件下，培养6～18小时后，用无菌接种环刮取少量接合菌落，稀释在无菌水中，取100微升涂布于含有庆大霉素和壮观霉素的LB平板上，在28～37℃条件下，培养24～36小时，筛选得到抗庆大霉素的单交换突变株；

(5)将所述单交换突变株稀释涂布于含有10％蔗糖的LB培养基上，在28～37℃条件下，培养36～48小时，从中筛选得到敲除的基因工程菌株。

优选地，步骤一中，所述致病性相关基因/基因簇包括：exsA(编码Ⅲ型分泌系统全局转录激活因子ExsA)、toxA(编码外毒素A)、adhesin(编码黏附素)、pilA-D和pilG-K基因簇(编码菌毛生物合成相关蛋白)或氢氰酸(HCN)生物合成基因簇。

优选地，步骤二中，所述申嗪霉素代谢基因包括phzM、phzS或phzH。

优选地，步骤三中，所述分支酸代谢相关基因包括trpE、pabB或pch基因簇。

优选地，所述基因exsA的两对引物如序列exsA-FOR-1和exsA-REV-1、exsA-FOR-2和exsA-REV-2所示；基因toxA的两对引物如序列toxA-FOR-1和toxA-REV-1、toxA-FOR-2和toxA-REV-2所示；基因adhesin的两对引物如序列adh-FOR-1和adh-REV-1、adh-FOR-2和adh-REV-2所示；基因pilA-D的两对引物如序列如pilAD-FOR-1和pilAD-REV-1、pilAD-FOR-2和pilAD-REV-2所示；基因pilG-K的两对引物如序列如pilGK-FOR-1和pilGK-REV-1、pilGK-FOR-2和pilGK-REV-2所示；基因HCN的两对引物如序列如hcn-FOR-1和hcn-REV-1、hcn-FOR-2和hcn-REV-2所示。

优选地，所述基因phzM的两对引物如序列如phzM-FOR-1和phzM-REV-1、phzM-FOR-2和phzM-REV-2所示；所述基因phzS的两对引物如序列phzS-FOR-1和phzS-REV-1、phzS-FOR-2和phzS-REV-2所示；所述基因phzH的两对引物如序列phzH-FOR-1和phzH-REV-1、phzH-FOR-2和phzH-REV-2所示；所述基因trpE的两对引物如序列trpE-FOR-1和trpE-REV-1、trpE-FOR-2和trpE-REV-2所示；所述基因pabB的两对引物如序列pabB-FOR-1和pabB-REV-1、pabB-FOR-2和pabB-REV-2所示；所述基因pch的两对引物如序列pch-FOR-1和pch-REV-1、pch-FOR-2和pch-REV-2所示。

优选地，步骤四中，所述芳香族氨基酸生物合成相关蛋白具体指PheA；所述点突变具体指将蛋白PheA的第323位氨基酸色氨酸突变为亮氨酸；通过点突变可以降低该蛋白的生物活性。

优选地，步骤五中，所述生物活性较低的基因为革兰氏阳性菌结核分枝杆菌的分支 酸丙酮酸裂解酶编码基因rv2949c。

优选地，步骤六中，所述基因组整合载体具体指mini-Tn7T-Gm-phzC，所述强启动子具体指P_tac；步骤七、八中，所述强启动子为P_1UTR。

本发明所涉及敲除基因、基因簇或特定DNA序列包括：毒性相关基因exsA、toxA、adhesin、pilA-D基因簇、pilG-K基因簇和HCN生物合成基因簇；申嗪霉素代谢相关基因phzM、phzS和phzH；分支酸代谢相关基因trpE、pabB和pch基因簇的敲除均可通过上述步骤1到5完成，不同之处在于使用引物为为扩增所述基因或基因簇两段侧翼序列设计(详见表2)；在工程菌株PA1201Δ 6中，致病性相关基因/基因簇exsA、toxA、adhesin、pilA-D基因簇、pilG-K基因簇和HCN生物合成基因簇均被敲除；在工程菌株PA1201MSHΔ 6中，申嗪霉素代谢相关基因phzM、phzS和phzH和致病性相关基因/基因簇exsA、toxA、adhesin、pilA-D基因簇、pilG-K基因簇和HCN生物合成基因簇均被敲除；在工程菌株中PA1201MSHΔ 9中，分支酸代谢相关基因trpE、pabB和pch基因簇，申嗪霉素代谢相关基因phzM、phzS和phzH和致病性相关基因/基因簇exsA、toxA、adhesin、pilA-D基因簇、pilG-K基因簇和HCN生物合成基因簇均被敲除。进一步的，上述致病性相关基因exsA、toxA、adhesin、pilA-D基因簇、pilG-K基因簇和HCN生物合成基因簇，申嗪霉素代谢相关基因phzM、phzS和phzH，以及分支酸代谢相关基因trpE、pabB和pch基因簇的基因敲除部分可以是全基因完整序列，也可以是上述基因的部分序列。

优选地，所述生产申嗪霉素的基因工程菌株的构建方法中，基因或启动子置换的方法包括如下：

(1)根据需要置换基因/启动子的DNA序列，每个基因/启动子设计引物两对，以铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)PA1201基因组DNA为模板，利用高保真聚合酶KOD-plus-neo扩增该基因/启动子两段侧翼序列(flanking sequences)；其中，扩增上游侧翼序列需使用引物r(上游片段)-FOR-1和引物r(上游片段)-REV-1，扩增下游侧翼序列需使用引物r(下游片段)-FOR-3和引物r(下游片段)-REV-3；

(2)根据需扩增基因/启动子的DNA序列，设计1对引物，以包含目标序列菌株基因组DNA或质粒为模板，利用高保真聚合酶KOD-plus-neo，扩增目标基因/启动子序列；

(3)利用引物r(上游片段)-FOR-1和引物r(下游片段)-REV-3，以上述3个PCR片段为模板，利用高保真聚合酶KOD-plus-neo扩增三片段融合片段；

(4)自杀质粒pEX18Gm和所述基因置换三融合片段经限制性内切酶双酶切后，将三融合片段插入到自杀质粒pEX18Gm，构建重组自杀质粒，用于基因或启动子置换；

(5)通过双亲杂交法，将上述构建重组自杀质粒转化至PA1201衍生菌株中：用无菌接种环，在LB平板上充分混合PA1201衍生菌株与含有重组自杀质粒的大肠杆菌S17-1菌株的菌落，在28～37℃条件下，培养6～18小时后，用无菌接种环刮取少量接合菌落，稀释在无菌水中，取100微升涂布于含有庆大霉素和壮观霉素的LB平板上，在28～37℃条件下，培养24～36小时，筛选得到抗庆大霉素的单交换突变株；

(6)将单交换突变株稀释涂布于含有10％蔗糖的LB培养基上，在28～37℃条件下，培养36～48小时，从中筛选得到基因/启动子置换后的工程菌株。

优选地，所述需置换基因/启动子包括：aroG基因(编码DAHP合酶AroG)启动子、申嗪霉素生物合成基因簇phzA2-G2启动子、mexGHI-opmD基因簇(编码申嗪霉素外排泵MexGHI-OpmD)启动子，和ubiC基因(编码分支酸丙酮酸裂解酶UbiC)。

优选地，所述用于替换上述基因/启动子的替代基因/启动子包括：P_tac强启动子、去除了phzA1-G1基因簇启动子上转录抑制区域5’-UTR的强启动子P_1UTR,和来源于革兰氏阳性菌结核分枝杆菌的分支酸丙酮酸裂解酶基因rv2949c。

优选地，所述用于置换aroG基因启动子的三对引物如序列r2020-FOR-1和r2020-REV-1、raroG-FOR-3和raroG-REV-3、rPtac-FOR-2和rPtac-REV-2；所示phzA2-G2基因簇启动子的两对引物如序列rqscR-FOR-1和rqscR-REV-1、rphzA2-FOR-3和rphzA2-REV-3、rUTR(A2)-FOR-2和rUTR-REV-2；mexGHI-opmD基因簇启动子的两对引物如序列r0733-FOR-1和r0733-REV-1、rmexG-FOR-3和rmexG-REV-3、rUTR(mexG)-FOR-2和rUTR-REV-2所示；ubiC基因的两对引物如序列如rglcC-FOR-1和rglcC-REV-1、rubiA-FOR-3和rubiA-FOR-3、rrv2949c-FOR-2和rrv2949c-REV-2所示。

本发明所涉及基因、启动子或特定DNA序列包括：DAHP合酶编码基因aroG启动子、申嗪霉素生物合成基因簇phzA2-G2启动子、申嗪霉素外排泵基因簇mexGHI-opmD启动子，和分支酸代谢相关基因ubiC的置换均可通过上述步骤1到6完成，不同之处在于使用引物为为扩增所述基因或启动子两段侧翼序列设计(详见表2)；在工程菌株PA1201MSHΔ 9pheA(W323L)Rv2949c中，DAHP合酶编码基因aroG启动子被置换为强启动P_tac；在工程菌株中PA-IΔ UTR中，申嗪霉素生物合成基因簇phzA2-G2启动子被置换为强启动子P_1UTR；在工程菌株PA-Ⅱ中mexGHI-opmD基因簇的启动子为强启动子P_1UTR；在工程菌株PA1201MSHΔ 9pheA(W323L)中，分支酸代谢相关基因ubiC被置换为来源于革兰氏阳性菌结核分枝杆菌的基因rv2949c；

第三方面，本发明提供一种所述生产申嗪霉素的基因工程菌株在制备生物农药申嗪霉素中的用途。

第四方面，本发明提供一种用所述基因工程菌株生产申嗪霉素的方法，所述方法包括如下步骤：

A、将所述基因工程菌株PA-Ⅲ接种于LB平板上，在25～37℃下活化生长18～28小时，然后挑取单克隆接种于LB培养液中，于25～30℃、转速为180～220转/分条件下震荡培养16～24小时，得种子液；

B、将所述种子液以1～5％的体积百分比接种于放大培养基中，于25～30℃、180～220转/分条件下放大发酵培养72～80小时，即得含有申嗪霉素的发酵液；

C、向所述发酵液中加入适量盐酸溶液，调整pH至3.0～4.0，再加入氯仿对发酵液中的吩嗪类物质进行萃取；静置，取下层氯仿萃取液，在35～45℃下将萃取液旋转蒸干，得申嗪霉素萃取液；其中，申嗪霉素的含量通过高效液相色谱分析测定。

优选地，步骤A中，所述LB培养液的制备包括：取去离子水1升、胰蛋白胨10克、酵母提取物5克、氯化钠10克，混合，pH调节为7.0～7.4，121摄氏度高压灭菌15分钟后，即得。

优选地，步骤B中，所述放大培养基选自黄豆粉发酵培养基或PPM发酵培养基；

所述黄豆粉发酵培养液的制备具体为：取去离子水978毫升、黄豆粉65克、玉米浆16克、葡萄糖12克，混合，pH调节为6.8～7.2，121摄氏度高压灭菌15分钟后，再加入无水乙醇22毫升，即得；

所述PPM发酵培养液的制备具体为：取去离子水1升、胰蛋白胨22克、葡萄糖20克、硝酸钾5克，混合，pH调节为7.2～7.6，121摄氏度高压灭菌15分钟后，即得。

本发明所涉基因工程菌株在黄豆粉发酵培养基中申嗪霉素产量为6.6～7.4克/升发酵液；在PPM发酵培养基中申嗪霉素产量为3.5～4.0克/升发酵液。

优选地，步骤C中，所述盐酸溶液的浓度为6M。

优选地，步骤C中，所述氯仿加入的量为发酵液体积的3倍。

优选地，步骤C中，所述高效液相色谱具体为：液相色谱柱为C18分析柱；流动相为5mM乙酸铵水溶液：乙腈(40:60，v/v)；流量为0.7ml/min；检测波长为252nm；进样量为2μL；出峰时间为1.9min。

优选地，步骤C中，所述申嗪霉素的含量通过高效液相色谱分析测定具体为：根据已知浓度的申嗪霉素标准样品通过上述方法测定的出峰峰面积，可得申嗪霉素含量的线性回归方程：申嗪霉素含量(毫克/升发酵液)＝(实测峰面积-23.283)/68.281 (R²＝0.99986)；根据回归方程，可计算出未知发酵液萃取液中申嗪霉素的含量。

本发明的目的在于针对现有菌株存在的缺陷，提供一种安全性能优越并超高产申嗪霉素的工程菌株PA-Ⅲ，在保证使用安全的前提下，大幅降低申嗪霉素的生产成本。

致病性相关基因的敲除：利用基因敲除方法，对拮抗菌株PA1201中致病性相关基因/基因簇进行敲除，包括：exsA(编码Ⅲ型分泌系统全局转录激活因子ExsA)、toxA(编码外毒素A)、adhesin(编码黏附素)、pilA-D和pilG-K基因簇(编码菌毛生物合成相关蛋白)，以及氢氰酸(HCN)生物合成基因簇，得到工程菌株PA1201Δ 6。该工程菌株PA1201Δ 6对小鼠巨噬细胞系RAW264.7和果蝇的细胞毒性较原菌株PA1201显著下降，但申嗪霉素的产量在PPM发酵培养基中或黄豆粉发酵培养基中不受上述致病性相关基因敲除影响，保持在0.8克/升发酵液左右。

申嗪霉素代谢基因的敲除：在铜绿假单胞菌中，申嗪霉素不是吩嗪生物合成途径的最终产物，PA1201基因组上包含3个申嗪霉素修饰基因phzM、phzS和phzH，可在胞内将申嗪霉素进一步转化为下游代谢产物(图1)，包括吩嗪-1-酰胺和绿脓菌素，其中绿脓菌素是一种致病因子，具有细胞毒性。为了阻断申嗪霉素在胞内向下游产物的转化(“节流”)，我们在致病性相关基因敲除菌株PA1201Δ 6的基础上，敲除了申嗪霉素代谢基因phzM、phzS和phzH，得到工程菌株PA1201MSHΔ 6，该菌株在PPM发酵培养基中申嗪霉素产量较原始菌株提高135％。

分支酸代谢相关基因的敲除、改造与替换：在铜绿假单胞菌PA1201中，申嗪霉素的生物合成前体为分支酸。分支酸是莽草酸途径的终产物，也是微生物代谢途径的一个重要分叉点。菌株PA1201除了可以利用分支酸合成申嗪霉素以外，还包含至少5个可利用分支酸的代谢途径来合成叶酸、芳香族氨基酸、螯铁蛋白和辅酶Q(图1)。为了阻止分支酸向除了申嗪霉素以外的代谢产物(“节流”)，我们在工程菌株PA1201MSHΔ 6的基础上，分别单独敲除了分支酸代谢相关基因trpE、pabB和pch基因簇(图1)；并利用点突变法将芳香族氨基酸生物合成途径中负责将分支酸转化为酪氨酸和苯丙氨酸合成前体预苯酸的关键蛋白PheA的第323位氨基酸色氨酸突变为亮氨酸，降低了PheA的生物活性；再利用基因置换法，将辅酶Q生物合成途径中负责编码分支酸丙酮酸裂解酶基因ubiC替换为来源于革兰氏阳性菌结核分枝杆菌的分支酸丙酮酸裂解酶基因rv2949c，基因rv2949c编码的分支酸丙酮酸裂解酶的生物活性较低；通过上述方法所得工程菌株在发酵培养基中的生长不受影响，但是申嗪霉素的产量较PA1201MSHΔ 6菌株均有一定程度的提高(表1)。随后，在工程菌株PA1201MSHΔ6的基础上对上述所有分支酸代谢基因/基 因簇相应地进行了敲除(基因trpE、pabB和pch基因簇)、点突变(pheA)和置换(ubiC)，所得工程菌株PA1201MSHΔ 9pheA(W323L)Rv2949c由分支酸转化为申嗪霉素转化效率得到大幅提高，在PPM发酵培养基中申嗪霉素的产量较PA1201MSHΔ 6提高175％。

表1

增强DAHP合酶PhzC和AroG的表达水平：在铜绿假单胞菌PA1201中，3-脱氧阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸(DAHP)合酶在申嗪霉素生物合成过程中至关重要，该酶负责在莽草酸途径中将4-磷酸赤藓糖和磷酸烯醇式丙酮酸转化为DAHP，控制体内碳源代谢流流向莽草酸(申嗪霉素生物合成前体)合成途径。PA1201基因组包含多个DAHP合酶编码基因，包括由位于2个申嗪霉素合成基因簇中的phzC1和phzC2基因编码的II型DAHP合酶(PhzC)，以及由aroG编码的I型DAHP合酶(AroG)。为了提高申嗪霉素合成前体水平(“开源”)来促进申嗪霉素的合成，我们利用基因组整合质粒mini-Tn7T-Gm在工程菌株PA1201MSHΔ 9pheA(W323L)Rv2949c基因组上过表达phzC基因，并通过启动子置换方法，增强aroG基因的表达水平，所得工程菌株PA-I在PPM发酵培养基中的申嗪霉素产量较PA1201MSHΔ 9pheA(W323L)Rv2949c菌株提高69％。

增强申嗪霉素生物合成基因簇phzA1-G1和phzA2-G2表达水平：申嗪霉素的生物合成依赖于两个高度同源的申嗪霉素合成基因簇：phzA1-phzG1和phzA2-phzG2。其中phzA1-phzG1基因簇启动子上存在一个转录抑制区域(5’-UTR)，大幅影响了该基因簇的转录水平，从而影响了申嗪霉素的产量。我们在工程菌株PA-I的基础上，敲除该转录抑制区域(5’-UTR)，将phzA1-phzG1基因簇启动子改造为一个强启动子P_1UTR来促进该基因簇的表达，得到工程菌株PA-IΔ UTR。随后，又在菌株PA-IΔ UTR的基础上，将第二个申嗪霉素合成基因簇phzA2-G2的启动子置换为上述构建启动子P_1UTR，改造后所得工程菌株PA-Ⅱ的两个申嗪霉素合成基因簇的表达都由该强启动子控制，菌株PA-Ⅱ的申嗪霉素产量在PPM发酵培养基中较PA-I菌株提高252％。

增强申嗪霉素外排泵MexGHI-OpmD的表达水平：由mexGHI-opmD基因簇编码的申嗪霉素外排泵MexGHI-OpmD负责将申嗪霉素从胞内排放到胞外，提高申嗪霉素向体外排放的速度有利于进一步提高申嗪霉素产量。因此，我们利用启动子置换法，在工程菌株PA-Ⅱ的基础上，将mexGHI-opmD的启动子置换为前述强启动子P_1UTR，所得工程菌株PA-Ⅲ的申 嗪霉素发酵效价在PPM发酵培养基中较PA-Ⅱ菌株提高21％，达到3.7克/升发酵液；并且工程菌株PA-Ⅲ在黄豆粉发酵培养基中申嗪霉素的发酵效价可达7.2克/升发酵液，是原始菌株PA1201的9倍之多。

表2.本发明菌株PA-Ⅲ构建中使用的引物序列

表中引物序列中：下划线部分为酶切位点(其中，SEQ ID No.87和88为氨基酸突变位点)，小写字母为侧翼下游扩增序列5’端18个碱基序列，该序列是侧翼上游扩增序列3’端18个碱基序列(一般为18碱基序列)的反向互补序列(重叠部分)。所述引物委托上海生工生物工程有限公司合成。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

(1)由于水稻根际拮抗菌PA1201与临床分离条件致病菌铜绿假单胞菌同源性高，因而被鉴定为铜绿假单胞菌。临床铜绿假单胞菌为机会性致病菌，能产生多种毒力因子，侵染人体，因此，若在工业生产中大规模使用菌株PA1201，将有造成人体感染的潜在风险。针对这个问题，我们系统分析了铜绿假单胞菌主要致病因子，再运用基因工程手段，全面敲除PA1201基因组中与毒性相关基因/基因簇，工程菌株PA-Ⅲ的细菌黏附系统和Ⅲ型分泌系统被破坏，不能产生致病性Ⅲ型分泌效应子；也不能产生具有细胞毒性副产物氢氰酸、外毒素A和绿脓菌素；因此，与野生型相比，对小鼠巨噬细胞RAW264.7的细胞毒性显著降低，在果蝇感染模型中，喂食了工程菌株PA-Ⅲ的黑腹果蝇的存活时间显著优于喂食了野生型菌株果蝇。由此可见，该工程菌株PA-Ⅲ相比野生型菌株PA1201，对动物的毒性显著降低，菌株的安全性得到大幅提升，有利于工业化大规模生产。

(2)利用菌株PA1201发酵申嗪霉素，其发酵效价仅能达到0.8克/升发酵液，发酵成本高，缺乏市场竞争力。为了提高申嗪霉素的发酵效价，我们本着“开源节流”的指导方针，对菌株PA1201中申嗪霉素的生物合成、代谢途径以及生物合成调控机理展开了全局性的分析，并在此基础上，对菌株PA1201进行了一系列的基因敲除、改造和置换， 分别从基因表达水平、蛋白质生物活性水平和碳源代谢流水平全面提升该菌株的申嗪霉素发酵效价，降低了生产成本，增加了该生物农药的市场竞争力。

首先，由于申嗪霉素不是假单胞菌吩嗪合成的最终产物，申嗪霉素在细菌体内可被进一步代谢为其衍生物，从而降低申嗪霉素的产量。通过全面敲除申嗪霉素代谢基因phzM、phzS和phzH，截断了体内申嗪霉素向绿脓菌素和吩嗪-1-酰胺转化的途径，所得工程菌株不再产生具有细胞毒性的化合物绿脓菌素，在提高菌株安全性的基础上显著增加了申嗪霉素的产量和纯度；

其次，前期申嗪霉素工程菌株的构建方法是通过质粒pME6032加强申嗪霉素生物合成基因簇在假单胞菌中的表达水平(专利名称：利用工程菌株M18G携带质粒pME6032Phz生产吩嗪-1-羧酸的方法(专利CN200910198664.2))，并未对申嗪霉素合成前体分支酸的生物合成途径进行分析和改造。申嗪霉素的生物合成前体是假单胞菌主要代谢途径莽草酸途径的最终产物分支酸。分支酸是微生物代谢途径的一个重要分叉点。假单胞菌可以通过不同分支酸代谢途径合成申嗪霉素、叶酸、芳香族氨基酸、螯铁蛋白和辅酶Q等代谢产物(图1)。因此，本发明首次将菌株改造靶标定位在分支酸代谢与生物合成途径上，通过以下四种方法：1)系统敲除分支酸代谢相关基因trpE、pabB和pch基因簇，2)定点突变法芳香族氨基酸生物合成途径中关键蛋白PheA中第323位氨基酸，3)将辅酶Q生物合成途径中负责编码分支酸丙酮酸裂解酶基因ubiC替换为来源于革兰氏阳性菌结核分枝杆菌且生物活性较低的分支酸丙酮酸裂解酶基因rv2949c，和4)增强编码负责控制体内碳源代谢流向莽草酸合成途径的DAHP合酶PhzC和AroG的表达水平，在不影响工程菌株生长的前提下，实现了对申嗪霉素合成前体分支酸的代谢途径的重新排列，截断或降低了分支酸流向其他副产物的途径，在大幅增加体内分支酸水平的同时，促进分支酸高效流向申嗪霉素生物合成代谢通路，从而显著提高申嗪霉素的产量。

最后，经过多轮基因改造，包括敲除申嗪霉素生物合成基因簇phzA1-phzG1转录抑制区域(5’-UTR)和phzA2-G2启动子改造、申嗪霉素外排基因启动子改造，进一步提高了申请霉素生物合成基因及其外排泵编码基因的表达水平，得到了低毒超高产申嗪霉素的工程菌株PA-Ⅲ，该菌株在黄豆粉发酵培养液中申嗪霉素的发酵效价可达7克/升以上，是原始菌株PA1201申嗪霉素产量的7～9倍，并优于现有申嗪霉素高产菌株(专利名称：利用工程菌株M18G携带质粒pME6032Phz生产吩嗪-1-羧酸的方法(专利CN200910198664.2))。

(3)本发明工程菌株PA-Ⅲ的改造全部发生在PA1201基因组上，因此，本发明菌株PA-Ⅲ未携带需要抗生素维持的质粒表达系统，在生产过程中，可不依赖于抗生素的添加来稳定发酵生产申嗪霉素，因此显著降低申嗪霉素工业化生产成本。

综上所述，本发明高产基因工程菌株PA-Ⅲ在黄豆粉发酵培养液中，能安全、经济、超高产绿色微生物农药申嗪霉素，因而可利用本发明菌株制备申嗪霉素，用于大规模防治植物病害。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为本发明所依据的机理图；

图2为本发明菌株在黄豆粉培养液中的生长曲线和申嗪霉素产生曲线；

图3为本发明所涉工程菌株及其比较菌株的相对细胞系RAW264.7细胞毒性测试结果图；

图4为本发明所涉工程菌株及其比较菌株的果蝇存活率测试结果图；

图5为pabB基因上下游侧翼序列扩增片段的检测图；

其中，M：DL10,000DNA分子量标准品，1：pabB上游侧翼序列，2：pabB下游侧翼序列；

图6为pabB基因融合片段的检测图；

其中，M：DL10,000DNA分子量标准品，1：pabB融合片段；

图7为pabB基因敲除突变体PCR验证图；

其中，M：DL10,000DNA分子量标准品，1：以pEX18Gm-pabB为模板，2：以Δ pabB突变体基因组DNA为模板，3：以野生型PA1201菌株的基因组DNA为模板；

图8为在基因组上插入P_tac-phzC基因融合片段的工作原理示意图；

图9为工程菌株中庆大霉素抗性基因被去除的PCR验证图；

其中，M:DL10,000DNA分子量标准品，1:以基因组整合重组质粒mini-Tn7-Ptac-phzC为模版(阳性对照)，2和3:以phzC插入工程菌株基因组DNA为模版；

图10为P_tac-phzC插入工程菌株的PCR验证图；

其中，M:DL10,000DNA分子量标准品，1:以野生型PA1201基因组DNA为模版，2和3:以Ptac-phzC插入工程菌株PA1201MSHΔ 9pheA(W323L)Rv2949c(Ptac-phzC)基因 组DNA为模版；

图11为aroG和aroG的上游侧翼序列和P_tac启动子序列构成的三融合片段的检测图；

其中，M：DL10,000DNA分子量标准品，1：三融合片段；

图12为aroG启动子置换为强启动自P_tac的工程菌株PA-I的PCR验证图；

其中，M:DL10,000DNA分子量标准品，1:以pEX-Ptac-aroG质粒为模版(阳性对照)，2:以工程菌株PA-I基因组DNA为模版，3:以PA1201基因组DNA为模版

图13为5’-UTR上下游侧翼序列扩增检测图；

其中，M：DL10,000DNA分子量标准品，1：5’-UTR上游侧翼序列，2：5’-UTR:下游侧翼序列；

图14为5’-UTR上下游侧翼序列融合片段的检测图；

其中，M：DL10,000DNA分子量标准品，1：5’-UTR融合片段；

图15为5’-UTR敲除验证图；

其中，M：DL10,000DNA分子量标准品，1：以pEX-5-UTR质粒为模板(阳性对照)，2：以工程菌PA-ⅠΔ UTR基因组DNA为模板，3：以PA1201基因组DNA为模板；

图16为qscR和phzA2基因的部分序列和P_1UTR强启动子序列构成的三融合片段的检测图；

其中，M：DL10,000DNA分子量标准品，1：三融合片段；

图17为phzA2-G2启动子置换为强启动子P_1UTR的工程菌株PA-Ⅱ的PCR验证图；

其中，M：DL10,000DNA分子量标准品，1：以pEX-P1UTR-phzA2质粒为模板(阳性对照)，2：以工程菌株PA-Ⅱ基因组DNA为模板，3：以PA1201基因组DNA为模板；

图18为mexGHI-opmD启动子上下游侧翼片段和P_1UTR强启动子序列构成的三融合片段的检测图；

其中，M：DL10,000DNA分子量标准品，1：三融合片段；

图19为mexGHI-opmD启动子置换为强启动子P_1UTR的工程菌株PA-Ⅲ的PCR验证图；

其中，M：DL10,000DNA分子量标准品，1：以pEX-P_1UTR-mexG质粒为模板(阳性对照)，2：以工程菌株PA-Ⅲ基因组DNA为模板，3：以PA1201基因组DNA为模板；

图20为ubiC基因上下游侧翼片段和rv2949c基因序列构成的三融合片段的检测图；

其中，M：DL10,000DNA分子量标准品，1：三融合片段；

图21为ubiC基因置换为rv2949c的工程菌株PA1201MSHΔ 9pheA(W323L)Rv2949c的PCR验证图；

其中，M：DL10,000DNA分子量标准品，1：pEX-rv2939c(ubiC)质粒为模板(阳性对照)，2：以工程菌株PA1201MSHΔ 9pheA(W323L)Rv2949c基因组DNA为模板，3：以PA1201基因组DNA为模板；

图22为pheA基因片段的检测图；

其中，M：DL10,000DNA分子量标准品，1：pheA基因DNA片段；

图23为pUC-pheA(W323L)双酶切验证图；

其中，M：DL10,000DNA分子量标准品，1：pUC-pheA(W323L)(Bam HI and HindⅢ)。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

实施例1

本实施例涉及敲除pabB基因，包括如下步骤：

1.构建重组自杀质粒pEX-pabB:

1.1 设计两对引物(pabB-FOR-1和pabB-REV-1、pabB-FOR-2和pabB-REV-2)，分别扩增基因pabB的上下游侧翼序列，引物的核苷酸序列如表2中SEQ ID No.37和SEQ IDNo.38、SEQ ID No.39和SEQ ID No.40所示。

1.2 以菌株PA1201基因组DNA为模板，利用高保真聚合酶KOD-plus-neo和设计的引物，扩增基因pabB的两段侧翼序列，PCR产物通过0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，并且通过AxyPrep凝胶回收试剂盒回收两个侧翼片段，长度分别为466bp和907bp(图5)。

1.3 以上述两个侧翼片段为模板，以pabB-FOR-1和pabB-REV-2为引物，利用高保真聚合酶KOD-plus-neo扩增融合片段，长度为1355bp，产物通过0.8％琼脂糖凝胶电泳检测(图6)，并且通过AxyPrep凝胶回收试剂盒回收。

1.4 pabB基因敲除融合片段用限制性内切酶Hind III、Xba I酶切回收后，与同样双酶切的自杀载体pEX18Gm混合，并通过T4DNA连接酶过夜连接。

1.5 连接后将连接产物转化至E.coli DH5α感受态细胞，并涂布于LB庆大霉素琼脂培养基上，37℃恒温培养18小时后，对转化子进行PCR验证。验证正确的转化子提取质粒后测序验证，得到重组自杀质粒pEX-pabB。

2.构建PA1201Δ pabB工程菌株中：

2.1 将测序正确的重组自杀质粒pEX-pabB转化至大肠杆菌S17-1感受态细胞，并涂布于LB庆大霉素琼脂培养基上，37℃恒温培养18小时后，得到含有pEX-pabB大肠杆菌S17-1单菌落。

2.2 将含有重组自杀质粒pEX-pabB的大肠杆菌S17-1在LB庆大霉素琼脂培养基上划线过夜培养；同时将PA1201野生型菌株在LB培养基上划线过夜培养。

2.3 用无菌接种环从上述平板上刮取少量重组自杀质粒pEX-pabB的大肠杆菌S17-1和PA1201菌落，在LB平板上充分混合后，在28～37℃条件下，培养6～18小时。

2.4 用无菌接种环刮取少量接合菌落，重悬在1毫升无菌水中。

2.5 稀释在无菌水中，取100微升涂布于含有庆大霉素和壮观霉素的LB平板上，在28～37℃条件下，培养24～36小时，筛选得到抗庆大霉素的单交换突变株。

2.6将上述单交换突变株用无菌水配置成菌悬液，取100微升涂布于含有10％蔗糖的LB琼脂培养基上，在28～37℃条件下，培养36～48小时。

2.7筛选在含有庆大霉素的LB培养基上不生长，但在含有壮观霉素的LB培养基上生长的单克隆菌落。

2.8利用引物pabB-FOR-1和pabB-REV-2对转化子进行基因组PCR，筛选和验证pabB敲除突变体，pabB基因敲除工程菌株的PCR扩增片段长度为1355bp，未敲除pabB基因菌株的PCR扩增片段长度为2549bp(图7)。

实施例2

本实施例通过构建基因组整合载体mini-Tn7T-Gm-phzC，在PA1201及其衍生工程菌株的基因组的attTn7位点上插入phzC全基因序列来增加phzC的表达拷贝数和表达水平(图8)，具体包括以下步骤：

1.构建基因组整合载体mini-Tn7T-Gm-phzC

1.1 设计一对引物(iphzC-FOR和iphzC-REV)，以铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)PA1201基因组DNA为模板，利用高保真聚合酶KOD-plus-neo扩增phzC基因的编码序列。所获得PCR产物通过0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，再利用AxyPrep凝胶回收试剂盒回收该片段，长度为1640bp。所述引物的核苷酸序列如表2中SEQ ID No.53和SEQ ID No.54所示。

1.2 设计一对引物(iptac-FOR和iptac-REV)，以pME6032质粒DNA为模板，利用高保真聚合酶KOD-plus-neo扩增P_tac启动子序列；所获得PCR产物通过3.0％琼脂糖凝胶电泳检测，再利用AxyPrep凝胶回收试剂盒回收该片段，长度为95bp。所述引物的核苷酸序列如表2中SEQ ID No.55和SEQ ID No.56所示。

1.3 以上述两段PCR扩增序列为模板，以iptac-FOR和iphzC-REV为引物，利用高保真聚合酶KOD-plus-neo扩增P_tac-phzC基因融合片段，长度为1717bp，所获得PCR产物通过0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，再利用AxyPrep凝胶回收试剂盒回收该片段

1.4 将上述融合片段用限制性内切酶HindⅢ、Kpn I酶切回后，与同样双酶切的mini-Tn7T-Gm混合，并通过T4DNA连接酶过夜连接。连接后，将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，并涂布于含有庆大霉素的LB培养基上，37℃恒温培养18小时后，对转化子进行PCR验证。验证正确的转化子提取质粒后测序验证，得到基因组整合重组质粒mini-Tn7-P_tac-phzC，用于在工程菌株PA1201MSHΔ 11的基因组上插入phzC基因；

2.构建工程菌株PA1201MSHΔ 9pheA(W323L)Rv2949c(P_tac-phzC)

2.1 设置电转化电压2.5kV，通过电转化法将重组质粒协助质粒pTNS2(编码转座酶)和基因组整合重组质粒mini-Tn7-P_tac-phzC转化至工程菌株PA1201MSHΔ 9pheA(W323L)Rv2949c感受态细胞，涂布于含有羧卞霉素的LB培养基上，在28～37℃条件下，培养36小时后，在含有庆大霉素的LB培养基上筛选得到抗庆大霉素并含有P_tac-phzC插入片段的插入转化子；

2.2 设置电转化电压2.5kV，将辅助质粒pFLP2(用于去除庆大霉素抗性基因)电转化至上述插入工程菌株的感受态细胞中，并涂布于含有羧卞霉素的LB培养基上，在28～37℃条件下，培养36小时，筛选得到去除庆大霉素抗性基因但含有P_tac-phzC插入片段的插入突变体，通过特异扩增庆大霉素抗性基因的引物Gm-FOR和Gm-Rev验证抗性基因的去除(图9)，未扩增出庆大霉素抗性基因片段说明基因组上庆大霉素抗性基因被去除。引物的核苷酸序列如表2中SEQ ID No.57和SEQ ID No.58所示。

2.3 将上述插入突变体制成菌悬液，取少量涂布于含有10％蔗糖的LB培养基上，在28～37℃条件下，培养36小时，筛选得到去除辅助质粒pFLP2的P_tac-phzC插入工程菌株；

2.4 利用引物glmS-FOR和glmS-REV，通过基因组PCR，筛选和验证P_tac-phzC插入工程菌株PA1201MSHΔ 9pheA(W323L)Rv2949c(P_tac-phzC)，含有P_tac-phzC插入片段菌株的PCR扩增片段长度为2052bp,无上述插入片度菌株的PCR扩增片段长度为335bp(图10)。引物的核苷酸序列如表2中SEQ ID No.59和SEQ ID No.60所示。

进一步的，所述phzC基因片段可以是完整的phzC基因也可以是phzC基因的一部分。本发明所述的phzC基因片段应至少包含phzC基因的完整编码区。

进一步的，所述phzC基因来源来源于铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，具体可选自铜绿假单胞菌菌株PA1201、PAO1、LESB58、PA14、M18、PUPa3。

进一步的，所述phzC来源于铜绿假单胞菌菌株PA1201。如实施例所列举的，其氨基酸序列为SEQ ID NO.89:

进一步的，所述phzC基因片段来源于铜绿假单胞菌菌株PA1201。如实施例所列举的，其碱基序列为SEQ ID NO.90:

实施例3

本实施例将PA1201衍生工程菌株PA1201MSHΔ 9pheA(W323L)Rv2949c(P_tac-phzC)基因组上的aroG基因启动子置换为P_tac强启动子的方法，具体包括如下步骤：

1.构建重组自杀质粒pEX-P_tac-aroG

1.1 设计2对引物(r2020-FOR-1、r2020-REV-1和raroG-FOR-3、raroG-REV-3)，以铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)PA1201基因组DNA为模板，利用高保真聚合酶KOD-plus-neo扩增aroG和aroG的上游侧翼序列，PCR产物通过0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，并且通过AxyPrep凝胶回收试剂盒回收两个侧翼片段，长度分别为680bp和640bp。引物的核苷酸序列如表2中SEQ ID No.61和SEQ ID No.62、SEQ ID No.63和SEQ ID No.64所示。

1.2 设计1对引物(rPtac-FOR-2和rPtac-REV-2)，以pME6032质粒DNA为模板，利用高保真聚合酶KOD-plus-neo，扩增P_tac启动子序列，PCR产物通过3.0％琼脂糖凝胶电泳检测，并且通过AxyPrep凝胶回收试剂盒回收，长度为113bp。引物的核苷酸序列如表2中SEQID No.65和SEQ ID No.66所示。

1.3 以r2020-FOR-1和raroG-REV-3为引物，以上述3个PCR扩增片段为模板，利用高保真聚合酶KOD-plus-neo扩增三片段融合片段，长度为1397bp，产物通过0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，并且通过AxyPrep凝胶回收试剂盒回收(图11)。

1.4 上述三片段融合片段经限制性内切酶EcoR I、Hind III酶切回收后，与同样双酶切的自杀载体pEX18Gm混合，并通过T4DNA连接酶过夜连接。连接后将连接产物转化至E.coli DH5α感受态细胞，并涂布于含有庆大霉素的LB琼脂培养基上，37℃恒温培养18小时后，对转化子进行PCR验证。验证正确的转化子提取质粒后测序验证，得到重组自杀质粒pEX-P_tac-aroG。再将该测序正确的重组自杀质粒pEX-P_tac-aroG转化至E.coli S17-1感受态细胞，并涂布于LB庆大霉素琼脂培养基上，37℃恒温培养18小时后，得到含有重组自杀质粒pEX-P_tac-aroG的S17-1大肠杆菌单菌落，用于将aroG基因自身启动子置换为P_tac强启动子。

2.构建工程菌株PA-I

2.1 通过双亲杂交法，将上述构建重组自杀质粒pEX-P_tac-aroG转化至PA1201衍生工程菌株PA1201MSHΔ 9pheA(W323L)Rv2949c(P_tac-phzC)基因组上：用无菌接种环，在LB平板上充分混合PA1201MSHΔ 9pheA(W323L)Rv2949c(P_tac-phzC)与含有重组自杀质粒pEX-P_tac-aroG的大肠杆菌S17-1菌株的菌落，在28～37℃条件下，培养6～18小时后，用 无菌接种环刮取少量接合菌落，稀释在无菌水中，取100微升涂布于含有庆大霉素和壮观霉素的LB平板上，在28～37℃条件下，培养24～36小时，筛选得到抗庆大霉素的单交换突变株；

2.2 将上述单交换突变株用无菌水配置成菌悬液后，取少许涂布于含有10％蔗糖的LB培养基上，在28～37℃条件下，培养36～48小时，筛选在含有庆大霉素的LB培养基上不生长，但在含有壮观霉素的LB培养基上生长的单克隆菌落；

2.3 利用引物rPtac-FOR-2和raroG-FOR-3，通过基因组PCR，筛选和验证aroG启动子置换为Ptac强启动子的工程菌株PA-I。aroG启动子置换为P_tac的菌株PCR扩增片段长度为735bp，启动子未置换的菌株不可得到扩增片段(图12)。

进一步的，所述强启动子P_tac来源于pME6032质粒。如实施例所列举的，其碱基序列为SEQ ID NO.91:

CGGTTCTGGC AAATATTCTG AAATGAGCTG TTGACAATTA ATCATCGGCT CGTATAATGT GTGGAATTGTGAGCGGATAA CAATTTCACA CAGGA

下划线序列是P_tac启动子的核心序列。

实施例4

本实施例涉及申嗪霉素合成基因簇phzA1-G1启动子上转录抑制区域5’-UTR的敲除方法，具体包括下列步骤：

1.构建重组自杀质粒pEX-5-UTR

1.1 设计两对引物(UTR-FOR-1、UTR-REV-1、UTR-FOR-2和UTR-REV-2)，以PA1201基因组DNA为模板，利用高保真聚合酶KOD-plus-neo扩增分别扩增phz1基因簇启动子中5’-UTR的上下游侧翼序列，PCR产物通过0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，并且通过AxyPrep凝胶回收试剂盒回收两个侧翼片段，长度分别为500bp和658bp(图13)。所涉及引物的核苷酸序列如表2中SEQ ID No.49和SEQ ID No.50、SEQ ID No.51和SEQ ID No.52所示。

1.2 以上述两个侧翼片段为模板，以UTR-FOR-1和UTR-REV-2为引物，利用高保真聚合酶KOD-plus-neo扩增融合片段，长度为1140bp，产物通过0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，并且通过AxyPrep凝胶回收试剂盒回收(图14)。

1.3 上述5’-UTR敲除融合片段经限制性内切酶EcoR I、HindⅢ酶切回收后，与同样双酶切的自杀载体pEX18Gm混合，并通过T4DNA连接酶过夜连接。连接后将连接产物转化至E.coli DH5α感受态细胞，并涂布于含有庆大霉素的LB琼脂培养基上，37℃恒温 培养18小时后，对转化子进行PCR验证。验证正确的转化子提取质粒后测序验证，得到重组自杀质粒pEX-5-UTR。再将该测序正确的重组自杀质粒pEX-5-UTR转化至E.coli S17-1感受态细胞，并涂布于LB庆大霉素琼脂培养基上，37℃恒温培养18小时后，得到含有重组自杀质粒pEX-5-UTR的S17-1大肠杆菌单菌落，用于5’-UTR敲除。

2.构建phzA1-G1启动子上转录抑制区域5’-UTR的敲除工程菌株PA-IΔ UTR

2.1 通过双亲杂交法，将上述构建重组自杀质粒pEX-5-UTR转化至PA1201衍生工程菌株PA-I中：用无菌接种环，在LB平板上充分混合PA-I与含有重组自杀质粒pEX-5-UTR的大肠杆菌S17-1菌株的菌落，在28～37℃条件下，培养6～18小时后，用无菌接种环刮取少量接合菌落，稀释在无菌水中，取100微升涂布于含有庆大霉素和壮观霉素的LB平板上，在28～37℃条件下，培养24～36小时，筛选得到抗庆大霉素的单交换突变株；

2.2 将上述单交换突变株用无菌水配置成菌悬液后，取少许涂布于含有10％蔗糖的LB培养基上，在28～37℃条件下，培养36～48小时，筛选在含有庆大霉素的LB培养基上不生长，但在含有壮观霉素的LB培养基上生长的单克隆菌落；

2.3 利用引物UTR-FOR-1和UTR-REV-2，通过基因组PCR，筛选和验证phzA1-G1启动子上转录抑制区域5’-UTR被敲除的工程菌株PA-IΔ UTR。5’-UTR区域敲除工程菌株基的扩增片段长度为1140bp，未敲除5’-UTR区域菌株的扩增片段长度为1445bp(图15)。工程菌中phzA1-G1基因簇启动子被改造成缺失转录抑制区域的强启动子P_1UTR。

实施例5

本实施例将PA1201衍生工程菌株PA-IΔ UTR基因组上的phzA2-G2基因簇的启动子置换为前述强启动子P_1UTR的方法，包括下列步骤：

1.构建重组自杀质粒pEX-P_1UTR-phzA2

1.1 设计2对引物(rqscR-FOR-1、rqscR-REV-1和rphzA2-FOR-3、rphzA2-REV-3)，以铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)PA1201基因组DNA为模板，利用高保真聚合酶KOD-plus-neo扩增qscR和phzA2基因的部分序列，PCR产物通过0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，并且通过AxyPrep凝胶回收试剂盒回收两个侧翼片段，长度分别为360bp和372bp。引物的核苷酸序列如表2中SEQ ID No.67和SEQ ID No.68、SEQ ID No.69和SEQ ID No.70所示。

1.2 设计1对引物(rUTR(A2)-FOR-2和rUTR-REV-2)，以工程菌株PA-IΔ UTR基因组为模板，利用高保真聚合酶KOD-plus-neo，扩增P_1UTR强启动子序列，PCR产物通过1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，并且通过AxyPrep凝胶回收试剂盒回收，长度为383bp。引物的核苷酸序列如表2中SEQ ID No.71和SEQ ID No.72所示。

1.3 以rqscR-FOR-1和rphzA2-REV-3为引物，以上述3个PCR片段为模板，利用高保真聚合酶KOD-plus-neo扩增三片段融合片段，长度为1079bp，产物通过0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，并且通过AxyPrep凝胶回收试剂盒回收(图16)。

1.4 上述三片段融合片段经限制性内切酶EcoR I、HindⅢ酶切回收后，与同样双酶切的自杀载体pEX18Gm混合，并通过T4DNA连接酶过夜连接。连接后将连接产物转化至E.coli DH5α感受态细胞，并涂布于含有庆大霉素的LB琼脂培养基上，37℃恒温培养18小时后，对转化子进行PCR验证。验证正确的转化子提取质粒后测序验证，得到重组自杀质粒pEX-P_1UTR-phzA2。再将该测序正确的重组自杀质粒pEX-P_1UTR-phzA2转化至E.coli S17-1感受态细胞，并涂布于LB庆大霉素琼脂培养基上，37℃恒温培养18小时后，得到含有重组自杀质粒pEX-P_1UTR-phzA2的S17-1大肠杆菌单菌落，用于将phzA2-G2基因簇自身启动子置换为P_1UTR强启动子。

2.构建工程菌株PA-Ⅱ

2.1 通过双亲杂交法，将上述构建重组自杀质粒pEX-P_1UTR-phzA2转化至PA1201衍生工程菌株PA-IΔ UTR基因组上：用无菌接种环，在LB平板上充分混合PA-IΔ UTR与含有重组自杀质粒pEX-P_1UTR–phzA2的大肠杆菌S17-1菌株的菌落，在28～37℃条件下，培养6～18小时后，用无菌接种环刮取少量接合菌落，稀释在无菌水中，取100微升涂布于含有庆大霉素和壮观霉素的LB平板上，在28～37℃条件下，培养24～36小时，筛选得到抗庆大霉素的单交换突变株。

2.2 将上述单交换突变株用无菌水配置成菌悬液后，取少许涂布于含有10％蔗糖的LB培养基上，在28～37℃条件下，培养36～48小时，筛选在含有庆大霉素的LB培养基上不生长，但在含有壮观霉素的LB培养基上生长的单克隆菌落；

2.3 利用引物rUTR(A2)-FOR-2和rphzA2-REV-3，通过基因组PCR，筛选和验证phzA2-G2启动子置换为P_1UTR强启动子的工程菌株PA-Ⅱ。phzA2-G2启动子置换为P_1UTR的菌株PCR扩增片段长度为737bp,启动子未置换的菌株不可得到扩增片段(图17)

进一步的，所述强启动子P_1UTR来源于工程菌株PA-IΔ UTR。如实施例所列举的，其碱基序列为SEQ ID NO.92:

实施例6

本实施例涉及将PA1201衍生工程菌株PA-Ⅱ基因组上的编码申嗪霉素外排系统基因簇mexGHI-opmD的启动子置换为通过前述步骤敲除了phz1基因簇启动子中转录抑制区域(5’-UTR)后的P_1UTR强启动子的方法，方法包括下列步骤：

1.构建重组自杀质粒pEX-P_1UTR-mexG

1.1 设计2对引物(r0733-FOR-1、r0733-REV-1和rmexGH-FOR-3、rmexGH-REV-3)，以铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)PA1201基因组DNA为模板，利用高保真聚合酶KOD-plus-neo扩增mexGHI-opmD启动子上下游侧翼片段，PCR产物通过0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，并且通过AxyPrep凝胶回收试剂盒回收两个侧翼片段，长度分别为566bp和578bp。引物的核苷酸序列如表中SEQ ID No.73和SEQ ID No.74、SEQ ID No.75和SEQ ID No.76所示。

1.2 设计1对引物(rUTR(mexG)-FOR-2和rUTR-REV-2)，以工程菌株PA-IΔ UTR基因组为模板，利用高保真聚合酶KOD-plus-neo，扩增P_1UTR强启动子序列，PCR产物通过3.0％琼脂糖凝胶电泳检测，并且通过AxyPrep凝胶回收试剂盒回收，长度为383bp。引物的核苷酸序列如表2中SEQ ID No.77和SEQ ID No.78所示。

1.3 以r0733-FOR-1和rmexG-REV-3为引物，以上述3个PCR片段为模板，利用高保真聚合酶KOD-plus-neo扩增三片段融合片段，长度为1491bp，产物通过0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，并且通过AxyPrep凝胶回收试剂盒回收(图18)。

1.4 上述三片段融合片段经限制性内切酶EcoR I、HindⅢ酶切回收后，与同样双酶切的自杀载体pEX18Gm混合，并通过T4DNA连接酶过夜连接。连接后将连接产物转化至E.coli DH5α感受态细胞，并涂布于含有庆大霉素的LB琼脂培养基上，37℃恒温培养18小时后，对转化子进行PCR验证。验证正确的转化子提取质粒后测序验证，得到重组自杀质粒pEX-P_1UTR-mexG。再将该测序正确的重组自杀质粒pEX-P_1UTR-mexG转化至E.coli S17-1感受态细胞，并涂布于LB庆大霉素琼脂培养基上，37℃恒温培养18小时后，得到含有重组自杀质粒pEX-P_1UTR–mexG的S17-1大肠杆菌单菌落，用于将phzA2-G2基因簇自身启动子置换为P_1UTR强启动子。

2.构建工程菌株PA-Ⅲ

2.1 通过双亲杂交法，将上述构建重组自杀质粒pEX-P_1UTR-mexG转化至PA1201衍生工程菌株PA-Ⅱ基因组上：用无菌接种环，在LB平板上充分混合PA-Ⅱ与含有重组自杀质粒pEX-P_1UTR-mexG的大肠杆菌S17-1菌株的菌落，在28～37℃条件下，培养6～18小时后，用无菌接种环刮取少量接合菌落，稀释在无菌水中，取100微升涂布于含有庆大霉素和壮观霉素的LB平板上，在28～37℃条件下，培养24～36小时，筛选得到抗庆大霉素的单交换突变株。

2.2 将上述单交换突变株用无菌水配置成菌悬液后，取少许涂布于含有10％蔗糖的LB培养基上，在28～37℃条件下，培养36～48小时，筛选在含有庆大霉素的LB培养基上不生长，但在含有壮观霉素的LB培养基上生长的单克隆菌落。

2.3 利用引物rUTR(mexG)-FOR-2和rmexG-REV-3，通过基因组PCR，筛选和验证mexGHI-opmD的启动子置换为P_IUTR强启动子的工程菌株PA-Ⅲ。mexGHI-opmD启动子置换为P_IUTR的菌株PCR扩增片段长度为943bp，启动子未置换的菌株不可得到扩增片段(图19)

实施例7

本实施例将PA1201衍生工程菌株PA1201MSHΔ 9pheA(W323L)基因组上的ubiC基因置换为来源于革兰氏阳性菌结核分枝杆菌的rv2949c基因的方法，包括下列步骤：

1.构建重组自杀质粒pEX-rv2939c(ubiC)

1.1 设计2对引物(rglcC-FOR-1、rglcC-REV-1和rubiA-FOR-3、rubiA-REV-3)，以铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)PA1201基因组DNA为模板，利用高保真聚合酶KOD-plus-neo扩增ubiC上下游侧翼片段，PCR产物通过0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，并且通过AxyPrep凝胶回收试剂盒回收两个侧翼片段，长度分别为502bp和455bp。引物的核苷酸序列如表2中SEQ ID No.79和SEQ ID No.80、SEQ ID No.81和SEQ ID No.82所示。

1.2 设计1对引物(rrv2949c-FOR-2和rrv2949c-REV-2)，以结核分枝杆菌基因组为模板，利用高保真聚合酶KOD-plus-neo，扩增rv2949c基因序列，PCR产物通过0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，并且通过AxyPrep凝胶回收试剂盒回收，长度为618bp。引物的核苷酸序列如表2中SEQ ID No.83和SEQ ID No.84所示。

1.3 以rglcC-FOR-1和rubiA-REV-3为引物，以上述3个PCR片段为模板，利用高保真聚合酶KOD-plus-neo扩增三片段融合片段，长度为1539bp，产物通过0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，并且通过AxyPrep凝胶回收试剂盒回收(图20)。

1.4 上述三片段融合片段经限制性内切酶HindⅢ、BamH I酶切回收后，与同样双酶切的自杀载体pEX18Gm混合，并通过T4DNA连接酶过夜连接。连接后将连接产物转化至E.coli DH5α感受态细胞，并涂布于含有庆大霉素的LB琼脂培养基上，37℃恒温培养18小时后，对转化子进行PCR验证。验证正确的转化子提取质粒后测序验证，得到重组自杀质粒pEX-rv2939c(ubiC)。再将该测序正确的重组自杀质粒pEX-rv2939c(ubiC)转化至E.coliS17-1感受态细胞，并涂布于LB庆大霉素琼脂培养基上，37℃恒温培养18小时后，得到含有重组自杀质粒pEX-rv2939c(ubiC)的S17-1大肠杆菌单菌落，用于将ubiC基因置换为rv2949c。

2.构建工程菌株PA1201MSHΔ 9pheA(W323L)Rv2949c

2.1 通过双亲杂交法，将上述构建重组自杀质粒pEX-rv2939c(ubiC)转化至PA1201衍生工程菌株PA1201MSHΔ 9pheA(W323L)基因组上：用无菌接种环，在LB平板上充分混合PA1201MSHΔ 9pheA(W323L)与含有重组自杀质粒pEX-rv2939c(ubiC)的大肠杆菌S17-1菌株的菌落，在28～37℃条件下，培养6～18小时后，用无菌接种环刮取少量接合菌落，稀释在无菌水中，取100微升涂布于含有庆大霉素和壮观霉素的LB平板上，在28～37℃条件下，培养24～36小时，筛选得到抗庆大霉素的单交换突变株。

2.2 将上述单交换突变株用无菌水配置成菌悬液后，取少许涂布于含有10％蔗糖的LB培养基上，在28～37℃条件下，培养36～48小时，筛选在含有庆大霉素的LB培养基上不生长，但在含有壮观霉素的LB培养基上生长的单克隆菌落；

2.3 利用引物rrv2949c-FOR-2和rrv2949c-REV-2，通过基因组PCR，筛选和验证ubiC基因置换为rv2949c的工程菌株PA1201MSHΔ 9pheA(W323L)Rv2949c。ubiC基因置换为rv2949c的菌株PCR扩增片段长度为618bp，启动子未置换的菌株不可得到扩增片段(图21)。

进一步的，所述rv2949c基因来源于结核分枝杆菌Mt103。如实施例所列举的，其氨基酸序列为SEQ ID NO.93:

进一步的，所述rv2949c基因来源于结核分枝杆菌Mt103。如实施例所列举的，其碱基序列为SEQ ID NO.94:

实施例8

本实施例将PA1201衍生工程菌株PA1201MSHΔ 9中由pheA基因编码的PheA蛋白中第323位氨基酸色氨酸突变为亮氨酸pheA(W323L)的方法，包括下列步骤：

1.构建包含pheA基因的载体pUC-pheA

1.1 设计1对引物(pheA-FOR和pheA-REV)，以铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)PA1201基因组DNA为模板，利用高保真聚合酶KOD-plus-neo扩增pheA基因，PCR产物通过0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，并且通过AxyPrep凝胶回收试剂盒回收扩增片段，长度为1098bp(图22)。引物的核苷酸序列如表2中SEQ ID No.85和SEQ ID No.86所示。

引物中的下划线为限制性酶切位点Bam HI、HindⅢ的酶切位点。该引物委托上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 上述PCR扩增片段经限制性内切酶Bam HI、HindⅢ酶切回收后，与同样双酶切的自杀载体pUC18混合，并通过T4DNA连接酶过夜连接。连接后将连接产物转化至E.coliDH5α感受态细胞，并涂布于含有氨苄青霉素的LB琼脂培养基上，37℃恒温培养18小时后，对转化子进行PCR验证。验证正确的转化子提取质粒后测序验证，得到重组质粒pUC-pheA。

2.在上述载体pUC-pheA基础上突变PheA第323位氨基酸，构建自杀载体pEX-pheA(W323L)

2.1 设计1对引物(pheA-W323L-FOR和pheA-W323L-REV)，上述构建载体pUC-pheA为模板，利用高保真聚合酶KOD-plus-neo扩增载体，PCR产物通过0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，并且通过AxyPrep凝胶回收试剂盒回收扩增片段，长度为3784bp。引物的核苷酸序列如表2中SEQ ID No.87和SEQ ID No.88所示。

引物中的下划线为phzA基因突变位点。该引物委托上海生工生物工程有限公司合成。

2.2 通过限制性内切酶Dpn I酶切处理上述PCR扩增片段，去除PCR产物中残留的模板DNA(质粒载体pUC-pheA)。回收酶切过的PCR产物后，将PCR产物转化至E.coli DH5α感受态细胞，并涂布于含有氨苄青霉素的LB琼脂培养基上，37℃恒温培养18小时后，对转化子进行PCR验证。验证正确的转化子提取质粒后测序验证，得到PheA蛋白第323位氨基酸色氨酸突变为亮氨酸的重组质粒pUC-pheA(W323L)。

2.3 利用限制性内切酶Bam HI、HindⅢ消化上述构建重组质粒pUC-pheA(W323L)后，将含有突变位点的phzA片段(1098bp)再经凝胶回收试剂盒纯化回收(图23)，与同样双酶切的自杀载体pEX18Gm混合，并通过T4DNA连接酶过夜连接。连接后将连接产物转化至E.coli DH5α感受态细胞，并涂布于含有庆大霉素的LB琼脂培养基上，37℃恒温培养18小时后，对转化子进行PCR验证。验证正确的转化子提取质粒后测序验证，得到重组自杀质粒pEX-pheA(W323L)。再将该测序正确的重组自杀质粒pEX-pheA(W323L)转化至E.coliS17-1感受态细胞，并涂布于LB庆大霉素琼脂培养基上，37℃恒温培养18小时后，得到含有重组自杀质粒pEX-pheA(W323L)的S17-1大肠杆菌单菌落，用于将PheA蛋白中第323位氨基酸色氨酸突变为亮氨酸pheA(W323L)。

3.构建工程菌株PA1201MSHΔ 9pheA(W323L)

3.1 通过双亲杂交法，将上述构建重组自杀质粒pEX-pheA(W323L)转化至PA1201衍生工程菌株PA1201MSHΔ 9基因组上：用无菌接种环，在LB平板上充分混合PA1201MSHΔ9与含有重组自杀质粒pEX-pheA(W323L)的大肠杆菌S17-1菌株的菌落，在28～37℃条件下，培养6～18小时后，用无菌接种环刮取少量接合菌落，稀释在无菌水中，取100微升涂布于含有庆大霉素和壮观霉素的LB平板上，在28～37℃条件下，培养24～36小时，筛选得到抗庆大霉素的单交换突变株。

3.2 将上述单交换突变株用无菌水配置成菌悬液后，取少许涂布于含有10％蔗糖的LB培养基上，在28～37℃条件下，培养36～48小时，筛选在含有庆大霉素的LB培养基上不生长，但在含有壮观霉素的LB培养基上生长的单克隆菌落；

3.3 利用引物pheA-FOR和pheA-REV和高保真聚合酶KOD-plus-neo，通过基因组PCR，通过凝胶回收纯化PCR片段后，对片段进行测序。选取pheA基因第968位碱基G突变为T的克隆，即为PheA蛋白中第323位氨基酸色氨酸突变为亮氨酸pheA(W323L)的克隆。

工程菌株PA1201MSHΔ 9pheA(W323L)与野生型pheA基因比对结果：

上述DNA序列定向插入质粒，感受态大肠杆菌的制备、转化以及重组质粒的提取和验证分别按照J.萨姆布鲁克、D.W.拉萨尔编著，2002年科学出版社出版的《分子克隆实验指南(第三版)》，第1章第68～71页和第96～99页及第8章第663～666页中所述方法进行。其中，自杀质粒pEX18Gm由上海交通大学生命科学技术学院提供。限制性内切酶和连接酶均购于上海皓嘉科技发展有限公司。大肠杆菌中重组质粒的提取采用由上海捷瑞生物工程有限公司提供的质粒小量制备试剂盒(离心柱型)，产品目录号：GK2002-100。高保真聚合酶KOD-plus-neo购于上海硕盟生物科技有限公司，产品目录号：KOD-201。DNA片段回收纯化采用AxyPrep凝胶回收试剂盒，产品目录号：AP-GX-50，购于上海正晃商贸有限公司。DNA凝胶电泳所用分子量标准品购于宝生物工程(大连)有限公司DL10，000DNA分子量标准品，产品目录号：3584A。

实施例9、细胞毒性和致病性测试

在完成前述系列工程菌株构建后，通过使用罗氏公司的细胞毒性检测试剂盒(Cytotoxicity Detection Kit(LDH)；货号：11644793001)，检测野生型菌株PA1201、致病性相关基因敲除工程菌株PA1201Δ 6、及本发明申嗪霉素超高产菌株PA-Ⅲ对小鼠巨噬细胞系RAW264.7的细胞毒性：当感染复数为50时，PA1201野生型菌株与细胞系RAW264.7共培养5小时后，RAW264.7细胞的死亡率62.3％，但本发明工程菌株PA-Ⅲ与PA1201Δ 6在与RAW264.7细胞共培养后，细胞死亡率分别仅为7.2％和16.5％，与感染大肠杆菌DH5α后RAW264.7细胞的死亡率5.2％相当；然而，相同条件下临床铜绿假单胞菌菌株PAO1侵染RAW264.7细胞后导致RAW264.7细胞大量死亡，死亡率高达95.0％(图2)。由此可见，敲除了致病性相关基因toxA、adhesin、pilA-D基因簇、pilG-K基因簇和HCN生物合成基因簇后，工程菌株PA-Ⅲ和PA1201Δ 6的细胞毒性显著下降。

用野生型菌株PA1201、致病性相关基因敲除工程菌株PA1201Δ 6、本发明申嗪霉素超高产菌株PA-Ⅲ和大肠杆菌DH5α分别喂食黑腹果蝇，记录并比较喂食后果蝇的存活时间。结果表明：喂食了PA1201果蝇在喂食后第4天开始死亡，并于第9天全部死亡；饲喂工程菌株PA1201Δ 6的果蝇在喂食后第7天开始死亡，在第11天后保持存活率20％；喂食申嗪霉素超高产菌株PA-Ⅲ的果蝇在喂食后第9天开始死亡，在第11天后保持存活率55％，该结果与喂食大肠杆菌DH5α的果蝇接近(图3)。由此可见，敲除了致病性相关基因toxA、adhesin、pilA-D基因簇、pilG-K基因簇和HCN生物合成基因簇后以及绿脓菌素合成相关基因phzM和phzS的申嗪霉素超高产工程菌株PA-Ⅲ对果蝇的毒性较出 发菌株PA1201显著下降。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (5)

1.一株生产申嗪霉素的基因工程菌株，其特征在于，所述基因工程菌株为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)CCTCC NO：M 2015040。

2.一种根据权利要求1所述生产申嗪霉素的基因工程菌株的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括如下步骤：

步骤一、敲除野生菌株PA1201中致病性相关基因/基因簇，得工程菌株PA1201Δ 6；

步骤二、敲除所述工程菌株PA1201Δ 6中申嗪霉素代谢基因，得工程菌株PA1201MSHΔ6；

步骤三、敲除所述工程菌株PA1201MSHΔ 6中分支酸代谢相关基因，得工程菌株PA1201MSHΔ 9；

步骤四、通过点突变法，将所述工程菌株PA1201MSHΔ 9中芳香族氨基酸生物合成相关蛋白进行突变，得到工程菌株PA1201MSHΔ 9pheA(W323L)；

步骤五、将所述工程菌株PA1201MSHΔ 9pheA(W323L)的辅酶Q生物合成途径中分支酸丙酮酸裂解酶编码基因ubiC替换为生物活性较低的基因，得到工程菌株PA1201MSHΔ9pheA(W323L)Rv2949c；

步骤六、利用基因组整合载体将在强启动子控制下的phzC基因整合入所述工程菌株PA1201MSHΔ 9pheA(W323L)Rv2949c的基因组，并将基因组上aroG基因的启动子置换为强启动子，得工程菌株PA-I；

步骤七、敲除所述工程菌株PA-I中申嗪霉素合成基因簇phzA1-phzG1上转录抑制区域(5’-UTR)，得到工程菌株PA-IΔUTR；将所述工程菌株PA-IΔUTR中申嗪霉素合成基因簇phzA2-G2的启动子置换为强启动子，得工程菌株PA-Ⅱ；

步骤八、将所述工程菌株PA-Ⅱ中mexGHI-opmD基因簇启动子置换为强启动子，即得所述生产申嗪霉素的基因工程菌株铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)CCTCC M2015040，即基因工程菌株PA-Ⅲ；

步骤一中，所述致病性相关基因/基因簇包括包括：exsA、toxA、adhesin、pilA-D和pilG-K基因簇和氢氰酸生物合成基因簇hcn；

步骤二中，所述申嗪霉素代谢基因包括phzM、phzS和phzH；

步骤三中，所述分支酸代谢相关基因包括trpE、pabB和pch基因簇；

步骤四中，所述芳香族氨基酸生物合成相关蛋白具体指PheA；所述点突变具体指将蛋白PheA的第323位氨基酸色氨酸突变为亮氨酸；

步骤五中，所述生物活性较低的基因为革兰氏阳性菌结核分枝杆菌的分支酸丙酮酸裂解酶编码基因rv2949c；

步骤六中，所述基因组整合载体具体指mini-Tn7T-Gm-phzC，所述强启动子具体指P_tac；

步骤七、八中，所述强启动子为P_1UTR。

3.一种根据权利要求1所述生产申嗪霉素的基因工程菌株在制备生物农药中的用途。

4.一种用权利要求1所述基因工程菌株生产申嗪霉素的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

A、将基因工程菌株接种于LB平板上，在25～37℃下活化生长18～28小时，然后挑取单克隆接种于LB培养液中，于25～30℃、转速为180～220转/分条件下震荡培养16～24小时，得种子液；

B、将所述种子液以1～5％的体积百分比接种于放大培养基中，于25～30℃、180～220转/分条件下放大发酵培养72～80小时，即得含有申嗪霉素的发酵液；

C、向所述发酵液中加入适量盐酸溶液，调整pH至3.0～4.0，再加入氯仿对发酵液中的吩嗪类物质进行萃取；静置，取下层氯仿萃取液，在35～45℃下将萃取液旋转蒸干，得申嗪霉素萃取液。

5.根据权利要求4所述的用所述基因工程菌株生产申嗪霉素的方法，其特征在于，步骤B中，所述放大培养基选自黄豆粉发酵培养基或PPM发酵培养基；步骤C中，所述盐酸溶液的浓度为6M；所述氯仿加入的量为发酵液体积的3倍。