CN107267568A - 利用spoT基因缺失菌株通过发酵生产L‑氨基酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用spoT基因缺失菌株通过发酵生产L‑氨基酸的方法,通过在培养基中培养属于肠杆菌科,并具有L‑氨基酸生产能力的细菌,该细菌于培养前进行修饰,使得spoT基因缺失,并从细菌的培养基或细胞收集L‑氨基酸,来生产L‑氨基酸。本发明通过一些列的试验验证,spoT基因的缺失,其功能或者其相关序列的缺失,对于L‑氨基酸发酵有利,有助于氨基酸产量和转化率的提升。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域,特别涉及一种通过发酵生产L-氨基酸的方法。
背景技术
在工业上,目前L-氨基酸的生产方法主要为生物发酵法,即通过具有L-氨基酸生产能力的各种微生物的发酵来生产L-氨基酸,因此具有L-氨基酸生产能力菌株的获得是L氨基酸生产方法的核心。目前获得L氨基酸生产菌株的方法主要有两种,一种是通过对野生型微生物(野生型菌株)进行诱变的方法,使其具有营养缺陷,并使其对某些代谢物产生拮抗作用,从而获得优良的工业生产菌株。
近年来随着基因工程技术的发展,重组DNA技术已经开始普遍应用于微生物代谢工程改造方面,使其成为另外一种重要的获得L-氨基酸生产菌株的方法。比如,通过提高目标产品合成途径中关键酶的表达,来达到提高微生物L-氨基酸生产能力(CN1305002A);再比如,通过提高目标产品的分泌蛋白的表达,来达到提高微生物L-氨基酸生产能力(CN1260393A);或者,通过降低某些基因的表达,来达到提高微生物L-氨基酸生产能力(CN1607246A);在或者,通过敲除某些基因,使其失活,来达到提高微生物L-氨基酸生产能力(CN1466630A)。
spoT的表达产物是一个双功能酶,具有水解酶和合成酶的活性,其是水解活性在ppGpp的降解过程中发挥了重要的作用。其在细胞脂肪酸合成受限,或者磷源缺失,或者离子受限的情况下,会发挥合成酶的活性。同时,SpoT对于pppGpp也具有水解酶活性和合成酶活性。目前,虽然对其的调控机制研究较多,但其对于L-氨基酸合成是否有影响还没有相关的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用spoT基因缺失菌株通过发酵生产L-氨基酸的方法,以提高L-氨基酸产量和转化率。
为实现上述目的,本发明采用的技术方案为:
一种利用spoT基因缺失菌株通过发酵生产L-氨基酸的方法,通过在培养基中培养属于肠杆菌科,并具有L-氨基酸生产能力的细菌,该细菌于培养前进行了修饰,使得spoT基因缺失,并从细菌的培养基或细胞收集L-氨基酸,来生产L-氨基酸。
进一步的,采用spoT基因缺失的菌株ATCC21151ΔspoT,通过发酵的方法生产得到L-苏氨酸。
所述spoT基因缺失的菌株ATCC21151ΔspoT通过下述方法构建得到:
首先,制备菌株ATCC21151的感受态细胞;利用质粒pKD46进行转化,获得ATCC21151/pKD46菌株;然后,利用基因片段spoTknock1转化ATCC21151/pKD46菌株的感受态细胞,获得的转化子利用引物spoT1-F/spoT1-R进行验证,验证正确的菌株命名为ATCC21151ΔspoT::SacBCm;最后,利用基因片段spoTknock2转化ATCC21151ΔspoT::SacBCm菌株的感受态细胞,获得的转化子利用引物spoT2-F/spoT2-R进行验证,验证正确的菌株命名为ATCC21151ΔspoT,至此L-苏氨酸生产所用的菌株spoT基因缺失的菌株ATCC21151ΔspoT构建完毕。
进一步的,采用spoT基因缺失的菌株MG1655/pwsk-lysC*-dapA*ΔspoT,通过发酵的方法生产得到L-赖氨酸。
所述spoT基因缺失的菌株MG1655/pwsk-lysC*-dapA*ΔspoT通过下述方法构建得到:
首先,制备菌株MG1655/pwsk-lysC*-dapA*的感受态细胞;利用质粒pKD46进行转化,获得MG1655/pwsk-lysC*-dapA*(pKD46)菌株;然后,利用基因片段spoTknock2转化MG1655/pwsk-lysC*-dapA*(pKD46)菌株的感受态细胞,获得的转化子利用引物spoT2-F/spoT2-R进行验证,验证正确的菌株命名为MG1655/pwsk-lysC*-dapA*ΔspoT::SacBCm;最后,利用基因片段spoTknock2转化MG1655/pwsk-lysC*-dapA*ΔspoT::SacBCm菌株的感受态细胞,获得的转化子利用引物spoT2-F/spoT2-R进行验证,验证正确的菌株命名为MG1655/pwsk-lysC*-dapA*ΔspoT,至此L-赖氨酸生产所用的spoT基因缺失的菌株MG1655/pwsk-lysC*-dapA*ΔspoT构建完毕。
所述菌株MG1655/pwsk-lysC*-dapA*通过下述方法构建得到:
利用多片段重组的方法构建以低拷贝质粒pWSK29为出发载体,包含dapA基因表达框和lysC基因表达框的质粒pwsk-lysC-dapA;
以质粒pwsk-lysC-dapA为基础构建dapA和lysC突变体过表达质粒,得到质粒pwsk-lysC*-dapA*;
将质粒pwsk-lysC*-dapA*电转化至大肠杆菌MG1655;获得的菌株命名为MG1655/pwsk-lysC*-dapA*。
有益效果:本发明提供的方法,采用spoT基因缺失的大肠杆菌菌株,通过发酵的方法生产得到L-氨基酸,并通过一些列的试验验证,spoT基因的缺失,其功能或者其相关序列的缺失,对于L-氨基酸发酵有利,有助于氨基酸产量和转化率的的提升。
附图说明
图1为基因片段spoTknock1的构建过程示意图;
图2为基因片段spoTknock2的构建过程示意图;
图3为基因质粒pwsk-lysC-dapA的构建过程示意图。
具体实施方式
本发明实施例所用的L-苏氨酸生产菌株为大肠杆菌ATCC21151,来源于美国典型微生物菌株菌种保藏中心(ATCC)。
本发明实施例所用的L-赖氨酸生产菌株为大肠杆菌MG1655(ATCC 47076),来源于美国典型微生物菌株菌种保藏中心(ATCC)。
DNA聚合酶购自北京全式金公司的Fastpfu;限制性内切酶及DNA连接酶等均购自Fermentas公司;
酵母粉和蛋白胨购自英国Oxoid公司产品;琼脂粉和抗生素购自北京索来宝;葡萄糖、硫酸铵等常用化学试剂均购自国药。
质粒提取试剂盒和琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒均购自上海生工,多片段重组试剂盒(MultiS One Step Cloning Kit)购自南京诺唯赞生物科技有限公司,相关操作均严格按照说明书执行;XL-Ⅱ定点突变试剂盒购自天津博鑫生物科技有限公司,相关操作均严格按照说明书执行;
质粒构建测序验证和基因缺失测序工作由华大基因完成;
DH5α感受态细胞购自北京全式金公司。
LB培养基成分:酵母粉5g/L,蛋白胨10g/L,NaCl 10g/L,固体培养基中添加2%的琼脂粉。
抗生素浓度为:氨苄青霉素100ug/mL,卡那霉素30ug/mL,氯霉素15ug/ml。
L-苏氨酸和L-赖氨酸检测方法:通过安捷伦液相仪,利用ZORBAX Eclipse AAA(氨基酸分析)色谱柱对发酵液中的L-赖氨酸和L-苏氨酸进行分析,相关操作均严格按照说明书执行。
葡萄糖分析方法采用山东科学院生产的SBA-40D生物传感分析仪进行检测。
实施例1 spoT敲除片段的构建
大肠杆菌基因敲除采用经典的Red重组方法,因此需要有进行重组的基因片段。相关基因片段构建方法如下:
首先,根据NCBI公布的大肠杆菌MG1655的基因组序列设计引物spoTup1-F/spoTup1-R和spoTdown1-F/spoTdown1-R,见表1,以大肠杆菌MG1655基因组为模板PCR扩增得到spoT基因上下游个600-700bp的同源臂基因片段,序列如序列表中SEQ ID NO.19及SEQID NO.20所示,PCR扩增参数为98℃2min;98℃20s,67℃20s,72℃30s,循环30次,72℃延伸10min;根据质粒ploi4162基因序列,设计引物SacBCm-F/SacBCm-R,见表1,以质粒ploi4162为模板,PCR扩增氯霉素(Cm)和蔗糖致死基因(SacB)基因序列,PCR扩增参数为98℃2min;98℃20s,55℃20s,72℃1.5min,循环30次;根据质粒pUC18基因序列,设计引物pUC1-F/pUC1-R,见表1,扩增线性pUC18基因片段,PCR扩增参数为98℃2min;98℃20s,55℃20s,72℃1.5min,循环30次;72℃延伸10min。获得基因片段通过凝胶电泳回收。
利用MultiS One Step Cloning Kit对上述获得片段进行连接,具体方法参见试剂盒说明。构建可用于扩增敲除spoT基因的基因片段的载体,具体构建过程见图1。经华大基因公司测序正确后,质粒命名为spoT1。根据质粒spoT1基因序列,设计引物spoT1-F/spoT1-R,以质粒spoT1为模板PCR扩增第一次spoT基因敲除的基因片段spoTknock1,PCR扩增参数为98℃2min;98℃20s,58℃20s,72℃2.5min,循环30次。获得基因片段通过凝胶电泳回收,用于进行spoT基因第一轮敲除。
然后,根据NCBI公布的大肠杆菌MG1655的基因组序列设计引物spoTup2-F/spoTup2-R和spoTdown2-F/spoTdown2-R,见表1,以大肠杆菌MG1655基因组为模板PCR扩增得到spoT基因上下游各600-700bp的同源臂基因片段,序列如序列表中SEQ ID NO.19及SEQID NO.20所示,PCR扩增参数为98℃2min;98℃20s,62℃20s,72℃30s,循环30次,72℃延伸10min;根据质粒pUC18基因序列,设计引物pUC2-F/pUC2-R,见表1,扩增线性pUC18基因片段,PCR扩增参数为98℃2min;98℃20s,57℃20s,72℃1.5min,循环30次;72℃延伸10min。获得基因片段通过凝胶电泳回收。
利用MultiS One Step Cloning Kit对上述获得片段进行连接,具体方法参见试剂盒说明。构建可用于扩增敲除spoT基因的基因片段的载体,具体构建过程见图2。经华大基因公司测序正确后,质粒命名为spoT2。根据质粒spoT2基因序列,设计引物spoT2-F/spoT2-R,以质粒spoT2为模板PCR扩增第二次spoT基因敲除的基因片段spoTknock2,PCR扩增参数为98℃2min;98℃20s,55℃20s,72℃2.5min,循环30次。获得基因片段通过凝胶电泳回收,用于进行spoT基因第二轮敲除。
表1引物
名称 | 序列 |
pUC1-F | GCTGGCGAAAGTCCGGGTACCGAGCTCGAATTCG |
pUC1-R | CAATTTTGGACGGCGGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCA |
spoTup1-F | TCTAGAGGATCCCCCGCCGTCCAAAATTGAACTGG |
spoTup1-R | CGATAACTCAAAAAATACGAGGCTTTCAAACAGATACAAGGGCG |
SacBCm-F | CCCTTGTATCTGTTTGAAAGCCTCGTATTTTTTGAGTTATCGAGATTTTCAGGAGCT |
SacBCm-R | CGGATTTTGCGCATGACAGCCTGAATCAGGCATTTGAGAAGCA |
spoTdown1-F | CTGATTCAGGCTGTCATGCGCAAAATCCGCGTGATGC |
spoTdown1-R | AGCTCGGTACCCGGACTTTCGCCAGCACCGGATAGCC |
pUC2-F | GCTGGCGAAAGTCCGGGTACCGAGCTCGAATTCG |
pUC2-R | TTTTGGACGGCGGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCA |
spoTup2-F | TCTAGAGGATCCCCCGCCGTCCAAAATTGAACTGG |
spoTup2-R | GCGGATTTTGCGCATGAAGGCTTTCAAACAGATACAAGGGCG |
spoTdown2-F | TCTGTTTGAAAGCCTTCATGCGCAAAATCCGCGTGATGC |
spoTdown2-R | AGCTCGGTACCCGGACTTTCGCCAGCACCGGATAGCC |
spoT1-F | CGTCCAAAATTGAACTGG |
spoT1-R | GCCAGCACCGGATAGCC |
spoT2-F | GCAAAATCCGCGTGATGC |
spoT2-R | CGCCAGCACCGGATAGCC |
实施例2 L-赖氨酸生产菌株构建
利用大肠埃希氏菌MG1655菌株(ATCC 47076)来构建一株可以生产L-赖氨酸的菌株。具体方法如下。
1.过表达二氢吡啶二羧酸合酶(dapA)和天冬氨酸激酶III(lysC)基因质粒构建
利用多片段重组的方法构建了以低拷贝质粒pWSK29为出发载体,包含dapA基因表达框和lysC基因表达框的质粒。具体方法如下所述:
首先,根据NCBI公布的大肠杆菌MG1655的基因组序列设计引物lysC-F/lysC-R和dapA-F/dapA-F,见表2,以大肠杆菌MG1655基因组为模板PCR扩增得到带有自身启动子的dapA和lysC基因片段,序列如序列表中SEQ ID NO.22及SEQ ID NO.23所示,PCR扩增参数为98℃2min;98℃20s,65℃20s,72℃2min,循环30次;72℃延伸10min。根据质粒pWSK29基因序列,设计引物pwsk-F/pwsk-R,扩增线性pWSK29基因片段,PCR扩增参数为98℃2min;98℃20s,60℃20s,72℃3min,循环30次;72℃延伸10min。获得基因片段通过凝胶电泳回收。
然后,利用MultiS One Step Cloning Kit对上述获得片段进行连接,具体方法参见试剂盒说明。构建过表达二氢吡啶二羧酸合酶(dapA)和天冬氨酸激酶III(lysC)基因质粒pwsk-lysC-dapA,具体构建过程见图3。经华大基因公司测序正确后进行下一步试验。
2.dapA和lysC突变体过表达质粒的构建
野生型的dapA基因和lysC基因是受到L-赖氨酸的反馈抑制的,因此为了解除L-赖氨酸对其的反馈抑制,增加其在细胞内的酶活力,对其进行了点突变,以pwsk-lysC-dapA为基础构建了dapA和lysC突变体过表达质粒。具体方法如下所述。
首先,设计利用Stratagene系列XL-Ⅱ定点突变试剂盒,通过引物LysCT352I F/LysCT352I R(见表2)对质粒pwsk-lysC-dapA进行PCR引入突变位点,获得的质粒基因片段经过PCR产物回收,除去PCR体系中的酶及缓冲体系中的盐离子后,采用DpnI酶37摄氏度酶切1h除去甲基化的模板质粒DNA,处理后的质粒转入感受态细胞Tran10(购自北京全式金生物技术有限公司),经测序验证,所获得的正确突变质粒命名为pwsk-lysC*-dapA,携带的lysC突变体核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.24所示。
然后,设计利用Stratagene系列XL-Ⅱ定点突变试剂盒,通过引物dapAE84T-F/dapAE84T-R(见表2)对质粒pwsk-lysC*-dapA进行PCR引入突变位点,获得的质粒基因片段经过PCR产物回收,除去PCR体系中的酶及缓冲体系中的盐离子后,采用DpnI酶37摄氏度酶切1h除去甲基化的模板质粒DNA,处理后的质粒转入感受态细胞Tran10,经测序验证,所获得的正确突变质粒命名为pwsk-lysC*-dapA*,携带的dapA突变体核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.25所示。
3.L-赖氨酸生产菌株SHG01的构建及发酵验证
将前面构建好的质粒pwsk-lysC*-dapA*电转化至大肠杆菌MG1655;获得的菌株命名为MG1655/pwsk-lysC*-dapA*。然后,对其进行L-赖氨酸发酵能力的验证。
发酵培养基如下:葡萄糖40g/L,硫酸铵10g/L,磷酸0.6mL/L,氯化钾0.8g/L,甜菜碱0.4g/L,硫酸镁1.2g/L,硫酸锰0.03g/L,硫酸亚铁0.03g/L,玉米浆有机氮0.4g/L,5%消泡剂0.5mL/L,苏氨酸0.2g/L,氨苄青霉素50ug/mL。
利用500ml装入30mL发酵培养基的三角瓶进行发酵实验,接种2mL LB过夜培养的菌液,在37℃、200rpm条件下发酵。利用稀释的氨水控制pH 6.8,发酵32h。
菌株MG1655/pwsk-lysC*-dapA*发酵32h后,L-赖氨酸产量为4.7g/L。
表2引物
名称 | 序列 |
pwsk-F | GCTGCCTGTAGTTCTGACGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCC |
pwsk-R | GCGCTAGCGCAGGTTGCAGCACATCCCCCTTTCGC |
lysC-F | GGATGTGCTGCAACCTGCGCTAGCGCAGGCC |
lysC-R | GGAGAAGAGTTCACGTTTATTATATAAAGACGCTGGTTAACAGAGTACAGGCTCG |
dapA-F | CTCTGTTAACCAGCGTCTTTATATAATAAACGTGAACTCTTCTCCCAGC |
dapA-R | CCAGGCTTTACACTTTATGCTTCGTCAGAACTACAGGCAGCG |
LysCT352I-F | gtggcattaatccttgataccaccggttcaacctccactg |
LysCT352I-R | gtatcaaggattaatgccacgctcacttctgacgtggtga |
dapAE84T-F | CGCTAACGCTACTGCGACCGCCATTAGCCTGACG |
dapAE84T-R | CGTCAGGCTAATGGCGGTCGCAGTAGCGTTAGCG |
实施例3spoT基因缺失菌株构建
1.L-苏氨酸生产菌株ATCC21151ΔspoT基因缺失突变株构建
L-苏氨酸生产菌株ATCC21151基因敲除方法采用经典的Red重组方法,参考相关文献进行。具体操作过程如下:
首先,制备菌株ATCC21151的感受态细胞,具体感受态细胞制备和转化过程参考J.萨姆布鲁克(Sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》;利用质粒pKD46进行转化,获得ATCC21151/pKD46菌株;然后,利用基因片段spoTknock1转化ATCC21151/pKD46菌株的感受态细胞,获得的转化子利用引物spoT1-F/spoT1-R进行验证,验证正确的菌株命名为ATCC21151ΔspoT::SacBCm。最后,利用基因片段spoTknock2转化ATCC21151ΔspoT::SacBCm菌株的感受态细胞,获得的转化子利用引物spoT2-F/spoT2-R进行验证,验证正确的菌株命名为ATCC21151ΔspoT,至此L-苏氨酸生产菌株ATCC21151ΔspoT基因缺失突变株构建完毕。
2.L-赖氨酸生产菌株MG1655/pwsk-lysC*-dapA*ΔspoT基因缺失突变株构建
L-赖氨酸生产菌株MG1655/pwsk-lysC*-dapA*基因敲除方法采用经典的Red重组方法,参考相关文献进行。具体操作过程如下:
首先,制备菌株MG1655/pwsk-lysC*-dapA*的感受态细胞,具体感受态细胞制备和转化过程参考J.萨姆布鲁克(Sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》;利用质粒pKD46进行转化,获得MG1655/pwsk-lysC*-dapA*(pKD46)菌株;然后,利用基因片段spoTknock2转化MG1655/pwsk-lysC*-dapA*(pKD46)菌株的感受态细胞,获得的转化子利用引物spoT2-F/spoT2-R进行验证,验证正确的菌株命名为MG1655/pwsk-lysC*-dapA*ΔspoT::SacBCm。最后,利用基因片段spoTknock2转化MG1655/pwsk-lysC*-dapA*ΔspoT::SacBCm菌株的感受态细胞,获得的转化子利用引物spoT2-F/spoT2-R进行验证,验证正确的菌株命名为MG1655/pwsk-lysC*-dapA*ΔspoT,至此L-赖氨酸生产菌株MG1655/pwsk-lysC*-dapA*ΔspoT基因缺失突变株构建完毕。
实施例4 spoT基因缺失对L-苏氨酸发酵的影响
为了验证spoT基因缺失对于L-苏氨酸发酵的影响,利用摇瓶发酵的方法对菌株ATCC21151和菌株ATCC21151ΔspoT进行发酵验证,具体过程如下:
发酵培养基如下表3所示:
表3
将上述L-苏氨酸生产菌株单菌落分别接种5mL LB液体培养基,37℃,220rpm培养12h。按照初始OD为0.1转接装有50mL发酵培养基的500mL三角瓶,37℃,220rpm培养36h,检测L-苏氨酸的浓度。
菌株最终产量结果如表4所示,对照菌株ATCC21151中L-苏氨酸产量为5.3g/L,spoT基因缺失的菌株ATCC21151ΔspoT中L-苏氨酸产量为6.5g/L,比出发菌株提高了22.6%,表明在大肠杆菌中部分或全部缺失ppGpp水解酶和合成酶活性能够提高L-苏氨酸的产量。
表4
菌株 | L-苏氨酸g/L |
ATCC21151 | 5.3 |
ATCC21151ΔspoT | 6.5 |
实施例5spoT基因缺失对L-赖氨酸发酵的影响
为了验证spoT基因缺失对于L-赖氨酸发酵的影响,利用摇瓶发酵的方法对菌株MG1655/pwsk-lysC*-dapA*和菌株MG1655/pwsk-lysC*-dapA*ΔspoT进行发酵验证,具体过程如下:
发酵培养基如下表5所示:
表5
将上述L-赖氨酸生产菌株单菌落分别接种5mL含有100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基,37℃,220rpm培养12h。按照10%的接种量转接装有30mL发酵培养基的500mL三角瓶,37℃,220rpm培养28h,检测L-赖氨酸的浓度。
菌株最终产量结果如表6所示,对照菌株MG1655/pwsk-lysC*-dapA*中L-赖氨酸产量为4.5g/L,spoT基因缺失的菌株MG1655/pwsk-lysC*-dapA*ΔspoT中L-赖氨酸产量为5.2g/L,比出发菌株提高了19.1%,表明在大肠杆菌中部分或全部缺失ppGpp水解酶和合成酶活性能够提高L-赖氨酸的产量。
表6
菌株 | L-赖氨酸g/L |
MG1655/pwsk-lysC*-dapA* | 4.7 |
MG1655/pwsk-lysC*-dapA*ΔspoT | 5.6 |
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出:对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110>徐州工程学院
<120>利用spoT基因缺失菌株通过发酵生产L-氨基酸的方法
<130> 2017
<160> 35
<210> 1
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 人工序列的描述:引物pUC1-F
<400> 1
GCTGGCGAAAGTCCGGGTACCGAGCTCGAATTCG 34
<210> 2
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 人工序列的描述:引物pUC1-R
<400> 2
CAATTTTGGACGGCGGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCA 40
<210> 3
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 人工序列的描述:引物spoTup1-F
<400> 3
TCTAGAGGATCCCCCGCCGTCCAAAATTGAACTGG 35
<210> 4
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 人工序列的描述:引物spoTup1-R
<400>4
CGATAACTCAAAAAATACGAGGCTTTCAAACAGATACAAGGGCG 44
<210> 5
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 人工序列的描述:引物SacBCm-F
<400>5
CCCTTGTATCTGTTTGAAAGCCTCGTATTTTTTGAGTTATCGAGATTTTCAGGAGCT 57
<210> 6
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 人工序列的描述:引物SacBCm-R
<400>6
CGGATTTTGCGCATGACAGCCTGAATCAGGCATTTGAGAAGCA 43
<210> 7
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 人工序列的描述:引物spoTdown1-F
<400>7
CTGATTCAGGCTGTCATGCGCAAAATCCGCGTGATGC 37
<210> 8
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 人工序列的描述:引物spoTdown1-R
<400>8
AGCTCGGTACCCGGACTTTCGCCAGCACCGGATAGCC 37
<210> 9
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 人工序列的描述:引物pUC2-F
<400>9
GCTGGCGAAAGTCCGGGTACCGAGCTCGAATTCG 34
<210> 10
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 人工序列的描述:引物pUC2-R
<400>10
TTTTGGACGGCGGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCA 37
<210> 11
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 人工序列的描述:引物spoTup2-F
<400>11
TCTAGAGGATCCCCCGCCGTCCAAAATTGAACTGG 35
<210> 12
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 人工序列的描述:引物spoTup2-R
<400>12
GCGGATTTTGCGCATGAAGGCTTTCAAACAGATACAAGGGCG 42
<210> 13
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 人工序列的描述:引物spoTdown2-F
<400>13
TCTGTTTGAAAGCCTTCATGCGCAAAATCCGCGTGATGC 39
<210> 14
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 人工序列的描述:引物spoTdown2-R
<400>14
AGCTCGGTACCCGGACTTTCGCCAGCACCGGATAGCC 37
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 人工序列的描述:引物spoT1-F
<400>15
CGTCCAAAATTGAACTGG 18
<210> 16
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 人工序列的描述:引物spoT1-R
<400>16
GCCAGCACCGGATAGCC 17
<210> 17
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 人工序列的描述:引物spoT2-F
<400>17
GCAAAATCCGCGTGATGC 18
<210> 18
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 人工序列的描述:引物spoT2-R
<400>18
CGCCAGCACCGGATAGCC 18
<210> 19
<211> 620
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 人工序列的描述:spoT上游同源臂基因序列
<400>19
ccgccgtccaaaattgaactggaccgccgtctacgcggtcgcggtcaggacagcgaagaggtcattgcaaagcgtatggcgcaagctgttgcagaaatgagccattacgccgaatatgattatctgattgtgaatgatgacttcgataccgcgttgaccgatttgaagaccattattcgcgccgaacgtctgcgcatgagccgccaaaagcagcgtcatgacgctttaatcagcaaattgttggcagactgaacctgatttcagtatcatgcccagtcatttcttcacctgtggagctttttaagtatggcacgcgtaactgttcaggacgctgtagagaaaattggtaaccgttttgacctggtactggtcgccgcgcgtcgcgctcgtcagatgcaggtaggcggaaaggatccgctggtaccggaagaaaacgataaaaccactgtaatcgcgctgcgcgaaatcgaagaaggtctgatcaacaaccagatcctcgacgttcgcgaacgccaggaacagcaagagcaggaagccgctgaattacaagccgttaccgctattgctgaaggtcgtcgttaatcacaaagcgggtcgcccttgtatctgtttgaaagcct 620
<210> 20
<211> 659
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 人工序列的描述:spoT下游同源臂基因序列
<400>20
Tcatgcgcaaaatccgcgtgatgccagacgtgattaaagtcacccgaaaccgaaattaatgttttatgaacccaacacgttatgcacgcatctgcgaaatgctcgccaggcggcagcctgatctgaccgtctgcatggagcaggtccacaaacctcataacgtttctgcgattattcgtaccgcagatgccgttggcgtacatgaagttcacgccgtctggcctggtagccgcatgcgcaccatggcttcggcagcggcgggtagtaacagctgggtacaggtgaaaacacaccgcaccattggcgatgccgtcgctcatctcaaaggccagggcatgcagattctggcaacccatctttctgataacgctgtcgatttccgcgaaattgattacactcgcccgacctgcattttgatgggacaggagaaaacgggcatcacgcaggaagcattggccctggcggatcaggacatcatcattccgatgatcggcatggtgcagtcgctgaatgtttccgttgcctcagccctcattctttacgaagcccagcgtcagcggcaaaatgcaggcatgtacctgcgtgaaaacagcatgttgccggaagcagagcaacaacgcctgttgtttgaaggcggctatccggtgctggcgaaagtc 659
<210> 21
<211> 2546
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 人工序列的描述:SacBCm基因序列
<400>21
cgtattttttgagttatcgagattttcaggagctaaggaagctaaaatggagaaaaaaatcactggatataccaccgttgatatatcccaatggcatcgtaaagaacattttgaggcatttcagtcagttgctcaatgtacctataaccagaccgttcagctggatattacggcctttttaaagaccgtaaagaaaaataagcacaagttttatccggcctttattcacattcttgcccgcctgatgaatgctcatccggaattccgtatggcaatgaaagacggtgagctggtgatatgggatagtgttcacccttgttacaccgttttccatgagcaaactgaaacgttttcatcgctctggagtgaataccacgacgatttccggcagtttctacacatatattcgcaagatgtggcgtgttacggtgaaaacctggcctatttccctaaagggtttattgagaatatgtttttcgtctcagccaatccctgggtgagtttcaccagttttgatttaaacgtggccaatatggacaacttcttcgcccccgttttcaccatgggcaaatattatacgcaaggcgacaaggtgctgatgccgctggcgattcaggttcatcatgccgtttgtgatggcttccatgtcggcagaatgcttaatgaattacaacagtactgcgatgagtggcagggcggggcgtaatttttttaaggcagttattggtgcccttaaacgcctggtgctacgcctgaataagtgataataagcggatgaatggcagaaattcgaaagcaaattcgacccggtcgtcggttcagggcagggtcgttaaatagccgctagatctaagtaaatcgcgcgggtttgttactgataaagcaggcaagacctaaaatgtgtaaagggcaaagtgtatactttggcgtcaccccttacatattttaggtctttttttattgtgcgtaactaacttgccatcttcaaacaggagggctggaagaagcagaccgctaacacagtacataaaaaaggagacatgaacgatgaacatcaaaaagtttgcaaaacaagcaacagtattaacctttactaccgcactgctggcaggaggcgcaactcaagcgtttgcgaaagaaacgaaccaaaagccatataaggaaacatacggcatttcccatattacacgccatgatatgctgcaaatccctgaacagcaaaaaaatgaaaaatatcaagttcctgaattcgattcgtccacaattaaaaatatctcttctgcaaaaggcctggacgtttgggacagctggccattacaaaacgctgacggcactgtcgcaaactatcacggctaccacatcgtctttgcattagccggagatcctaaaaatgcggatgacacatcgatttacatgttctatcaaaaagtcggcgaaacttctattgacagctggaaaaacgctggccgcgtctttaaagacagcgacaaattcgatgcaaatgattctatcctaaaagaccaaacacaagaatggtcaggttcagccacatttacatctgacggaaaaatccgtttattctacactgatttctccggtaaacattacggcaaacaaacactgacaactgcacaagttaacgtatcagcatcagacagctctttgaacatcaacggtgtagaggattataaatcaatctttgacggtgacggaaaaacgtatcaaaatgtacagcagttcatcgatgaaggcaactacagctcaggcgacaaccatacgctgagagatcctcactacgtagaagataaaggccacaaatacttagtatttgaagcaaacactggaactgaagatggctaccaaggcgaagaatctttatttaacaaagcatactatggcaaaagcacatcattcttccgtcaagaaagtcaaaaacttctgcaaagcgataaaaaacgcacggctgagttagcaaacggcgctctcggtatgattgagctaaacgatgattacacactgaaaaaagtgatgaaaccgctgattgcatctaacacagtaacagatgaaattgaacgcgcgaacgtctttaaaatgaacggcaaatggtacctgttcactgactcccgcggatcaaaaatgacgattgacggcattacgtctaacgatatttacatgcttggttatgtttctaattctttaactggcccatacaagccgctgaacaaaactggccttgtgttaaaaatggatcttgatcctaacgatgtaacctttacttactcacacttcgctgtacctcaagcgaaaggaaacaatgtcgtgattacaagctatatgacaaacagaggattctacgcagacaaacaatcaacgtttgcgccaagcttcctgctgaacatcaaaggcaagaaaacatctgttgtcaaagacagcatccttgaacaaggacaattaacagttaacaaataaaaacgcaaaagaaaatgccgatattgactaccggaagcagtgtgaccgtgtgcttctcaaatgcctgattcaggctg 2546
<210> 22
<211> 1750
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 人工序列的描述: LysC基因序列
<400>22
cctgcgctagcgcaggccagaagaggcgcgttgcccaagtaacggtgttggaggagccagtcctgtgataacacctgagggggtgcatcgccgaggtgattgaacggctggccacgttcatcatcggctacaggggctgaatcccctgggttgtcaccagaagcgttcgcagtcgggcgtttcgcaagtggtggagcacttctgggtgaaaatagtagcgaagtatcgctctgcgcccacccgtcttccgctcttcccttgtgccaaggctgaaaatggatcccctgacacgaggtagttatgtctgaaattgttgtctccaaatttggcggtaccagcgtagctgattttgacgccatgaaccgcagcgctgatattgtgctttctgatgccaacgtgcgtttagttgtcctctcggcttctgctggtatcactaatctgctggtcgctttagctgaaggactggaacctggcgagcgattcgaaaaactcgacgctatccgcaacatccagtttgccattctggaacgtctgcgttacccgaacgttatccgtgaagagattgaacgtctgctggagaacattactgttctggcagaagcggcggcgctggcaacgtctccggcgctgacagatgagctggtcagccacggcgagctgatgtcgaccctgctgtttgttgagatcctgcgcgaacgcgatgttcaggcacagtggtttgatgtacgtaaagtgatgcgtaccaacgaccgatttggtcgtgcagagccagatatagccgcgctggcggaactggccgcgctgcagctgctcccacgtctcaatgaaggcttagtgatcacccagggatttatcggtagcgaaaataaaggtcgtacaacgacgcttggccgtggaggcagcgattatacggcagccttgctggcggaggctttacacgcatctcgtgttgatatctggaccgacgtcccgggcatctacaccaccgatccacgcgtagtttccgcagcaaaacgcattgatgaaatcgcgtttgccgaagcggcagagatggcaacttttggtgcaaaagtactgcatccggcaacgttgctacccgcagtacgcagcgatatcccggtctttgtcggctccagcaaagacccacgcgcaggtggtacgctggtgtgcaataaaactgaaaatccgccgctgttccgcgctctggcgcttcgtcgcaatcagactctgctcactttgcacagcctgaatatgctgcattctcgcggtttcctcgcggaagttttcggcatcctcgcgcggcataatatttcggtagacttaatcaccacgtcagaagtgagcgtggcattaacccttgataccaccggttcaacctccactggcgatacgttgctgacgcaatctctgctgatggagctttccgcactgtgtcgggtggaggtggaagaaggtctggcgctggtcgcgttgattggcaatgacctgtcaaaagcctgcggcgttggcaaagaggtattcggcgtactggaaccgttcaacattcgcatgatttgttatggcgcatccagccataacctgtgcttcctggtgcccggcgaagatgccgagcaggtggtgcaaaaactgcatagtaatttgtttgagtaaatactgtatggcctggaagctatatttcgggccgtattgattttcttgtcactatgctcatcaataaacgagcctgtactctgttaaccagcgtctttat 1750
<210> 23
<211> 1279
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 人工序列的描述: dapA基因序列
<400>23
ataataaacgtgaactcttctcccagcatcgccaggcgactgtcttcaatattacagccgcaactactgacatgacgggtgatggtgttcacaattccagggcgatcggcacccaacgcagtgatcaccagataatgttgcgatgacagtgtcaaactggttattcctttaaggggtgagttgttcttaaggaaagcataaaaaaaacatgcatacaacaatcagaacggttctgtctgcttgcttttaatgccataccaaacgtaccattgagacacttgtttgcacagaggatggcccatgttcacgggaagtattgtcgcgattgttactccgatggatgaaaaaggtaatgtctgtcgggctagcttgaaaaaactgattgattatcatgtcgccagcggtacttcggcgatcgtttctgttggcaccactggcgagtccgctaccttaaatcatgacgaacatgctgatgtggtgatgatgacgctggatctggctgatgggcgcattccggtaattgccgggaccggcgctaacgctactgcggaagccattagcctgacgcagcgcttcaatgacagtggtatcgtcggctgcctgacggtaaccccttactacaatcgtccgtcgcaagaaggtttgtatcagcatttcaaagccatcgctgagcatactgacctgccgcaaattctgtataatgtgccgtcccgtactggctgcgatctgctcccggaaacggtgggccgtctggcgaaagtaaaaaatattatcggaatcaaagaggcaacagggaacttaacgcgtgtaaaccagatcaaagagctggtttcagatgattttgttctgctgagcggcgatgatgcgagcgcgctggacttcatgcaattgggcggtcatggggttatttccgttacggctaacgtcgcagcgcgtgatatggcccagatgtgcaaactggcagcagaagggcattttgccgaggcacgcgttattaatcagcgtctgatgccattacacaacaaactatttgtcgaacccaatccaatcccggtgaaatgggcatgtaaggaactgggtcttgtggcgaccgatacgctgcgcctgccaatgacaccaatcaccgacagtggtcgtgagacggtcagagcggcgcttaagcatgccggtttgctgtaaagtttagggagatttgatggcttactctgttcaaaagtcgcgcctggcaaaggttgcgggtgtttcgcttgttttattactcgctgcctgtagttctgac 1279
<210> 24
<211> 1750
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 人工序列的描述:LysC*基因序列
<400>24
cctgcgctagcgcaggccagaagaggcgcgttgcccaagtaacggtgttggaggagccagtcctgtgataacacctgagggggtgcatcgccgaggtgattgaacggctggccacgttcatcatcggctacaggggctgaatcccctgggttgtcaccagaagcgttcgcagtcgggcgtttcgcaagtggtggagcacttctgggtgaaaatagtagcgaagtatcgctctgcgcccacccgtcttccgctcttcccttgtgccaaggctgaaaatggatcccctgacacgaggtagttatgtctgaaattgttgtctccaaatttggcggtaccagcgtagctgattttgacgccatgaaccgcagcgctgatattgtgctttctgatgccaacgtgcgtttagttgtcctctcggcttctgctggtatcactaatctgctggtcgctttagctgaaggactggaacctggcgagcgattcgaaaaactcgacgctatccgcaacatccagtttgccattctggaacgtctgcgttacccgaacgttatccgtgaagagattgaacgtctgctggagaacattactgttctggcagaagcggcggcgctggcaacgtctccggcgctgacagatgagctggtcagccacggcgagctgatgtcgaccctgctgtttgttgagatcctgcgcgaacgcgatgttcaggcacagtggtttgatgtacgtaaagtgatgcgtaccaacgaccgatttggtcgtgcagagccagatatagccgcgctggcggaactggccgcgctgcagctgctcccacgtctcaatgaaggcttagtgatcacccagggatttatcggtagcgaaaataaaggtcgtacaacgacgcttggccgtggaggcagcgattatacggcagccttgctggcggaggctttacacgcatctcgtgttgatatctggaccgacgtcccgggcatctacaccaccgatccacgcgtagtttccgcagcaaaacgcattgatgaaatcgcgtttgccgaagcggcagagatggcaacttttggtgcaaaagtactgcatccggcaacgttgctacccgcagtacgcagcgatatcccggtctttgtcggctccagcaaagacccacgcgcaggtggtacgctggtgtgcaataaaactgaaaatccgccgctgttccgcgctctggcgcttcgtcgcaatcagactctgctcactttgcacagcctgaatatgctgcattctcgcggtttcctcgcggaagttttcggcatcctcgcgcggcataatatttcggtagacttaatcaccacgtcagaagtgagcgtggcattaatccttgataccaccggttcaacctccactggcgatacgttgctgacgcaatctctgctgatggagctttccgcactgtgtcgggtggaggtggaagaaggtctggcgctggtcgcgttgattggcaatgacctgtcaaaagcctgcggcgttggcaaagaggtattcggcgtactggaaccgttcaacattcgcatgatttgttatggcgcatccagccataacctgtgcttcctggtgcccggcgaagatgccgagcaggtggtgcaaaaactgcatagtaatttgtttgagtaaatactgtatggcctggaagctatatttcgggccgtattgattttcttgtcactatgctcatcaataaacgagcctgtactctgttaaccagcgtctttat 1750
<210> 25
<211> 1279
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 人工序列的描述: dapA*基因序列
<400>25
ataataaacgtgaactcttctcccagcatcgccaggcgactgtcttcaatattacagccgcaactactgacatgacgggtgatggtgttcacaattccagggcgatcggcacccaacgcagtgatcaccagataatgttgcgatgacagtgtcaaactggttattcctttaaggggtgagttgttcttaaggaaagcataaaaaaaacatgcatacaacaatcagaacggttctgtctgcttgcttttaatgccataccaaacgtaccattgagacacttgtttgcacagaggatggcccatgttcacgggaagtattgtcgcgattgttactccgatggatgaaaaaggtaatgtctgtcgggctagcttgaaaaaactgattgattatcatgtcgccagcggtacttcggcgatcgtttctgttggcaccactggcgagtccgctaccttaaatcatgacgaacatgctgatgtggtgatgatgacgctggatctggctgatgggcgcattccggtaattgccgggaccggcgctaacgctactgcgaccgccattagcctgacgcagcgcttcaatgacagtggtatcgtcggctgcctgacggtaaccccttactacaatcgtccgtcgcaagaaggtttgtatcagcatttcaaagccatcgctgagcatactgacctgccgcaaattctgtataatgtgccgtcccgtactggctgcgatctgctcccggaaacggtgggccgtctggcgaaagtaaaaaatattatcggaatcaaagaggcaacagggaacttaacgcgtgtaaaccagatcaaagagctggtttcagatgattttgttctgctgagcggcgatgatgcgagcgcgctggacttcatgcaattgggcggtcatggggttatttccgttacggctaacgtcgcagcgcgtgatatggcccagatgtgcaaactggcagcagaagggcattttgccgaggcacgcgttattaatcagcgtctgatgccattacacaacaaactatttgtcgaacccaatccaatcccggtgaaatgggcatgtaaggaactgggtcttgtggcgaccgatacgctgcgcctgccaatgacaccaatcaccgacagtggtcgtgagacggtcagagcggcgcttaagcatgccggtttgctgtaaagtttagggagatttgatggcttactctgttcaaaagtcgcgcctggcaaaggttgcgggtgtttcgcttgttttattactcgctgcctgtagttctgac 1279
<210> 26
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 人工序列的描述:引物pwsk-F
<400>26
GCTGCCTGTAGTTCTGACGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCC 47
<210> 27
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 人工序列的描述:引物pwsk-R
<400>27
GCGCTAGCGCAGGTTGCAGCACATCCCCCTTTCGC 35
<210> 28
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 人工序列的描述: 引物lysC-F
<400>28
GGATGTGCTGCAACCTGCGCTAGCGCAGGCC 31
<210>29
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 人工序列的描述:引物lysC-R
<400>29
GGAGAAGAGTTCACGTTTATTATATAAAGACGCTGGTTAACAGAGTACAGGCTCG 55
<210>30
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 人工序列的描述:引物dapA-F
<400>30
CTCTGTTAACCAGCGTCTTTATATAATAAACGTGAACTCTTCTCCCAGC 49
<210>31
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 人工序列的描述:引物dapA-R
<400>31
CCAGGCTTTACACTTTATGCTTCGTCAGAACTACAGGCAGCG 42
<210>32
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 人工序列的描述:引物LysCT352I-F
<400>32
gtggcattaatccttgataccaccggttcaacctccactg 40
<210>33
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 人工序列的描述:引物LysCT352I-R
<400>33
gtatcaaggattaatgccacgctcacttctgacgtggtga 40
<210>34
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 人工序列的描述:引物dapAE84T-F
<400>34
CGCTAACGCTACTGCGACCGCCATTAGCCTGACG 34
<210>35
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 人工序列的描述:引物dapAE84T-R
<400>35
CGTCAGGCTAATGGCGGTCGCAGTAGCGTTAGCG 34
Claims (7)
1.一种利用spoT基因缺失菌株通过发酵生产L-氨基酸的方法,其特征在于:通过在培养基中培养属于肠杆菌科,并具有L-氨基酸生产能力的细菌,该细菌于培养前进行了修饰,使得spoT基因缺失,并从细菌的培养基或细胞收集L-氨基酸,来生产L-氨基酸。
2.根据权利要求1所述的利用spoT基因缺失菌株通过发酵生产L-氨基酸的方法,其特征在于:采用spoT基因缺失的菌株ATCC21151ΔspoT,通过发酵的方法生产得到L-苏氨酸。
3.根据权利要求2所述的利用spoT基因缺失菌株通过发酵生产L-氨基酸的方法,其特征在于:所述spoT基因缺失的菌株ATCC21151ΔspoT通过下述方法构建得到:
首先,制备菌株ATCC21151的感受态细胞;利用质粒pKD46进行转化,获得ATCC21151/pKD46菌株;然后,利用基因片段spoTknock1转化ATCC21151/pKD46菌株的感受态细胞,获得的转化子利用引物spoT1-F/spoT1-R进行验证,验证正确的菌株命名为ATCC21151ΔspoT::SacBCm;最后,利用基因片段spoTknock2转化ATCC21151ΔspoT::SacBCm菌株的感受态细胞,获得的转化子利用引物spoT2-F/spoT2-R进行验证,验证正确的菌株命名为ATCC21151ΔspoT,至此L-苏氨酸生产所用的菌株spoT基因缺失的菌株ATCC21151ΔspoT构建完毕。
4.根据权利要求1所述的利用spoT基因缺失菌株通过发酵生产L-氨基酸的方法,其特征在于:采用spoT基因缺失的菌株MG1655/pwsk-lysC*-dapA*ΔspoT,通过发酵的方法生产得到L-赖氨酸。
5.根据权利要求4所述的利用spoT基因缺失菌株通过发酵生产L-氨基酸的方法,其特征在于:所述spoT基因缺失的菌株MG1655/pwsk-lysC*-dapA*ΔspoT通过下述方法构建得到:
首先,制备菌株MG1655/pwsk-lysC*-dapA*的感受态细胞;利用质粒pKD46进行转化,获得MG1655/pwsk-lysC*-dapA*(pKD46)菌株;然后,利用基因片段spoTknock2转化MG1655/pwsk-lysC*-dapA*(pKD46)菌株的感受态细胞,获得的转化子利用引物spoT2-F/spoT2-R进行验证,验证正确的菌株命名为MG1655/pwsk-lysC*-dapA*ΔspoT::SacBCm;最后,利用基因片段spoTknock2转化MG1655/pwsk-lysC*-dapA*ΔspoT::SacBCm菌株的感受态细胞,获得的转化子利用引物spoT2-F/spoT2-R进行验证,验证正确的菌株命名为MG1655/pwsk-lysC*-dapA*ΔspoT,至此L-赖氨酸生产所用的spoT基因缺失的菌株MG1655/pwsk-lysC*-dapA*ΔspoT构建完毕。
6.根据权利要求5所述的利用spoT基因缺失菌株通过发酵生产L-氨基酸的方法,其特征在于:所述菌株MG1655/pwsk-lysC*-dapA*通过下述方法构建得到:
利用多片段重组的方法构建以低拷贝质粒pWSK29为出发载体,包含dapA基因表达框和lysC基因表达框的质粒pwsk-lysC-dapA;
以质粒pwsk-lysC-dapA为基础构建dapA和lysC突变体过表达质粒,得到质粒pwsk-lysC*-dapA*;
将质粒pwsk-lysC*-dapA*电转化至大肠杆菌MG1655;获得的菌株命名为MG1655/pwsk-lysC*-dapA*。
7.根据权利要求3或5所述的利用spoT基因缺失菌株通过发酵生产L-氨基酸的方法,其特征在于:所述基因片段spoTknock1和spoTknock2通过以下方法构建得到:
首先,根据NCBI公布的大肠杆菌MG1655的基因组序列设计引物spoTup1-F/spoTup1-R和spoTdown1-F/spoTdown1-R,以大肠杆菌MG1655基因组为模板PCR扩增得到spoT基因上下游个600-700bp的同源臂基因片段,PCR扩增参数为98℃2min;98℃20s,67℃20s,72℃30s,循环30次,72℃延伸10min;根据质粒ploi4162基因序列,设计引物SacBCm-F/SacBCm-R,以质粒ploi4162为模板,PCR扩增氯霉素(Cm)和蔗糖致死基因(SacB)基因序列,PCR扩增参数为98℃2min;98℃20s,55℃20s,72℃1.5min,循环30次;根据质粒pUC18基因序列,设计引物pUC1-F/pUC1-R,扩增线性pUC18基因片段,PCR扩增参数为98℃2min;98℃20s,55℃20s,72℃1.5min,循环30次;72℃延伸10min;获得基因片段通过凝胶电泳回收;
利用MultiS One Step Cloning Kit对上述获得片段进行连接,构建可用于扩增敲除spoT基因的基因片段的载体,华大基因公司测序正确后,质粒命名为spoT1;根据质粒spoT1基因序列,设计引物spoT1-F/spoT1-R,以质粒spoT1为模板PCR扩增第一次spoT基因敲除的基因片段spoTknock1,PCR扩增参数为98℃2min;98℃20s,58℃20s,72℃2.5min,循环30次;获得基因片段通过凝胶电泳回收,用于进行spoT基因第一轮敲除;
然后,根据NCBI公布的大肠杆菌MG1655的基因组序列设计引物spoTup2-F/spoTup2-R和spoTdown2-F/spoTdown2-R,以大肠杆菌MG1655基因组为模板PCR扩增得到spoT基因上下游各600-700bp的同源臂基因片段,PCR扩增参数为98℃2min;98℃20s,62℃20s,72℃30s,循环30次,72℃延伸10min;根据质粒pUC18基因序列,设计引物pUC2-F/pUC2-R,扩增线性pUC18基因片段,PCR扩增参数为98℃2min;98℃20s,57℃20s,72℃1.5min,循环30次;72℃延伸10min;获得基因片段通过凝胶电泳回收;
利用MultiS One Step Cloning Kit对上述获得片段进行连接,构建可用于扩增敲除spoT基因的基因片段的载体,经华大基因公司测序正确后,质粒命名为spoT2;根据质粒spoT2基因序列,设计引物spoT2-F/spoT2-R,以质粒spoT2为模板PCR扩增第二次spoT基因敲除的基因片段spoTknock2,PCR扩增参数为98℃2min;98℃20s,55℃20s,72℃2.5min,循环30次;获得基因片段通过凝胶电泳回收,用于进行spoT基因第二轮敲除。
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