CN107267542A - 利用rhsA基因缺失菌株通过发酵生产L‑氨基酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用rhsA基因缺失菌株通过发酵生产L‑氨基酸的方法，通过在培养基中培养属于肠杆菌科，并具有L‑氨基酸生产能力的细菌，该细菌于培养前进行修饰，使得rhsA基因缺失，并从细菌的培养基或细胞收集L‑氨基酸，来生产L‑氨基酸。本发明通过一些列的试验验证，rhsA基因的缺失，其功能或者其相关序列的缺失，对于L‑氨基酸发酵有利，有助于氨基酸产量和转化率的提升。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，特别涉及一种通过发酵生产L-氨基酸的方法。
背景技术
在工业上，目前L-氨基酸的生产方法主要为生物发酵法，即通过具有L-氨基酸生产能力的各种微生物的发酵来生产L-氨基酸，因此具有L-氨基酸生产能力菌株的获得是L氨基酸生产方法的核心。目前获得L氨基酸生产菌株的方法主要有两种，一种是通过对野生型微生物(野生型菌株)进行诱变的方法，使其具有营养缺陷，并使其对某些代谢物产生拮抗作用，从而获得优良的工业生产菌株。
近年来随着基因工程技术的发展，重组DNA技术已经开始普遍应用于微生物代谢工程改造方面，使其成为另外一种重要的获得L-氨基酸生产菌株的方法。比如，通过提高目标产品合成途径中关键酶的表达，来达到提高微生物L-氨基酸生产能力(CN1305002A)；再比如，通过提高目标产品的分泌蛋白的表达，来达到提高微生物L-氨基酸生产能力(CN1260393A)；或者，通过降低某些基因的表达，来达到提高微生物L-氨基酸生产能力(CN1607246A)；在或者，通过敲除某些基因，使其失活，来达到提高微生物L-氨基酸生产能力(CN1466630A)。
rhs基因是一类广泛存在于大肠杆菌中的基因序列，其包含核心区域包含重复序列和不同的C末端序列。其家族包括rhsA，rhsB，rhsC，rhsD等。有研究表明，rhsA的过表达会造成细胞在稳定期生存能力下降。目前，对于rhsA功能的研究比较少，其对于L-氨基酸合成是否具有影响还没有相关的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用rhsA基因缺失菌株通过发酵生产L-氨基酸的方法，以提高L-氨基酸产量和转化率。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种利用rhsA基因缺失菌株通过发酵生产L-氨基酸的方法，其特征在于：通过在培养基中培养属于肠杆菌科，并具有L-氨基酸生产能力的细菌，该细菌于培养前进行了修饰，使得rhsA基因缺失，并从细菌的培养基或细胞收集L-氨基酸，来生产L-氨基酸。
进一步的，采用rhsA基因缺失的菌株ATCC21151ΔrhsA，通过发酵的方法生产得到L-苏氨酸。
所述rhsA基因缺失的菌株ATCC21151ΔrhsA通过下述方法构建得到：
首先，制备菌株ATCC21151的感受态细胞；利用质粒pKD46进行转化，获得ATCC21151/pKD46菌株；然后，利用基因片段rhsAknock1转化ATCC21151/pKD46菌株的感受态细胞，获得的转化子利用引物rhsA1-F/rhsA1-R进行验证，验证正确的菌株命名为ATCC21151ΔrhsA::SacBCm；最后，利用基因片段rhsAknock2转化ATCC21151ΔrhsA::SacBCm菌株的感受态细胞，获得的转化子利用引物rhsA2-F/rhsA2-R进行验证，验证正确的菌株命名为ATCC21151ΔrhsA，至此L-苏氨酸生产所用的rhsA基因缺失的菌株ATCC21151ΔrhsA构建完毕。
进一步的，采用rhsA基因缺失的菌株MG1655/pwsk-lysC*-dapA*ΔrhsA，通过发酵的方法生产得到L-赖氨酸。
所述rhsA基因缺失的菌株MG1655/pwsk-lysC*-dapA*ΔrhsA通过下述方法构建得到：
首先，制备菌株MG1655/pwsk-lysC*-dapA*的感受态细胞；利用质粒pKD46进行转化，获得MG1655/pwsk-lysC*-dapA*(pKD46)菌株；然后，利用基因片段rhsAknock2转化MG1655/pwsk-lysC*-dapA*(pKD46)菌株的感受态细胞，获得的转化子利用引物rhsA2-F/rhsA2-R进行验证，验证正确的菌株命名为MG1655/pwsk-lysC*-dapA*ΔrhsA::SacBCm；最后，利用基因片段rhsAknock2转化MG1655/pwsk-lysC*-dapA*ΔrhsA::SacBCm菌株的感受态细胞，获得的转化子利用引物rhsA2-F/rhsA2-R进行验证，验证正确的菌株命名为MG1655/pwsk-lysC*-dapA*ΔrhsA，至此L-赖氨酸生产所用的rhsA基因缺失的菌株MG1655/pwsk-lysC*-dapA*ΔrhsA构建完毕。
所述菌株MG1655/pwsk-lysC*-dapA*通过下述方法构建得到：
利用多片段重组的方法构建以低拷贝质粒pWSK29为出发载体，包含dapA基因表达框和lysC基因表达框的质粒pwsk-lysC-dapA；
以质粒pwsk-lysC-dapA为基础构建dapA和lysC突变体过表达质粒，得到质粒pwsk-lysC*-dapA*；
将质粒pwsk-lysC*-dapA*电转化至大肠杆菌MG1655；获得的菌株命名为MG1655/pwsk-lysC*-dapA*。
有益效果：本发明提供的方法，采用rhsA基因缺失的大肠杆菌菌株，通过发酵的方法生产得到L-氨基酸，并通过一些列的试验验证，rhsA基因的缺失，其功能或者其相关序列的缺失，对于L-氨基酸发酵有利，有助于氨基酸产量和转化率的的提升。
附图说明
图1为基因片段rhsAknock1的构建过程示意图；
图2为基因片段rhsAknock2的构建过程示意图；
图3为基因质粒pwsk-lysC-dapA的构建过程示意图。
具体实施方式
本发明实施例所用的L-苏氨酸生产菌株为大肠杆菌ATCC21151，来源于美国典型微生物菌株菌种保藏中心(ATCC)。
本发明实施例所用的L-赖氨酸生产菌株为大肠杆菌MG1655(ATCC 47076)，来源于美国典型微生物菌株菌种保藏中心(ATCC)。
DNA聚合酶购自北京全式金公司的Fastpfu；限制性内切酶及DNA连接酶等均购自Fermentas公司；
酵母粉和蛋白胨购自英国Oxoid公司产品；琼脂粉和抗生素购自北京索来宝；葡萄糖、硫酸铵等常用化学试剂均购自国药。
质粒提取试剂盒和琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒均购自上海生工，多片段重组试剂盒(MultiS One Step Cloning Kit)购自南京诺唯赞生物科技有限公司，相关操作均严格按照说明书执行；XL-Ⅱ定点突变试剂盒购自天津博鑫生物科技有限公司，相关操作均严格按照说明书执行；
质粒构建测序验证和基因缺失测序工作由华大基因完成；
DH5α感受态细胞购自北京全式金公司。
LB培养基成分：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，固体培养基中添加2％的琼脂粉。
抗生素浓度为：氨苄青霉素100ug/mL，卡那霉素30ug/mL，氯霉素15ug/ml。
L-苏氨酸和L-赖氨酸检测方法：通过安捷伦液相仪，利用ZORBAX Eclipse AAA(氨基酸分析)色谱柱对发酵液中的L-赖氨酸和L-苏氨酸进行分析，相关操作均严格按照说明书执行。
葡萄糖分析方法采用山东科学院生产的SBA-40D生物传感分析仪进行检测。
实施例1 rhsA敲除片段的构建
大肠杆菌基因敲除采用经典的Red重组方法，因此需要有进行重组的基因片段。相关基因片段构建方法如下：
首先，根据NCBI公布的大肠杆菌MG1655的基因组序列设计引物rhsAup1-F/rhsAup1-R和rhsAdown1-F/rhsAdown1-R，见表1，以大肠杆菌MG1655基因组为模板PCR扩增得到rhsA基因上下游个600-700bp的同源臂基因片段，序列如序列表中SEQ ID NO.19及SEQID NO.20所示，PCR扩增参数为98℃2min；98℃20s，63℃20s，72℃40s，循环30次，72℃延伸10min；根据质粒ploi4162基因序列，设计引物SacBCm-F/SacBCm-R，见表1，以质粒ploi4162为模板，PCR扩增氯霉素(Cm)和蔗糖致死基因(SacB)基因序列，PCR扩增参数为98℃2min；98℃20s，56℃20s，72℃2.5min，循环30次；根据质粒pUC18基因序列，设计引物pUC1-F/pUC1-R，见表1，扩增线性pUC18基因片段，PCR扩增参数为98℃2min；98℃20s，57℃20s，72℃1.5min，循环30次；72℃延伸10min。获得基因片段通过凝胶电泳回收。
利用MultiS One Step Cloning Kit对上述获得片段进行连接，具体方法参见试剂盒说明。构建可用于扩增敲除rhsA基因的基因片段的载体，具体构建过程见图1。经华大基因公司测序正确后，质粒命名为rhsA1。根据质粒rhsA1基因序列，设计引物rhsA1-F/rhsA1-R，以质粒rhsA1为模板PCR扩增第一次rhsA基因敲除的基因片段rhsAknock1，PCR扩增参数为98℃2min；98℃20s，60℃20s，72℃2.5min，循环30次。获得基因片段通过凝胶电泳回收，用于进行rhsA基因第一轮敲除。
然后，根据NCBI公布的大肠杆菌MG1655的基因组序列设计引物rhsAup2-F/rhsAup2-R和rhsAdown2-F/rhsAdown2-R，见表,1，以大肠杆菌MG1655基因组为模板PCR扩增得到rhsA基因上下游各600-700bp的同源臂基因片段，序列如序列表中SEQ ID NO.19及SEQID NO.20所示，PCR扩增参数为98℃2min；98℃20s，60℃20s，72℃1min，循环30次，72℃延伸10min；根据质粒pUC18基因序列，设计引物pUC2-F/pUC2-R，见表1，扩增线性pUC18基因片段，PCR扩增参数为98℃2min；98℃20s，55℃20s，72℃3min，循环30次；72℃延伸10min。获得基因片段通过凝胶电泳回收。
利用MultiS One Step Cloning Kit对上述获得片段进行连接，具体方法参见试剂盒说明。构建可用于扩增敲除rhsA基因的基因片段的载体，具体构建过程见图2。经华大基因公司测序正确后，质粒命名为rhsA2。根据质粒rhsA2基因序列，设计引物rhsA2-F/rhsA2-R，以质粒rhsA2为模板PCR扩增第二次rhsA基因敲除的基因片段rhsAknock2，PCR扩增参数为98℃2min；98℃20s，57℃20s，72℃2.5min，循环30次。获得基因片段通过凝胶电泳回收，用于进行rhsA基因第二轮敲除。
表1引物
| 名称 | 序列 |
| pUC1-F | TTTAGATACTATGCGGGTACCGAGCTCGAATTCG |
| pUC1-R | CCTGTTTAGCCGCGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCA |
| rhsAup1-F | CTCTAGAGGATCCCGCGGCTAAACAGGTTTTCGACCA |
| rhsAup1-R | CGATAACTCAAAAAATACGGGTTATTTGTCTGCTGACAGGCGAAACCC |
| SacBCm-F | GTCAGCAGACAAATAACCCGTATTTTTTGAGTTATCGAGATTTTCAGGAGCT |
| SacBCm-R | ATCAAGTAAGCGACAGCCTGAATCAGGCATTTGAGAAGCA |
| rhsAdown1-F | CTGATTCAGGCTGTCGCTTACTTGATGATCACAATTCC |
| rhsAdown1-R | CGAGCTCGGTACCCGCATAGTATCTAAAACAGGAAGTAGCGTTTTATCACC |
| pUC2-F | TTTAGATACTATGCGGGTACCGAGCTCGAATTCG |
| pUC2-R | CCTGTTTAGCCGCGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCA |
| rhsAup2-F | CTCTAGAGGATCCCGCGGCTAAACAGGTTTTCGACCA |
| rhsAup2-R | TGATCATCAAGTAAGCGAGGTTATTTGTCTGCTGACAGGCGAAACCC |
| rhsAdown2-F | CAGCAGACAAATAACCTCGCTTACTTGATGATCACAATTCC |
| rhsAdown2-R | CGAGCTCGGTACCCGCATAGTATCTAAAACAGGAAGTAGCGTTTTATCACC |
| rhsA1-F | GCTAAACAGGTTTTCGACC |
| rhsA1-R | CAGGAAGTAGCGTTTTATCAC |
| rhsA2-F | CTAAACAGGTTTTCGACC |
| rhsA2-R | ACAGGAAGTAGCGTTTTATCAC |
实施例2 L-赖氨酸生产菌株构建
利用大肠埃希氏菌MG1655菌株(ATCC 47076)来构建一株可以生产L-赖氨酸的菌株。具体方法如下。
1.过表达二氢吡啶二羧酸合酶(dapA)和天冬氨酸激酶III(lysC)基因质粒构建
利用多片段重组的方法构建了以低拷贝质粒pWSK29为出发载体，包含dapA基因表达框和lysC基因表达框的质粒。具体方法如下所述：
首先，根据NCBI公布的大肠杆菌MG1655的基因组序列设计引物lysC-F/lysC-R和dapA-F/dapA-F，见表2，以大肠杆菌MG1655基因组为模板PCR扩增得到带有自身启动子的dapA和lysC基因片段，序列如序列表中SEQ ID NO.22及SEQ ID NO.23所示，PCR扩增参数为98℃2min；98℃20s，65℃20s，72℃2min，循环30次；72℃延伸10min。根据质粒pWSK29基因序列，设计引物pwsk-F/pwsk-R，扩增线性pWSK29基因片段，PCR扩增参数为98℃2min；98℃20s，60℃20s，72℃3min，循环30次；72℃延伸10min。获得基因片段通过凝胶电泳回收。
然后，利用MultiS One Step Cloning Kit对上述获得片段进行连接，具体方法参见试剂盒说明。构建过表达二氢吡啶二羧酸合酶(dapA)和天冬氨酸激酶III(lysC)基因质粒pwsk-lysC-dapA，具体构建过程见图3。经华大基因公司测序正确后进行下一步试验。
2.dapA和lysC突变体过表达质粒的构建
野生型的dapA基因和lysC基因是受到L-赖氨酸的反馈抑制的，因此为了解除L-赖氨酸对其的反馈抑制，增加其在细胞内的酶活力，对其进行了点突变，以pwsk-lysC-dapA为基础构建了dapA和lysC突变体过表达质粒。具体方法如下所述。
首先，设计利用Stratagene系列XL-Ⅱ定点突变试剂盒，通过引物LysCT352I F/LysCT352I R(见表2)对质粒pwsk-lysC-dapA进行PCR引入突变位点，获得的质粒基因片段经过PCR产物回收，除去PCR体系中的酶及缓冲体系中的盐离子后，采用DpnI酶37摄氏度酶切1h除去甲基化的模板质粒DNA，处理后的质粒转入感受态细胞Tran10(购自北京全式金生物技术有限公司)，经测序验证，所获得的正确突变质粒命名为pwsk-lysC*-dapA，携带的lysC突变体核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.24所示。
然后，设计利用Stratagene系列XL-Ⅱ定点突变试剂盒，通过引物dapAE84T-F/dapAE84T-R(见表1)对质粒pwsk-lysC*-dapA进行PCR引入突变位点，获得的质粒基因片段经过PCR产物回收，除去PCR体系中的酶及缓冲体系中的盐离子后，采用DpnI酶37摄氏度酶切1h除去甲基化的模板质粒DNA，处理后的质粒转入感受态细胞Tran10，经测序验证，所获得的正确突变质粒命名为pwsk-lysC*-dapA*，携带的dapA突变体核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.25所示。
3.L-赖氨酸生产菌株SHG01的构建及发酵验证
将前面构建好的质粒pwsk-lysC*-dapA*电转化至大肠杆菌MG1655；获得的菌株命名为MG1655/pwsk-lysC*-dapA*。然后，对其进行L-赖氨酸发酵能力的验证。
发酵培养基如下：葡萄糖40g/L，硫酸铵10g/L，磷酸0.6mL/L，氯化钾0.8g/L，甜菜碱0.4g/L，硫酸镁1.2g/L，硫酸锰0.03g/L，硫酸亚铁0.03g/L，玉米浆有机氮0.4g/L，5％消泡剂0.5mL/L。
利用500ml装入30mL发酵培养基的三角瓶进行发酵实验，接种2mL LB过夜培养的菌液，在37℃、200rpm条件下发酵。利用稀释的氨水控制pH 6.8，发酵32h。
菌株MG1655/pwsk-lysC*-dapA*发酵32h后，L-赖氨酸产量为4.6g/L。
表2引物
| 名称 | 序列 |
| pwsk-F | GCTGCCTGTAGTTCTGACGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCC |
| pwsk-R | GCGCTAGCGCAGGTTGCAGCACATCCCCCTTTCGC |
| lysC-F | GGATGTGCTGCAACCTGCGCTAGCGCAGGCC |
| lysC-R | GGAGAAGAGTTCACGTTTATTATATAAAGACGCTGGTTAACAGAGTACAGGCTCG |
| dapA-F | CTCTGTTAACCAGCGTCTTTATATAATAAACGTGAACTCTTCTCCCAGC |
| dapA-R | CCAGGCTTTACACTTTATGCTTCGTCAGAACTACAGGCAGCG |
| LysCT352I-F | g tggcattaatccttgataccaccggttcaacctccactg |
| LysCT352I-R | gtatcaaggattaatgccacgctcacttctgacgtggtga |
| dapAE84T-F | CGCTAACGCTACTGCGACCGCCATTAGCCTGACG |
| dapAE84T-R | CGTCAGGCTAATGGCGGTCGCAGTAGCGTTAGCG |
实施例3 rhsA基因缺失菌株构建
1.L-苏氨酸生产菌株ATCC21151ΔrhsA基因缺失突变株构建
L-苏氨酸生产菌株ATCC21151基因敲除方法采用经典的Red重组方法，参考相关文献进行。具体操作过程如下：
首先，制备菌株ATCC21151的感受态细胞，具体感受态细胞制备和转化过程参考J.萨姆布鲁克(Sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》；利用质粒pKD46进行转化，获得ATCC21151/pKD46菌株；然后，利用基因片段rhsAknock1转化ATCC21151/pKD46菌株的感受态细胞，获得的转化子利用引物rhsA1-F/rhsA1-R进行验证，验证正确的菌株命名为ATCC21151ΔrhsA::SacBCm。最后，利用基因片段rhsAknock2转化ATCC21151ΔrhsA::SacBCm菌株的感受态细胞，获得的转化子利用引物rhsA2-F/rhsA2-R进行验证，验证正确的菌株命名为ATCC21151ΔrhsA，至此L-苏氨酸生产菌株ATCC21151ΔrhsA基因缺失突变株构建完毕。
2.L-赖氨酸生产菌株MG1655/pwsk-lysC*-dapA*ΔrhsA基因缺失突变株构建
L-赖氨酸生产菌株MG1655/pwsk-lysC*-dapA*基因敲除方法采用经典的Red重组方法，参考相关文献进行。具体操作过程如下：
首先，制备菌株MG1655/pwsk-lysC*-dapA*的感受态细胞，具体感受态细胞制备和转化过程参考J.萨姆布鲁克(Sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》；利用质粒pKD46进行转化，获得MG1655/pwsk-lysC*-dapA*(pKD46)菌株；然后，利用基因片段rhsAknock2转化MG1655/pwsk-lysC*-dapA*(pKD46)菌株的感受态细胞，获得的转化子利用引物rhsA2-F/rhsA2-R进行验证，验证正确的菌株命名为MG1655/pwsk-lysC*-dapA*ΔrhsA::SacBCm。最后，利用基因片段rhsAknock2转化MG1655/pwsk-lysC*-dapA*ΔrhsA::SacBCm菌株的感受态细胞，获得的转化子利用引物rhsA2-F/rhsA2-R进行验证，验证正确的菌株命名为MG1655/pwsk-lysC*-dapA*ΔrhsA，至此L-赖氨酸生产菌株MG1655/pwsk-lysC*-dapA*ΔrhsA基因缺失突变株构建完毕。
实施例4 rhsA基因缺失对L-苏氨酸发酵的影响
为了验证rhsA基因缺失对于L-苏氨酸发酵的影响，利用摇瓶发酵的方法对菌株ATCC21151和菌株ATCC21151ΔrhsA进行发酵验证，具体过程如下：
发酵培养基如下表3所示：
表3
将上述L-苏氨酸生产菌株单菌落分别接种5mL LB液体培养基，37℃，220rpm培养12h。按照初始OD为0.1转接装有20mL发酵培养基的500mL三角瓶，37℃，220rpm培养32h，检测L-苏氨酸的浓度。
菌株最终产量结果如表4所示，对照菌株ATCC21151中L-苏氨酸产量为4.2g/L，rhsA基因缺失的菌株ATCC21151ΔrhsA中L-苏氨酸产量为5.1g/L，比出发菌株提高了21.4％，表明在大肠杆菌中部分或全部缺失rhsA基因序列能够提高L-苏氨酸的产量。
表4
| 菌株 | L-苏氨酸g/L |
| ATCC21151 | 4.2 |
| ATCC21151ΔrhsA | 5.1 |
实施例5rhsA基因缺失对L-赖氨酸发酵的影响
为了验证rhsA基因缺失对于L-赖氨酸发酵的影响，利用摇瓶发酵的方法对菌株MG1655/pwsk-lysC*-dapA*和菌株MG1655/pwsk-lysC*-dapA*ΔrhsA进行发酵验证，具体过程如下：
发酵培养基如下表5所示：
表5
将上述L-赖氨酸生产菌株单菌落分别接种5mL含有100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，37℃，220rpm培养12h。按照15％的接种量转接装有20mL发酵培养基的500mL三角瓶，37℃，220rpm培养30h，检测L-赖氨酸的浓度。
菌株最终产量结果如表6所示，对照菌株MG1655/pwsk-lysC*-dapA*中L-赖氨酸产量为4.6g/L，rhsA基因缺失的菌株MG1655/pwsk-lysC*-dapA*ΔrhsA中L-赖氨酸产量为5.5g/L，比出发菌株提高了19.6％，表明在大肠杆菌中部分或全部rhsA基因序列能够提高L-赖氨酸的产量。
表6
| 菌株 | L-赖氨酸g/L |
| MG1655/pwsk-lysC*-dapA* | 4.6 |
| MG1655/pwsk-lysC*-dapA*ΔrhsA | 5.5 |
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110>徐州工程学院
<120>利用rhsA基因缺失菌株通过发酵生产L-氨基酸的方法
<130> 2017
<160> 35
<210> 1
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 人工序列的描述：引物pUC1-F
<400> 1
TTTAGATACTATGCGGGTACCGAGCTCGAATTCG 34
<210> 2
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 人工序列的描述：引物pUC1-R
<400> 2
CCTGTTTAGCCGCGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCA 37
<210> 3
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 人工序列的描述：引物rhsAup1-F
<400> 3
CTCTAGAGGATCCCGCGGCTAAACAGGTTTTCGACCA 37
<210> 4
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 人工序列的描述：引物rhsAup1-R
<400>4
CGATAACTCAAAAAATACGGGTTATTTGTCTGCTGACAGGCGAAACCC 48
<210> 5
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 人工序列的描述：引物SacBCm-F
<400>5
GTCAGCAGACAAATAACCCGTATTTTTTGAGTTATCGAGATTTTCAGGAGCT 52
<210> 6
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 人工序列的描述：引物SacBCm-R
<400>6
ATCAAGTAAGCGACAGCCTGAATCAGGCATTTGAGAAGCA 40
<210> 7
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 人工序列的描述：引物rhsAdown1-F
<400>7
CTGATTCAGGCTGTCGCTTACTTGATGATCACAATTCC 38
<210> 8
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 人工序列的描述：引物rhsAdown1-R
<400>8
CGAGCTCGGTACCCGCATAGTATCTAAAACAGGAAGTAGCGTTTTATCACC 51
<210> 9
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 人工序列的描述：引物pUC2-F
<400>9
TTTAGATACTATGCGGGTACCGAGCTCGAATTCG 34
<210> 10
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 人工序列的描述：引物pUC2-R
<400>10
CCTGTTTAGCCGCGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCA 37
<210> 11
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 人工序列的描述：引物rhsAup2-F
<400>11
CTCTAGAGGATCCCGCGGCTAAACAGGTTTTCGACCA 37
<210> 12
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 人工序列的描述：引物rhsAup2-R
<400>12
TGATCATCAAGTAAGCGAGGTTATTTGTCTGCTGACAGGCGAAACCC 47
<210> 13
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 人工序列的描述：引物rhsAdown2-F
<400>13
CAGCAGACAAATAACCTCGCTTACTTGATGATCACAATTCC 41
<210> 14
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 人工序列的描述：引物rhsAdown2-R
<400>14
CGAGCTCGGTACCCGCATAGTATCTAAAACAGGAAGTAGCGTTTTATCACC 51
<210> 15
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 人工序列的描述：引物rhsA1-F
<400>15
GCTAAACAGGTTTTCGACC 19
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 人工序列的描述：引物rhsA1-R
<400>16
CAGGAAGTAGCGTTTTATCAC 21
<210> 17
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 人工序列的描述：引物rhsA2-F
<400>17
CTAAACAGGTTTTCGACC 18
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 人工序列的描述：引物rhsA2-R
<400>18
ACAGGAAGTAGCGTTTTATCAC 22
<210> 19
<211> 780
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 人工序列的描述：rhsA上游同源臂基因序列
<400>19
gcggctaaacaggttttcgaccagtttgactaagtgtgggcggtcgacacaccaacctggcgcaacgcggcggaaattgagatatccgacggcacaggcaatggcgatagtcgccagattgaccgtatcggttttgagtgtgccatcgaccagatatccttccagcacatccagactgcggttgattttctcccgctggcgtaacaattcatcttcagactgctgcgccgctggacgcgcctgttcacgcaccgataccagcccggcatccataatgccatccgccagtgcctcaattttgcgcacccgcaacgactccagcggatcgcgcggcaacatcgccggagcgacattcattaattcaatatattcagcgatgatcggcgaatcaaaccagcattcgccctcttcggtcaccagcaccggcacttttcctaacgggttaaattgcgccacgccgttgtccgcgttatagggcagttcattaataaattcgaaagttatgcccttttctaacaacagaatagaaagtttgcgtacaaacgggctggtgtagctaccgacgagtttcatgccgagtcctttgtgcgaggaaaaatatcagtatggcctggtgatgggaaaaagggcagaaaatgttgatggtttgttacttccaaataaatcacatatttatcatggtgatataaatattttcctaattatttcactctgatggatatctcacttcaggctttcttataaatctgtagggtttcgcctgtcagcagacaaataacc 780
<210> 20
<211> 694
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 人工序列的描述：rhsA下游同源臂基因序列
<400>20
Tcgcttacttgatgatcacaattccttgaaaaggatttcatctgccagagtattacagttaagaggtgggcaagacgctgttagattggcaattgagttctgctctgataaaaattatatccgtagagatatcggagcatttatactcgggcaaataaaaatttgcaaaaaatgcgaagataatgtttttaatattttgaacaatatggcattgaatgataagagcgcttgcgttcgagctacggcaatcgagtcaacggctcagcgatgcaagaaaaacccaatttattcacctaaaatagtagaacaatctcaaattactgcttttgataaatcgactaatgtcagacgtgctacagcatttgctatttctgttatcaatgataaagcaacaattccactattgattaatctgttaaaagatccaaatggagatgtcagaaactgggccgcatttgcaataaatatcaataaatatgataatagtgatattagggattgttttgtggagatgcttcaggataaaaatgaggaagtccgtattgaagcaataatcggactttcctacagaaaagataaaagggttttatctgttttatgcgatgagttaaaaaaaaatactgtttatgatgatatcattgaagctgcgggtgaattaggtgataaaacgctacttcctgttttagatactatg 694
<210> 21
<211> 2546
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 人工序列的描述：SacBCm基因序列
<400>21
cgtattttttgagttatcgagattttcaggagctaaggaagctaaaatggagaaaaaaatcactggatataccaccgttgatatatcccaatggcatcgtaaagaacattttgaggcatttcagtcagttgctcaatgtacctataaccagaccgttcagctggatattacggcctttttaaagaccgtaaagaaaaataagcacaagttttatccggcctttattcacattcttgcccgcctgatgaatgctcatccggaattccgtatggcaatgaaagacggtgagctggtgatatgggatagtgttcacccttgttacaccgttttccatgagcaaactgaaacgttttcatcgctctggagtgaataccacgacgatttccggcagtttctacacatatattcgcaagatgtggcgtgttacggtgaaaacctggcctatttccctaaagggtttattgagaatatgtttttcgtctcagccaatccctgggtgagtttcaccagttttgatttaaacgtggccaatatggacaacttcttcgcccccgttttcaccatgggcaaatattatacgcaaggcgacaaggtgctgatgccgctggcgattcaggttcatcatgccgtttgtgatggcttccatgtcggcagaatgcttaatgaattacaacagtactgcgatgagtggcagggcggggcgtaatttttttaaggcagttattggtgcccttaaacgcctggtgctacgcctgaataagtgataataagcggatgaatggcagaaattcgaaagcaaattcgacccggtcgtcggttcagggcagggtcgttaaatagccgctagatctaagtaaatcgcgcgggtttgttactgataaagcaggcaagacctaaaatgtgtaaagggcaaagtgtatactttggcgtcaccccttacatattttaggtctttttttattgtgcgtaactaacttgccatcttcaaacaggagggctggaagaagcagaccgctaacacagtacataaaaaaggagacatgaacgatgaacatcaaaaagtttgcaaaacaagcaacagtattaacctttactaccgcactgctggcaggaggcgcaactcaagcgtttgcgaaagaaacgaaccaaaagccatataaggaaacatacggcatttcccatattacacgccatgatatgctgcaaatccctgaacagcaaaaaaatgaaaaatatcaagttcctgaattcgattcgtccacaattaaaaatatctcttctgcaaaaggcctggacgtttgggacagctggccattacaaaacgctgacggcactgtcgcaaactatcacggctaccacatcgtctttgcattagccggagatcctaaaaatgcggatgacacatcgatttacatgttctatcaaaaagtcggcgaaacttctattgacagctggaaaaacgctggccgcgtctttaaagacagcgacaaattcgatgcaaatgattctatcctaaaagaccaaacacaagaatggtcaggttcagccacatttacatctgacggaaaaatccgtttattctacactgatttctccggtaaacattacggcaaacaaacactgacaactgcacaagttaacgtatcagcatcagacagctctttgaacatcaacggtgtagaggattataaatcaatctttgacggtgacggaaaaacgtatcaaaatgtacagcagttcatcgatgaaggcaactacagctcaggcgacaaccatacgctgagagatcctcactacgtagaagataaaggccacaaatacttagtatttgaagcaaacactggaactgaagatggctaccaaggcgaagaatctttatttaacaaagcatactatggcaaaagcacatcattcttccgtcaagaaagtcaaaaacttctgcaaagcgataaaaaacgcacggctgagttagcaaacggcgctctcggtatgattgagctaaacgatgattacacactgaaaaaagtgatgaaaccgctgattgcatctaacacagtaacagatgaaattgaacgcgcgaacgtctttaaaatgaacggcaaatggtacctgttcactgactcccgcggatcaaaaatgacgattgacggcattacgtctaacgatatttacatgcttggttatgtttctaattctttaactggcccatacaagccgctgaacaaaactggccttgtgttaaaaatggatcttgatcctaacgatgtaacctttacttactcacacttcgctgtacctcaagcgaaaggaaacaatgtcgtgattacaagctatatgacaaacagaggattctacgcagacaaacaatcaacgtttgcgccaagcttcctgctgaacatcaaaggcaagaaaacatctgttgtcaaagacagcatccttgaacaaggacaattaacagttaacaaataaaaacgcaaaagaaaatgccgatattgactaccggaagcagtgtgaccgtgtgcttctcaaatgcctgattcaggctg 2546
<210> 22
<211> 1750
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 人工序列的描述：LysC基因序列
<400>22
cctgcgctagcgcaggccagaagaggcgcgttgcccaagtaacggtgttggaggagccagtcctgtgataacacctgagggggtgcatcgccgaggtgattgaacggctggccacgttcatcatcggctacaggggctgaatcccctgggttgtcaccagaagcgttcgcagtcgggcgtttcgcaagtggtggagcacttctgggtgaaaatagtagcgaagtatcgctctgcgcccacccgtcttccgctcttcccttgtgccaaggctgaaaatggatcccctgacacgaggtagttatgtctgaaattgttgtctccaaatttggcggtaccagcgtagctgattttgacgccatgaaccgcagcgctgatattgtgctttctgatgccaacgtgcgtttagttgtcctctcggcttctgctggtatcactaatctgctggtcgctttagctgaaggactggaacctggcgagcgattcgaaaaactcgacgctatccgcaacatccagtttgccattctggaacgtctgcgttacccgaacgttatccgtgaagagattgaacgtctgctggagaacattactgttctggcagaagcggcggcgctggcaacgtctccggcgctgacagatgagctggtcagccacggcgagctgatgtcgaccctgctgtttgttgagatcctgcgcgaacgcgatgttcaggcacagtggtttgatgtacgtaaagtgatgcgtaccaacgaccgatttggtcgtgcagagccagatatagccgcgctggcggaactggccgcgctgcagctgctcccacgtctcaatgaaggcttagtgatcacccagggatttatcggtagcgaaaataaaggtcgtacaacgacgcttggccgtggaggcagcgattatacggcagccttgctggcggaggctttacacgcatctcgtgttgatatctggaccgacgtcccgggcatctacaccaccgatccacgcgtagtttccgcagcaaaacgcattgatgaaatcgcgtttgccgaagcggcagagatggcaacttttggtgcaaaagtactgcatccggcaacgttgctacccgcagtacgcagcgatatcccggtctttgtcggctccagcaaagacccacgcgcaggtggtacgctggtgtgcaataaaactgaaaatccgccgctgttccgcgctctggcgcttcgtcgcaatcagactctgctcactttgcacagcctgaatatgctgcattctcgcggtttcctcgcggaagttttcggcatcctcgcgcggcataatatttcggtagacttaatcaccacgtcagaagtgagcgtggcattaacccttgataccaccggttcaacctccactggcgatacgttgctgacgcaatctctgctgatggagctttccgcactgtgtcgggtggaggtggaagaaggtctggcgctggtcgcgttgattggcaatgacctgtcaaaagcctgcggcgttggcaaagaggtattcggcgtactggaaccgttcaacattcgcatgatttgttatggcgcatccagccataacctgtgcttcctggtgcccggcgaagatgccgagcaggtggtgcaaaaactgcatagtaatttgtttgagtaaatactgtatggcctggaagctatatttcgggccgtattgattttcttgtcactatgctcatcaataaacgagcctgtactctgttaaccagcgtctttat 1750
<210> 23
<211> 1279
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 人工序列的描述：dapA基因序列
<400>23
ataataaacgtgaactcttctcccagcatcgccaggcgactgtcttcaatattacagccgcaactactgacatgacgggtgatggtgttcacaattccagggcgatcggcacccaacgcagtgatcaccagataatgttgcgatgacagtgtcaaactggttattcctttaaggggtgagttgttcttaaggaaagcataaaaaaaacatgcatacaacaatcagaacggttctgtctgcttgcttttaatgccataccaaacgtaccattgagacacttgtttgcacagaggatggcccatgttcacgggaagtattgtcgcgattgttactccgatggatgaaaaaggtaatgtctgtcgggctagcttgaaaaaactgattgattatcatgtcgccagcggtacttcggcgatcgtttctgttggcaccactggcgagtccgctaccttaaatcatgacgaacatgctgatgtggtgatgatgacgctggatctggctgatgggcgcattccggtaattgccgggaccggcgctaacgctactgcggaagccattagcctgacgcagcgcttcaatgacagtggtatcgtcggctgcctgacggtaaccccttactacaatcgtccgtcgcaagaaggtttgtatcagcatttcaaagccatcgctgagcatactgacctgccgcaaattctgtataatgtgccgtcccgtactggctgcgatctgctcccggaaacggtgggccgtctggcgaaagtaaaaaatattatcggaatcaaagaggcaacagggaacttaacgcgtgtaaaccagatcaaagagctggtttcagatgattttgttctgctgagcggcgatgatgcgagcgcgctggacttcatgcaattgggcggtcatggggttatttccgttacggctaacgtcgcagcgcgtgatatggcccagatgtgcaaactggcagcagaagggcattttgccgaggcacgcgttattaatcagcgtctgatgccattacacaacaaactatttgtcgaacccaatccaatcccggtgaaatgggcatgtaaggaactgggtcttgtggcgaccgatacgctgcgcctgccaatgacaccaatcaccgacagtggtcgtgagacggtcagagcggcgcttaagcatgccggtttgctgtaaagtttagggagatttgatggcttactctgttcaaaagtcgcgcctggcaaaggttgcgggtgtttcgcttgttttattactcgctgcctgtagttctgac 1279
<210> 24
<211> 1750
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 人工序列的描述：LysC*基因序列
<400>24
cctgcgctagcgcaggccagaagaggcgcgttgcccaagtaacggtgttggaggagccagtcctgtgataacacctgagggggtgcatcgccgaggtgattgaacggctggccacgttcatcatcggctacaggggctgaatcccctgggttgtcaccagaagcgttcgcagtcgggcgtttcgcaagtggtggagcacttctgggtgaaaatagtagcgaagtatcgctctgcgcccacccgtcttccgctcttcccttgtgccaaggctgaaaatggatcccctgacacgaggtagttatgtctgaaattgttgtctccaaatttggcggtaccagcgtagctgattttgacgccatgaaccgcagcgctgatattgtgctttctgatgccaacgtgcgtttagttgtcctctcggcttctgctggtatcactaatctgctggtcgctttagctgaaggactggaacctggcgagcgattcgaaaaactcgacgctatccgcaacatccagtttgccattctggaacgtctgcgttacccgaacgttatccgtgaagagattgaacgtctgctggagaacattactgttctggcagaagcggcggcgctggcaacgtctccggcgctgacagatgagctggtcagccacggcgagctgatgtcgaccctgctgtttgttgagatcctgcgcgaacgcgatgttcaggcacagtggtttgatgtacgtaaagtgatgcgtaccaacgaccgatttggtcgtgcagagccagatatagccgcgctggcggaactggccgcgctgcagctgctcccacgtctcaatgaaggcttagtgatcacccagggatttatcggtagcgaaaataaaggtcgtacaacgacgcttggccgtggaggcagcgattatacggcagccttgctggcggaggctttacacgcatctcgtgttgatatctggaccgacgtcccgggcatctacaccaccgatccacgcgtagtttccgcagcaaaacgcattgatgaaatcgcgtttgccgaagcggcagagatggcaacttttggtgcaaaagtactgcatccggcaacgttgctacccgcagtacgcagcgatatcccggtctttgtcggctccagcaaagacccacgcgcaggtggtacgctggtgtgcaataaaactgaaaatccgccgctgttccgcgctctggcgcttcgtcgcaatcagactctgctcactttgcacagcctgaatatgctgcattctcgcggtttcctcgcggaagttttcggcatcctcgcgcggcataatatttcggtagacttaatcaccacgtcagaagtgagcgtggcattaatccttgataccaccggttcaacctccactggcgatacgttgctgacgcaatctctgctgatggagctttccgcactgtgtcgggtggaggtggaagaaggtctggcgctggtcgcgttgattggcaatgacctgtcaaaagcctgcggcgttggcaaagaggtattcggcgtactggaaccgttcaacattcgcatgatttgttatggcgcatccagccataacctgtgcttcctggtgcccggcgaagatgccgagcaggtggtgcaaaaactgcatagtaatttgtttgagtaaatactgtatggcctggaagctatatttcgggccgtattgattttcttgtcactatgctcatcaataaacgagcctgtactctgttaaccagcgtctttat 1750
<210> 25
<211> 1279
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 人工序列的描述：dapA*基因序列
<400>25
ataataaacgtgaactcttctcccagcatcgccaggcgactgtcttcaatattacagccgcaactactgacatgacgggtgatggtgttcacaattccagggcgatcggcacccaacgcagtgatcaccagataatgttgcgatgacagtgtcaaactggttattcctttaaggggtgagttgttcttaaggaaagcataaaaaaaacatgcatacaacaatcagaacggttctgtctgcttgcttttaatgccataccaaacgtaccattgagacacttgtttgcacagaggatggcccatgttcacgggaagtattgtcgcgattgttactccgatggatgaaaaaggtaatgtctgtcgggctagcttgaaaaaactgattgattatcatgtcgccagcggtacttcggcgatcgtttctgttggcaccactggcgagtccgctaccttaaatcatgacgaacatgctgatgtggtgatgatgacgctggatctggctgatgggcgcattccggtaattgccgggaccggcgctaacgctactgcgaccgccattagcctgacgcagcgcttcaatgacagtggtatcgtcggctgcctgacggtaaccccttactacaatcgtccgtcgcaagaaggtttgtatcagcatttcaaagccatcgctgagcatactgacctgccgcaaattctgtataatgtgccgtcccgtactggctgcgatctgctcccggaaacggtgggccgtctggcgaaagtaaaaaatattatcggaatcaaagaggcaacagggaacttaacgcgtgtaaaccagatcaaagagctggtttcagatgattttgttctgctgagcggcgatgatgcgagcgcgctggacttcatgcaattgggcggtcatggggttatttccgttacggctaacgtcgcagcgcgtgatatggcccagatgtgcaaactggcagcagaagggcattttgccgaggcacgcgttattaatcagcgtctgatgccattacacaacaaactatttgtcgaacccaatccaatcccggtgaaatgggcatgtaaggaactgggtcttgtggcgaccgatacgctgcgcctgccaatgacaccaatcaccgacagtggtcgtgagacggtcagagcggcgcttaagcatgccggtttgctgtaaagtttagggagatttgatggcttactctgttcaaaagtcgcgcctggcaaaggttgcgggtgtttcgcttgttttattactcgctgcctgtagttctgac 1279
<210> 26
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 人工序列的描述：引物pwsk-F
<400>26
GCTGCCTGTAGTTCTGACGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCC 47
<210> 27
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 人工序列的描述：引物pwsk-R
<400>27
GCGCTAGCGCAGGTTGCAGCACATCCCCCTTTCGC 35
<210> 28
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 人工序列的描述：引物lysC-F
<400>28
GGATGTGCTGCAACCTGCGCTAGCGCAGGCC 31
<210>29
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 人工序列的描述：引物lysC-R
<400>29
GGAGAAGAGTTCACGTTTATTATATAAAGACGCTGGTTAACAGAGTACAGGCTCG 55
<210>30
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 人工序列的描述：引物dapA-F
<400>30
CTCTGTTAACCAGCGTCTTTATATAATAAACGTGAACTCTTCTCCCAGC 49
<210>31
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 人工序列的描述：引物dapA-R
<400>31
CCAGGCTTTACACTTTATGCTTCGTCAGAACTACAGGCAGCG 42
<210>32
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 人工序列的描述：引物LysCT352I-F
<400>32
gtggcattaatccttgataccaccggttcaacctccactg 40
<210>33
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 人工序列的描述：引物LysCT352I-R
<400>33
gtatcaaggattaatgccacgctcacttctgacgtggtga 40
<210>34
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 人工序列的描述：引物dapAE84T-F
<400>34
CGCTAACGCTACTGCGACCGCCATTAGCCTGACG 34
<210>35
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 人工序列的描述：引物dapAE84T-R
<400>35
CGTCAGGCTAATGGCGGTCGCAGTAGCGTTAGCG 34
Claims (7)
1.一种利用rhsA基因缺失菌株通过发酵生产L-氨基酸的方法，其特征在于：通过在培养基中培养属于肠杆菌科，并具有L-氨基酸生产能力的细菌，该细菌于培养前进行了修饰，使得rhsA基因缺失，并从细菌的培养基或细胞收集L-氨基酸，来生产L-氨基酸。
2.根据权利要求1所述的利用rhsA基因缺失菌株通过发酵生产L-氨基酸的方法，其特征在于：采用rhsA基因缺失的菌株ATCC21151ΔrhsA，通过发酵的方法生产得到L-苏氨酸。
3.根据权利要求2所述的利用rhsA基因缺失菌株通过发酵生产L-氨基酸的方法，其特征在于：所述rhsA基因缺失的菌株ATCC21151ΔrhsA通过下述方法构建得到：
首先，制备菌株ATCC21151的感受态细胞；利用质粒pKD46进行转化，获得ATCC21151/pKD46菌株；然后，利用基因片段rhsAknock1转化ATCC21151/pKD46菌株的感受态细胞，获得的转化子利用引物rhsA1-F/rhsA1-R进行验证，验证正确的菌株命名为ATCC21151ΔrhsA::SacBCm；最后，利用基因片段rhsAknock2转化ATCC21151ΔrhsA::SacBCm菌株的感受态细胞，获得的转化子利用引物rhsA2-F/rhsA2-R进行验证，验证正确的菌株命名为ATCC21151ΔrhsA，至此L-苏氨酸生产所用的rhsA基因缺失的菌株ATCC21151ΔrhsA构建完毕。
4.根据权利要求1所述的利用rhsA基因缺失菌株通过发酵生产L-氨基酸的方法，其特征在于：采用rhsA基因缺失的菌株MG1655/pwsk-lysC*-dapA*ΔrhsA，通过发酵的方法生产得到L-赖氨酸。
5.根据权利要求4所述的利用rhsA基因缺失菌株通过发酵生产L-氨基酸的方法，其特征在于：所述rhsA基因缺失的菌株MG1655/pwsk-lysC*-dapA*ΔrhsA通过下述方法构建得到：
首先，制备菌株MG1655/pwsk-lysC*-dapA*的感受态细胞；利用质粒pKD46进行转化，获得MG1655/pwsk-lysC*-dapA*(pKD46)菌株；然后，利用基因片段rhsAknock2转化MG1655/pwsk-lysC*-dapA*(pKD46)菌株的感受态细胞，获得的转化子利用引物rhsA2-F/rhsA2-R进行验证，验证正确的菌株命名为MG1655/pwsk-lysC*-dapA*ΔrhsA::SacBCm；最后，利用基因片段rhsAknock2转化MG1655/pwsk-lysC*-dapA*ΔrhsA::SacBCm菌株的感受态细胞，获得的转化子利用引物rhsA2-F/rhsA2-R进行验证，验证正确的菌株命名为MG1655/pwsk-lysC*-dapA*ΔrhsA，至此L-赖氨酸生产所用的rhsA基因缺失的菌株MG1655/pwsk-lysC*-dapA*ΔrhsA构建完毕。
6.根据权利要求5所述的利用rhsA基因缺失菌株通过发酵生产L-氨基酸的方法，其特征在于：所述菌株MG1655/pwsk-lysC*-dapA*通过下述方法构建得到：
利用多片段重组的方法构建以低拷贝质粒pWSK29为出发载体，包含dapA基因表达框和lysC基因表达框的质粒pwsk-lysC-dapA；
以质粒pwsk-lysC-dapA为基础构建dapA和lysC突变体过表达质粒，得到质粒pwsk-lysC*-dapA*；
将质粒pwsk-lysC*-dapA*电转化至大肠杆菌MG1655；获得的菌株命名为MG1655/pwsk-lysC*-dapA*。
7.根据权利要求3或5所述的利用rhsA基因缺失菌株通过发酵生产L-氨基酸的方法，其特征在于：所述基因片段rhsAknock1和rhsAknock2通过以下方法构建得到：
首先，根据NCBI公布的大肠杆菌MG1655的基因组序列设计引物rhsAup1-F/rhsAup1-R和rhsAdown1-F/rhsAdown1-R，以大肠杆菌MG1655基因组为模板PCR扩增得到rhsA基因上下游个600-700bp的同源臂基因片段，PCR扩增参数为98℃2min；98℃20s，63℃20s，72℃40s，循环30次，72℃延伸10min；根据质粒ploi4162基因序列，设计引物SacBCm-F/SacBCm-R，以质粒ploi4162为模板，PCR扩增氯霉素(Cm)和蔗糖致死基因(SacB)基因序列，PCR扩增参数为98℃2min；98℃20s，56℃20s，72℃2.5min，循环30次；根据质粒pUC18基因序列，设计引物pUC1-F/pUC1-R，扩增线性pUC18基因片段，PCR扩增参数为98℃2min；98℃20s，57℃20s，72℃1.5min，循环30次；72℃延伸10min。获得基因片段通过凝胶电泳回收；
利用MultiS One Step Cloning Kit对上述获得片段进行连接，构建可用于扩增敲除rhsA基因的基因片段的载体，经华大基因公司测序正确后，质粒命名为rhsA1；根据质粒rhsA1基因序列，设计引物rhsA1-F/rhsA1-R，以质粒rhsA1为模板PCR扩增第一次rhsA基因敲除的基因片段rhsAknock1，PCR扩增参数为98℃2min；98℃20s，60℃20s，72℃2.5min，循环30次；获得基因片段通过凝胶电泳回收，用于进行rhsA基因第一轮敲除。
然后，根据NCBI公布的大肠杆菌MG1655的基因组序列设计引物rhsAup2-F/rhsAup2-R和rhsAdown2-F/rhsAdown2-R，以大肠杆菌MG1655基因组为模板PCR扩增得到rhsA基因上下游各600-700bp的同源臂基因片段，PCR扩增参数为98℃2min；98℃20s，60℃20s，72℃1min，循环30次，72℃延伸10min；根据质粒pUC18基因序列，设计引物pUC2-F/pUC2-R，扩增线性pUC18基因片段，PCR扩增参数为98℃2min；98℃20s，55℃20s，72℃3min，循环30次；72℃延伸10min；获得基因片段通过凝胶电泳回收；
利用MultiS One Step Cloning Kit对上述获得片段进行连接，构建可用于扩增敲除rhsA基因的基因片段的载体，经华大基因公司测序正确后，质粒命名为rhsA2；根据质粒rhsA2基因序列，设计引物rhsA2-F/rhsA2-R，以质粒rhsA2为模板PCR扩增第二次rhsA基因敲除的基因片段rhsAknock2，PCR扩增参数为98℃2min；98℃20s，57℃20s，72℃2.5min，循环30次；获得基因片段通过凝胶电泳回收，用于进行rhsA基因第二轮敲除。
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| CN1466630A (zh) * | 2000-09-30 | 2004-01-07 | 德古萨股份公司 | 使用肠细菌科菌株发酵生产l-氨基酸的方法 |
| CN105505969A (zh) * | 2014-09-26 | 2016-04-20 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 一种提高l-苏氨酸转化率的方法及其应用 |
-
2017
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|---|
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