CN111363710B - 一种通过糖多孢红霉菌sace_4839基因途径提高红霉素产量的方法 - Google Patents
一种通过糖多孢红霉菌sace_4839基因途径提高红霉素产量的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种通过糖多孢红霉菌SACE_4839基因途径提高红霉素产量的方法，属于基因工程技术领域，其是在糖多孢红霉菌中，通过基因工程途径缺失SACE_4839，获得红霉素高产工程菌株，并过表达靶基因SACE_4838，用所获得的菌株发酵生产红霉素可以大幅度提高产量，为工业生产提高红霉素产量提供新的技术支持。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种通过糖多孢红霉菌SACE_4839基因途径提高红霉素产量的方法。
背景技术
TetR家族转录调节因子是最常见的原核转录调控因子之一，以其家族中结构和功能研究最为清楚的四环素抗性阻遏蛋白(Tet repressor,TetR)而得名。随着越来越多TetR家族晶体结构的解析,可以发现它们通常以同源二聚体的形式结合在DNA上。每个单体都含有N端的DNA结合域和C端的小分子配体结合域。TetR家族在N端的DNA结合结构域上有高度的保守性，而C端的氨基酸组成差异较大，暗示了其结合的小分子配体具有结构多样性。TetR家族在微生物中的分布非常广泛，参与调控多药抗性、抗生素生物合成等重要生理活动。近年来在放线菌中发现了多种参与抗生素生物合成和形态分化的TetR家族转录调控子，表明TetR家族调控基因在放线菌抗生素生物合成中的重要性。
糖多孢红霉菌是一种栖息于土壤中的革兰氏阳性细菌，隶属于放线菌，最早于1952年被Waksman等人分离得到。红霉素是由糖多孢红霉菌产生的一种大环内酯类抗生素。红霉素包括红霉素A(Er-A)、红霉素B(Er-B)、红霉素C(Er-C)、红霉素D(Er-D)，而红霉素A因其抑菌活性最高被广泛应用于临床。以红霉素为基础又衍生出了地红霉素、克林霉素、阿奇霉素、罗红霉素、泰利霉素等新型药物，都被广泛的应用于临床。如何提高红霉素的产量，满足当前需求是人们急需解决的问题。通过基因工程途径改造糖多孢红霉菌，获得红霉素高产的菌株，具有可控制、操作简单、经济省时等优点，有很好的前景。
糖多孢红霉菌合成基因簇中不存在调控基因，而通过基因工程途径去改造糖多孢红霉菌的基因获得高产菌株只能从整个基因组中改造其它的调控基因。目前已报道的有参与糖多孢红霉菌孢子形态分化的SACE_7040和SACE_0012，以及调控红霉素合成的SACE_5599、SACE_3986、SACE_7301、SACE_3446、BldD(SACE_2077)、PccD(SACE_3396)和SACE_Lrp(SACE_5388)等。
发明内容
本发明目的在于提供一种通过糖多孢红霉菌SACE_4839基因途径提高红霉素产量的方法，通过基因工程途径在糖多孢红霉菌中失活负调控基因SACE_4839，提高糖多孢红霉菌的红霉素产量。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种通过糖多孢红霉菌SACE_4839基因途径提高红霉素产量的方法，其是通过SACE_4839基因产物可负调控红霉素生物合成，在糖多孢红霉菌中失活SACE_4839基因，以提高红霉素产量。
通过基因工程途径在糖多孢红霉菌中失活SACE_4839基因，获得红霉素高产工程菌株，提高了红霉素生物合成的产量，用所述菌株发酵生产红霉素。
本发明的优点是：
本发明研究中筛选到了红霉素生物合成负调控子SACE_4839，通过基因工程途径失活糖多孢红霉菌染色体上SACE_4839基因，能够获得红霉素高产菌株，为工业生产提高红霉素产量提供技术支持。
糖多孢红霉菌A226中失活SACE_4839基因时，红霉素产量提高了38％；在ΔSACE_4839缺失突变株中回补SACE_4839基因，红霉素产量得到恢复；在A226中增加SACE_4839的拷贝数，红霉素产量下降33％，从而表明SACE_4839是一个参与红霉素生物合成的负调控因子。以红霉素高产菌株WB作为出发菌株，缺失SACE_4839基因，所获得的突变株WBΔSACE_4839较WB红霉素产量提高约23％。在失活SACE_4839基因的工业菌株中过表达靶基因SACE_4838,红霉素产量增加了47.8％。
附图说明
图1为ΔSACE_4839基因及周边邻近基因在染色体上的位置信息以及突变体构建示意图和缺失突变株的PCR鉴定；
(A)ΔSACE_4839基因及周边邻近基因在染色体上的位置信息；
(B)ΔSACE_4839突变体构建示意图；
(C)ΔSACE_4839突变体的PCR鉴定：SACE_4839基因(618bp)被tsr抗性基因(1367bp)替换；M,5000bp DNA Marker；
图2为ΔSACE_4839突变株和出发菌株A226菌株的抑菌实验；
图3：(A)为ΔSACE_4839突变株和出发菌株A226菌株的孢子生长情况；
(B)为ΔSACE_4839突变株和出发菌株A226菌株菌丝体的生物量测定；
图4为出发菌株A226、缺失突变株ΔSACE_4839、缺失回补菌株ΔSACE_4839/pIB139-4839及回补空载对照菌株A226/pIB139、过表达菌A226/pIB139-4839及过表达空载对照菌株A226/pIB139红霉素A的HPLC分析；
图5为ΔSACE_4839与出发菌株A226中相关基因转录分析，SACE_4839缺失突变株中；
(A)红霉素生物合成基因簇中eryAI(SACE_0721)以及红霉素抗性基因ermE(SACE_0733)的转录情况，两者转录水平提高；
(B)SACE_4839缺失突变株中，自身基因与邻近邻近基因的转录情况，SACE_4839自身转录水平降低，SACE_4838转录水平升高；
“*”表示p<0.05；“**”表示p<0.01；“***”表示p<0.001。
图6为SACE_4839蛋白的表达及其纯化；
(A)SDS-PAGE检测SACE_4839蛋白的诱导表达及纯化：6泳道显示的为纯化后的目的蛋白；1-5泳道显示的是不同浓度咪唑洗脱后的洗脱液
(B)SDS-PAGE分析纯化后SACE_4839蛋白及分子大小；
图7：SACE_4839蛋白的EMSA分析
(A)EMSA分析SACE_4839蛋白与eryAI启动子区的结合情况。
(B)EMSA分析SACE_4839蛋白与ermE启动子区的结合情况。
(C)EMSA分析SACE_4839蛋白与邻近基因间隔区PSACE_4838-4839的结合情况；
图8：(A)ΔSACE_4838突变株和出发菌株A226菌株的孢子生长情况；
(B)ΔSACE_4838突变株和出发菌株A226菌株菌丝体的生物量测定；
图9为出发菌株A226、缺失突变株ΔSACE_4838、缺失回补菌株ΔSACE_4838/pIB139-4838及回补空载对照菌株A226/pIB139、过表达菌A226/pIB139-4838及过表达空载对照菌株A226/pIB139红霉素A的HPLC分析；
图10为ΔSACE_4838与出发菌株A226中相关基因转录分析，SACE_4838缺失突变株中，(A)红霉素生物合成基因簇中eryAI(SACE_0721)以及红霉素抗性基因ermE(SACE_0733)的转录情况，两者转录水平降低；
(B)SACE_4838缺失突变株中，自身基因与邻近邻近基因的转录情况，两者转录水平降低；
“*”表示p<0.05；“**”表示p<0.01；“***”表示p<0.001。
图11：WBΔSACE_4839以及WBΔSACE_4839/pIB139-4839 PCR鉴定示意图；
图12：所示为高产菌株WB中改造SACE_4839可提高红霉素产量，并在WBΔSACE_4839突变株过量表达其靶基因SACE_4838,同样可提高红霉素产量；“*”表示p<0.05，“***”表示p<0.001。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例
实施例中使用到的菌株和质粒见表1。大肠杆菌在37℃的液体LB培养基或在添加1.25％琼脂的固体LB平板上培养。红霉素产生菌糖多孢红霉菌及其工程菌株在30℃胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)培养基或在含有2.2％琼脂的R3M平板上培养。
表1本实施例中所用的菌种和质粒
实施例中PEG3350、溶菌酶、TES、酪蛋氨基酸、硫链丝菌肽、安普霉素从Sigma公司购买。TSB、酵母提取物、蛋白胨购买于Oxoid公司。甘氨酸、琼脂粉、氯化钠和其它生物学试剂都购于试剂公司。大肠杆菌和糖多孢红霉菌的一般操作技术按照标准操作。引物的合成和DNA测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。
1、SACE_4839基因缺失、回复与过表达菌株的构建
pUCTSR质粒是在pUC18的BamHI和SmaI酶切位点之间插入1367bp的硫链丝菌肽抗性；以4839-P1/4839-P2和4839-P3/4839-P4为引物，糖多孢红霉菌A226基因组为模板，PCR扩增SACE_4839基因的上、下游各约1.5kb的同源片段。PCR引物序列为：
4839-P1:aaaaagcttataacaaccccaaatgagat(HindIII)；
4839-P2:aaatctagacggccgcgcgcgcgatgtcg(XbaI)；
4839-P3:aaaggtaccatgccggggaccagaccggg(KpnI)；
4839-P4:aaagaattccccatgctggtttcgggcg(EcoRI)
分别将这两个4839-U和4839-D上下游片段分别连接到pUCTSR的tsr抗性基因序列两侧，完成构建质粒pUCTSRΔ4839；以4839-P1和4839-P4为引物、pUCTSRΔ4839质粒为模板，PCR扩增tsr-Δ4839大片段，利用染色体片段同源重组技术将tsr-Δ4839大片段转化至糖多孢红霉菌原生质体中，通过硫链丝菌肽抗性筛选阳性突变株，获得SACE_4839基因被tsr替换的基因工程菌株。以4839-P5和4839-P6作为鉴定引物，以质粒pUCTSRΔ4839为阳性模板，A226基因组为阴性模板进行PCR鉴定，阳性缺失突变体命名为ΔSACE_4839。鉴定引物及基因回复与过表达序列为：
4839-P5:aatcatatggtgactgactcagcgaagcc(NdeI)
4839-P6:aaatctagatcaaccggctccgctgttcc(XbaI)
利用设计的引物4839-P5和4839-P6扩增出SACE_4839基因，并电泳回收，使用NdeI和Xba I内切酶分别对回收到的SACE_4839基因片段与pIB139进行双酶切并回收，通过T4DNA连接酶将SACE_4839基因片段连接到pIB139上，成功获得整合型质粒pIB139-4839。然后通过PEG介导的原生质体转化方法将pIB139-4839导入ΔSACE_4839原生质体中。通过安普霉素初步筛选，以安普霉素抗性基因(apr)为对象进行PCR鉴定，获得的回复菌株命名为ΔSACE_4839/pIB139-4839。pIB139-4839通过PEG介导的原生质体转化技术导入糖多孢红霉菌A226原生质体中，以安普霉素抗性基因(apr)为对象进行PCR鉴定，获得过表达菌株命名为A226/pIB139-4839。引物序列为：
apr-F:ggagtgcatatggtgcaatacgaatggcgaaaag；
apr-R:ctcaaagcttcagccaatcgactggcgagcg
2、糖多孢红霉菌发酵产物的HPLC检测
接种糖多孢红霉菌系列菌株至TSB培养基中，在30℃振荡培养48小时后，转接至R5液体培养基，30℃振荡培养6天，然后利用有机溶剂对发酵液进行萃取，使用水浴锅蒸干后，加入1mL甲醇溶解并使用0.22μm有机滤膜处理，后上机检测样品中的红霉素A含量。
3、SACE_4839蛋白表达纯化及EMSA实验
使用设计的引物4839-22b_F和4839-22b_R扩增出SACE_4839基因，使用Nde I和Hind III酶进行双酶切并回收，插入到pET22b的Nde I和Hind III酶切位点之间，构建出质粒pET22b-4839，然后将其导入到BL21(DE3)感受态中，得到蛋白表达宿主BL21(DE3)-4839。
将得到的蛋白表达菌种BL21(DE3)-4839以1％的接种量接种到摇管中进行过夜培养，再以2％的接种量接种到50ml液体LB(已加入氨苄抗生素)摇瓶中，37℃培养至OD600达到0.4-0.5时加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG，并于16℃诱导20h，培养结束后取适量菌液热变性后进行SDS-PAGE分析，检测目的蛋白是否成功表达。如图6示
成功表达后的目的蛋白进行镍柱纯化，先使用适量浓度的梯度咪唑缓冲液洗脱杂蛋白，最后用500mM咪唑缓冲液将目的蛋白洗脱下来，即得到纯化后的目的蛋白。取适量上述纯化的目的蛋白分别与SACE_4839邻近基因间隔区序列(包括SACE_4839与SACE_4838间隔区及两端延伸基因内部的120bp)、eryAI启动子区以及ermE启动子区进行混合，加入一定量的结合缓冲液，于30℃孵育10min，进行活性PAGE分析，观察蛋白与DNA的结合情况。如图7示4839-22b_F：aaacatatggtgactgactcagcgaagcc4839-22b_R：aaaaagctttcaaccggctccgctgtt
4、ΔSACE_4839中相关基因的转录分析：
收集24h的ΔSACE_4839和出发菌株A226菌液，提取获得所需RNA，反转成cDNA后，使用实时荧光定量PCR仪上机检测，如图5示。
所用引物为：
1801-1：ccaagggctacaagttctcg
1801-2：accgagcttgttgatgacct
eryAI-1：ccgctgatgccgaacgac
eryAI-2：cacccttccccgcactctg
ermE-1：ctgttcgagtgggagttcgt
ermE-2：accatcgactcgtagcgttc
4838-1：gtcctgctttcctcccagat
4838-2：gaagatcgtgcgttcggtg
4839-1：actacttcaagaccaaggacga
4839-2：gatccaggcctcgacgag
5、SACE_4838基因缺失、回复与过表达菌株的构建
pUCTSR质粒是在pUC18的BamHI和SmaI酶切位点之间插入1367bp的硫链丝菌肽抗性；以4838-P1/4838-P2和4838-P3/4838-P4为引物，糖多孢红霉菌A226基因组为模板，PCR扩增SACE_4838基因的上、下游各约1.5kb的同源片段。PCR引物序列为：
4838-P1:aaaaagcttaaggacaacaacgaggcgat(HindIII)；
4838-P2:aaaggatccagcaggacgaagaaggcgtc(BamH1)；
4838-P3:aaaggtaccgtcttgggcgaggaagtc(KpnI)；
4838-P4:aaagaattcatctcatttgggtgtgtttc(EcoRI)
分别将这两个4838-U和4838-D上下游片段分别连接到pUCTSR的tsr抗性基因序列两侧，完成构建质粒pUCTSRΔ4838；以4838-P1和4838-P4为引物、pUCTSRΔ4838质粒为模板，PCR扩增tsr-Δ4838大片段，利用染色体片段同源重组技术将tsr-Δ4838大片段转化至糖多孢红霉菌原生质体中，通过硫链丝菌肽抗性筛选阳性突变株，获得SACE_4838基因被tsr替换的基因工程菌株。以4838-P5和4838-P6作为鉴定引物，以质粒pUCTSRΔ4838为阳性模板，A226基因组为阴性模板进行PCR鉴定，阳性缺失突变体命名为ΔSACE_4838。鉴定引物及基因回复与过表达序列为：
4838-p5:aaa catatgatgatcgtggtgacaggcgc(NdeI)
4838-p6:aaatctagactaccggaaggccggcaggt(XbaI)
利用设计的引物4838-P5和4838-P6扩增出SACE_4838基因，并电泳回收，使用NdeI和Xba I内切酶分别对回收到的SACE_4838基因片段与pIB139进行双酶切并回收，通过T4连接酶将SACE_4838基因片段连接到pIB139上，成功获得整合型质粒pIB139-4838。然后通过PEG介导的原生质体转化方法将pIB139-4838导入ΔSACE_4838原生质体中。通过安普霉素初步筛选，以安普霉素抗性基因(apr)为对象进行PCR鉴定，获得的回复菌株命名为ΔSACE_4838/pIB139-4838。pIB139-4838通过PEG介导的原生质体转化技术导入糖多孢红霉菌A226原生质体中，以安普霉素抗性基因(apr)为对象进行PCR鉴定，获得过表达菌株命名为A226/pIB139-4838。(同1中apr引物)
6、SACE_4838系列菌株糖多孢红霉菌发酵产物的HPLC检测接种糖多孢红霉菌系列菌株至TSB培养基中，在30℃振荡培养48小时后，转接至R5液体培养基，30℃振荡培养7天，然后利用有机溶剂对发酵液进行萃取，使用水浴锅蒸干后，加入1mL甲醇溶解并使用0.22μm有机滤膜处理，后上机检测样品中的红霉素A含量。
7、ΔSACE_4838中相关基因的转录分析：
收集24h的ΔSACE_4838和出发菌株A226菌液，提取获得所需RNA，反转成cDNA后，使用实时荧光定量PCR仪上机检测，如图10示所用引物为：(同4所用引物)
8、工业高产菌株WB中SACE_4839及其靶基因的组合改造
利用染色体片段同源重组技术将，在红霉素高产菌株WB中，构建SACE_4839基因缺失突变体，命名为WBΔSACE_4839。在工业菌株中失活SACE_4839基因，同时过表达靶基因SACE_4838，获得红霉素高产工程菌株，命名为WBΔSACE_4839/pIB139-4838。
结果分析：
SACE_4839与临近基因在糖多孢红霉菌染色体上的位置参见KEGG(https://www.kegg.jp/5405654..5406271)。SACE_4839基因缺失突变株ΔSACE_4839构建过程见图1B。SACE_4839基因缺失突变体在含有30μg/ml硫链丝菌肽的R3M平板上筛选并通过PCR证实(图1C)。
ΔSACE_4839在R5液体培养基中发酵7天，离心收集发酵上清液；点样于含枯草芽孢杆菌菌液的LB平板表面，37℃培养12小时后观察平板上抑菌圈大小，结果显示：ΔSACE_4839的发酵液抑菌圈较A226明显偏大(图2)，初步推断SACE_4839基因可能是负调节红霉素的产量。
为了验证突变体ΔSACE_4839中红霉素产量的提高是因为SACE_4839基因缺失引起的，将SACE_4839基因表达载体pIB139-4839和pIB139载体(作为对照)，分别导入ΔSACE_4839突变株和出发菌株A226的原生质体中，获得回复菌株及空载ΔSACE_4839/pIB139-4839、ΔSACE_4839/pIB139，过表达菌株及空载A226/pIB139-4839、A226/pIB139。后将A226及ΔSACE_4839系列突变株进行摇瓶发酵，HPLC检测结果显示：ΔSACE_4839的红霉素A产量较A226升高38％；回复菌株ΔSACE_4839/pIB139-4839的红霉素A产量较A226基本恢复；A226/pIB139-4839的红霉素A产量相比于A226降低33％(图4)。这些结果表明SACE_4839负调控红霉素的生物合成。
测定发酵7天的ΔSACE_4838突变株与A226菌株的菌体干重，绘制相应变化曲线，结果显示ΔSACE_4838较A226的生物量差异不大(图3B)，暗示着SACE_4839基因的缺失并未影响菌体的初级代谢。为了确定SACE_4839基因是否调控菌体的孢子形成，将突变株ΔSACE_4839、过表达菌株A226/pIB139-4839以及野生型对照菌株A226同时涂于R3M平板上，30℃培养72小时，观察菌株孢子生长情况。结果显示相比于A226，ΔSACE_4839突变体的孢子形态无明显差异(图3A)，说明SACE_4839基因缺失不影响孢子的形成。
ΔSACE_4839在R5液体培养基中发酵7天，离心收集发酵上清液；点样于含枯草芽孢杆菌菌液的LB平板表面，37℃培养12小时后观察平板上抑菌圈大小，结果显示：ΔSACE_4839的发酵液抑菌圈较A226明显偏大(图2)，初步推断SACE_4839基因可能是负调节红霉素的产量。
为了验证突变体ΔSACE_4838中红霉素产量的提高是因为SACE_4838基因缺失引起的，将SACE_4838基因表达载体pIB139-4838和pIB139载体(作为对照)，分别导入ΔSACE_4838突变株和出发菌株A226的原生质体中，获得回复菌株及空载ΔSACE_4838/pIB139-4838、ΔSACE_4838/pIB139，过表达菌株及空载A226/pIB139-4838、A226/pIB139。后将A226及ΔSACE_4838系列突变株进行摇瓶发酵，HPLC检测结果显示：ΔSACE_4838的红霉素A产量较A226降低30％；回复菌株ΔSACE_4838/pIB139-4838的红霉素A产量较A226基本恢复；A226/pIB139-4838的红霉素A产量相比于A226升高18％(图9)。这些结果表明SACE_4838正调控红霉素的生物合成。
测定发酵6天的ΔSACE_4838突变株与A226菌株的菌体干重，绘制相应变化曲线，结果显示ΔSACE_4838较A226的生物量差异不大(图8B)，暗示着SACE_4838基因的缺失并未影响菌体的初级代谢。为了确定SACE_4838基因是否调控菌体的孢子形成，将突变株ΔSACE_4838、过表达菌株A226/pIB139-4838以及野生型对照菌株A226同时涂于R3M平板上，30℃培养72小时，观察菌株孢子生长情况。结果显示相比于A226，ΔSACE_4838突变体的孢子形态无明显差异(图8A)，说明SACE_4838基因缺失不影响孢子的形成。
后将WB/ΔSACE_4839,WBΔSACE_4839/pIB139-4838突变株及工业高产菌株WB涂板活化，然后分别接入工业种子培养基的摇瓶中，30℃转速220rpm下培养2天后，转接工业发酵培养基中，继续培养7天。发酵结束后萃取浓缩经HPLC分析，相比较出发菌株WB，WBΔSACE_4839,WBΔSACE_4839/pIB139-4838的红霉素产量分别提高了23％和47.8％(图11)。这说明在高产菌株WB中失活SACE_4839基因并且过表达靶基因SACE_4838同样可以提高红霉素产量。
序列表
<110> 安徽大学
<120> 一种通过改造糖多孢红霉菌SACE_4839基因提高红霉素产量的方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 662
<212> DNA
<213> 糖多孢红霉菌(Saccharopolyspora erythraea)
<400> 1
aaaaagctta taacaacccc aaatgagata aatctagacg gccgcgcgcg cgatgtcgaa 60
aggtaccatg ccggggacca gaccgggaaa gaattcccca tgctggtttc gggcgaatca 120
tatggtgact gactcagcga agccaaatct agatcaaccg gctccgctgt tccggagtgc 180
atatggtgca atacgaatgg cgaaaagctc aaagcttcag ccaatcgact ggcgagcgaa 240
acatatggtg actgactcag cgaagccaaa aagctttcaa ccggctccgc tgttccaagg 300
gctacaagtt ctcgaccgag cttgttgatg acctccgctg atgccgaacg accacccttc 360
cccgcactct gctgttcgag tgggagttcg taccatcgac tcgtagcgtt cgtcctgctt 420
tcctcccaga tgaagatcgt gcgttcggtg actacttcaa gaccaaggac gagatccagg 480
cctcgacgag aaaaagctta aggacaacaa cgaggcgata aaggatccag caggacgaag 540
aaggcgtcaa aggtaccgtc ttgggcgagg aagtcaaaga attcatctca tttgggtgtg 600
tttcaaacat atgatgatcg tggtgacagg cgcaaatcta gactaccgga aggccggcag 660
gt 662
Claims (2)
1.一种通过糖多孢红霉菌SACE_4839基因途径提高红霉素产量的方法，其特征在于：通过基因工程途径在糖多孢红霉菌中失活SACE_4839基因，获得产红霉素工程菌株，用所述工程菌株发酵生产红霉素，所述SACE_4839基因的核苷酸序列如序列1所示。
2.根据权利要求1所述的一种通过糖多孢红霉菌SACE_4839基因途径提高红霉素产量的方法，其特征在于：在失活SACE_4839基因的同时过表达靶基因SACE_4838，所述SACE_4838基因通过PCR扩增获得，所述扩增引物为4838-p5:aaa catatgatgatcgtggtgacaggcgc(NdeI)和4838-p6:aaatctagactaccggaaggccggcaggt(XbaI)，所述扩增的模板为糖多孢红霉菌A226基因组。
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