CN115433685B

CN115433685B - 一种通过改造糖多孢红霉菌sace_5812基因途径提高红霉素产量的方法

Info

Publication number: CN115433685B
Application number: CN202210644809.2A
Authority: CN
Inventors: 吴攀攀; 吴杭; 张部昌; 张弛
Original assignee: Anhui University
Current assignee: Anhui University
Priority date: 2022-06-08
Filing date: 2022-06-08
Publication date: 2023-03-03
Anticipated expiration: 2042-06-08
Also published as: CN115433685A

Abstract

本发明提供了一种通过改造糖多孢红霉菌SACE_5812基因途径提高红霉素产量的方法，通过基因工程方法在糖多孢红霉菌菌株A226中敲除SACE_5812基因，或者，过表达其靶基因SACE_5813，或者，通过基因工程方法敲除糖多孢红霉菌基因组上的SACE_5812基因，并在SACE_5812缺失突变株基础上，过表达其靶基因SACE_5813，以获得红霉素高产工程菌株，利用所述红霉素高产工程菌株发酵生产红霉素。本发明的优点在于：用所获得的红霉素高产工程菌株发酵生产红霉素，可以大幅度提高产量，为工业生产提高红霉素产量提供新的技术支持。

Description

一种通过改造糖多孢红霉菌SACE_5812基因途径提高红霉素产量的方法

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种通过改造糖多孢红霉菌SACE_5812基因途径提高红霉素产量的方法。

背景技术

放线菌可产生诸多具有生物活性的次级代谢物，如抗生素、杀虫剂、降胆固醇药物、抗癌药物和免疫抑制剂等。目前有2/3以上的抗生素由放线菌产生，广泛应用于临床、农业与畜牧业等领域。然而，这些抗生素的原始产量普遍偏低，需要通过复杂的筛选才能获得工业生产的高产菌株。传统的随机诱变育种不但耗时，而且无法对菌种进行理性设计。通过基因工程途径改造获得高产工程菌株，具有可控制、操作简单、经济省时等优点，应用前景良好。

红霉素是一类具有广谱抗菌效果的大环内酯类抗生素，主要由糖多孢红霉菌(Saccharopolyspora erythraea)发酵产生，包括红霉素A、红霉素B、红霉素C和红霉素D四种组分，其中红霉素A为主要活性成分。红霉素的多种衍生物如克拉霉素、阿奇霉素、罗红霉素、泰利霉素等已被广泛应用于临床治疗。目前红霉素及其衍生物在全球市场每年销售额达数百亿美元，因此提高红霉素工业生产菌种的产量具有重要的经济和社会价值。

转录调控因子是决定菌种工业发酵产率高低的关键因素之一。糖多孢红霉菌基因组中存在着众多的转录调控因子家族，例如TetR、Lrp、MarR、LysR、ArsR、OmpR、LuxR和GntR等，其中TetR家族转录调控因子(TetR family transcriptional regulators,TFRs)有101个，数量最多。TFRs的调控功能非常广泛，主要涉及抗生素生物合成、形态分化、群体感应、生物膜形成、药物外排、细胞间信号转导等诸多生理活动。目前，已报道多个参与糖多孢红霉菌红霉素生物合成的TFRs，如SACE_3986、SACE_7301、SACE_3446、SACE_5754、SACE_0303和AcrT(SACE_3980)等，表明TFRs对红霉素生物合成产量具有重要的调控作用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种通过改造糖多孢红霉菌SACE_5812基因途径提高红霉素产量的方法。

本发明采用以下技术方案解决上述技术问题：

一种通过改造糖多孢红霉菌SACE_5812基因途径提高红霉素产量的方法，通过基因工程方法在糖多孢红霉菌菌株A226中敲除SACE_5812基因，获得红霉素高产工程菌株，利用所述红霉素高产工程菌株发酵生产红霉素；所述SACE_5812基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

作为本发明的优选方式之一，所述SACE_5812基因编码的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

作为本发明的优选方式之一，所述SACE_5812基因负向调控红霉素生物合成。

一种通过改造糖多孢红霉菌SACE_5812基因途径提高红霉素产量的方法，通过基因工程方法在糖多孢红霉菌菌株A226中过表达SACE_5812基因的靶基因SACE_5813，获得红霉素高产工程菌株，利用所述红霉素高产工程菌株发酵生产红霉素；其中，所述SACE_5813基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

作为本发明的优选方式之一，所述SACE_5813基因编码的氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示。

作为本发明的优选方式之一，所述SACE_5813基因正向影响红霉素生物合成。

一种通过改造糖多孢红霉菌SACE_5812基因途径提高红霉素产量的方法，通过基因工程方法在糖多孢红霉菌菌株A226中敲除SACE_5812基因，同时过表达SACE_5813基因，获得红霉素高产组合工程菌株，利用所述红霉素高产组合工程菌株发酵生产红霉素；其中，所述SACE_5812基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述SACE_5813基因为SACE_5812基因途径中的靶基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

作为本发明的优选方式之一，所述SACE_5813基因正向影响红霉素生物合成；所述SACE_5812基因通过抑制所述SACE_5813基因的转录，实现对红霉素生物合成的负向调控。

研究过程及思路：

首先，本发明通过在糖多孢红霉菌A226中敲除SACE_5812基因，发现红霉素A产量提高了26％；通过在ΔSACE_5812突变株中回补SACE_5812基因，发现红霉素产量得到恢复；通过在A226中过表达SACE_5812基因，发现红霉素A产量降低25％。由此证明，SACE_5812可有效负调控红霉素的产生。

接着，继续研究了ΔSACE_5812与A226中相关基因的转录水平，发现SACE_5812可直接抑制SACE_5813、eryAI和ermE的转录；同时，进一步地研究了SACE_5813与红霉素产量的关系，发现在A226中增加靶基因SACE_5813的基因拷贝时，红霉素A产量较A226提高了31％。这进一步证明，SACE_5813基因正向影响红霉素生物合成，而SACE_5812基因则通过抑制所述SACE_5813基因的转录，实现对红霉素生物合成的负向调控。

最后，通过在菌株A226中进行SACE_5812敲除和SACE_5813过表达的组合改造，发现最终工程突变菌株的红霉素A产量较A226增加了47％。由此获得具有超高红霉素A产量的工程突变菌株。

本发明相比现有技术的优点在于：

本发明筛选到了调控红霉素生物合成的转录因子SACE_5812(负调控红霉素生物合成)以及SACE_5812基因途径中的靶基因SACE_5813(正向影响红霉素生物合成)，通过基因工程技术敲除糖多孢红霉菌基因组上的SACE_5812基因，或者，增加其靶基因SACE_5813的拷贝，可获得红霉素高产工程菌株；通过基因工程技术敲除糖多孢红霉菌基因组上的SACE_5812基因，并在SACE_5812缺失突变株基础上，增加其靶基因SACE_5813的拷贝，可获得红霉素高产的工程组合改造菌株；用所获得的红霉素高产工程菌株与工程组合改造菌株发酵生产红霉素，可以大幅度提高产量，为工业生产提高红霉素产量提供新的技术支持。

附图说明

图1是SACE_5812基因及周边邻近基因在基因组上的位置信息图；

图2是本发明中片段同源重组技术图示和ΔSACE_5812的构建及其产物分析(图2中，A图为ΔSACE_5812突变体构建的示意图；B图为ΔSACE_5812的PCR鉴定，该图中，糖多孢红霉菌基因组上的SACE_5812基因部分序列被硫链丝菌肽抗性基因(tsr)所替换，SACE_5812(711bp)中部分序列被tsr(1360bp)替换后长度增加至1690bp；M：5000bp DNA Marker；C图为出发菌株A226与ΔSACE_5812发酵液的抑菌实验；D图为A226与ΔSACE_5812的红霉素A产量分析，“*”表示P<0.05)；

图3是ΔSACE_5812/pIB5812、ΔSACE_5812/pIB139和A226/pIB5812的构建(图3中，A图为回补菌株ΔSACE_5812/pIB5812的PCR鉴定；B图为回补对照菌株ΔSACE_5812/pIB139的PCR鉴定；C图为过表达菌株A226/pIB5812的PCR鉴定，该图中，目的条带为776bp的安普霉素抗性基因aac(3)IV；M：5000bp DNA Marker)；

图4是SACE_5812基因系列菌株中红霉素A产量的HPLC分析(图4中，“*”表示P<0.05；“ns”表示无显著差异)；

图5是菌株A226与ΔSACE_5812的表型分析(图5中，A图为A226与ΔSACE_5812孢子发育的比较；B图为A226与ΔSACE_5812菌丝体干重的测定)；

图6是A226与ΔSACE_5812中SACE_5813、eryAI和ermE的转录分析(图6中，“**”表示P<0.01；“***”表示P<0.001)；

图7是SACE_5812蛋白的纯化及其与靶点的EMSA分析(图7中，A图为SACE_5812蛋白的分离纯化；B图为SACE_5812与靶基因间隔区SACE_5812-5813-int的EMSA分析；C图为SACE_5812与基因间隔区eryAI-BIV-int的EMSA分析；D图为SACE_5812与基因间隔区ermE-eryCI-int的EMSA分析)；

图8是靶基因SACE_5813过表达菌株的构建及其红霉素A产量检测(A图为SACE_5813过表达菌株A226/pIB5813的PCR鉴定；B图为A226与A226/pIB5813的红霉素A产量分析，该图中，“*”表示P<0.05)；

图9是SACE_5812和SACE_5813工程组合改造菌株的红霉素A产量检测(图9中，“*”表示P<0.05)。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

下述实施例中使用到的菌株和质粒见表1，合成的引物序列见表2。其中，出发菌株为糖多孢红霉菌A226(CGMCC 8279)，为可直接购买获得的菌株。

同时，下述实施例中使用到的大肠杆菌在37℃的液体LB培养基或在添加1.25％琼脂的固体LB平板上培养。红霉素生产菌糖多孢红霉菌在30℃条件下的胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)、液体R5或添加2.2％琼脂的固体R5培养基上培养。

下述实施例中使用到的溶菌酶、TES、PEG3350、硫链丝菌肽、安普霉素购置于Sigma公司。TSB、酪蛋白氨基酸、酵母提取物、蛋白胨购置于Oxoid公司。甘氨酸、琼脂和其它化学品均购置于试剂公司。大肠杆菌和糖多孢红霉菌的常规操作参照标准操作技术进行。DNA合成和测序委托生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

表1本发明涉及的菌株和质粒及其主要性质

表2本发明涉及的引物

实施例1

SACE_5812基因敲除突变株的构建及其初步产物分析：

基于KEGG数据库(https://www.kegg.jp/)的基因注释信息，糖多孢红霉菌基因组中SACE_5812及其周边基因的位置信息与潜在基因功能如图1所示。SACE_5812基因全长为711bp，由236个氨基酸组成，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码的氨基酸序列如SEQID NO.2所示。

SACE_5812基因敲除过程如图2A所示。利用表2中引物对5812-U-F/R和5812-D-F/R，以糖多孢红霉菌A226基因组DNA为模板，分别扩增得到SACE_5812基因的上、下游约1.5kb的同源臂。然后将这两条同源臂分别连接至pUCTSR中tsr基因的两侧，构建重组质粒pUCTSRΔ5812。以该质粒为模板，使用引物对5812-F/R，扩增出包含SACE_5812上下游同源臂和tsr基因的DNA片段。利用PEG化学介导方法将上述片段导入糖多孢红霉菌A226的原生质体，经线性片段同源双交换和硫链丝菌肽抗性筛选，构建SACE_5812基因被tsr替换的重组工程菌株。使用引物对5812-V-F/R，以上述pUCTSRΔ5812为阳性对照模板，A226基因组DNA为阴性对照模板进行PCR鉴定，成功鉴定的工程突变株命名为ΔSACE_5812(图2B)。

取长势良好的突变株ΔSACE_5812和出发菌株A226的孢子分别转接至50mL TSB培养基中，30℃振荡培养48小时后，以10％比例的接种量将种子液转接至液体R5培养基，相同发酵条件下继续培养7天。一方面离心收集少量发酵上清液，使用微量上样器准确吸取5.0μL上清液，悬滴于覆盖有枯草芽孢杆菌的固体LB平板表面，于37℃培养约12小时后观察抑菌圈大小；另一方面使用氯仿对发酵液进行萃取以获得红霉素，利用1mL甲醇充分溶解蒸干后的样品，经过滤处理后，使用HPLC检测分析各样品的红霉素A浓度。抑菌实验(图2C)和HPLC结果(图2D)显示，ΔSACE_5812发酵液的抑菌圈直径明显大于A226的，同时前者的红霉素A产量相比于后者的显著提高，初步表明SACE_5812可能负调控红霉素的产生。

实施例2

SACE_5812基因回补与过表达菌株的构建：

为了进一步确认SACE_5812对红霉素产量的调控作用，利用表2中引物对5812-CO-F/R，以A226基因组为模板，扩增得到SACE_5812基因片段，对该片段和pIB139质粒分别进行NdeI/XbaI双酶切处理，然后利用T4连接酶将SACE_5812基因连接至pIB139，成功构建重组质粒pIB5812。然后，在PEG介导下，将质粒pIB5812或pIB139导入到ΔSACE_5812与A226的原生质体。经安普霉素抗性筛选、阳性克隆子中安普霉素抗性基因aac(3)IV的PCR鉴定(图3)，成功构建出SACE_5812基因回补菌株ΔSACE_5812/pIB5812和回补对照菌株ΔSACE_5812/pIB139，以及过表达菌株A226/pIB5812。

实施例3

SACE_5812基因系列菌株发酵产物的HPLC检测：

参照实施例1中菌株的发酵培养和HPLC检测方法，对SACE_5812基因系列菌株培养7天后的发酵液进行萃取，并使用HPLC检测各样品的红霉素A含量。结果如图4所示，ΔSACE_5812的红霉素A产量相比于出发菌株A226的提高了26％。而在ΔSACE_5812突变株中回补SACE_5812基因，其红霉素A产量得到恢复，同时在A226中过表达SACE_5812基因使红霉素A产量降低了25％。这表明SACE_5812可负调控红霉素的产生。

实施例4

ΔSACE_5812与A226的孢子形态观察和菌丝体干重测定：

取长势良好的ΔSACE_5812和A226的孢子，分别涂布于R5固体平板上，然后将平板置于30℃恒温培养箱中培养。每隔24小时观察并记录菌株的孢子生长状态，结果如图5A所示，ΔSACE_5812与A226的孢子生长趋势基本一致，无明显提前或延迟现象。

参照实施例1中菌株的发酵培养方法，每24小时对发酵液进行取样，每次取两个平行样品，离心收集菌体沉淀，经无水乙醇漂洗、烘干后，测定菌体的干重，7天发酵周期后，根据测定的数据绘制ΔSACE_5812与A226的生长曲线，结果如图5B所示，ΔSACE_5812与A226的菌丝体长势无明显差异。综合以上结果，表明在当前实验条件下SACE_5812并不影响糖多孢红霉菌的孢子发育和菌体生长。

实施例5

ΔSACE_5812与A226中相关基因的转录水平分析：

参照实施例1中菌株的发酵培养方法，离心收集发酵24小时的ΔSACE_5812和A226的菌体沉淀，使用TransZol试剂盒分别提取上述菌体的总RNA，经DNA消化、RNA反转，获得cDNA，并利用表2中的相关引物进行qRT-PCR检测分析，结果如图6所示，ΔSACE_5812中其邻近基因SACE_5813、红霉素合成簇内基因eryAI和抗性基因ermE的转录量较A226分别增加了3.5、4.3和3.3倍。这表明SACE_5812可抑制SACE_5813、eryAI和ermE的转录。

实施例6

SACE_5812蛋白表达及其与上述基因启动子的EMSA实验：

利用表2中的引物对5812-28a-F/R，以A226基因组DNA为模板，PCR扩增出全长的SACE_5812基因片段，经NdeI/HindⅢ双酶切处理后，将其连接至蛋白表达载体pET28a上，成功构建出重组质粒pET28a5812。

将上述pET28a5812转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，并置于含有卡那霉素抗性的LB固体平板上培养，挑取单菌落并扩大培养后得到SACE_5812蛋白表达菌株BL21/pET28a5812。

取上述BL21/pET28a5812菌液转接至含卡那霉素抗性的液体LB培养基，37℃培养约12小时。然后以3％比例的接种量转接至50mL相同抗性的液体LB中，继续培养至菌体OD₆₀₀为0.6左右，然后加入终浓度为0.5mM的IPTG，16℃180rpm条件下诱导表达约20小时。离心收集菌体并进行超声波破碎，利用镍离子柱对蛋白进行纯化，SDS-PAGE分析不同浓度梯度的咪唑洗脱液(5、40、80、160、300、500mM)，SACE_5812蛋白分子量约为26.1kDa(图7A)。

利用表2中引物对5812-5813-F/R、eryAI-BIV-F/R和ermE-CI-F/R，以A226基因组为模板，分别扩增并回收获得SACE_5813、eryAI和ermE的基因启动子区。分别将上述探针与SACE_5812蛋白于30℃条件下充分孵育结合20min，然后对反应物进行活性PAGE分析。结果如图7B、C、D所示，SACE_5812蛋白可分别结合SACE_5813、eryAI和ermE的启动子区。综合转录分析结果，表明SACE_5812直接抑制这些基因的转录。

实施例7

靶基因SACE_5813过表达菌株的构建及其产物分析：

SACE_5813基因全长为1527bp，由508个氨基酸组成，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

根据KEGG数据库基因注释，SACE_5812的靶基因SACE_5813编码膜外排蛋白，为了探究SACE_5813和红霉素产量间的关系，利用表2中引物对5813-O-F/R，以A226基因组为模板，扩增得到SACE_5813基因片段，对该片段和pIB139分别进行NdeI/XbaI双酶切处理，然后利用T4连接酶将SACE_5813连接到pIB139上，成功构建重组质粒pIB5813。然后在PEG介导下，将该重组质粒导入到A226原生质体中。经安普霉素抗性筛选、阳性克隆子中安普霉素抗性基因aac(3)IV的PCR鉴定，成功构建出SACE_5813过表达菌株A226/pIB5813(图8A)。

参照实施例1中菌株发酵培养和产物检测方法，HPLC分析出发菌株A226和过表达菌株A226/pIB5813的红霉素A产量。结果(图8B)显示，A226/pIB5813的红霉素A产量较A226提高了31％，表明增加SACE_5813基因拷贝可提高红霉素产量。

实施例8

SACE_5812及其靶基因组合改造的工程菌株构建及其产物分析：

在SACE_5812敲除突变株中进一步过表达靶基因SACE_5813，成功构建出SACE_5812与SACE_5813组合改造的红霉素高产菌株ΔSACE_5812/pIB5813，并利用HPLC对其发酵产物进行检测。结果(图9)显示，ΔSACE_5812/pIB5813的红霉素A产量有了进一步增加，较A226提高了47％。

综上所述，通过基因工程技术敲除糖多孢红霉菌基因组上的SACE_5812基因，或者，增加其靶基因SACE_5813的拷贝，或者，通过基因工程技术敲除糖多孢红霉菌基因组上的SACE_5812基因，并在SACE_5812缺失突变株基础上，增加其靶基因SACE_5813的拷贝，均可获得红霉素高产工程菌株；本发明为工业生产提高红霉素产量提供了强有力的技术支持。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 安徽大学

<120> 一种通过改造糖多孢红霉菌SACE_5812基因途径提高红霉素产量的方法

<130> 2022

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 711

<212> DNA

<213> 糖多孢属

<400> 1

atgaccgcga agtcgaagac ctcgacgtcc gagggtgctc ccggtgcggt gtggttccgc 60

ccggagaagc agtcgaggac gaagccgctg ctgacgcagg acaagatcgt ctccgcggcc 120

gtggagctgc tcgaccgcga cggcgtgcgg cagctcagca tgcgcaagct ggccgaccgg 180

ctgcaggcgc acgcgacgag cctgtactgg cacgtgtcga ccaaggacga cgtcctggac 240

ctcgccctcg acgccgtgtt cggggaggtc cggctgcccg tggagtccgg cccgtcgtgg 300

cgcgacgaca tcatcgcctt catggccgaa ctgcggcgcg tgctgctgga ccacccgtgg 360

gcggcggccc tggcgagcac ccgcccgctg gccggcccca acgccctggc gcgctcggag 420

ttcgtctacg ccgcgctggc ggcggcaggc ttcggccgcg ccgacgtcct ggcggccggg 480

gcggcggtct ccaactacgt catcggctcg gtgtcggcgg agtcggtctg gcgccaccag 540

gacgaggcgg gcacccgctc cgccctcgcc gagcacctgc gcgcccgcga ggccgactac 600

cccgctctcg ccggcaactt cccggctgac ggcggcgact ggcaagccca cttcgaccgc 660

ggcgcgcagt acctcgtcgc gggcatggcc gcgaccgccg ggctggagta g 711

<210> 2

<211> 236

<212> PRT

<213> 糖多孢属

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1 5 10 15

Val Trp Phe Arg Pro Glu Lys Gln Ser Arg Thr Lys Pro Leu Leu Thr

20 25 30

Gln Asp Lys Ile Val Ser Ala Ala Val Glu Leu Leu Asp Arg Asp Gly

35 40 45

Val Arg Gln Leu Ser Met Arg Lys Leu Ala Asp Arg Leu Gln Ala His

50 55 60

Ala Thr Ser Leu Tyr Trp His Val Ser Thr Lys Asp Asp Val Leu Asp

65 70 75 80

Leu Ala Leu Asp Ala Val Phe Gly Glu Val Arg Leu Pro Val Glu Ser

85 90 95

Gly Pro Ser Trp Arg Asp Asp Ile Ile Ala Phe Met Ala Glu Leu Arg

100 105 110

Arg Val Leu Leu Asp His Pro Trp Ala Ala Ala Leu Ala Ser Thr Arg

115 120 125

Pro Leu Ala Gly Pro Asn Ala Leu Ala Arg Ser Glu Phe Val Tyr Ala

130 135 140

Ala Leu Ala Ala Ala Gly Phe Gly Arg Ala Asp Val Leu Ala Ala Gly

145 150 155 160

Ala Ala Val Ser Asn Tyr Val Ile Gly Ser Val Ser Ala Glu Ser Val

165 170 175

Trp Arg His Gln Asp Glu Ala Gly Thr Arg Ser Ala Leu Ala Glu His

180 185 190

Leu Arg Ala Arg Glu Ala Asp Tyr Pro Ala Leu Ala Gly Asn Phe Pro

195 200 205

Ala Asp Gly Gly Asp Trp Gln Ala His Phe Asp Arg Gly Ala Gln Tyr

210 215 220

Leu Val Ala Gly Met Ala Ala Thr Ala Gly Leu Glu

225 230 235

<210> 3

<211> 1527

<212> DNA

<213> 糖多孢属

<400> 3

gtgaccggaa ggcagcgaga acgggaacag cggcctcagc cgcagaccgg cgaccagggg 60

caccctcggc gatggctgat cctggtggcg ctgtgcgcgg cgctgctggt gatcgtcatc 120

gacaacacgg tcctcaacgt ggcgatcccg gagatcgggc ggaccttcga cgcctcgacg 180

ggcgagctgc aggccgtgct cgactcctac gtcgtggtgt gcggcggcct gctggtcgcc 240

gccggcgcgc tctccgaccg gtgcggacgg cgccgcgtca tggtggccgg gctcgtcgtc 300

ttcggcctga cctcggcggg cgccgcgctg gccccgtcgg tctggtggct gatcggcatg 360

cgcgcggcca tgggagtcgg tgcggcgctg gtgatgcccg cgacgctggc gatcatggtg 420

cgcgtcttcc cgccgcacga acgcccgaag gccttcgccg cgtggacggc ggtcgggtcg 480

gtggccctcg ggctggggcc gctgctgggc ggcgcgctgg tggacctgtg gagctgggct 540

gggatcttcc tggtcaacct gcctttcgtg gcggtggcgc tggcaggcgt cgtccggctg 600

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accaccggga tggtggccct ggtctgggcg gtgatcgcgg tgccggagcg cggcgcgctc 720

gcgaccccgg tgctcgccgc cacggcactg gctgtggtgt cgctggcctg gttcggcgtg 780

cgccagcgac gcgcgagcgc gccgatggtc gacttcggcc tgtaccggga ccgccggttc 840

gccggggcga gctcggccat cgcgctgatc gcggtggcca ccggcagcac gctgttcgtc 900

ctcagccagt acctgcaact ggtgcgcggc cacagcgcgg tggtggccgg gatggcggcc 960

ctgccgctgg ccgccgggag cgtggtgggc tcggcgctgg gagcccgggc acctgcccgg 1020

atcggctacc gggcatgcat cgtcaccggg ttcgccgtca ccgccgccgg gttcggcgtg 1080

ctggccgcgc tcgggccgga cagcggccag ccgcacatcg cgttcgggct cctgctctgc 1140

gggttcggga ccggcttcgc cggaccggcg gccaccagca ccgcgctggg cgccgtgccc 1200

gccgaccgcg ccgggatggg ctcggcgctc aacgacaccc accagcagct cgggatcgcc 1260

ttcggcgtgg cggtgctcgg cggcctgctc tcgaccgcct accgcgcttt cctacccacc 1320

ggcgtgccgc acgacgcgag cacgtcgctc gccgcgaccc tgtcgttcgc cgacgagcgc 1380

accagcgccg cgctggccga cgccgcccgg ctcgccttca cccaggctca gagcgcgacg 1440

atgacggccg gactcgcctg cgcgctggcc ggcgcggcgg tcgccatgct cagcctgcgc 1500

tcgggacggc gagcgccgtc gcgctga 1527

<210> 4

<211> 508

<212> PRT

<213> 糖多孢属

<400> 4

Met Thr Gly Arg Gln Arg Glu Arg Glu Gln Arg Pro Gln Pro Gln Thr

1 5 10 15

Gly Asp Gln Gly His Pro Arg Arg Trp Leu Ile Leu Val Ala Leu Cys

20 25 30

Ala Ala Leu Leu Val Ile Val Ile Asp Asn Thr Val Leu Asn Val Ala

35 40 45

Ile Pro Glu Ile Gly Arg Thr Phe Asp Ala Ser Thr Gly Glu Leu Gln

50 55 60

Ala Val Leu Asp Ser Tyr Val Val Val Cys Gly Gly Leu Leu Val Ala

65 70 75 80

Ala Gly Ala Leu Ser Asp Arg Cys Gly Arg Arg Arg Val Met Val Ala

85 90 95

Gly Leu Val Val Phe Gly Leu Thr Ser Ala Gly Ala Ala Leu Ala Pro

100 105 110

Ser Val Trp Trp Leu Ile Gly Met Arg Ala Ala Met Gly Val Gly Ala

115 120 125

Ala Leu Val Met Pro Ala Thr Leu Ala Ile Met Val Arg Val Phe Pro

130 135 140

Pro His Glu Arg Pro Lys Ala Phe Ala Ala Trp Thr Ala Val Gly Ser

145 150 155 160

Val Ala Leu Gly Leu Gly Pro Leu Leu Gly Gly Ala Leu Val Asp Leu

165 170 175

Trp Ser Trp Ala Gly Ile Phe Leu Val Asn Leu Pro Phe Val Ala Val

180 185 190

Ala Leu Ala Gly Val Val Arg Leu Val Pro Glu Ser Arg Asp Pro Ala

195 200 205

Ala Gly Ala Pro Asp Leu Pro Ser Thr Val Leu Val Thr Thr Gly Met

210 215 220

Val Ala Leu Val Trp Ala Val Ile Ala Val Pro Glu Arg Gly Ala Leu

225 230 235 240

Ala Thr Pro Val Leu Ala Ala Thr Ala Leu Ala Val Val Ser Leu Ala

245 250 255

Trp Phe Gly Val Arg Gln Arg Arg Ala Ser Ala Pro Met Val Asp Phe

260 265 270

Gly Leu Tyr Arg Asp Arg Arg Phe Ala Gly Ala Ser Ser Ala Ile Ala

275 280 285

Leu Ile Ala Val Ala Thr Gly Ser Thr Leu Phe Val Leu Ser Gln Tyr

290 295 300

Leu Gln Leu Val Arg Gly His Ser Ala Val Val Ala Gly Met Ala Ala

305 310 315 320

Leu Pro Leu Ala Ala Gly Ser Val Val Gly Ser Ala Leu Gly Ala Arg

325 330 335

Ala Pro Ala Arg Ile Gly Tyr Arg Ala Cys Ile Val Thr Gly Phe Ala

340 345 350

Val Thr Ala Ala Gly Phe Gly Val Leu Ala Ala Leu Gly Pro Asp Ser

355 360 365

Gly Gln Pro His Ile Ala Phe Gly Leu Leu Leu Cys Gly Phe Gly Thr

370 375 380

Gly Phe Ala Gly Pro Ala Ala Thr Ser Thr Ala Leu Gly Ala Val Pro

385 390 395 400

Ala Asp Arg Ala Gly Met Gly Ser Ala Leu Asn Asp Thr His Gln Gln

405 410 415

Leu Gly Ile Ala Phe Gly Val Ala Val Leu Gly Gly Leu Leu Ser Thr

420 425 430

Ala Tyr Arg Ala Phe Leu Pro Thr Gly Val Pro His Asp Ala Ser Thr

435 440 445

Ser Leu Ala Ala Thr Leu Ser Phe Ala Asp Glu Arg Thr Ser Ala Ala

450 455 460

Leu Ala Asp Ala Ala Arg Leu Ala Phe Thr Gln Ala Gln Ser Ala Thr

465 470 475 480

Met Thr Ala Gly Leu Ala Cys Ala Leu Ala Gly Ala Ala Val Ala Met

485 490 495

Leu Ser Leu Arg Ser Gly Arg Arg Ala Pro Ser Arg

500 505

Claims

1.一种通过改造糖多孢红霉菌SACE_5812基因途径提高红霉素产量的方法，其特征在于，通过基因工程方法在糖多孢红霉菌菌株A226中敲除SACE_5812基因，获得红霉素高产工程菌株，利用所述红霉素高产工程菌株发酵生产红霉素；所述SACE_5812基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的通过改造糖多孢红霉菌SACE_5812基因途径提高红霉素产量的方法，其特征在于，所述SACE_5812基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.根据权利要求1所述的通过改造糖多孢红霉菌SACE_5812基因途径提高红霉素产量的方法，其特征在于，所述SACE_5812基因负向调控红霉素生物合成。

4.一种通过改造糖多孢红霉菌SACE_5812基因途径提高红霉素产量的方法，其特征在于，通过基因工程方法在糖多孢红霉菌菌株A226中过表达SACE_5813基因，获得红霉素高产工程菌株，利用所述红霉素高产工程菌株发酵生产红霉素；其中，所述SACE_5813基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

5.根据权利要求4所述的通过改造糖多孢红霉菌SACE_5812基因途径提高红霉素产量的方法，其特征在于，所述SACE_5813基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

6.根据权利要求4所述的通过改造糖多孢红霉菌SACE_5812基因途径提高红霉素产量的方法，其特征在于，所述SACE_5813基因正向调控红霉素生物合成。

7.一种通过改造糖多孢红霉菌SACE_5812基因途径提高红霉素产量的方法，其特征在于，通过基因工程方法在糖多孢红霉菌菌株A226中敲除SACE_5812基因，同时过表达SACE_ 5813基因，获得红霉素高产组合工程菌株，利用所述红霉素高产组合工程菌株发酵生产红霉素；其中，所述SACE_5812基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述SACE_5813基因为SACE_5812基因途径中的靶基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

8.根据权利要求7所述的通过改造糖多孢红霉菌SACE_5812基因途径提高红霉素产量的方法，其特征在于，所述SACE_5812基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

9.根据权利要求7所述的通过改造糖多孢红霉菌SACE_5812基因途径提高红霉素产量的方法，其特征在于，所述SACE_5813基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

10.根据权利要求7所述的通过改造糖多孢红霉菌SACE_5812基因途径提高红霉素产量的方法，其特征在于，所述SACE_5813基因正向调控红霉素生物合成；所述SACE_5812基因通过抑制所述SACE_5813基因的转录，实现对红霉素生物合成的负向调控。