CN111139192B - 一种通过改造糖多孢红霉菌sace_4682基因提高红霉素产量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种通过改造糖多孢红霉菌SACE_4682基因提高红霉素产量的方法，在糖多孢红霉菌中，通过基因工程方法缺失TetR家族转录调节基因SACE_4682，获得红霉素高产工程菌株，用所获得的菌株发酵生产红霉素，为工业生产提高红霉素产量提供新的技术支持。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种通过改造糖多孢红霉菌SACE_4682基因提高红霉素产量的方法。
背景技术
红霉素是糖多孢红霉菌产生的一类广谱大环内酯类抗生素，具有良好的抗革兰氏阳性菌活性和较低的肠胃道毒副作用。自1952年首次从糖多孢红霉菌(Saccharopolysporaerythraea)中分离获得后，红霉素的使用率一直位于全球抗生素类药物的前列。糖多孢红霉菌发酵产生的红霉素各组分中，红霉素A抑菌活性最高，以红霉素为基础衍生的阿奇霉素、克拉霉素、罗红霉素和泰利霉素等也都是当今主流的医用抗生素。由此可见，提高红霉素的产量是当下急需解决的一个问题。
由于红霉素A的结构较为复杂，采用化学合成工艺累积步骤繁琐，成本较高，因此生产上主要采用微生物发酵的方法获得。传统方法通过优化发酵条件提高红霉素产量，但该方法耗时且不经济，不适合广泛应用。而通过基因工程的方法，在糖多孢红霉菌中通过失活某些调控基因或增加某些合成基因的拷贝数，获得红霉素高产菌株，有很好的前景。
糖多孢红霉菌合成基因簇中不存在调控基因，而通过基因工程途径去改造糖多孢红霉菌的基因获得高产菌株只能从整个基因组中改造其它的调控基因。目前已报道的有参与糖多孢红霉菌孢子形态分化的SACE_7040和SACE_0012，以及调控红霉素合成的SACE_5599、SACE_3986、SACE_7301、SACE_3446、BldD(SACE_2077)、PccD(SACE_3396)和SACE_Lrp(SACE_5388)等。
TetR家族转录调节因子(TetR family transcriptional regulators,TFRs)是最常见的原核转录调控因子之一，以其家族中结构和功能研究最为清楚的四环素抗性阻遏蛋白(Tet repressor,TetR)而得名。随着越来越多TFRs晶体结构的解析,可以发现它们通常以同源二聚体的形式结合在DNA上。每个单体都含有N端的DNA结合域和C端的小分子配体结合域。TFRs在N端的DNA结合结构域上有高度的保守性，而C端的氨基酸组成差异较大，暗示了其结合的小分子配体具有结构多样性。TFRs在微生物中的分布非常广泛，参与调控多药抗性、抗生素生物合成等重要生理活动。近年来在放线菌中发现了多种参与抗生素生物合成和形态分化的TetR家族转录调控子，表明TetR家族调控基因在放线菌抗生素生物合成中的重要性。
发明内容
本发明目的就是为了弥补已有技术的缺陷，提供一种通过改造糖多孢红霉菌SACE_4682基因提高红霉素产量的方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种通过改造糖多孢红霉菌SACE_4682基因提高红霉素产量的方法，通过基因工程途径使糖多孢红霉菌中缺失TetR家族转录调控基因SACE_4682，获得红霉素高产工程菌株，用所得的红霉素高产工程菌株发酵生产红霉素即可。
进一步的，分别通过抑菌试验和HPLC对发酵产物进行检测，发现SACE_4682基因产物可以负向调控红霉素生物合成。
进一步的，所述糖多孢红霉菌中缺失TetR家族转录调控基因SACE_4682在工业菌株WB中应用，在工业菌株中缺失TetR家族调控基因SACE_4682，获得高产突变株，可用于红霉素生产。
本发明的优点是：本发明方法中筛选到了红霉素生物合成负调控子SACE_4682，通过基因工程途径缺失糖多孢红霉菌染色体上SACE_4682基因，能够获得红霉菌高产菌株，为工业生产提高红霉素发酵产量提供技术支持。
在糖多孢红霉菌A226中缺失SACE_4682基因，所获得的突变株ΔSACE_4682较A226的红霉素产量提高了50％。在ΔSACE_4682缺失突变株中回补SACE_4682基因，红霉素产量得到恢复。进一步在A226中增加SACE_4682的拷贝数，红霉素产量下降35％。这些结果表明SACE_4682是一个参与红霉素生物合成的负调控因子。以红霉素高产菌株WB作为出发菌株，缺失SACE_4682基因，所获得的突变株WBΔSACE_4682较WB的红霉素产量提高45％。说明缺失SACE_4682基因提高红霉素产量的技术在工业菌株中同样适用。
附图说明
图1所示为SACE_4682基因及周边邻近基因在染色体上的位置信息。
图2所示为本发明的染色体片段同源重组技术示意图及缺失突变株的PCR验证，其中：
(A)ΔSACE_4682突变体构建示意图；
(B)ΔSACE_4682突变体的PCR鉴定：SACE_4682基因(555bp)被tsr抗性基因(1360bp)替换后长度变为1760bp；M：5000bp DNA Marker。
图3所示为抑菌试验和HPLC对发酵产物进行检测
(A)出发菌株A226和ΔSACE_4682突变株发酵液的抑菌分析；
(B)出发菌株A226、缺失突变株ΔSACE_4682、缺失回补菌株ΔSACE_4682/pIB139-4682及回补空载对照菌株A226/pIB139、过表达菌A226/pIB139-4682及过表达空载对照菌株A226/pIB139红霉素A的HPLC分析。“ns”表示没有显著性差异；“**”表示p<0.01。
图4所示为ΔSACE_4682与出发菌株A226中相关基因转录分析，SACE_4682缺失突变株中，红霉素生物合成基因簇中eryK(SACE_0713)、eryBVI(SACE_0717)、eryBIV(SACE_0720)、eryAI(SACE_0721)和eryBI(SACE_0732)转录水平提高；eryBIII(SACE_0731)和eryCI(SACE_0734)转录没有变化；红霉素抗性基因ermE(SACE_0733)转录水平降低。“ns”表示没有显著性差异；“*”表示p<0.05；“**”表示p<0.01；“***”表示p<0.001。
图5所示为红霉素工业高产菌株WBΔSACE_4682缺失突变株的红霉素产量分析。“*”表示p<0.05。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
一种通过改造糖多孢红霉菌SACE_4682基因提高红霉素产量的方法，通过基因工程途径使糖多孢红霉菌中缺失TetR家族转录调控基因SACE_4682，获得红霉素高产工程菌株，用所得的红霉素高产工程菌株发酵生产红霉素即可。
进一步的，如图3所示，分别通过抑菌试验和HPLC对发酵产物进行检测，发现SACE_4682基因产物可以负向调控红霉素生物合成。如图1所示SACE_4682基因及周边邻近基因在染色体上的位置信息。
进一步的，所述糖多孢红霉菌中缺失TetR家族转录调控基因SACE_4682在工业菌株WB中应用，在工业菌株中缺失TetR家族调控基因SACE_4682，获得高产突变株，可用于红霉素生产。
实施例中使用到的菌株和质粒见表1。大肠杆菌在37℃的液体LB培养基或在添加1.25％琼脂的固体LB平板上培养。红霉素产生菌糖多孢红霉菌在30℃胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)培养基或在含有2.2％琼脂的R3M平板上培养。
实施例使用的材料中PEG3350、溶菌酶、TES、酪蛋白氨基酸、硫链丝菌肽、安普霉素从Sigma公司购买。TSB、酵母提取物、蛋白胨购买于Oxoid公司。甘氨酸、琼脂粉、氯化钠和其它生物学试剂都购于试剂公司。大肠杆菌和林可链霉菌的一般操作技术按照标准操作。引物的合成和DNA测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。
表1本实施例中所用的菌种和质粒
表2本研究所用引物
实施例1
SACE_4682基因缺失突变体的构建：
如图2所示，为了敲除糖多孢红霉菌中的SACE_4682基因，分别用4682-P1、4682-P2、4682-P3和4682-P4为引物、糖多孢红霉菌A226基因组为模板，PCR扩增SACE_4682基因的上、下游各约1.5kb的同源片段。
将上述SACE_4682上下游片段分别连接到pUCTSR载体上，完成构建质粒pUCTSRΔ4682。利用PEG介导的原生质体转化技术，将tsr-Δ4682大片段转化到糖多孢红霉菌原生质体中，基于染色体片段同源重组技术，利用硫链丝菌肽抗性筛选阳性突变株，获得SACE_4682基因被tsr替换的基因工程菌株。以4682-P5和4682-P6作为鉴定引物，以质粒pUCTSRΔ4682为阳性模板，A226基因组为阴性模板进行PCR鉴定，阳性缺失突变体命名为ΔSACE_4682(见图2B)。
实施例2
SACE_4682基因回复和过表达菌株的构建：
利用设计的引物4682-P5和4682-P6扩增出SACE_4682基因，并电泳回收，使用NdeI和XbaI内切酶分别对回收到的SACE_4682基因片段与pIB139进行双酶切并回收，通过T4DNA连接酶将SACE_4682基因片段连接到pIB139上，成功获得质粒pIB139-4682。然后通过PEG介导的原生质体转化技术将pIB139和pIB139-4682质粒分别导入A226与ΔSACE_4682原生质体中。通过安普霉素初步筛选，以安普霉素抗性基因(apr)为对象进行PCR鉴定。获得的阳性回复菌株命名为ΔSACE_4682/pIB139-4682，阳性回复空载对照菌株命名为ΔSACE_4682/pIB139；获得的阳性过表达菌株命名为A226/pIB139-4682，阳性过表达空载对照菌株命名为A226/pIB139。
实施例3
糖多孢红霉菌发酵产物HPLC检测：
接种糖多孢红霉菌系列菌株至TSB培养基中，在30℃振荡培养48小时后，转接至R5液体培养基，30℃振荡培养6天，然后利用有机溶剂对发酵液进行萃取，使用水浴锅蒸干后，加入1mL甲醇溶解并使用0.22μm有机滤膜处理，后上机检测样品中的红霉素A含量，如图3B所示。
实施例4
ΔSACE_4682中相关基因的转录分析：
收集20h的ΔSACE_4682和出发菌株A226菌液，提取获得所需RNA，反转成cDNA后，使用实时荧光定量PCR仪上机检测，如图4所示。
实施例5
红霉素工业高产菌株WBΔSACE_4682菌株的构建及HPLC检测：
在红霉素工业菌株WB中缺失SACE_4682，验证正确菌株命名为WBΔSACE_4682。并将WB高产菌株与缺失突变株WBΔSACE_4682的发酵产物进行HPLC检测。突变株构建过程和HPLC检测参考上述实施例1和实施例3的方法。红霉素工业高产菌株WBΔSACE_4682缺失突变株的红霉素产量分析如图5所示。“*”表示p<0.05。
序列表
<110> 安徽大学
<120> 一种通过改造糖多孢红霉菌SACE_4682基因提高红霉素产量的方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 594
<212> DNA
<213> 糖多孢红霉菌(Saccharopolyspora erythraea)
<400> 1
ccggaattcc cgtcgagggt gatccgacag gtacccggcg ggggcgctcg tctagaacgg 60
aggcctgccc gaccaaaagc ttcggctcgc ccggctcccc atatggtgcg ctaccaccgc 120
agcgtctaga tcaccggttg accctggacg tgcaatacga atggcgaaac cgctcgccag 180
tcgattggcc cccatatggt gcgctaccac cgcatggaag ctttcaccgg ttgaccctgg 240
accaagggct acaagttctc gaccgagctt gttgatgacc tgacgtcatg gtcaacacct 300
gggcgatgat ctcctccaga acgtggtgaa catggacctc agcaggctgt tcatgttgtg 360
acgtgatcgt gcacctggtg ctcgcgtaga gcaacacccg ctgatgccga acgaccaccc 420
ttccccgcac tctgatcgcg atgttctacg acctgcaggt agctctgctc catcggcttt 480
cctacaccac gttcgcgagt tcgaccttct ggtactgttc gagtgggagt tcgtaccatc 540
gactcgtagc gttcctacgg ctcgaagcag aagtacgtcc ttcagttccg tctg 594
Claims (3)
1.一种通过改造糖多孢红霉菌SACE_4682基因提高红霉素产量的方法，其特征在于：通过基因工程途径使糖多孢红霉菌中缺失TetR家族转录调控基因SACE_4682，获得产红霉素工程菌株，用所述的工程菌株发酵生产红霉素即可，所述SACE_4682基因的核苷酸序列如序列1所示。
2.根据权利要求1所述的一种通过改造糖多孢红霉菌SACE_4682基因提高红霉素产量的方法，其特征在于：分别通过抑菌试验和HPLC对发酵产物进行检测，发现SACE_4682基因产物可以负向调控红霉素生物合成。
3.根据权利要求1所述的一种通过改造糖多孢红霉菌SACE_4682基因提高红霉素产量的方法，其特征在于：所述糖多孢红霉菌为糖多孢红霉菌WB菌株。
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Non-Patent Citations (3)
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| "Complete genome sequence of the erythromycinproducing bacterium Saccharopolyspora erythraea producing bacterium Saccharopolyspora erythraea NRRL23338";Markiyan Oliynyk et al.;《Nature Biotechnology》;20070318;第25卷(第4期);第447-453页 * |
| "前体代谢工程提高红霉素产量的研究进展";张万祥 等;《生物技术通讯》;20190131;第30卷(第1期);第134-139页 * |
| "放线菌中与抗生素合成相关 TetR 家族转录因子的研究进展";倪静姝 等;《微生物学通报》;20190125;第1-11页 * |
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