CN109136253B - 一种通过糖多孢红霉菌sace_5754基因途径提高红霉素产量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种通过糖多孢红霉菌SACE_5754基因途径提高红霉素产量的方法，属于基因工程技术领域，其是在糖多孢红霉菌中，通过基因工程途径缺失SACE_5754，并过表达其靶基因SACE_0388和SACE_6149，获得红霉素高产工程菌株，用所获得的菌株发酵生产红霉素可以大幅度提高产量，为工业生产提高红霉素产量提供新的技术支持。

Description

一种通过糖多孢红霉菌SACE_5754基因途径提高红霉素产量 的方法

技术领域

本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种通过糖多孢红霉菌SACE_5754基因途径提高红霉素产量的方法。

背景技术

红霉素是糖多孢红霉菌次级代谢产生的一类广谱大环内酯类抗生素，具有良好的抗革兰氏阳性菌活性和较低的肠胃道毒副作用。自1952年首次从糖多孢红霉菌(Saccharopolyspora erythraea)中分离获得后，红霉素的使用率一直位于全球抗生素类药物的前列。糖多孢红霉菌次级代谢产物红霉素各组分中广泛应用的是红霉素A，其抑菌活性最高，而以红霉素A为基础改造的阿奇霉素、克拉霉素、罗红霉素和泰利霉素等也都是当今主流的医用抗生素。由此可见，提高红霉素的产量是当下急需解决的一个问题。

由于红霉素A的结构较为复杂，采用化学合成工艺累积步骤繁琐，成本较高，因此生产上主要采用微生物发酵的方法获得。传统优化发酵条件提高红霉素A产量的方法耗时且不经济，不适合广泛应用。而通过基因工程的方法，在糖多孢红霉菌中通过失活某些调控基因或增加某些合成基因的拷贝数获得改造的红霉素高产菌株，有很好的前景。

糖多孢红霉菌合成基因簇中不存在调控基因，而通过基因工程途径去改造糖多孢红霉菌的基因获得高产菌株只能从整个基因组中改造其它的调控基因。目前已报道的有参与糖多孢红霉菌孢子形态分化的SACE_7040和SACE_0012，以及调控红霉素合成的SACE_5599、SACE_3986、SACE_7301、SACE_3446、BldD(SACE_2077)、PccD(SACE_3396)和SACE_Lrp(SACE_5388)等。

2005年，Ramos等以序列相似性、结构和功能为标准将原核生物转录调控子分成LysR、AraC/XylS、TetR、LuxR、LacI、ArsR、IcIR、MerR、AsnC、MarR、NtrC(EBP)、OmpR、DeoR、Cold shock、GntR和Crp共16个家族。其中TetR家族调控基因在DNA结合结构域上有高度的保守性，参与调控多药抗性和抗生素生物合成等重要生理活动。近年来发现了多种参与抗生素产量和放线菌形态分化的TetR家族转录调控子，表明TetR家族调控基因在放线菌次级代谢及抗生素生物合成中的重要性。

发明内容

本发明目的在于提供一种通过糖多孢红霉菌SACE_5754基因途径提高红霉素产量的方法，通过基因工程途径在糖多孢红霉菌中失活负调控基因SACE_5754或过量表达SACE_5754靶基因SACE_0388和SACE_6149，提高糖多孢红霉菌的红霉素产量。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种通过糖多孢红霉菌SACE_5754基因途径提高红霉素产量的方法，其是通过SACE_5754基因产物可负调控红霉素生物合成，在糖多孢红霉菌中失活SACE_5754基因，以提高红霉素产量。

进一步的，在糖多孢红霉菌中过量表达SACE_5754靶基因SACE_0388和SACE_6149，以提高红霉素产量。

所述方法中以糖多孢红霉菌SACE_5754基因或其表达产物为出发点，寻找到与红霉素生物合成相关的新基因或蛋白，通过对寻找到的相关基因进行失活、增加拷贝、提高表达量的办法在糖多孢红霉菌中构建红霉素高产菌株，用于发酵生产红霉素或其中间产物和衍生物。

所述构建红霉素高产菌株的技术方法为：通过基因工程途径在糖多孢红霉菌中失活SACE_5754基因，并过量表达其靶基因SACE_0388和SACE_6149，获得红霉素高产工程菌株，提高了红霉素生物合成的产量，用所述菌株发酵生产红霉素。

本发明的优点是：

本发明研究中筛选到了红霉素生物合成负调控子SACE_5754，通过基因工程途径失活糖多孢红霉菌染色体上SACE_5754基因，并在SACE_5754缺失突变株中，过量表达SACE_5754靶基因SACE_0388和SACE_6149，能够获得红霉素高产菌株，为工业生产提高红霉素产量提供技术支持。

糖多孢红霉菌A226中失活SACE_5754基因时，红霉素产量提高了41％；在ΔSACE_5754缺失突变株中回补SACE_5754基因，红霉素产量得到恢复；在A226中增加SACE_5754的拷贝数，红霉素产量下降31％，从而表明SACE_5754是一个参与红霉素生物合成的负调控因子。在A226中对SACE_5754的靶基因SACE_0388和SACE_6149进行过量表达，红霉素产量分别提高了32％和28％。进一步在ΔSACE_5754中过量表达SACE_0388和SACE_6149，相比ΔSACE_5754的红霉素产量分别提高83％和50％。以红霉素高产菌株WB作为出发菌株，缺失SACE_5754基因，所获得的突变株WBΔSACE_5754较WB红霉素产量提高19％。在WBΔSACE_5754中单独过量表达SACE_0388和SACE_6149，红霉素产量分别提高42％和30％，进一步在WBΔSACE_5754中同时过量表达SACE_0388和SACE_6149，红霉素产量提高了64％。

附图说明

图1所示为本发明的染色体片段同源重组技术示意图及缺失突变株的PCR验证，其中：

(A)ΔSACE_5754突变体构建示意图；

(B)ΔSACE_5754突变体的PCR鉴定：SACE_5754基因(624bp)被tsr抗性基因(1360bp)替换后长度变为1652bp；M：5000bp DNA Marker。

图2所示为原始菌株A226及缺失突变株ΔSACE_5754的表型分析，其中：

(A)A226出发菌株和ΔSACE_5754突变株发酵液的抑菌分析；

(B)ΔSACE_5754突变株和野生型A226菌株的孢子生长情况，其中1：A226菌株，2：ΔSACE_5754突变株，3：ΔbldD(影响糖多孢红霉菌孢子形态分化菌株)；4：过表达菌株A226/pIB139-5754；

(C)ΔSACE_5754突变株和野生型A226菌株菌丝体的生物量测定。

图3所示为出发菌株A226、缺失突变株ΔSACE_5754、缺失回补菌株ΔSACE_5754/pIB139-5754及回补空载对照菌株A226/pIB139、过表达菌A226/pIB139-5754及过表达空载对照菌株A226/pIB139红霉素A的HPLC分析。

图4所示为ΔSACE_5754与出发菌株A226中相关基因转录分析，SACE_5754缺失突变株中，红霉素生物合成酶基因eryAI(SACE_0721)和红霉素抗性基因ermE(SACE_0733)转录水平有显著提高。

图5所示为SACE_5754对其靶基因分子调控作用，其中：

(A)SACE_5754可能靶基因的周边基因信息；

(B)SACE_5754与P0388-0389的EMSA分析；

(C)SACE_5754与P3599的EMSA分析；

(D)SACE_5754与P6148-6149的EMSA分析；

(E)SACE_5754的基因缺失对其靶基因转录的影响。

图6所示为SACE_5754可能靶基因SACE_0388、SACE_0649和SACE_3599与红霉素生物合成相关性，其中：

(A)SACE_0388基因缺失、回补与过表达菌株的红霉素产量；

(B)SACE_6149基因缺失、回补与过表达菌株的红霉素产量；

(C)SACE_3599基因缺失、回补与过表达菌株的红霉素产量。

图7所示为原始菌株A226中SACE_5754与其靶基因的组合改造可提高红霉素产量。

图8所示为高产菌株WB中SACE_5754与其靶基因的组合改造可提高红霉素产量。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例

实施例中使用到的菌株和质粒见表1。大肠杆菌在37℃的液体LB培养基或在添加1.25％琼脂的固体LB平板上培养。红霉素产生菌糖多孢红霉菌及其工程菌株在30℃胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)培养基或在含有2.2％琼脂的R3M平板上培养。

表1本实施例中所用的菌种和质粒

实施例中PEG3350、溶菌酶、TES、酪蛋氨基酸、硫链丝菌肽、安普霉素从Sigma公司购买。TSB、酵母提取物、蛋白胨购买于Oxoid公司。甘氨酸、琼脂粉、氯化钠和其它生物学试剂都购于试剂公司。大肠杆菌和糖多孢红霉菌的一般操作技术按照标准操作。引物的合成和DNA测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1、SACE_5754基因缺失、回复与过表达菌株的构建

pUCTSR质粒是在pUC18的BamHI和SmaI酶切位点之间插入1360bp的硫链丝菌肽抗性；以5754-P1/5754-P2和5754-P3/5754-P4为引物，糖多孢红霉菌A226基因组为模板，PCR扩增SACE_5754基因的上、下游各约1.5kb的同源片段。PCR引物序列为：

5754-p1:CCCAAGCTTAGCTCCTCGATCAGCTCCAGG(HindIII)；

5754-p2:CTAGTCTAGAGTCGTAGCCCTGCTCGATGA(XbaI)；

5754-p3:CGGGGTACCGTGATGTTCGGCGGCCTGGTC(KpnI)；

5754-p4:CCGGAATTCCCCTGGATGTATGGCCGTCGC(EcoRI)

分别将这两个5754-U和5754-D上下游片段分别连接到pUCTSR的tsr抗性基因序列两侧，完成构建质粒pUCTSRΔ5754；以5754-P1和5754-P4为引物、pUCTSRΔ5754质粒为模板，PCR扩增tsr-Δ5754大片段，利用染色体片段同源重组技术将tsr-Δ5754大片段转化至糖多孢红霉菌原生质体中，通过硫链丝菌肽抗性筛选阳性突变株，获得SACE_5754基因被tsr替换的基因工程菌株。以5754-P5和5754-P6作为鉴定引物，以质粒pUCTSRΔ5754为阳性模板，A226基因组为阴性模板进行PCR鉴定，阳性缺失突变体命名为ΔSACE_5754。鉴定引物及基因回复与过表达序列为：

5754-p5:AAATCTAGACACCGCTCACACCGCCATCCTCGCT(NdeI)

5754-p6:CTAGTCTAGACACCGCTCACACCGCCATCCTCGCT(XbaI)

利用设计的引物5754-P5和5754-P6扩增出SACE_5754基因，并电泳回收，使用NdeI和Xba I内切酶分别对回收到的SACE_5754基因片段与pIB139进行双酶切并回收，通过T4DNA连接酶将SACE_5754基因片段连接到pIB139上，成功获得整合型质粒pIB139-5754。然后通过PEG介导的原生质体转化方法将pIB139-5754导入ΔSACE_5754原生质体中。通过安普霉素初步筛选，以安普霉素抗性基因(apr)为对象进行PCR鉴定，获得的回复菌株命名为ΔSACE_5754/pIB139-5754。pIB139-5754通过PEG介导的原生质体转化技术导入糖多孢红霉菌A226原生质体中，以安普霉素抗性基因(apr)为对象进行PCR鉴定，获得过表达菌株命名为A226/pIB139-5754。引物序列为：

Apr-F:ggAgTgCATATggTgCAATACgAATggCgAAAAg；

Apr-R:CTCAAAgCTTCAgCCAATCgACTggCgAgCg

2、SACE_0388基因缺失、回复与过表达菌株的构建

以0388-P1/0388-P2和0388-P3/0388-P4为引物、糖多孢红霉菌A226基因组为模板，PCR扩增SACE_0388基因的上、下游各约1.5kb的同源片段，纯化回收后，使用EcoRI和NdeI对pUCTSR-0388-up和下游片段双酶切后，克隆到pUCTSR-0388-up质粒上得到连接SACE_0388下游同源臂的重组质粒pUCTSRΔ0388。利用大片段同源重组方法获得在出发菌株A226中构建了SACE_0388基因缺失突变株ΔSACE_0388。利用设计的引物0388-P5和0388-P6扩增出SACE_0388基因，纯化回收后将其连接到pIB139-0388。随后将pIB139-0388和pIB139分别导入到ΔSACE_0388和A226中，获得回复菌株ΔSACE_0388/pIB139-0388及相对应的空载对照菌株ΔSACE_0388/pIB139，以及过表达菌株A226/pIB139-5754和其空载对照菌株A226/pIB139。以上具体过程参考1的方法。本部分设计的引物序列为：

0388-p1:AACTGCAGCATCCCCGCGAACAGGCCGC(pstI)

0388-p2:CTAGTCTAGAGAAGCCAGGCGGTACGCGCA(XbaI)

0388-p3:CGGGGTACCCTGTTCCTCACCGCGGGCGG(kpnI)

0388-p4:CCGGAATTCTCTGGCGGGCCACGGACGTT(EcoRI)

0388-p5:CGCCATATGATGGCACCCACCGGAGGGCG(NdeI)

0388-p6:CTAGTCTAGATCAGGTCGCGGCGCTCTCC(XbaI)

3、SACE_6149基因缺失、回复与过表达菌株的构建

以6149-P1/6149-P2和6149-P3/6149-P4为引物，糖多孢红霉菌A226基因组为模板，PCR扩增SACE_6149基因的上、下游各约1.5kb的同源片段，纯化回收后，使用EcoRI和NdeI对pUCTSR-6149-up和下游片段双酶切后，克隆到pUCTSR-6149-up质粒上得到连接SACE_6149下游同源臂的重组质粒pUCTSRΔ6149。利用大片段同源重组方法获得在出发菌株A226中构建了SACE_6149基因缺失突变株ΔSACE_6149。利用设计的引物6149-P5和6149-P6扩增出SACE_6149基因，纯化回收后将其连接到pIB139-6149。随后将pIB139-6149和pIB139分别导入到ΔSACE_6149和A226中，获得回复菌株ΔSACE_6149/pIB139-6149及相对应的空载对照菌株ΔSACE_6149/pIB139，以及过表达菌株A226/pIB139-6149和其空载对照菌株A226/pIB139。以上具体过程参考1的方法。本部分设计的引物序列为：

6149-p1:CCCAAGCTTCTCGGTCGGCTCGGCCGGGA(HindIII)

6149-p2:CTAGTCTAGAGCGTCCGGAAGTCGCCGAGC(XbaI)

6149-p3:CGGGGTACCCGCCGAACCGCTGCGCGAGA(kpnI)

6149-p4:CCGGAATTC TGGCCGACTACAAGGTCCGC(EcoRI)

6149-p5:CGCCATATGATGGAGCGAACGACGTGTTG(NdeI)

6149-p6:CTAGTCTAGATCAGCGCAGCGACACCTTCG(XbaI)

4、SACE_3599基因缺失突变株的构建

以3599-P1/6149-P2和3599-P3/3599-P4为引物和糖多孢红霉菌A226基因组为模板，PCR扩增SACE_3599基因的上、下游各约1.5kb的同源片段，纯化回收后，使用EcoRI和NdeI对pUCTSR-3599-up和下游片段双酶切后，克隆到pUCTSR-3599-up质粒上得到连接SACE_3599下游同源臂的重组质粒pUCTSRΔ3599。利用大片段同源重组方法获得在出发菌株A226中构建了SACE_3599基因缺失突变株ΔSACE_3599。突变株构建过程参考1的方法。本部分设计的引物序列为：

3599-p1:CCCAAGCTTGGGCAGATCAGGCTGTCAGG(HindIII)

3599-p2:CTAGTCTAGAGGGCATGCGGAAGGGCACGT(XbaI)

3599-p3:CGGGGTACCCTGGGCCTGGGCCGGCGGCT(kpnI)

3599-p4:CGAGCTCGTAGAGCAGCAGGCCCATCA(SacI)

3599-p5:CGCCATATG ATGACCAAGCACTTCGCGTT(NdeI)

3599-p6:CTAGTCTAGA TCAGGCCAGGTAGGACTCCA(XbaI)

5、ΔSACE_5754中分别过表达SACE_0388和SACE_6149

利用PEG介导的原生质体转化方法，将pIB139-0388和pIB139-6149分别导入到ΔSACE_5754中，通过抗性筛选与PCR验证，获得重组菌株ΔSACE_5754/pIB139-0388和ΔSACE_5754/pIB139-6149。

6、工业高产菌株WB中SACE_5754及其靶基因的组合改造

利用染色体片段同源重组技术将，在红霉素高产菌株WB中，构建SACE_5754基因缺失突变体，命名为WBΔSACE_5754，具体过程参考1.3方法。在基础上，将pIB139-0388、pIB139-6149和pIB139-0388-6149分别导入到WBΔSACE_5754中，获得了相对应的菌株WBΔSACE_5754/pIB139-0388、WBΔSACE_5754/pIB139-6149和WBΔSACE_5754/pIB139-0388-6149。

7、糖多孢红霉菌发酵产物的HPLC检测

接种糖多孢红霉菌系列菌株至TSB培养基中，在30℃振荡培养48小时后，转接至R5液体培养基，30℃振荡培养6天，然后利用有机溶剂对发酵液进行萃取，使用水浴锅蒸干后，加入1mL甲醇溶解并使用0.22μm有机滤膜处理，后上机检测样品中的红霉素A含量。

8、ΔSACE_5754中相关基因的转录分析

收集培养2天的ΔSACE_5754和出发菌株A226菌液，采用赛百盛RNA提取试剂盒获得所需RNA，反转成cDNA后，使用实时荧光定量PCR仪上机检测。

9、SACE_5754的蛋白表达与其靶启动子的EMSA分析

从糖多孢红霉菌A226基因组中扩增出SACE_5754基因，连接到pET22b的NdeI和HindIII酶切位点之间，获得质粒pET22b-5754，将其导入到BL21(DE3)感受态中，得到蛋白表达菌株BL21(DE3)-5754。以1％的接种量，将BL21(DE3)-5754接至大试管中进行过夜培养，再以2％接种量接至50ml液体LB摇瓶中，37℃培养至OD600达到0.6-0.8时，加入适量IPTG，22℃180rpm条件下诱导20h。用5mL的5mmol/L咪唑重悬菌体和破碎菌体后，利用镍柱纯化蛋白，分别加入5mmol/L、40mmol/L、80mmol/L、100mmol/L、160mmol/L、300mmol/L、500mmol/L的咪唑洗脱蛋白，在咪唑浓度为160mmol/L和300mmol/L时就可以洗脱下目的蛋白。取适量纯化后的SACE_5754蛋白，分别与其靶基因的启动子片段进行混合，加入适量的结合缓冲液，30℃温育20min，进行活性PAGE分析，观察蛋白与DNA的结合情况。

结果分析：

SACE_5754与临近基因在糖多孢红霉菌染色体上的位置参见NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/4945495)。SACE_5754基因缺失突变株A226/ΔSACE_5754构建过程见图1A。SACE_5754基因缺失突变体在含有30μg/ml硫链丝菌肽的R3M平板上筛选并通过PCR证实(图1B)。

ΔSACE_5754在R5液体培养基中发酵6天(144h)，离心收集发酵上清液；点样于含枯草芽孢杆菌菌液的LB平板表面，37℃培养12小时后观察平板上抑菌圈大小，结果显示：ΔSACE_5754的发酵液抑菌圈较A226明显偏大(图2A)，初步推断SACE_5754基因可能是负调节于红霉素的产量。

为了验证突变体ΔSACE_5754中红霉素产量的提高是因为SACE_5754基因缺失引起的，将SACE_5754基因表达载体pIB139-5754和pIB139载体(作为对照)，分别导入ΔSACE_5754突变株和出发菌株A226的原生质体中，获得回复菌株及空载ΔSACE_5754/pIB139-5754、ΔSACE_5754/pIB139，过表达菌株及空载A226/pIB139-5754、A226/pIB139。后将A226及ΔSACE_5754系列突变株进行摇瓶发酵，HPLC检测结果显示：ΔSACE_5754的红霉素A产量较A226升高41％；回复菌株ΔSACE_5754/pIB139-5754的红霉素A产量较A226基本恢复；A226/pIB139-5754的红霉素A产量相比于A226降低31％(图3)。这些结果表明SACE_5754负调控红霉素的生物合成。

测定发酵6天的ΔSACE_5754突变株与A226菌株的菌体干重，绘制相应变化曲线，结果显示ΔSACE_5754较A226的生物量差异不大(图2B)，暗示着SACE_5754基因的缺失并未影响菌体的初级代谢。为了确定SACE_5754基因是否调控菌体的孢子形成，将突变株ΔSACE_5754、ΔbldD、过表达菌株A226/pIB139-5754以及野生型对照菌株A226同时涂于R3M平板上，30℃培养72小时，观察菌株孢子生长情况。结果显示相比于A226，ΔSACE_5754突变体的孢子形态无明显差异(图2B)，说明SACE_5754基因缺失不影响孢子的形成。

qRT-PCR结果证实，在ΔSACE_5754突变株中，红霉素生物合成基因簇上的结构基因eryAI的表达量较出发菌株A226提高了3.9倍，抗性基因ermE提高了4.1倍(图4)，说明SACE_5754的缺失可以使红霉素生物合成基因簇的基因转录水平上升。

为了寻找SACE_5754的靶基因，通过选择转录组中概率值大于0.9的80个基因启动子区域与SACE_5754进行EMSA实验，结果表明只有P0388-0389、P3599和P6148-6149能与SACE_5754特异性结合。qRT-PCR显示在ΔSACE_5754中，SACE_0389和SACE_6148的转录水平没有变化，但SACE_0388、SACE_6149和SACE_3599的转录水平分别增加了158倍、95倍和4.7倍，暗示SACE_0388、SACE_6149和SACE_3599是SACE_5754的靶基因。

为了探究SACE_0388、SACE_6149和SACE_3599与红霉素生物合成的关系，构建了ΔSACE_0388、ΔSACE_3599和ΔSACE_6149突变体。结果发现SACE_0388和SACE_6149对红霉素合成有正效应作用(图6A-B)，而SACE_3599并不参与红霉素合成(图6C)。随后，在ΔSACE_5754中分别过表达SACE_0388和SACE_6149，和ΔSACE_5754相比红霉素A产量分别提高了83％和50％(图7)。

首先进行WB/ΔSACE_5754突变株的构建，构建过程参照图1A。后将WB/ΔSACE_5754突变株及工业高产菌株WB涂板活化，然后分别接入工业种子培养基的摇瓶中，30℃转速220rpm下培养2天后，转接工业发酵培养基中，继续培养6天。发酵结束后萃取浓缩经HPLC分析，相比较出发菌株WB，WB/ΔSACE_5754的红霉素产量分别提高了19％(图8)。这说明在高产菌株WB中失活SACE_5754基因同样可以提高红霉素产量。进一步再WB/ΔSACE_5754单独或组合过表达SACE_0388和SACE_6149，所获得的菌株WBΔSACE_5754/pIB139-0388、WBΔSACE_5754/pIB139-6149和WBΔSACE_5754/pIB139-0388-6149，较原始菌株WB的红霉素A产量，分别提高了46％、34％和64％(图8)。

序列表

<110> 安徽大学

<120> 一种通过糖多孢红霉菌SACE_5754基因途径提高红霉素产量的方法

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 624

<212> DNA

<213> 糖多孢红霉菌(Saccharopolyspora erythraea)

<400> 1

gtgagcggtg gcatcgagga ggaggcgccg aggcgccggg gacggcggcg cagcggcgag 60

gacaccaggg cggcgctggt ctcggcggcc agggaggtgt tcatcgagca gggctacgac 120

ggggcgaccg tgcgggccat cgccaccagg gcgggtgtgg acgcggcgat ggtcaaccac 180

tggttcgggg gcaaggcggg actgttcacc gccgcggtgt ccatcccggt caaccccgcc 240

gaggtgctgc ccaagatcct cgacggcccg cgcgaccgcg tcggcgagcg gatggtgcgc 300

accttcgtga cggtgtggga ccgcgagggc ggcggcgcgt tcgcggcgct ggtgcgcagc 360

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tcgcaggtcg tcggcctggg catggtccgc tacgtcgcgg cgctggaacc gatcgcgtcg 540

gccgacgccg agaccgtcgt cgcggcggtg gcgccgaacc tccagcgcta cctgaccggc 600

gacctgtcgg acgtgccgtc gtag 624

Claims (3)

1.一种通过糖多孢红霉菌A226中的SACE_5754基因途径提高红霉素产量的方法，其特征在于，其是通过SACE_5754基因产物可负调控红霉素生物合成，在糖多孢红霉菌A226中失活SACE_5754基因，以提高红霉素产量。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在糖多孢红霉菌中过量表达SACE_5754靶基因SACE_0388和SACE_6149，以提高红霉素产量。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，以糖多孢红霉菌SACE_5754基因或其表达产物为出发点，寻找到与红霉素生物合成相关的新基因，通过对寻找到的相关基因进行失活、增加拷贝、提高表达量的办法在糖多孢红霉菌中构建红霉素高产菌株，用于发酵生产红霉素或中间产物；

所述构建红霉素高产菌株的技术方法为：通过基因工程途径在糖多孢红霉菌中失活SACE_5754基因，并过量表达其靶基因SACE_0388和SACE_6149，获得红霉素高产工程菌株，用所述菌株发酵生产红霉素。

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