CN103205451A

CN103205451A - 通过糖多孢红霉菌sace_7301基因途径提高红霉素产量

Info

Publication number: CN103205451A
Application number: CN201310082765XA
Authority: CN
Inventors: 张部昌; 刘敬涛; 吴杭; 袁莉
Original assignee: Anhui University
Current assignee: Anhui University
Priority date: 2013-03-15
Filing date: 2013-03-15
Publication date: 2013-07-17
Anticipated expiration: 2033-03-15
Also published as: CN103205451B

Abstract

本发明公开了一种通过糖多孢红霉菌SACE_7301基因途径提高红霉素产量，其特征在于所述的方法为：通过基因工程途径使糖多孢红霉菌SACE_7301基因拷贝数增加或提高SACE_7301基因表达量，获得糖多孢红霉菌红霉素高产工程菌株，用所述技术获得的菌株发酵可以提高红霉素产量。

Description

通过糖多孢红霉菌SACE_7301基因途径提高红霉素产量

技术领域

本发明主要涉及一种提高发酵生产红霉素产量的方法，尤其涉及一种通过增加糖多孢红霉菌染色体上正向调控基因SACE_7301提高红霉素产量的方法。

背景技术

放线菌次级代谢产物具有广泛的用途，如抗生素、抗癌剂、免疫调节剂、驱虫剂、昆虫防治剂。目前发现的23000种生物活性次级代谢产物中，有10000多种是放线菌产生的。然而，这些次级代谢物原始产量非常低，需要通过筛选才能获得工业生产高产菌株。过去工业生产菌株主要通过随机物理或化学诱变方法获得。传统的随机诱变技术不但耗时，而且无法指导对育种进行理性设计。本发明目的就是通过基因工程途径定向改变基因来获得红霉素高产菌株，用于红霉素或中间产物生产。

糖多孢红霉菌是1952年从土壤中分离出的革兰氏阳性丝状放线菌，其次级代谢产物红霉素A是重要的广谱大环内酯类抗生素，目前红霉素系列化学衍生物(克拉霉素、阿奇霉素、罗红霉素、泰利霉素等)被广泛用来治疗感染性疾病。由于红霉素及其衍生物每年的世界销售量达数百亿美元，吸引了许多科学家来研究如何提高其产量。2007年，Oliynyk等报道了糖多孢红霉菌NRRL23338的基因组序列，但糖多孢红霉菌调控基因研究很少，到目前为止只有bldD(SACE_2077)和SACE_7040的调控基因研究报道，及我们申报的发明专利（申请号 201210099708.8）。

原核生物的转录调控子可以分为LysR、AraC/XylS、TetR、LuxR、LacI、ArsR、IcIR、MerR、AsnC、MarR、NtrC (EBP)、OmpR、DeoR、Cold shock、GntR 和Crp等16个家族，其中TetR家族成员在DNA结合域方面具有螺旋-转角-螺旋（HTH）的结构特征。TetR家族在细菌中普遍存在，大约有2000多个成员，但到目前为止人们只发现100多个成员的特征。糖多孢红霉菌染色体上有101个TetR家族基因，其中有些基因可能参与红霉素生物合成。

发明内容

本发明目的就是通过增加糖多孢红霉菌中正向调控基因SACE_7301拷贝，提高红霉素产量。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种构建红霉素高产菌株的技术方法，所述的方法为：通过基因工程途径使糖多孢红霉菌SACE_7301基因拷贝数增加或提高SACE_7301基因表达量，获得糖多孢红霉菌红霉素高产工程菌株，用所述的菌株发酵生产红霉素。

以SACE_7301为出发点构建红霉素高产菌株的技术方法，其特征在于以糖多孢红霉菌SACE_7301基因或其表达产物为出发点，寻找到与红霉素生物合成相关的新基因或蛋白，通过对寻找到的所有相关基因进行失活、增加拷贝、提高表达量等办法构建糖多孢红霉菌红霉素高产菌株，用于发酵生产红霉素或中间产物。

本发明的优点是：

本发明研究中筛选到了红霉素生物合成正向调控子SACE_7301，通过基因工程途径增加糖多孢红霉菌染色体上SACE_7301基因拷贝，能够获得红霉素高产菌株，为工业生产提高红霉素发酵产量提供技术支持。

糖多孢红霉菌A226中敲除SACE_7301基因时红霉素产量降低了34.5%，而在ΔSACE_7301基因突变株中回补SACE_7301基因，红霉素产量部分恢复，表明SACE_7301是一个参与红霉素生物合成的正向调控子。当在糖多孢红霉菌A226中增加SACE_7301基因拷贝时，红霉素产量较出发菌株提高9.5%，说明在糖多孢红霉菌中提高SACE_7301基因拷贝，可以构建红霉素高产菌株。

同时，红霉素生物合成基因调控是一个网络，通过基因工程途径改变SACE_7301基因或产物的上下游调控因子，也可构建红霉素高产菌株，用于提高发酵红霉素产量。

附图说明

图1为染色体同源重组技术示意图

硫链丝菌肽抗性基因(tsr)替换了糖多孢红霉菌A226染色体上SACE_7301基因；

图2为SACE_7301基因在糖多孢红霉菌染色体上的位置及编码氨基酸序列

参见 NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene?term=SACE_7301及http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/134096620?report=genbank&from=8107531&to=8108388)；

图3为ΔSACE_7301突变体鉴定及红霉素产量分析

(A) ΔSACE_7301突变体鉴定：SACE_7301基因（660bp）被tsr抗性基因(1360bp)替换后长度增加了700bp；M, 5000bp DNA Marker

(B) 糖多孢红霉菌出发菌株A226、突变菌株ΔSACE_7301及回复菌株ΔSACE_7301/pZMW7301(对照为ΔSACE_7301/pZMW)在TSB培养基中30℃发酵6天产物HPLC分析；

图4为SACE_7301基因过表达及红霉素产量分析

(A)A226/ pZMW7301过表达菌株PCR鉴定: PCR产物为pZMW 载体上apr抗性基因（776bp）；M, 5000bp DNA Marker

(B) 糖多孢红霉菌出发菌株A226、SACE_7301过表达菌株A226/ pZMW7301(对照为A226/pZMW)在TSB培养基中30℃发酵6天产物HPLC分析。

具体实施方式

实施例1

1.1 菌株、质粒与生长条件

试验中使用到的菌株和质粒见表1。大肠杆菌在37°C的液体LB(Luria-Bertani)培养基或在添加1.25%琼脂的LB平板上培养。红霉素生产菌糖多孢红霉菌A226及其工程菌株在30°C胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）培养基或在含有2.2%琼脂的R3M平板上培养。

1.2 材料、DNA操作与测序

PEG3350、溶菌酶、TES、酪蛋氨基酸、硫链丝菌肽、安普霉素从Sigma公司购买。TSB、酵母提取物、蛋白胨购买于Oxoid公司。甘氨酸、琼脂粉、氯化钠和其它生物学试剂都购于试剂公司。大肠杆菌和糖多孢红霉菌的一般操作技术按照标准操作。引物的合成和DNA测序由上海捷瑞生物工程有限公司完成。

表1 试验中使用到的菌株和质粒

1.3 SACE_7301基因缺失突变体的构建

pUCTSR质粒是在pUC18的BamH Ⅰ和 Sma Ⅰ酶切位点之间插入1.36kb硫链丝菌肽抗性基因（tsr）。为了敲除糖多孢红霉菌中的SACE_7301基因，分别用PU1/PU2和PD1/PD2为引物、糖多孢红霉菌基因组为模板，PCR扩增SACE_7301基因的上下游各约1.5kb的同源臂SU和SD DNA片段。

PCR扩增SU DNA片段引物为：

PU1：5ˊCCAAAGCTTGGAGTCGGCGCATGCTGGTCTC 3ˊ(划线的序列为HindIII的酶切位点),

PU2：5ˊCTCTCTAGACACCACGGCGGCCTGCCGGC 3ˊ(划线的序列为XbaI的酶切位点)；

PCR扩增SD DNA片段引物为：

PD1：5ˊCCCGGTACCCGGCTCCGGATGGAACCG 3ˊ(划线的序列为KpnI的酶切位点),

PD2：5ˊCGCGAATTCGCATCCTCGAGCACTTCACCG 3ˊ(划线的序列为EcoRI的酶切位点)。

分别将上述SU和SD两个DNA 片段连接到pUCTSR的tsr抗性基因两侧，完成构建质粒pUCTSRΔ7301；以PU1和PD2为引物、pUCTSRΔ7301质粒为模板，PCR扩增SU-tsr-SD DNA片段，利用染色体片段同源重组技术将SU-tsr-SD DNA片段导入糖多孢红霉菌中，根据硫链丝菌肽抗性筛选突变体，即获得SACE_7301基因被硫链丝菌肽抗性基因（tsr）替换的基因工程菌株，命名为ΔSACE_7301。

1.4 SACE_7301基因回复菌株的构建

为了在ΔSACE_7301中引入SACE_7301基因，设计了PCR扩增SACE_7301基因引物：

上游：5ˊAGACATATGATGAAGGCCGACGTGGAGCAC 3ˊ(划线的序列为Nde Ⅰ的酶切位点)，

下游：5ˊGCAGATATCTCACTCCGGTTTCCAGTCGCG 3ˊ(划线的序列为EcoR Ⅴ的酶切位点)。

从糖多孢红霉菌A226基因组中扩增出SACE_7301基因，插入到pZMW的Nde Ⅰ和EcoR Ⅴ酶切位点之间，构建表达质粒pZMW7301，然后通过PEG介导的原生质体转化方法将pZMW7301导入ΔSACE_7301中。通过安普霉素初步筛选，以安普霉素抗性基因（apr）和SACE_7301基因为对象进行PCR鉴定，获得的回复菌株命名为ΔSACE_7301/pZMW7301。

1.5 糖多孢红霉菌A226中过量表达SACE_7301基因

pZMW7301经过大肠杆菌ET12567去甲基化以后，通过PEG介导的原生质体转化技术导入糖多孢红霉菌A226中，以安普霉素抗性基因（apr）为对象进行PCR鉴定，获得菌株命名为A226/pZMW7301。

1.6 糖多孢红霉菌发酵产物HPLC检测

接种糖多孢红霉菌于TSB培养基，在30℃振荡培养144小时。

结果分析：

2.1 ΔSACE_7301比出发菌株A226红霉素产量降低

SACE_7301基因突变构建ΔSACE_7301突变菌株过程见图1。糖多孢红霉菌TetR家族转录调控基因SACE_7301是由219个氨基酸组成的，氨基酸序列见图2。根据其保守区域的结构特征，SACE_7301基因属于TetR家族转录调控基因。SACE_7301和临近基因在糖多孢红霉菌染色体上的位置见图2。SACE_7301基因缺失突变体在含有30 μg ml^-1硫链丝菌肽的R3M平板上筛选并通过PCR证实（见图3A）。ΔSACE_7301在TSB液体培养基中发酵6天（144h），其红霉素产量比出发菌株A226的产量降低了34.5%（见图3B），表明SACE_7301可能是参与红霉素生物合成的正向调控子。

2.2 SACE_7301基因回复实验

为了验证突变体ΔSACE_7301中红霉素产量的降低是因为SACE_7301基因缺失引起的，将SACE_7301基因表达载体pZMW7301，导入突变体ΔSACE_7301中。ΔSACE_7301/pZMW7301的红霉素产量与出发菌株A226的产量相比，恢复到84.17%，没有完全恢复可能是载体pZMW整合导致产量总体降低（见图3B），此结果验证了SACE_7301是一种参与红霉素生物合成的正向调控子。

2.3 A226中过表达SACE_7301基因引起红霉素产量提高

为了探索通过SACE_7301途径提高糖多孢红霉菌生产红霉素产量，将表达载体pZMW7301导入到A226构建了工程菌A226/pZMW7301，图4A中776bp的安普霉素抗性基因PCR产物证实了工程菌株A226/pZMW7301构建的完成。其红霉素产量比A226的产量提高了9.5%，而与对照A226/pZMW相比，产量提高了23.1%（见图4B），进一步验证了SACE_7301是糖多孢红霉菌中正向调控基因，通过基因工程途径增加糖多孢红霉菌中SACE_7301基因拷贝数可以提高红霉素等产量。

Claims

1.SACE_7301基因的新功能：SACE_7301基因产物可以正向调控红霉素生物合成。

2.一种构建红霉素高产菌株的技术方法，其特征在于所述的方法为：通过基因工程途径使糖多孢红霉菌SACE_7301基因拷贝数增加或提高SACE_7301基因表达量，获得糖多孢红霉菌红霉素高产工程菌株，用所述的菌株发酵生产红霉素。

3.根据权利要求1所述的SACE_7301基因的新功能，其特征在于以糖多孢红霉菌SACE_7301基因或其表达产物为出发点，寻找到与红霉素生物合成相关的新基因或蛋白，通过对寻找到的所有相关基因进行失活、增加拷贝、提高表达量等办法构建糖多孢红霉菌红霉素高产菌株，用于发酵生产红霉素或中间产物。