CN102242142A - 通过敲除phrC基因提高枯草芽孢杆菌抗菌肽产量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及通过敲除phrC基因提高枯草杆菌抗菌肽产量的方法，属于生物技术领域。本方法首先以枯草芽孢杆菌ATCC9943为出发菌株，以大肠杆菌克隆载体pGEM-T为骨架构建一个基因敲除载体pCSF-EM，利用同源重组原理，通过双交换过程敲除枯草芽孢杆菌ATCC9943基因组phrC基因的方法构建了一个高产抗菌肽菌株FMB25。经过高效液相色谱分析，确定改良菌株产surfactin和fengycin的能力大大提高。
Description
一、技术领域
本发明涉及通过敲除phrC基因提高枯草芽孢杆菌抗菌肽产量的方法，属于生物技术领域。
二、背景技术
枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是目前公认的安全微生物之一，其抗菌代谢产物丰富多样，尤其是脂肽类抗菌物质，不仅抗菌谱广而且还具有生物表面活性剂的功能，因此不仅可以在农业上用于进行生物防治，而且在工业和环境保护上也有着广泛的应用。
枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）ATCC 9943是一种可以分泌 surfactin，fengycin等抗菌肽物质的枯草芽孢杆菌（Valérie Leclère, Romain Marti, Max Béchet. The lipopeptides mycosubtilin and surfactin enhance spreading of Bacillus subtilis strains by their surface-active properties. Arch Microbiol. (2006) 186: 475-483）。其中，surfactin作为一种生物表面活性剂，与化学表面活性剂相比，其具有拥有生物降解能力，低毒，结构丰富的优点，随着对工业原料的环境适应性要求的提高，其应用于环境保护，石油开采方面潜力将会越来越大。但实际中，其并未在工业以及环境保护中广泛应用，究其原因，是因为它生产成本巨大，所以提高其产量便成为降低其生产成本的核心问题。
目前，世界范围内，提高其产量的方法主要是筛选优良菌株，以及优化发酵条件，而很少采用分子生物学技术对菌种进行改良的方法来提高其产抗菌物质的产量。但随着对抗菌肽合成分泌研究的日益深入，已经逐渐开始采用分子生物学技术，通过改造其合成分泌中信号通路等方法来对原始菌种进行基因改良，从而提高其自身合成分泌抗菌肽能力。
phrC基因（Gene ID: 937009），其表达产物枯草杆菌感受态芽孢因子（CSF）是枯草杆菌中十分重要的调控蛋白之一，在枯草芽孢杆菌各种生理代谢过程中发挥着重要的作用，相关研究表明，CSF蛋白对于抗菌物质的合成具有一定的阻碍作用。
本方法首先以枯草芽孢杆菌ATCC 9943为出发菌株，以大肠杆菌克隆载体pGEM-T为骨架构建一个基因敲除载体pCSF-EM，利用同源重组原理，通过双交换过程敲除枯草芽孢杆菌ATCC 9943基因组中phrC基因的方法构建了一个高产抗菌肽菌株FMB 25。
三、发明内容
技术问题
本发明的目的是利用分子生物学技术，构建phrC基因敲除载体，经过电转化通过同源重组将枯草芽孢杆菌ATCC 9943基因组中phrC基因敲除，从而构建一种高产抗菌肽的枯草芽孢杆菌菌株FMB 25。
技术方案
1、通过敲除phrC基因提高枯草芽孢杆菌抗菌肽产量的方法，其特征在于：
（1） phrC基因敲除载体pCSF-EM的构建
根据枯草芽孢杆菌phrC基因设计引物PhrC5’-F和PhrC5’-R，以枯草芽孢杆菌ATCC 9943基因组DNA为模板PCR扩增部分5’端phrC基因及其上游基因，获得500bp基因片段；根据枯草芽孢杆菌phrC基因设计引物PhrC3’-F和PhrC3’-R，以枯草芽孢杆菌ATCC 9943基因组DNA为模板PCR扩增部分3’端phrC基因及其下游基因，获得500bp基因片段；根据pMUTIN4的DNA设计引物EM-F和EM-R，以pMUTIN4质粒为模板PCR扩增包括启动子和终止子的红霉素抗性基因表达框，获得850bp基因片段；扩增得到的三个基因分别克隆至pMD19-T载体，转化大肠杆菌（Escherichia coli）DH5a，经验证、测序正确后，分别命名为pCSF5’-T、pCSF3’ -T、pEM-T，于-20℃条件下保存备用；
| 名称 | 序列 | 酶切位点 |
| PhrC5’-F | 5’GAATTCCATGGCCCAAGCAGAACAAAAAGCC 3’ | EcoRI |
| PhrC5’-R | 5’TCTAGACATGAAAGTCGAGTGCTTCCGCAT 3’ | XbaI |
| PhrC3’-F | 5’AAATCTAGATAAGAACAAGCCCCTTCTCATTAG 3’ | XbaI |
| PhrC3’-R | 5’ACAGCATGCTTTATATCACCTTCATATAGCCG 3’ | SphI |
| EM-F | 5’ TGATCTAGATAGAAGCAAACTTAAGAGTGTGT 3’ | XbaI |
| EM-R | 5’ TGATCTAGAAATTATTTCCTCCCGTTAAATAAT 3’ | XbaI |
PCR扩增体系如下：
10x Pfu PCR buffer 10μl
10μΜ 上游引物 10μl
10μM 下游引物 10μl
2.5mM dNTPs 8μl
枯草芽孢杆菌基因组DNA
或者pMUTIN4质粒DNA 1μl
Pfu DNA聚合酶 1μl
ddH2O 60μl
PCR程序为94℃ 2min；34个循环：94℃ 45s，58℃ 50s，72℃ 4min；72℃ 10min；
pCSF5’-T用EcoRI/XbaI双酶切后获得phrC5’片段，与经过相同双酶切处理的pGEM-T载体，用T4 DNA连接酶连接，构建pGEM-phrC5’载体，酶切验证正确后于-20℃条件下保存备用；
pCSF3’-T用XbaI/SphI双酶切后获得phrC3’片段，与经过相同双酶切处理的pGEM- phrC5’载体，用T4 DNA连接酶连接，构建pGEM-phrC载体，酶切验证正确后于-20℃条件下保存备用；
pEM-T用XbaI酶切后获得EM片段，与经过相同酶切处理的pGEM-phrC载体，用T4 DNA连接酶连接，构建phrC基因敲除载体pCSF-EM，酶切验证正确后，转化大肠杆菌（Escherichia coli）DH5a，用于下一步转化；
（2）FMB-29突变菌株的构建
以枯草芽孢杆菌ATCC 9943为出发菌株制备感受态细胞，采用电转化方法，将构建的phrC基因敲除载体pCSF-EM转化入枯草芽孢杆菌ATCC 9943，在基因组phrC基因位点发生双交换，EM抗性平板上筛选得到红霉素抗性菌株，命名为FMB 25；该菌株的phrC基因被红霉素抗性基因所取代，成为缺失了phrC基因的突变菌株，即为所得到的菌株。
所述敲除phrC基因枯草芽孢杆菌菌株FMB 25可以在生产枯草杆菌抗菌肽中应用，生产枯草芽孢杆菌抗菌肽产品。
有益效果
枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）在生长代谢过程中能够产生不同种类的抗菌物质，其中抗菌肽占主导地位。由于它广谱的抗菌活性、生物降解和毒性低的特点,因此愈来愈受到人们的重视，在植物病害生物控制、食品防腐以及饲料添加剂等方面具有潜在的应用前景。特别针对目前农药残留、化学食品和饲料添加剂对于食品安全的严重影响，探索天然的抗菌物质对于农产品安全生产有重要的现实意义。
国内外针对实验室条件下抗菌肽的发酵工艺和分离技术已经开展大量研究。虽然通过发酵工艺的优化能够提高抗菌肽生产水平，但是发酵产量依然难于大规模工业化生产。因此从分子生物学水平，利用基因工程技术对菌种进行定向改良将成为一种新的提高抗菌肽产量的手段。
本发明通过分子生物学技术，成功构建一株高产抗菌肽菌株FMB 25。与原始菌株ATCC 9943相比，经过菌种改良的菌株FMB 25合成分泌抗菌肽能力大大提高，其中surfactin产量从777 mg/L提高到1596 mg/L，提高了2.05倍；fengycin的产量从646 mg/L提高到1860mg/L，提高了2.87倍。此外，此发明还揭示了CSF蛋白对抗菌肽物质合成分泌的有阻抑作用，可以通过这种方法，利用pCSF-EM载体对任何枯草芽孢杆菌进行基因改良，以获得相应的改良菌种，达到提高抗菌肽产量的目的。
四、附图说明
图1.技术方案；
图2. phrC基因敲除载体的构建；
图3. phrC基因缺失菌株的构建；
图4. phrC基因敲除菌株PCR验证；
五、具体实施方式
本发明首先构建phrC基因敲除载体pCSF-EM，经过电转化将pCSF-EM载体转化入枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）ATCC 9943（购自The Global Bioresource Center），经过双交换同源重组过程将其基因组内phrC基因用红霉素抗性基因代替，达到敲除phrC基因的目的，从而构建一株高产抗菌肽的枯草芽孢杆菌菌株FMB 25。通过PCR方法对突变菌株进行鉴定；利用高效液相色谱（HPLC）分析改良菌株surfactin和fengycin的产量。具体实施方式如下：
（1） phrC基因敲除载体pCSF-EM的构建
根据枯草芽孢杆菌phrC基因（Gene ID: 938281）设计引物PhrC5’-F和PhrC5’-R，以枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）ATCC 9943基因组DNA为模板PCR扩增部分5’端phrC基因及其上游基因，获得500bp基因片段；根据枯草芽孢杆菌phrC基因（Gene ID: 938281）设计引物PhrC3’-F和PhrC3’-R，以枯草芽孢杆菌ATCC 9943基因组DNA为模板PCR扩增部分3’端phrC基因及其下游基因，获得500bp基因片段；根据pMUTIN4的DNA中EM基因序列设计引物EM-F和EM-R，以pMUTIN4质粒（购自Bacillus Genetic Stock Center BGSCID: ECE139）DNA为模板PCR扩增红霉素抗性基因，获得850bp基因片段。扩增得到的三个基因分别克隆至pMD19-T载体（购自Takara公司），转化大肠杆菌（Escherichia coli）DH5a (购自宝生物工程有限公司)，经验证、测序正确后，分别命名为pCSF5’-T、pCSF3’ -T、pEM-T，于-20℃条件下保存备用；
| 名称 | 序列 | 酶切位点 |
| PhrC5’-F | 5’GAATTCCATGGCCCAAGCAGAACAAAAAGCC 3’ | EcoRI |
| PhrC5’-R | 5’TCTAGACATGAAAGTCGAGTGCTTCCGCAT 3’ | XbaI |
| PhrC3’-F | 5’AAATCTAGATAAGAACAAGCCCCTTCTCATTAG 3’ | XbaI |
| PhrC3’-R | 5’ACAGCATGCTTTATATCACCTTCATATAGCCG 3’ | SphI |
| EM-F | 5’ TGATCTAGATAGAAGCAAACTTAAGAGTGTGT 3’ | XbaI |
| EM-R | 5’ TGATCTAGAAATTATTTCCTCCCGTTAAATAAT 3’ | XbaI |
PCR扩增体系如下：
10x Pfu PCR buffer 10μl
10μΜ 上游引物 10μl
10μM 下游引物 10μl
2.5mM dNTPs 8μl
枯草芽孢杆菌基因组DNA
或者pMUTIN4质粒DNA 1μl
Pfu DNA聚合酶 1μl
ddH2O 60μl
PCR程序为94℃ 2min；34×(94℃ 45s；58℃ 50s；72℃ 4min)；72℃ 10min。
pCSF5’-T用EcoRI/XbaI双酶切后获得phrC5’片段，与经过相同双酶切处理的pGEM-T载体，用T4 DNA连接酶连接，构建pGEM-phrC5’载体，酶切验证正确后于-20℃条件下保存备用；
pCSF3’-T用XbaI/SphI双酶切后获得phrC3’片段，与经过相同双酶切处理的pGEM- phrC5’载体，用T4 DNA连接酶连接，构建pGEM-phrC载体，酶切验证正确后于-20℃条件下保存备用；
pEM-T用XbaI酶切后获得EM片段，与经过相同酶切处理的pGEM-phrC载体，用T4 DNA连接酶连接，构建phrC基因敲除载体pCSF-EM，酶切验证正确后，转化大肠杆菌（Escherichia coli）DH5a (购自宝生物工程有限公司)，用于下一步转化；
（2）FMB 25突变菌株的构建
以枯草芽孢杆菌ATCC 9943（购自The Global Bioresource Center）制备感受态细胞，采用电转化方法，将获得的phrC基因敲除载体pCSF-EM转化入枯草芽孢杆菌ATCC 9943，在基因组phrC位点发生双交换，红霉素平板上筛选得到红霉素抗性菌株5株，命名为FMB 25。该菌株的phrC基因被红霉素抗性基因所取代，成为缺失了phrC基因的突变菌株，即我们所改良的菌株。
（3）蛋白酶失活菌株的分子验证
对枯草芽孢杆菌FMB 25突变菌是否缺失phrC基因进行分子验证。由于菌株内phrC基因被红霉素抗性基因所取代，所以我们根据pMUTIN4中红霉素抗性基因设计引物EMT-F / EMT-R，以经抗性筛选得到枯草芽孢杆菌FMB25基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到800bp基因片段，与预期结果一致（图4，第1泳道）。经过分子生物学验证，我们确实得到了缺失phrC基因的改良枯草芽孢杆菌菌株FMB 25。
（4）改良枯草芽孢杆菌菌株FMB 25抗菌肽产量HPLC分析
将枯草芽孢杆菌FMB 25种子液以5%浓度接种于Landy发酵培养基中，在33°C，180 rpm下培养36 h，得抗菌物质发酵液。发酵液11000g离心15 min除去菌体，用6 M HCl将上清液调节到pH 2，然后静止过夜，11000g离心收集沉淀，加入甲醇后用NaOH中和至pH 7，获得抗菌肽粗提物。
经过高效液相色谱(HPLC，Agilent 1100 Series)分析，与原始菌株ATCC 9943相比，改良菌株FMB25 中surfactin产量从777 mg/L提高到1596 mg/L，提高了2.05倍；fengycin的产量从646 mg/L提高到1860 mg/L，提高了2.87倍。
SEQUENCE LISTING
<110> 南京农业大学
<120> 通过敲除phrC基因提高枯草芽孢杆菌抗菌肽产量的方法
<130> 说明书
<160> 9
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<221> PhrC5'-F
<222> (1)..(31)
<223>
<400> 1
gaattccatg gcccaagcag aacaaaaagc c 31
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<221> PhrC5'-R
<222> (1)..(28)
<223>
<400> 2
tctagactac acgtcctaat tcatcaac 28
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<223>
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acagcatgct ttatatcacc ttcatatagc cg 32
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<223>
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<220>
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<223>
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aattatttcc tcccgttaaa taat 24
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<212> DNA
<213> Bacillus subtilis
<220>
<221> 红霉素抗性基因序列
<222> (1)..(790)
<223>
<400> 9
tagaagcaaa cttaagagtg tgttgatagt gcagtatctt aaaattttgt ataataggaa 60
ttgaagttaa attagatgct aaaaatttgt aattaagaag gagtgattac atgaacaaaa 120
atataaaata ttctcaaaac tttttaacga gtgaaaaagt actcaaccaa ataataaaac 180
aattgaattt aaaagaaacc gataccgttt acgaaattgg aacaggtaaa gggcatttaa 240
cgacgaaact ggctaaaata agtaaacagg taacgtctat tgaattagac agtcatctat 300
tcaacttatc gtcagaaaaa ttaaaactga atactcgtgt cactttaatt caccaagata 360
ttctacagtt tcaattccct aacaaacaga ggtataaaat tgttgggagt attccttacc 420
atttaagcac acaaattatt aaaaaagtgg tttttgaaag ccatgcgtct gacatctatc 480
tcttgcacac tcaagtctcg attcagcaat tgcttaagct gccagcggaa tgctttcatc 540
ctaaaccaaa agtaaacagt gtcttaataa aacttacccg ccataccaca gatgttccag 600
ataaatattg gaagctatat acgtactttg tttcaaaatg ggtcaatcga gaatatcgtc 660
aactgtttac taaaaatcag tttcatcaag caatgaaaca cgccaaagta aacaatttaa 720
gtaccgttac ttatgagcaa gtattgtcta tttttaatag ttatctatta tttaacggga 780
ggaaataatt 790
Claims (4)
1.通过敲除phrC基因提高枯草芽孢杆菌抗菌肽产量的方法，其特征在于：
（1） phrC基因敲除载体pCSF-EM的构建
设计引物PhrC5’-F和PhrC5’-R，以枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）ATCC 9943基因组DNA为模板PCR扩增部分5’端phrC基因及其上游基因，获得500bp基因片段；设计引物PhrC3’-F和PhrC3’-R，以枯草芽孢杆菌ATCC 9943基因组DNA为模板PCR扩增部分3’端PhrC基因及其下游基因，获得500bp基因片段；设计引物EM-F和EM-R，以pMUTIN4质粒为模板PCR扩增包括启动子和终止子的红霉素抗性基因表达框，获得850bp基因片段；扩增得到的三个基因分别克隆至pMD19-T载体，转化大肠杆菌（Escherichia coli）DH5a，经验证、测序正确后，分别命名为pCSF5’-T、pCSF3’ -T、pEM-T，于-20℃条件下保存备用；
pCSF5’-T用EcoRI/XbaI双酶切后获得phrC5’片段，与经过相同双酶切处理的pGEM-T载体，用T4 DNA连接酶连接，构建pGEM-phrC5’载体，酶切验证正确后于-20℃条件下保存备用；
pCSF3’-T用XbaI/SphI双酶切后获得phrC3’片段，与经过相同双酶切处理的pGEM-phrC5’载体，用T4 DNA连接酶连接，构建pGEM-phrC载体，酶切验证正确后于-20℃条件下保存备用；
pEM-T用XbaI酶切后获得EM片段，与经过相同酶切处理的pGEM-phrC载体，用T4 DNA连接酶连接，构建phrC基因敲除载体pCSF-EM，酶切验证正确后，转化大肠杆菌DH5a，用于下一步转化；
（2）FMB 25突变菌株的构建
以枯草芽孢杆菌ATCC 9943制备感受态细胞，采用电转化方法，将获得的phrC基因敲除载体pCSF-EM转化入枯草芽孢杆菌ATCC 9943，在基因组phrC位点发生双交换，红霉素平板上筛选得到红霉素抗性菌株，命名为FMB 25；该菌株的phrC基因被红霉素抗性基因所取代，成为缺失了phrC基因的突变菌株，即为所得到的菌株。
2.权利要求1所述方法获得的敲除phrC基因菌株FMB 25。
3.权利要求2所述敲除phrC基因菌株FMB 25在生产枯草芽孢杆菌抗菌肽中的应用。
4.用权利要求2所述敲除phrC基因菌株FMB 25生产的枯草芽孢杆菌抗菌肽产品。
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