CN102399737A

CN102399737A - 一种用于生产新型微生物源杀菌剂的生物工程菌株及其应用

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Publication number: CN102399737A
Application number: CN2011103477907A
Authority: CN
Inventors: 许煜泉; 申慧峰; 何亚文; 周万平
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2011-11-07
Filing date: 2011-11-07
Publication date: 2012-04-04
Anticipated expiration: 2031-11-07
Also published as: US9491943B2; US20140309232A1; CN102399737B; WO2013067719A1; MY184195A

Abstract

本发明涉及一种用于生产新型微生物源杀菌剂的生物工程菌株及其应用。本发明的用于生产微生物源杀菌剂的生物工程菌株，为将phzH基因重组表达质粒转化入产吩嗪-1-羧酸的菌株后获得，所述生物工程菌株产吩嗪-1-羧酸酰胺。本发明利用现有的生产吩嗪-1-羧酸的菌株携带phzH基因重组表达质粒，实现phzH基因的高效表达,并将吩嗪-1-羧酸转化为吩嗪-1-羧酸酰胺。本发明还进一步公开了所述生物工程菌株的用途，包括由所述生物工程菌株发酵生产的微生物源杀菌剂及该微生物源杀菌剂的制备与应用。吩嗪-1-羧酸酰胺的抗菌活性不受其使用条件的酸度值影响，从而稳定其抗菌活性，能更加有效地防治作物病害。

Description

一种用于生产新型微生物源杀菌剂的生物工程菌株及其应用

技术领域

本发明属于微生物源农药生产技术领域，尤其涉及一种用于生产新型微生物源杀菌剂的生物工程菌株及其应用。

背景技术

农作物病害引起的损失幅度约占总产量的25～75％，以我国主要的粮食作物水稻为例，每年种植面积约4亿亩，按亩产量400公斤，水稻病害平均引起减产10％计，每年造成经济损失达300多亿元人民币之巨，严重威胁粮食作物的安全生产。目前，生产上控制植物病害除了选用良种和改进栽培措施外，主要依靠喷洒化学杀菌剂。目前使用的大多化学杀菌剂对人体和动物具有不同程度的毒害作用，残留在植物可食部分的有害成份会对人体健康造成潜在威胁，已经引起政府和社会各阶层的关注；不仅如此，有些化学农药难以分解，会长期地累积在生态系统中，造成对环境的污染，不利于社会经济的可持续发展；而且，现有的化学农药对某些植物病害并不完全有效。因此，在努力发展新一代化学农药的同时，还需要大力研究和发展高效、安全、经济、对环境相容性好的生物源农药。目前，在生产上已经推广使用的生物源农药，其种类和数量都较少，有些品种则由于使用年久，引起了植物病原菌的抗药性，防治效果不够理想。以水稻纹枯病为例，防治该病害的药剂主要依赖于老牌生物源农药井岗霉素。但是，经过将近40年的长期使用，部分水稻纹枯病菌的融合群已产生抗药性；而且，井岗霉素仅对水稻纹枯病菌有效，对其他病原菌没有明显的防治效果，使用范围具有很大的局限性。

生物农药促生拈抗菌M18，对植物病害具有高效、安全、广谱的杀菌作用，与环境相容性好，易于在环境中解体。该促生拈抗菌M18已于2000年6月27日在中国专利局指定的保藏单位：北京，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCCNO.0462。生物农药促生拈抗菌M18的制备和应用，已经获得国家发明专利，专利号为00119857.2。但是，生物农药促生拈抗菌M18是一种活菌菌剂，其作用机理主要是通过M18活菌合成抗植物病害的活性成分实现对农作物植物病源菌的抑制作用，其合成的活性成分含量容易受到菌体本身的代谢调控机制和环境条件的影响。因而，对植物病害的防治效果具有不稳定性的缺陷，难以在农业生产中进行大规模的推广应用。

已经查明，促生拈抗菌M18防治植物病害的主要活性成分是吩嗪-1-羧酸，从促生拈抗菌M18的发酵液中提取吩嗪-1-羧酸，利用活性成分而不是活菌对农作物病害的防治同样具有高效、安全、广谱、与环境相容性好等特征；同时，能克服利用促生拈抗菌M18防治病害效果不稳定性的缺陷。但是，利用促生拈抗菌M18发酵，合成活性成分吩嗪-1-羧酸的效价很低，仅为每升200毫克左右，如何提高发酵效价，降低使用成本，成为开发本产品的瓶颈所在。近年来，我们已经运用分子生物学的技术，对促生拈抗菌M18合成吩嗪-1-羧酸的调控机制，开展深入地研究。在此基础上，运用基因工程手段，对促生拈抗菌M18基因组中的双组分调控基因gacA开展了定向失活突变，获得了M18衍生菌株M18G，大大提高了吩嗪-1-羧酸的产量，使其发酵效价达到每升1500-1700毫克左右。该研究成果的技术方法已经于2004年在《微生物学报》44卷第761～765页公开，论文题目为《假单胞菌gacA插入突变对藤黄绿菌素和吩嗪-1-羧酸合成代谢的差异性调控》。在2006年，名称为“利用促生拈抗菌M18衍生菌株制备杀菌剂的方法”的中国发明专利中(专利号：ZL200610023459.9)，提供一种了利用促生拈抗菌M18衍生菌株M18G和M18R制备杀菌剂的方法，利用微生物的代谢产物而非微生物活体制备杀菌剂，通过两种衍生菌株的代谢产物的复配，达到提高防治效果的目的。2009年，我们又发明了利用工程菌株M18G携带质粒pME6032Phz生产吩嗪-1-羧酸的方法，能使吩嗪-1-羧酸的发酵效价达到每升5700～6600毫克的水平，进一步降低生产成本，实现在农业生产的大规模推广应用。该项技术已经获得国家发明专利，专利号：ZL200910198664.2。以吩嗪-1-羧酸为主要成分的微生物源杀菌剂，我国农药命名单位已经定名为申嗪霉素。申嗪霉素原药和1％申嗪霉素悬浮剂于2011年获得了农业部颁发的正式登记证(登记号：PB20110314和PB20110315)。农业部已经将申嗪霉素列入“十二五”期间全国推广产品(证书号：TG2011-002)。

但是，吩嗪-1-羧酸对病源菌的防病作用与使用时的酸度(pH)值密切相关，在pH值7.0的条件下，其抗菌活性仅为pH值5.0条件下的20％，大大降低了吩嗪-1-羧酸在碱性条件下的防病效果。同时发现，促生拈抗菌M18及其衍生菌株M18G的基因组中，phzH基因是一个已经发生突变的失活基因。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术中存在的缺陷，提供一种用于生产新型微生物源杀菌剂的生物工程菌株及其应用技术。

本发明利用生产吩嗪-1-羧酸的菌株，携带能表达phzH基因、编码产生PhzH(glutaminephenazine-1-carboxylic acid amidotransferase，谷酰胺吩嗪-1-羧酸酰胺转移酶，PhzH)的重组表达质粒，补充并添加phzH基因的拷贝数，并在工程菌株中进行表达，将吩嗪-1-羧酸转化为吩嗪-1-羧酸酰胺。吩嗪-1-羧酸酰胺的抗菌活性不受其使用条件的酸度值影响，从而稳定其抗菌活性，能更加有效地防治作物病害。

本发明首先公开了一种用于生产微生物源杀菌剂的生物工程菌株，为将phzH基因重组表达质粒转化入产吩嗪-1-羧酸的菌株后获得，所述生物工程菌株产吩嗪-1-羧酸酰胺。

本发明还公开了所述用于生产该微生物源杀菌剂的生物工程菌株的构建方法，包括下列步骤：

1)扩增phzH基因片段；

2)将扩增的phzH基因片段插入表达载体中构建成phzH基因重组表达质粒；

3)将构建的phzH基因重组表达质粒导入产吩嗪-1-羧酸的菌株，构建成所述用于生产微生物源杀菌剂的生物工程菌株。

所述phzH基因重组表达质粒为克隆有phzH基因片段的重组表达质粒。所述phzH基因重组表达质粒能在所述产吩嗪-1-羧酸的菌株中表达phzH基因，编码产生PhzH(谷酰胺吩嗪-1-羧酸酰胺转移酶)。

本发明所述的phzH基因包含phzH基因的编码区及其非编码区。

所述的phzH基因片段可以是完整的phzH基因也可以是phzH基因的一部分。本发明所述的phzH基因片段应至少包含phzH基因的完整编码区。较佳的，为利于高效表达为PhzH，所述phzH基因片段包含phzH基因的完整编码区及其5’端的非编码区。所述phzH基因片段所包含的5’端的非编码区可以为部分的或是完整的phzH基因5’端非编码区。所述phzH基因片段所包含的phzH基因5’端非编码区应当有利于PhzH的表达。优选的，phzH基因片段所包含的5’端的非编码区含有自phzH基因翻译起始密码子上游第1位碱基始至其上游第683位碱基止的多核苷酸片段。

进一步的所述PhzH为假单胞菌的PhzH。所述phzH基因片段为假单胞菌的phzH基因片段。

优选的，所述假单胞菌为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)或绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)。具体可选自铜绿假单胞菌株PAO1、LESB58、PA14、PUPa3或绿针假单胞菌株PCL1391。

进一步的，所述PhzH来源于铜绿假单胞菌株PAO1。如实施例所列举的，其氨基酸序列为SEQ ID NO：1：

MCGLAGWVDY TRKLDDEFPA IFAMTDTLAL RGPDAEGIWK HRNALLGHRR LAVIDLSGGV 60

QPMSYRFPTG QEVTLVYTGE VYNHDALRER LRRAGHEFRT RSDTEVVLHA YLQWGERCCE 120

YLTGMFAFAV FDGRDGHLLL VRDRLGIKPL YYARHREGLL FGSEIKSILA HPEFAARLDA 180

VGLVDLLTLS RGTSQTPFRE VQELLPGHLL SWRPNSQAKL RRYWEVRRQE HADDLQSTVQ 240

RTRELVTRAL GAQLHADVPV CSLLSGGLDS TALTGIAQRI AKAEHGGDIN SFSVDFVGQA 300

EQFRSDDLRP DQDQPFALLA AQYIGSRHRT VLIDNAELVC ERAREEVFRA KDVPFTFGDM 360

DTSLHLMFGE IRRHSTVAIS GEGADELFGG YGWFRDPQAV AAARFPWASR VRLPAGFIDA 420

GFNRRCDLLQ YQQASYDDGL RQVEHLAGDS PEERRMREFS HLHLKRWMVL LLERKDRLSM 480

CNGLEVRVPY TDHELVEYVY NVPWSIKSRD GEEKWLLKRA CADYVPEAVL KRRKSPYPTS 540

ANLGYERFLR GSVRRLLEDA VNPVFGIVSR EFLAAELEHP EGYFNTQVSR HNLETALALE 600

GWLRLYGLSA 610

进一步的，所述phzH基因片段来源于铜绿假单胞菌株PAO1基因组。如实施例所列举的，其碱基序列为SEQ ID NO：2：

gtccgaggac ccgtgcagcg ggccggtgtt cggtccgtcg acctgcgaat gcccttgagg 60

taggtcgtct ggcgggcccg gtgcagcggg cccgcttccg gatgtatcgc tcgctcgaag 120

ttgccttctt taattctcca ttccccgcgc cgccctactt ttcccgctcg tccatcgtcg 180

cgtcgaacgt tgccacgaaa tcagcgtcga tggacaactc ttatattcaa tagttgtacg 240

atctgagttt gttgtagtca tttgcttagt tggctattca tatgattgcc gtaaagcaac 300

tataagttta attggattag ccttctaagt ctttggaaag agccgtgaac gaccctgtaa 360

tatctggttg tagagccgcg taatgatgtt tcaggatatt tcattaattt tgtagattat 420

tgtttttcct ttgttttttt aaaaacagct accagattta gatagatatt aattaactcg 480

gccacgtttt ttcctgttct atcattggcc ttccttgggc gcaggcctgc cgaaactgct 540

tatcttcagg tcctcgaaaa gttcatacat cgaccgcctt gggcgaagca ttcgtacgcc 600

ggaaatctgt ccggccgcac ggatgttttc agcatgttct ctggatgagt ttcccgataa 660

acatcaatta gaggagtttc cctatgtgcg gtctcgcggg ttgggtggat tacacgcgca 720

agctcgacga cgaatttccg gcgatcttcg ccatgaccga tacgctcgcc atgcgcgggc 780

cggatgccga gggcatctgg aagcaccgca acgccctgct gggtcaccgg cggctggcgg 840

tcatcgacct cagcggcggc gtgcagccga tgtcctatcg ctttcccacc ggccaggagg 900

tcaccctcgt ctacaccggc gaggtgtaca accacgatgc cctgcgcgag cggttgcgcc 960

gggccggaca tgagttccgc acccgcagcg ataccgaggt ggtcctgcac gcctatctgc 1020

aatggggcga gcgttgttgc gagtacctga ccgggatgtt cgccttcgcc gtcttcgatg 1080

gccgcgacgg ccacctgctg ctggtgcgcg accgcctggg catcaagccg ctgtattacg 1140

cgcggcaccg cgagggactg ctgttcggct cggagatcaa gtccatcctg gcgcatccgg 1200

aattcgccgc caggctcgac gcggtcggcc tggtcgacct cctgacgctg tcccggggca 1260

cttcgcagac gccgttccgc gaggtccagg aactgctgcc cggccacctg ctgtcctggc 1320

gtcccaattc ccaggcgaag ttgcgccgct attgggaggt acgccgccag gagcatgccg 1380

acgacctgca gagcaccgtg cagcgcaccc gcgaactggt cacccgcgcc ctgggggcgc 1440

aattgcacgc cgacgttccg gtgtgttcgc tgctatcggg tgggctcgat tcgaccgccc 1500

tgaccggcat cgcccagcgc atcgcgaagg cggagcacgg cggcgacatc aattcattct 1560

cggtggactt cgtcggccag gccgagtagt tccgcagcga cgacctgcgt cccgaccagg 1620

accagccgtt cgccctgctg gccgcgcagt acatcggcag ccgtcatcgc accgtgctca 1680

tcgacaatgc cgaactggtc tgcgaacgag cgcgcgaaga ggtattccgg gccaaggacg 1740

tacctttcac cttcggcgac atggatacct cgctgcacct gatgttcggc gagatccgcc 1800

ggcattccac ggtggccatc tccggtgaag gcgccgacga gctgttcggt ggctacggct 1860

ggttccgcga tccgcaggcg gtggctgcgg cgcgcttccc ctgggcctcc agggtgcgcc 1920

tgccagccgg cttcatcgac gccggtttca accgccgctg cgatctcctc cagtaccagc 1980

aggccagcta cgacgatggg ctgcgccagg tcgaacacct ggccggcgac agcccggagg 2040

agcggcggat gcgcgagttc agccacctgc atctgaagcg ctggatggtg ctgctgctcg 2100

aacgcaagga tcgcctgagc atgtgcaacg gcctggaggt gcgggtgccc tacaccgacc 2160

atgagctggt ggagtacgtc tacaacgtgc cctggtcgat caagagccgg gacggcgagg 2220

agaagtggct gctcaagcgg gcctgcgccg actatgtccc ggaagccgtg ctcaagcgcc 2280

gcaagagccc ttatccgact tctgccaacc tcggctacga gcgtttcctg cgcgggagcg 2340

tgcggcgtct gctggaggac gcggcgaacc cggtgttcgg catcgtttcg cgagagttcc 2400

tggccgccga actggagcat ccggaggggt acttcaacac ccaggtgagc cgccacaacc 2460

tggagaccgc gctggcgctg gaaggctggc tcaggttgta cgggctctcc gcctga 2516

碱基序列中带有下划线并加粗的密码子分别为phzH基因的起始密码子和终止密码子，起始密码子之前的碱基为phzH基因的5’端的非编码区。

进一步的，用于构建phzH基因重组表达质粒的表达载体为大肠杆菌/假单胞菌穿梭表达质粒。

为了让phzH基因重组表达质粒能够正确表达phzH基因，需要保证插入大肠杆菌/假单胞菌穿梭表达质粒多克隆位点处的phzH基因读码框正确。

较佳的，为了促进PhzH的高效表达，所述大肠杆菌/假单胞菌穿梭表达质粒含有强启动子，且所述phzH基因片段克隆于所述强启动子之后，由该强启动子控制其表达。所述强启动子可为噬菌体启动子T3prom或T7prom。

在所述质粒的特定位置插入目的基因并保证目的基因的读码框正确是本技术领域的技术人员熟知的技术。所述大肠杆菌/假单胞菌穿梭表达质粒可为pBBR1MCS系列质粒及其衍生的各种表达质粒。如实施例列举的，所述大肠杆菌/假单胞菌穿梭表达质粒为pBBR1MCS-5。可以通过合适的引物设计，扩增phzH基因片段在保证读码框正确的前提下，置于pBBR1MCS-5的噬菌体启动子T3prom控制下获得基因重组表达质粒pBBRphzH。

所述产吩嗪-1-羧酸的菌株是指可经发酵生产吩嗪-1-羧酸的野生型菌株及其衍生的工程菌株。进一步的，所述产吩嗪-1-羧酸的菌株属于假单胞菌，如M18、M18G。

所述M18的保藏号为CGMCC NO.0462，为一种生物农药促生拈抗菌，可活菌合成抗植物病害的活性成分吩嗪-1-羧酸，M18为现有技术。

所述M18G菌株为M18(CGMCC NO.0462)的衍生菌株，为现有技术。其制备方法已为公知，如2004年在《微生物学报》44卷第761～765页，《假单胞菌gacA插入突变对藤黄绿菌素和吩嗪-1-羧酸合成代谢的差异性调控》。相比M18，M18G的吩嗪-1-羧酸的产量获得了很大的提升，因此，本发明优选的产吩嗪-1-羧酸工程菌株为M18G。

由于产吩嗪-1-羧酸的野生型菌株及其衍生的工程菌株能产生吩嗪-1-羧酸，所述phzH基因重组表达质粒又能在产吩嗪-1-羧酸工程菌株中表达phzH基因，其编码产物谷酰胺吩嗪-1-羧酸酰胺转移酶能将吩嗪-1-羧酸酰胺化，合成吩嗪-1-羧酸酰胺(吩嗪-1-羧酸酰胺的分子结构式见图1)，因此，本发明所述生物工程菌株的代谢产物中含有吩嗪-1-羧酸酰胺。

phzH基因重组表达质粒导入产吩嗪-1-羧酸工程菌株的方法为常规转化或转导方法。

本发明的用于生产微生物源杀菌剂的生物工程菌株可用于发酵生产本发明的微生物源杀菌剂。

本发明进一步提供了一种微生物源杀菌剂，所述微生物源杀菌剂为本发明的生物工程菌株的发酵液。

所述发酵液中，主要的杀菌活性成分为吩嗪-1-羧酸酰胺。此外，还含有微量的杀菌活性成分藤黄绿菌素。

进一步的，所述发酵液中，吩嗪-1-羧酸酰胺的含量为每升2500～2800毫克。

本发明进一步公开了所述微生物源杀菌剂的制备方法，为在合适表达吩嗪-1-羧酸及PhzH的条件下，发酵培养本发明的生物工程菌株后获得。

进一步的，所述微生物源杀菌剂的制备方法包括下列步骤：

1.工程菌株的活化；

2.种子扩大培养：先在甘油培养液中摇瓶培养后，转接入产素培养液中放大发酵培养获得发酵液。

所述工程菌株活化可采用固体甘油培养基活化培养。

所述的甘油培养液中含有的组分重量百分比为：蛋白胨1.8～2.2％、甘油1.3～1.7％、硫酸镁0.05～0.1％、磷酸二氢钾0.01～0.05％、余量为水，pH 6.8～7.2。

所述的固体甘油培养基中含有的组分重量百分比为：蛋白胨1.8～2.2％、甘油1.3～1.7％、硫酸镁0.05～0.1％、磷酸二氢钾0.01～0.05％、琼脂1.2-1.5％、余量为水，pH 6.8～7.2。

所述的产素培养液的组分重量百分比为：蛋白胨2.2～3.0％、葡萄糖2.0～2.5％、硝酸钾0.5～0.7％、余量为水，pH6.5～7.0。

较佳的，工程菌株的活化条件为：将工程菌接入甘油培养基平板，在26～30℃下，活化生长20～24小时；而后再次在甘油培养基的平板上划菌块，26～30℃下活化10～12小时。

较佳的，所述种子扩大培养中，在甘油培养液中摇瓶培养条件为：将活化后的菌株接入甘油培养液、26～30℃振荡培养9～11小时。震荡培养时，摇床转速可为160～180转/分。

较佳的，所述种子扩大培养中，接入产素培养液中放大发酵培养的条件为：将甘油培养液中摇瓶培养的菌株转接入含有产素培养液中，在26～30℃下发酵培养60～72小时。发酵培养时，摇床转速可为160～180转/分。

本发明所述微生物源杀菌剂可用于防治植物病害或用于制备防治植物病害的药剂。

进一步的，用于对农作物进行喷雾或灌根施用，防治水稻纹枯病、水稻白叶枯病、水稻稻曲病、小麦赤霉病、黄瓜枯萎病、西瓜枯萎病、甜瓜蔓枯病、棉花枯萎病、炭疽病、立枯病和各种腐霉或疫霉引起的植物病害。

本发明还进一步公开了一种防治植物病害的药剂，含有杀菌有效量的本发明所述微生物源杀菌剂或其杀菌活性成分。

可将本发明的用于生产微生物源杀菌剂的生物工程菌株的发酵液直接用作防治植物病害的药剂；也可将所述发酵液常规方法干燥成粉后作为杀菌活性成分原料与其他常规辅料一并配置防治植物病害的药剂；或者，也可将发酵液中的主要杀菌活性成分吩嗪-1-羧酸酰胺分离出后，作为杀菌活性成分原料用于配制防治植物病害的药剂。

本发明利用产吩嗪-1-羧酸的基因工程菌株携带重组表达载体，生产吩嗪-1-羧酸酰胺的方法的优点是：

1抗菌活性稳定性好，不受酸度影响。利用本发明生产的吩嗪-1-羧酸酰胺，不仅具有高效的抗真菌能力，而且在pH值4.0至8.0的范围内，不受使用环境的酸度影响，无论在种植在酸性还是碱性环境中的作物上使用，都能获得稳定的防治效果。

2转化率高。本发明中通过构建携带phzH基因的完整编码区及其5’端的非编码区的基因重组质粒，将宿主中的吩嗪-1-羧酸转化为吩嗪-1-羧酸酰胺。在优选方案中，由于phzH基因及其5’端的非编码区片段置于噬菌体强启动子T3prom的控制下高效表达，同时重组质粒在宿主M18G具有多个拷贝，在宿主M18G中phzH基因能大量表达并合成酰胺化酶，将吩嗪-1-羧酸全部转化为吩嗪-1-羧酸酰胺，转化效率可达100％。

3生产成本低，经济效益高。运用本发明生产吩嗪-1-羧酸酰胺，除了研制和构建工程菌株所耗费的一次性的前期成本外，一旦实施产业化生产，除了消耗培养基外，不需要进一步的添加其他原料和消耗额外的能量，随着生产规模的扩大和延续，单位产量的平均生产成本不断下降，利于在农业生产中获得大规模推广应用。

4实现清洁生产，保护环境。运用生物技术发酵生产吩嗪-1-羧酸酰胺，能将全部吩嗪-1-羧酸转化为吩嗪-1-羧酸酰胺，在生产过程中，除了消耗培养基外，不使用其它特殊的原料，也不形成任何其它的中间产物。所以，不会产生新的污染物释放到环境中去，能实现清洁生产，保护环境生态。

附图说明

图1为本发明中吩嗪-1-羧酸酰胺的分子结构式。

图2为本发明中质粒pBBRphzH的构建示意图。

本发明涉及一种利用工程菌株M18G携带质粒pBBRphzH生产吩嗪-1-羧酸酰胺的方法，从铜绿假单胞菌PAO1基因组中扩增出phzH基因及其5’端的非编码区片段，并将该片段插入表达质粒pBBR1MCS-5中，置于噬菌体启动子T3prom的控制下，构建成重组质粒pBBRphzH；然后将该重组质粒导入促生拈抗菌M18的衍生菌株M18G中，构建成基因工程菌株M18G/pBBRphzH。该工程菌株实现了谷酰胺吩嗪-1-羧酸酰胺转移酶PhzH的高效稳定表达。最后将基因工程菌株M18G/pBBRphzH在培养液中培养，高效稳定地生产吩嗪-1-羧酸酰胺。利用本发明的高产基因工程菌株制备吩嗪-1-羧酸酰胺，其防治病害的效果不受酸度条件影响，其生产成本能进一步降低，无论在酸性或碱性环境使用，都有效地防治植物病害。

图3为相同浓度的吩嗪-1-羧酸(PCA)和吩嗪-1-羧酸酰胺(PCN)，在不同酸度条件的马铃薯葡萄糖培养基中，对水稻纹枯病菌的抑菌活性的比较结果图。实验中采用的马铃薯葡萄糖培养基成分的重量百分比为，马铃薯20％，葡萄糖2％，琼脂粉1.2％，余量为水。

具体实施方式

本发明优选的实施例利用促生拈抗菌M18的衍生菌株M18G携带重组质粒pBBRphzH的方法构建基因工程菌株M18G/pBBRphzH，在M18G菌株中补充并添加phzH基因的完整编码区及其5’端的非编码区片段的拷贝数，将吩嗪-1-羧酸转化为吩嗪-1-羧酸酰胺，以生产吩嗪-1-羧酸酰胺。

本发明优选的实施例从铜绿假胞菌株PAO1中扩增出phzH基因的完整编码区及其5’端的非编码区片段，并将该片段插入表达质粒pBBR1MCS-5中，置于噬菌体启动子T3prom的控制下，构建成重组质粒pBBRphzH；然后，将该重组质粒pBBRphzH导入促生拈抗菌M18的衍生菌株M18G中，构建成基因工程菌株M18G/pBBRphzH，该工程菌株能够实现phzH基因的高效稳定表达。最后，基因工程菌株M18G/pBBRphzH在培养液中培养，高效稳定地生产吩嗪-1-羧酸酰胺，而不是吩嗪-1-羧酸，吩嗪-1-羧酸酰胺的产量达到每升2500～2800毫克的水平。在pH等于或大于7.0的条件下，吩嗪-1-羧酸酰胺的抗水稻纹枯病的活性，与吩嗪-1-羧酸相比，提高了5倍以上。按此抗菌活性推算，单位体积发酵液中生产的吩嗪-1-羧酸酰胺的抗菌活性大大超过吩嗪-1-羧酸的抗菌活性。

本发明构建基因工程菌株M18G/pBBRphzH及利用该菌株生产吩嗪-1-羧酸酰胺的具体方案为：

1、扩增phzH基因及其5’端的非编码区片段。

设计一对引物，引物的核苷酸序列如下：

正向：5’-CGCGCTCGAGGTCCGAGGACCCGTGCAGC-3’(SEQ ID NO：3)

反向：5’-CGCGAAGCTTTCAGGCGGAGAGCCCGTAC-3’(SEQ ID NO：4)

序列中下划线为限制性内切酶Xho I、Hind III的酶切位点；然后以铜绿假单胞菌PAO1基因组DNA为模板，利用DNA聚合酶LA Taq和设计的引物，扩增phzH基因及其5’端的非编码区片段，扩增产物通过琼脂糖电泳检测，回收长度为2.5kb的phzH基因及其5’端的非编码区片段。

2、构建重组质粒pBBRphzH

将回收的基因扩增片段phzH及其5’端的非编码区，经限制性内切酶Xho I、Hind III酶切，在连接酶的作用下，插入大肠杆菌/假单胞菌穿梭表达质粒pBBR1MCS-5中的相应酶切位点，将phzH基因的完整编码区及其5’端的非编码区的表达置于噬菌体启动子T3prom控制下，形成重组质粒pBBRphzH并转化进入大肠杆菌；在庆大霉素抗性平板上，筛出经pBBRphzH转化的大肠杆菌转化子；从大肠杆菌中提取构建的基因重组质粒pBBRphzH。

3、构建基因工程菌株M18G/pBBRphzH。

制备促生拈抗菌M18衍生菌株M18G的感受态细胞，并将上述基因重组质粒pBBRphzH转化到M18G的感受态细胞中，在28～37℃条件下，培养1～2天，从中筛选出基因工程菌株M18G/pBBRphzH。

4、基因工程菌株M18G/pBBRphzH的培养。

将基因工程菌株M18G/pBBRphzH接种在甘油培养基的平板上，在26～30℃下，活化生长20～24小时，再次在甘油培养基的平板上划菌块，26～30℃下活化10～12小时，然后将活化的M18G/pBBRphzH菌块，转接到含有25毫升甘油培养液、体积为250毫升的三角瓶中，在26～30℃的摇床中振荡培养9～11小时，摇床转速为160～180转/分；最后转接到含有65毫升的产素培养液、体积为500毫升的三角瓶中，进行放大发酵培养，温度和转速不变，发酵时间为60～72小时，得到吩嗪-1-羧酸酰胺的产量为每升2500～2800毫克。

下面结合实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而非限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照常规条件如分子克隆试验手册中所述的条件或者制造商建议的条件进行或配制。以下实施例不构成对本发明的限定。

实施例1

1、扩增phzH基因及其5’端的非编码区片段

设计一对引物，用以扩增phzH基因及其5’端的非编码区片段，引物的核苷酸序列如下：

正向.5’-CGCGCTCGAGGTCCGAGGACCCGTGCAGC-3’

反向：5’-CGCGAAGCTTTCAGGCGGAGAGCCCGTAC-3’

序列中带有下划线的核苷酸为限制性内切酶Xho I、Hind III的酶切位点。该引物委托上海生工生物工程有限公司合成。

然后，以铜绿假单胞菌PAO1基因组DNA为模板，利用DNA聚合酶LA Taq和上述设计的引物，扩增phzH基因的完整编码区及其5’端的非编码区的片段，产物通过0.7％琼脂糖电泳检测，回收长度约为2.5kb的phzH基因的完整编码区及其5’端的非编码区的片段，基因片段经核苷酸测序验证为准确。其中，所述铜绿假单胞菌PAO1基因组DNA的制备利用AxyPrep细菌基因组DNA试剂盒进行，基因片段的回收利用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒进行，均由爱思进生物技术(杭州)有限公司提供，产品目录号分别为AP-MN-BT-GDNA-4和AP-GX-50；所述基因扩增反应的条件以及琼脂糖电泳，分别按照J.萨姆布鲁克、D.W.拉塞尔编著，2002年科学出版社出版的《分子克隆实验指南(第三版)》，第8章第611～618页和第5章第387～400页中所述的方法进行。其中，所使用的DNA聚合酶LA Taq和基因扩增试剂盒，购自TAKARA公司上海代理公司，产品目录号：DRR002AG。琼脂糖购自GENE TECH公司上海代理公司。基因片段(phzH及其5’端的非编码区)的核苷酸测序验证委托上海英骏生物技术有限公司完成，测序结果证实基因片段含SEQ ID NO：2，其编码的蛋白氨基酸序列为SEQ ID NO：1。

2、构建重组质粒pBBRphzH

将步骤1中回收的基因扩增片段(phzH及其5’端的非编码区)，经限制性内切酶Xho I、Hind III酶切后，在连接酶的作用下，插入大肠杆菌/假单胞菌穿梭表达质粒pBBR1MCS-5中相应的位点，并将基因phzH及其5’端的非编码区片段的表达置于噬菌体启动子T3prom控制下，形成重组质粒pBBRphzH并转化进入大肠杆菌。在庆大霉素抗性平板上，筛出经pBBRphzH转化的大肠杆菌转化子；最后，从大肠杆菌转化子中提取构建的基因重组质粒pBBRphzH并验证。

构建的基因重组质粒pBBRphzH如图2所示，含有phzH基因的完整编码区及其5’端的非编码区片段经限制性酶Xho I、Hind III酶切后，在连接酶的作用下，插入质粒pBBR1MCS-5中的相应酶切位点，置于噬菌体启动子T3prom的控制下，构建成重组质粒pBBRphzH。图2中：4766bp表示质粒pBBR1MCS-5的长度，为4766个碱基对；图中，phzH代表谷酰胺吩嗪-1-羧酸酰胺转移酶编码基因；//为基因缩短片段的符号；Xho I、Hind III为限制性内切酶位点；图中的数字表示连接到pBBR1MCS-5质粒中的phzH基因的编码序列及其5’非编码区的核苷酸序列的长度，分别为1833bp和683bp；Gm为质粒pBBR1MCS-5中抗庆大霉素的选择标记基因；T3prom和T7prom为两个噬菌体启动子；mob所标记的为质粒转移所需要的基因；rep所标记的为质粒的复制所需要的序列；lacZ所标记的基因编码大肠杆菌的lacZ’基因所编码的a-肽链。

上述基因片段定向插入质粒、感受态大肠杆菌的制备、转化以及重组质粒的提取和验证分别按照J.萨姆布鲁克、D.W.拉塞尔编著，2002年科学出版社出版的《分子克隆实验指南(第三版)》，第1章第68～71页和第96～99页及第8章第663～666页中所述的方法进行。其中：质粒pBBR1MCS-5质粒由上海交通大学生命科学技术学院提供。限制性内切酶和连接酶，均购自深圳中晶生物技术有限公司。大肠杆菌中重组质粒的提取，采用B型少量质粒快速提取试剂盒，由北京博大泰克生物基因技术有限责任公司提供，产品目录号：MK014-2。重组质粒的验证所使用的限制性酶、DNA聚合酶LA Taq和基因扩增试剂盒，均购自TAKARA公司上海代理公司，产品目录号：DRR002AG。琼脂糖购自GENE TECH公司上海代理公司。

3、构建基因工程菌株M18G/pBBRphzH

制备促生拈抗菌M18衍生菌株M18G的感受态细胞，并将上述重组质粒pBBRphzH转化到M18G的感受态细胞中，在28℃条件下，培养2天，从中筛选出基因工程菌株M18G/pBBRphzH。

促生拈抗菌M18衍生菌株M18G的感受态细胞的制备方法、重组质粒pBBRphzH转化到M18G的感受态细胞以及高效生产吩嗪-1-羧酸酰胺的基因工程菌株M18G/pBBRphzH的筛选方法，均按照J.萨姆布鲁克、D.W.拉塞尔编著，2002年科学出版社出版的《分子克隆实验指南(第三版)》，第1章第96～99页中所述的方法进行。

4、基因工程菌株M18G/pBBRphzH的培养

将基因工程菌株M18G/pBBRphzH接种在甘油培养基平板上，在26℃下活化生长24小时，然后再次在甘油培养基的平板上划菌块，26℃下活化10小时，然后，将活化的M18G/pBBRphzH菌块转接到含有25毫升甘油培养液、体积为250毫升的三角瓶中，在26℃的摇床中振荡培养9小时，摇床转速为160转/分；最后转接到含有65毫升的产素培养液、体积为500毫升的特殊三角瓶中，进行放大发酵培养，温度和转速不变，发酵时间为60小时，在发酵液中，获得的吩嗪-1-羧酸酰胺含量为每升2500毫克，检测不出吩嗪-1-羧酸的含量，表明全部吩嗪-1-羧酸已经转化为吩嗪-1-羧酸酰胺，检测结果表明吩嗪-1-羧酸转化为吩嗪-1-羧酸酰胺的转化率为100％。

其中，所述甘油培养液中含有的组分重量百分比为：蛋白胨1.8％、甘油1.3％、硫酸镁0.07％、磷酸二氢钾0.03％、余量为水，pH7.0。所述甘油培养基(固体)中还含有琼脂1.5％。所述的产素培养液的组分重量百分比为：蛋白胨2.2％、葡萄糖2.0％、硝酸钾0.5％、余量为水，pH6.8。

在此配方下，65毫升的M18G/pBBRphzH发酵液中获得吩嗪-1-羧酸酰胺产量为162.5毫克，吩嗪-1-羧酸的含量为零，按一定比例稀释，配置每升含有16毫克吩嗪-1-羧酸酰胺的马铃薯葡萄糖培养基(pH7.0)，同时按一定比例稀释M18G/pME6032Phz发酵液(ZL200910198664.2记载)，配置每升含有16毫克吩嗪-1-羧酸的马铃薯葡萄糖培养基(pH7.0)，以不加发酵液的马铃薯葡萄糖培养基(pH7.0)为对照，分别测定水稻纹枯病菌在各种马铃薯葡萄糖培养基(pH7.0)中的生长速率，并按照实施例6的计算方法，计算吩嗪-1-羧酸酰胺和吩嗪-1-羧酸的抑菌活性，按照在相同pH7.0条件下的生物活性计算，每升M18G/pBBRphzH发酵液获得吩嗪-1-羧酸酰胺产量相当于吩嗪-1-羧酸12500毫克的抑菌效果，抑菌活性提高了约1.9倍。

实施例2

1、采用与实施例1相同的方法扩增phzH基因的完整编码区及其5’端的非编码区，产物通过1.0％琼脂糖电泳检测，回收获得长度约为2.5kb的phzH基因及其5’端的非编码区片段。

2、将回收的phzH基因及其5’端的非编码区片段，经限制性内切酶Xho I、Hind III酶切，连接酶连接，插入大肠杆菌/假单胞菌穿梭表达质粒pBBR1MCS-5，并将phzH基因及其5’端的非编码区片段的表达置于噬菌体启动子T3prom控制下，形成重组质粒pBBRphzH并转化进入大肠杆菌。在庆大霉素抗性平板上，筛出经pBBRphzH转化的大肠杆菌转化子；最后，从大肠杆菌转化子中提取重组质粒并验证。

3、制备促生拈抗菌M18衍生菌株M18G的感受态细胞，并将上述重组质粒pBBRphzH转化到M18G的感受态细胞中，在30℃条件下，培养1天。

促生拈抗菌M18衍生菌株M18G的感受态细胞的制备方法、重组质粒pBBRphzH转化到M18G的感受态细胞以及高效生产吩嗪-1-羧酸酰胺的基因工程菌株M18G/pBBRphzH的筛选方法，均同实施例1。

4、将基因工程菌株M18G/pBBRphzH接种在甘油培养基的平板上，在28℃下活化生长22小时，然后再次在甘油培养基的平板上划菌块，28℃下活化11小时，然后将活化的M18G/pBBRphzH菌块转接到含有25毫升甘油培养液、体积为250毫升的三角瓶中，在28℃的摇床中振荡培养10小时，摇床转速为170转/分；最后转接到含有65毫升的产素培养液、体积为500毫升的三角瓶中，进行放大发酵培养，温度和转速不变，发酵时间为66小时，在发酵液中，得到吩嗪-1-羧酸酰胺含量为每升2700毫克，检测不出吩嗪-1-羧酸的含量，表明全部吩嗪-1-羧酸已经转化为吩嗪-1-羧酸酰胺，检测结果表明吩嗪-1-羧酸转化为吩嗪-1-羧酸酰胺的转化率为100％。

其中，所述甘油培养基中含有的组分重量百分比为：蛋白胨2.2％、甘油1.7％、硫酸镁0.05％、磷酸二氢钾0.01％、余量为水，pH 7.2。所述甘油培养基(固体)中还含有琼脂1.5％。所述产素培养液的组分重量百分比为：蛋白胨2.2％、葡萄糖2.5％、硝酸钾0.5％、余量为水，pH7.2。

在此配方下，65毫升的M18G/pBBRphzH发酵液中获得吩嗪-1-羧酸酰胺产量为175.5毫克，吩嗪-1-羧酸的含量为零，按一定比例稀释，配置每升含有16毫克吩嗪-1-羧酸酰胺的马铃薯葡萄糖培养基(pH7.0)，同时按一定比例稀释M18G/pME6032Phz发酵液(ZL200910198664.2记载)，配置每升含有16毫克吩嗪-1-羧酸的马铃薯葡萄糖培养基(pH7.0)，以不加发酵液的马铃薯葡萄糖培养基(pH7.0)为对照，分别测定水稻纹枯病菌的在各种马铃薯葡萄糖培养基(pH7.0)中的生长速率，并按照实施例6的计算方法，计算吩嗪-1-羧酸酰胺和吩嗪-1-羧酸的抑菌活性，按照在相同pH7.0条件下的抑菌活性计算，每升M18G/pBBRphzH发酵液获得吩嗪-1-羧酸酰胺的产量相当于吩嗪-1-羧酸13500毫克的抑菌效果，抑菌活性提高了约2.1倍。

实施例3

1、采用与实施例1相同的方法扩增phzH基因的完整编码区及其5’端的非编码区，产物通过1.0％琼脂糖电泳检测，回收获得长度约为2.5kb的基因phzH及其5’端的非编码区片段。

2、将回收的phzH基因及其5’端的非编码区片段，经限制性内切酶Xho I、Hind III酶切，在连接酶的作用下，插入大肠杆菌/假单胞菌穿梭表达质粒pBBR1MCS-5中相应的酶切位点，置于噬菌体启动子T3prom控制下，形成重组质粒pBBRphzH并转化进入大肠杆菌。在庆大霉素抗性平板上，筛出经pBBRphzH转化的大肠杆菌转化子；最后，从大肠杆菌中提取重组质粒并验证。

3、制备促生拈抗菌M18的衍生菌株M18G的感受态细胞，并将上述重组质粒pBBRphzH转化到M18G的感受态细胞中，在32℃条件下，培养2天，从中筛选出高效生产吩嗪-1-羧酸酰胺的基因工程菌株M18G/pBBRphzH。

4、将利用基因工程技术构建的工程菌株M18G/pBBRphzH，接种在甘油培养基的平板上，在30℃下活化生长20小时，然后再次在甘油培养基的平板上划菌块，30℃下活化12小时，然后将活化的M18G/pBBRphzH菌株转接到含有25毫升甘油培养液、体积为250毫升的三角瓶中放大，在30℃的摇床中振荡培养11小时，摇床转速为180转/分；最后转接到含有65毫升的产素培养液、体积为500毫升的三角瓶中，进行放大发酵培养，温度和转速不变，发酵时间为72小时，在发酵液中，得到吩嗪-1-羧酸酰胺产量为每升2800毫克，检测不出吩嗪-1-羧酸的含量，表明全部吩嗪-1-羧酸已经转化为吩嗪-1-羧酸酰胺，检测结果表明吩嗪-1-羧酸转化为吩嗪-1-羧酸酰胺的转化率为100％。

其中，所述甘油培养基中含有的组分重量百分比为：蛋白胨2.0％、甘油1.5％、硫酸镁0.1％、磷酸二氢钾0.05％、余量为水，pH6.8；所述甘油培养基(固体)中还含有琼脂1.5％。所述的产素培养液的组分重量百分比为：蛋白胨3.0％、葡萄糖2.5％、硝酸钾0.8％、余量为水，pH7.0。

在此配方下，65毫升的M18G/pBBRphzH发酵液中获得吩嗪-1-羧酸酰胺产量为182毫克，吩嗪-1-羧酸的含量为零，按一定比例稀释，配置每升含有16毫克吩嗪-1-羧酸酰胺的马铃薯葡萄糖培养基(pH7.0)，同时按一定比例稀释M18G/pME6032Phz发酵液(ZL200910198664.2记载)，配置每升含有16毫克吩嗪-1-羧酸的马铃薯葡萄糖培养基(pH7.0)，以不加发酵液的马铃薯葡萄糖培养基(pH7.0)为对照，分别测定水稻纹枯病菌的生长速率，并按照实施例6的计算方法，计算吩嗪-1-羧酸酰胺和吩嗪-1-羧酸的抑菌活性，按照在相同pH7.0条件下的抑菌活性计算，每升M18G/pBBRphzH发酵液获得吩嗪-1-羧酸酰胺产量相当于吩嗪-1-羧酸14000毫克的抑菌效果，抑菌活性提高了约2.2倍。

实施例4

3、制备促生拈抗菌M18株的感受态细胞，并将上述重组质粒pBBRphzH转化到M18的感受态细胞中，在32℃条件下，培养2天，从中筛选出生产吩嗪-1-羧酸酰胺的基因工程菌株M18/pBBRphzH。

促生拈抗菌M18株的感受态细胞的制备方法、重组质粒pBBRphzH转化到M18的感受态细胞以及生产吩嗪-1-羧酸酰胺的基因工程菌株M18/pBBRphzH的筛选方法，均按照J.萨姆布鲁克、D.W.拉塞尔编著，2002年科学出版社出版的《分子克隆实验指南(第三版)》，第1章第96～99页中所述的方法进行。

4、将利用基因工程技术构建的工程菌株M18/pBBRphzH，接种在甘油培养基的平板上，在30℃下活化生长20小时，然后再次在甘油培养基的平板上划菌块，30℃下活化12小时，然后将活化的M18/pBBRphzH菌株转接到含有25毫升甘油培养液、体积为250毫升的三角瓶中放大，在30℃的摇床中振荡培养11小时，摇床转速为180转/分；最后转接到含有65毫升的产素培养液、体积为500毫升的三角瓶中，进行放大发酵培养，温度和转速不变，发酵时间为72小时，在发酵液中，得到吩嗪-1-羧酸酰胺产量为每升300毫克，检测不出吩嗪-1-羧酸的含量。

其中，所述甘油培养基及产素培养液的组分同实施例1。

在此配方下的吩嗪-1-羧酸酰胺产量为每升产吩嗪-1-羧酸酰胺300毫克，吩嗪-1-羧酸的含量为零，全部吩嗪-1-羧酸已经转化为吩嗪-1-羧酸酰胺。检测结果表明在M18/pBBRphzH工程菌株中，吩嗪-1-羧酸转化为吩嗪-1-羧酸酰胺的转化率为100％。

实施例5

2、将回收的phzH基因及其5’端的非编码区片段，经限制性内切酶Xho I、Hind III酶切，在连接酶的作用下，插入大肠杆菌/假单胞菌穿梭表达质粒pBBR1MCS-5中相应的酶切位点，将phzH基因的表达置于噬菌体启动子T3prom控制下，形成重组质粒pBBRphzH并转化进入大肠杆菌。在庆大霉素抗性平板上，筛出经pBBRphzH转化的大肠杆菌转化子；最后，从大肠杆菌中提取重组质粒并验证。

3、制备铜绿假单胞菌PAO1株的感受态细胞，并将上述重组质粒pBBRphzH转化到PAO1的感受态细胞中，在32℃条件下，培养2天，从中筛选出生产吩嗪-1-羧酸酰胺的基因工程菌株PAO1/pBBRphzH。

铜绿假单胞菌PAO1株的感受态细胞的制备方法、重组质粒pBBRphzH转化到PAO1的感受态细胞以及生产吩嗪-1-羧酸酰胺的基因工程菌株PAO1/pBBRphzH的筛选方法，均按照J.萨姆布鲁克、D.W.拉塞尔编著，2002年科学出版社出版的《分子克隆实验指南(第三版)》，第1章第96～99页中所述的方法进行。

4、将利用基因工程技术构建的工程菌株PAO1/pBBRphzH，接种在甘油培养基的平板上，在30℃下活化生长20小时，然后再次在甘油培养基的平板上划菌块，30℃下活化12小时，然后将活化的PAO1/pBBRphzH菌株转接到含有25毫升甘油培养液、体积为250毫升的三角瓶中放大，在30℃的摇床中振荡培养11小时，摇床转速为180转/分；最后转接到含有65毫升的产素培养液、体积为500毫升的三角瓶中，进行放大发酵培养，温度和转速不变，发酵时间为72小时，在发酵液中，得到吩嗪-1-羧酸酰胺产量为每升50毫克，检测不出吩嗪-1-羧酸的含量。

其中，所述甘油培养基及产素培养液的组分同实施例1。

在此配方下，得到吩嗪-1-羧酸酰胺产量为每升50毫克，检测不出吩嗪-1-羧酸的含量，全部吩嗪-1-羧酸已经转化为吩嗪-1-羧酸酰胺，检测结果表明在工程菌株PAO1/pBBRphzH中，吩嗪-1-羧酸转化为吩嗪-1-羧酸酰胺的转化率为100％。

实施例6：吩嗪-1-羧酸酰胺发酵产物抗菌活性稳定性检测

用磷酸盐-柠檬酸缓冲液将马铃薯葡萄糖培养基的酸度值分别调节为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0。在不同酸度值的马铃薯葡萄糖培养基中，分别加入一定量的M18G/pME6032Phz发酵液和M18G/pBBRphzH发酵液，获得最终含有浓度分别稀释为16毫克/升的吩嗪-1-羧酸和吩嗪-1-羧酸酰胺的不同酸度值的马铃薯葡萄糖培养基，倒入直径为9cm的培养皿中成平板，以不加发酵液的马铃薯葡萄糖培养基平板为空白对照，每个处理设置三个重复；在平板中央接入直径为8mm的水稻纹枯病的病原菌菌丝块，置于28℃恒温培养箱中培养；待空白对照中的病原菌丝长满整个平皿时，采用十字交叉法分别测定接种在各种马铃薯葡萄糖培养基中的菌块的直径。抑菌率即对真菌生长的抑制效率的计算方法为：抑菌率＝(1-(D²-D_in ²)/(D_ck ²-D_in ²))×100％。式中：D表示处理组的菌丝块平均直径；D_in表示菌丝块的初始直径；D_ck表示对照的菌丝块的平均直径。分析结果如图3所示，其中PCA表示吩嗪-1-羧酸，PCN表示吩嗪-1-羧酸酰胺。结果表明在酸度值为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的条件下吩嗪-1-羧酸(PCA)对水稻纹枯病菌的抑菌活性分别为95.5％、82.9％、67.5％、15.9％、0；吩嗪-1-羧酸酰胺(PCN)的抑菌活性分别为65％、69％、73.6％、80.1％、90％。即：在pH值在4到8的条件下吩嗪-1-羧酸酰胺对水稻纹枯病菌的抑菌活性与吩嗪-1-羧酸相比，具有稳定性；同时，酸度值为7.0的条件下吩嗪-1-羧酸酰胺对水稻纹枯病菌的抑菌活性是吩嗪-1-羧酸抑菌活性的5倍。

其中，所述马铃薯葡萄糖培养基中含有的组分重量百分比为：马铃薯20％、葡萄糖2％、琼脂1.5％、余量为水。

Claims

1.一种用于生产微生物源杀菌剂的生物工程菌株，为将phzH基因重组表达质粒转化入产吩嗪-1-羧酸的菌株后获得，所述生物工程菌株产吩嗪-1-羧酸酰胺。

2.如权利要求1所述的生物工程菌株，其特征在于，所述phzH基因重组表达质粒能在产吩嗪-1-羧酸的菌株中表达phzH基因，编码产生PhzH(谷酰胺吩嗪-1-羧酸酰胺转移酶)。

3.如权利要求2所述的生物工程菌株，其特征在于，所述PhzH的氨基酸序列为SEQ ID NO：1。

4.如权利要求2所述的生物工程菌株，其特征在于，所述phzH基因重组表达质粒为克隆有phzH基因片段的重组表达质粒。

5.如权利要求4所述的生物工程菌株，其特征在于，所述的phzH基因片段包含phzH基因的完整编码区及其5’端的非编码区。

6.如权利要求5所述的生物工程菌株，其特征在于，所述PhzH为假单胞菌的PhzH，且所述phzH基因片段为假单胞菌的phzH基因片段。

7.如权利要求6所述的生物工程菌株，其特征在于，所述假单胞菌为铜绿假单胞菌或绿针假单胞菌。

8.如权利要求7所述的生物工程菌株，其特征在于，所述假单胞菌选自铜绿假单胞菌株PAO1、LESB58、PA14、PUPa3或绿针假单胞菌株PCL1391。

9.如权利要求4所述的生物工程菌株，其特征在于，所述phzH基因片段的碱基序列为SEQID NO：2。

10.如权利要求1-9任一权利要求所述的生物工程菌株，其特征在于，用于构建所述phzH基因重组表达质粒的表达载体为大肠杆菌/假单胞菌穿梭表达质粒。

11.如权利要求10所述的生物工程菌株，其特征在于，所述大肠杆菌/假单胞菌穿梭表达质粒含有强启动子，且所述phzH基因片段克隆于所述强启动子之后，由该强启动子控制其表达。

12.如权利要求11所述的生物工程菌株，其特征在于，所述大肠杆菌/假单胞菌穿梭表达质粒为pBBR1MCS系列质粒及其衍生的表达质粒。

13.如权利要求12所述的生物工程菌株，其特征在于，所述大肠杆菌/假单胞菌穿梭表达质粒为pBBR1MCS-5，所述phzH基因在保证读码框正确的前提下，置于pBBR1MCS-5的噬菌体启动子T3prom控制下。

14.如权利要求1-13任一权利要求所述的生物工程菌株，其特征在于，所述产吩嗪-1-羧酸的菌株为促生拈抗菌M18或其衍生的工程菌株M18G。

15.如权利要求1-14任一权利要求所述的生物工程菌株用于发酵生产微生物源杀菌剂的用途。

16.一种微生物源杀菌剂，为权利要求1-14任一权利要求所述生物工程菌株的发酵液。

17.如权利要求16所述微生物源杀菌剂，其特征在于，所述发酵液的主要杀菌活性成分含吩嗪-1-羧酸酰胺。

18.如权利要求17所述微生物源杀菌剂，其特征在于，所述发酵液中，吩嗪-1-羧酸酰胺的含量为每升2500～2800毫克。

19.如权利要求16所述微生物源杀菌剂，其特征在于，所述微生物源杀菌剂为在合适表达吩嗪-1-羧酸及PhzH的条件下，发酵培养权利要求1-13任一权利要求所述的生物工程菌株后获得。

20.如权利要求19所述微生物源杀菌剂，其特征在于，所述微生物源杀菌剂采用包括下列步骤的方法获得：

1)生物工程菌株的活化；

2)种子扩大培养：先在甘油培养液中摇瓶培养后，转接入产素培养液中放大发酵培养获得发酵液。

21.如权利要求20所述微生物源杀菌剂，其特征在于，所述工程菌株活化采用固体甘油培养基活化培养。

22.如权利要求21所述微生物源杀菌剂，其特征在于，所述的甘油培养液中含有的组分重量百分比为：蛋白胨1.8～2.2％、甘油1.3～1.7％、硫酸镁0.05～0.1％、磷酸二氢钾0.01～0.05％、余量为水，pH 6.8～7.2；所述的固体甘油培养基中含有的组分重量百分比为：蛋白胨1.8～2.2％、甘油1.3～1.7％、硫酸镁0.05～0.1％、磷酸二氢钾0.01～0.05％、琼脂1.2-1.5％、余量为水，pH 6.8～7.2；所述的产素培养液中含有的组分重量百分比为：蛋白胨2.2～3.0％、葡萄糖2.0～2.5％、硝酸钾0.5～0.7％、余量为水，pH6.5～7.0。

23.如权利要求22所述微生物源杀菌剂，其特征在于，所述工程菌株的活化条件为：在将工程菌接入甘油培养基平板，在26～30℃下，活化生长20～24小时；而后再次在甘油培养基的平板上划菌块，26～30℃下活化10～12小时；所述种子扩大培养中，在甘油培养液中摇瓶培养条件为：将活化后的菌株接入甘油培养液、26～30℃振荡培养9～11小时；所述种子扩大培养中，接入产素培养液中放大发酵培养的条件为：将甘油培养液中摇瓶培养的菌株转接入产素培养液、26～30℃发酵培养60～72小时。

24.如权利要求16-23任一权利要求所述微生物源杀菌剂用于防治植物病害或用于制备防治植物病害的药剂的用途。

25.一种防治植物病害的药剂，含有杀菌有效量的权利要求16-23任一权利要求所述微生物源杀菌剂或来源于所述微生物源杀菌剂的杀菌活性成分。