CN112111440B - 用于生产吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一株用于生产吩嗪‑1‑甲酰胺的基因工程菌及其制备方法和用途,属于基因工程技术领域。本发明是以绿针假单胞菌Qlu‑1为出发菌株,通过基因工程技术从Qlu‑1菌株基因组中phzO基因替换为外源的phzH基因,然后再敲除lon基因、rsmE基因、psrA基因、parS基因和rpeA基因,同时导入phzC基因、aroB基因、aroD基因、aroE基因、tktA基因和ppsA基因,并敲除pykF基因,通过构建相应基因工程菌株,使得吩嗪‑1‑甲酰胺的产量大幅提高。其中,基因工程菌株QPCN‑8具有最佳效果,其PCN产量高达10378.5mg/L,同时生长性能良好,因此具有良好的实际应用之价值。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域,具体涉及用于生产吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌及其制备方法和用途。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解,而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
吩嗪衍生物是一类含氮杂环化合物,通常颜色各异,以橙色或黄色为主,也有绿色、红色等,侧链取代基的不同决定了吩嗪颜色的不同,而结构上的差异同时决定了各自不同的物理属性以及抑制病原菌的生物活性。目前自然界已经发现了多种具有相似基本结构的吩嗪类化合物,有些产吩嗪的菌株能同时产生好几种不同的吩嗪衍生物,而几乎所有的吩嗪化合物对细菌和真菌都有生物活性。假单胞菌产生的吩嗪类抗生素包括绿脓菌素(pyocyanin,PYO)和吩嗪-1-甲酰胺(phenazine-1-carboxamide,PCN)、吩嗪-1-羧酸(phenazine-1-carboxilic acid,PCA)、1-羟基吩嗪(1-hydroxyphenazine,1-OH-PHZ)、2-羟基吩嗪(2-hydroxyphenazine,2-OH-PHZ)等。其中,PCN不仅具有良好的生防功能,同时还具有抗肿瘤等生物医药功能,有比较好的应用前景。
目前,吩嗪-1-甲酰胺生产方法虽有化工方法,但条件苛刻,并且向环境释放有毒有害物质,所以主要由假单胞菌中的铜绿假单胞菌生产,但发明人发现,铜绿假单胞菌则是目前医院中一种比较常见的机会致病菌,并不太适合作为生产菌株来推广应用。
发明内容
为了克服上述技术问题,本发明提供用于生产吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌及其制备方法和用途。本发明以相对安全的绿针假单胞菌为出发菌株,通过基因工程技术在其基因组上敲除具有负调控作用的双元调控相关基因,并通过增强莽草酸的利用提高PCN产量,最终制备得到的基因工程菌其PCN产量高达10378.5mg/L,具有良好的实际应用之价值。
为实现上述技术目的,本发明采用的技术方案如下:
本发明的第一个方面,提供一株用于生产吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌,具体是将绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)Qlu-1及其衍生物基因组中的phzO基因替换为外源的phzH基因,并敲除lon基因、rsmE基因、psrA基因、parS基因和rpeA基因;然后导入phzC基因、aroB基因、aroD基因、aroE基因、tktA基因和ppsA基因,敲除pykF基因即得。
其中,所述绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)Qlu-1是一株筛选自中国潍坊蔬菜大棚菜椒根际的绿针假单胞菌,经测序得知含有phzABCDEFG基因簇,以及吩嗪类的修饰基因phzO,可以产生吩嗪-1-羧酸以及2-羟基吩嗪。该菌株已送至中国典型培养物保藏中心(地址:湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学),保藏日期为2020年05月08日,保藏编号为CCTCC NO:M 2020108。
本发明的第二个方面,提供上述高产吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株的制备方法,所述方法包括:
将绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)Qlu-1及其衍生物基因组中的phzO基因替换为外源的phzH基因,然后再敲除lon基因、rsmE基因、psrA基因、parS基因和rpeA基因;然后导入phzC基因、aroB基因、aroD基因、aroE基因、tktA基因和ppsA基因,并敲除pykF基因即得。
本发明的第三个方面,提供上述基因工程菌株在生产吩嗪-1-甲酰胺中的应用。
本发明的第四个方面,提供一种吩嗪-1-甲酰胺的生产方法,所述方法包括:将上述高产吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株接种于发酵培养基中进行培养。
上述一个或多个技术方案的有益技术效果在于:
上述技术方案是以绿针假单胞菌Qlu-1为出发菌株,通过基因工程技术从Qlu-1菌株基因组中phzO基因替换为外源的phzH基因,然后再敲除lon基因、rsmE基因、psrA基因、parS基因和rpeA基因,同时导入phzC基因、aroB基因、aroD基因、aroE基因、tktA基因和ppsA基因,并敲除pykF基因,通过构建相应基因工程菌株,使得吩嗪-1-甲酰胺的产量大幅提高,能够更加有效用于生物防治。其中,基因工程菌株QPCN-8具有最佳效果,其PCN产量高达10378.5mg/L,同时生长性能良好,因此具有良好的实际应用之价值。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解,本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明,并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例中突变质粒pK18-rpeA-ud构建电泳图;
(A)rpeA上下游同源臂的扩增:1,DNA Ladder;2,rpeA上游同源臂扩增;3,rpeA下游同源臂扩增;(B)rpeA上游同源臂融合片段扩增:1,DNA Ladder;2,3rpeA基因上下游臂融合片段;
图2为本发明实施例中rpeA基因双亲杂交双抗性平板筛选图;
图3为本发明实施例中影印法筛选rpeA基因双交换阳性单克隆;
图4为本发明实施例中rpeA敲除株PCR验证图;外部引物检测:1,空白对照;2,DNALadder;3,野生株Qlu-1基因组为模板扩增片段;4,rpeA敲除株基因组为模板扩增片段;内部引物检测:1,野生株Qlu-1基因组为模板扩增片段;2,DNA Ladder;3,rpeA敲除株基因组为模板扩增片段;4,空白对照;
图5为本发明实施例中QPCN-1产物NMR碳谱鉴定图;
图6为本发明实施例中QPCN-1产物NMR氢谱鉴定图;
图7为本发明实施例中不同菌株PCN产量图;
图8为本发明实施例中模块质粒pBbB8K-GFP多基因组装原理图;
图9为本发明实施例中多基因顺序图;
图10为本发明实施例中pykF基因敲除模式图;
图11为本发明实施例中不同菌株PCN产量图。
具体实施方式
应该指出,以下详细说明都是例示性的,旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明,本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是,这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式,而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的,除非上下文另外明确指出,否则单数形式也意图包括复数形式,此外,还应当理解的是,当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时,其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。应理解,本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案;还应当理解,本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案,而不是为了限制本发明的保护范围。
本发明的一个典型具体实施方式中,提供一株用于生产吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌,具体是将绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)Qlu-1及其衍生物基因组中的phzO基因替换为外源的phzH基因,并敲除lon基因、rsmE基因、psrA基因、parS基因和rpeA基因;然后导入phzC基因、aroB基因、aroD基因、aroE基因、tktA基因和ppsA基因,敲除pykF基因即得。
其中,所述绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)Qlu-1是一株筛选自潍坊蔬菜大棚菜椒根际的绿针假单胞菌,经测序得知含有phzABCDEFG基因簇,以及吩嗪类的修饰基因phzO,可以产生吩嗪-1-羧酸以及2-羟基吩嗪。该菌株已送至中国典型培养物保藏中心(地址:湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学),保藏日期为2020年05月08日,保藏编号为CCTCC NO:M 2020108。
所述phzO基因的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。
所述外源phzH基因来自铜绿假单胞菌株,其碱基序列如SEQ ID NO.2所示。
所述lon基因、rsmE基因、psrA基因、parS基因和rpeA基因的碱基序列分别如SEQID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示。
所述phzC基因、aroB基因、aroD基因、aroE基因、tktA基因和ppsA基因的碱基序列分别如SEQ ID NO.43、SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.45、SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.47和SEQID NO.48所示。
所述pykF基因的碱基序列如SEQ ID NO.49所示。
本发明的又一具体实施方式中,提供上述高产吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株的制备方法,所述方法包括:
将绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)Qlu-1及其衍生物基因组中的phzO基因替换为外源的phzH基因,然后再敲除lon基因、rsmE基因、psrA基因、parS基因和rpeA基因;然后导入phzC基因、aroB基因、aroD基因、aroE基因、tktA基因和ppsA基因,并敲除pykF基因即得。
其中,“所述phzO基因替换为外源的phzH基因”的具体步骤包括:敲除phzO基因后得菌株QPCA-1,然后将外源phzH基因导入菌株QPCA-1中。
更具体的,所述敲除phzO基因步骤包括:
i、扩增phzO基因片段的上下游同源臂;采用融合PCR法连接上下游同源臂并插入pK18mobsacB质粒中得phzO基因重组质粒;
ii、将phzO基因重组质粒导入大肠杆菌S17-1(λ)后与绿针假单胞菌Qlu-1进行双亲杂交培养,从而将phzO基因重组质粒导入绿针假单胞菌Qlu-1;
iii、筛选阳性克隆,即得菌株QPCA-1;
其中,扩增phzO基因片段上游同源臂的引物包括phzO-F1和phzO-R1,序列分别如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示;
扩增phzO基因片段下游同源臂的引物包括phzO-F2和phzO-R2,序列分别如SEQ IDNO.10和SEQ ID NO.11所示;
采用融合PCR法连接上下游同源臂获得的phzO基因上下游融合片段序列如SEQ IDNO.12所示。
筛选阳性克隆的方法具体包括蔗糖平板筛选、影印筛选和PCR筛选。
更具体的,所述外源phzH基因导入菌株QPCA-1中具体方法为:
i、以QPCA-1基因组为模板,以phzO-F1/phzO-R1-2,phzO-F2-2/phzO-R2分别为引物扩增phzO基因的上游片段phzO-U2及下游片段phzO-D2;以合成的phzH基因为模板,phzH-F1/phzH-R1为引物扩增片段phzH-2;以phzO-U2、phzO-D2、phzH-2为模板,以phzO-F1/phzO-R2为引物,扩增融合phzO基因上下游的phzH导入片段phzH-IN;将融合片段phzH-IN插入pK18mobsacB质粒中得phzH基因重组质粒;
ii、将phzH基因重组质粒导入大肠杆菌S17-1(λ)后与菌株QPCA-1进行双亲杂交培养,从而将phzH基因重组质粒导入菌株QPCA-1;
iii、筛选阳性克隆,即得。
其中,phzO-F1和phzO-R1-2的序列分别如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.13所示;
phzO-F2-2和phzO-R2的序列分别如SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.11所示;
phzH-F1和phzH-R1的序列分别如SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示。
phzH-IN基因上下游融合片段的序列如SEQ ID NO.17所示。
筛选阳性克隆的方法具体包括蔗糖平板筛选、影印筛选和PCR筛选。
优选的,敲除lon基因、rsmE基因、psrA基因、parS基因和rpeA基因的方法与敲除phzO基因的方法相同。
其中,敲除lon基因方法中,
扩增lon基因片段上游同源臂的引物包括lon-F1和lon-R1,序列分别如SEQ IDNO.18和SEQ ID NO.19所示;
扩增lon基因片段下游同源臂的引物包括lon-F2和lon-R2,序列分别如SEQ IDNO.20和SEQ ID NO.21所示;
采用融合PCR法连接上下游同源臂获得的lon基因上下游融合片段序列如SEQ IDNO.22所示。
其中,敲除rsmE基因方法中,
扩增rsmE基因片段上游同源臂的引物包括rsmE-F1和rsmE-R1,序列分别如SEQ IDNO.23和SEQ ID NO.24所示;
扩增rsmE基因片段下游同源臂的引物包括rsmE-F2和rsmE-R2,序列分别如SEQ IDNO.25和SEQ ID NO.26所示;
采用融合PCR法连接上下游同源臂获得的rsmE基因上下游融合片段序列如SEQ IDNO.27所示。
其中,敲除psrA基因方法中,
扩增psrA基因片段上游同源臂的引物包括psrA-F1和psrA-R1,序列分别如SEQ IDNO.28和SEQ ID NO.29所示;
扩增psrA基因片段下游同源臂的引物包括psrA-F2和psrA-R2,序列分别如SEQ IDNO.30和SEQ ID NO.31所示;
采用融合PCR法连接上下游同源臂获得的psrA基因上下游融合片段序列如SEQ IDNO.32所示。
其中,敲除parS基因方法中,
扩增parS基因片段上游同源臂的引物包括parS-F1和parS-R1,序列分别如SEQ IDNO.33和SEQ ID NO.34所示;
扩增parS基因片段下游同源臂的引物包括parS-F2和parS-R2,序列分别如SEQ IDNO.35和SEQ ID NO.36所示;
采用融合PCR法连接上下游同源臂获得的parS基因上下游融合片段序列如SEQ IDNO.37所示。
其中,敲除rpeA基因方法中,
扩增rpeA基因片段上游同源臂的引物包括rpeA-F1和rpeA-R1,序列分别如SEQ IDNO.38和SEQ ID NO.39所示;
扩增rpeA基因片段下游同源臂的引物包括rpeA-F2和rpeA-R2,序列分别如SEQ IDNO.40和SEQ ID NO.41所示;
采用融合PCR法连接上下游同源臂获得的rpeA基因上下游融合片段序列如SEQ IDNO.42所示。
其中,所述“导入phzC基因、aroB基因、aroD基因、aroE基因、tktA基因和ppsA基因”具体方法为:
以菌株Qlu-1基因组为模板,将吩嗪合成前导途径相关基因phzC,aroB,aroD,aroE及中心代谢相关基因tktA,ppsA分别进行扩增;基于模块原理将基因整合成串联基因pBbB8K-aroE-aroD-aroB-phzC--tktA-ppsA,并整合至工程菌中;
其中,扩增phzC基因片段的引物包括phzC-F和phzC-R,序列分别如SEQ ID NO.50和SEQ ID NO.51所示。
其中,扩增aroB基因片段的引物包括aroB-F和aroB-R,序列分别如SEQ ID NO.52和SEQ ID NO.53所示。
其中,扩增aroD基因片段的引物包括aroD-F和aroD-R,序列分别如SEQ ID NO.54和SEQ ID NO.55所示。
其中,扩增aroE基因片段的引物包括aroE-F和aroE-R,序列分别如SEQ ID NO.56和SEQ ID NO.57所示。
其中,扩增tktA基因片段的引物包括tktA-F和tktA-R,序列分别如SEQ ID NO.58和SEQ ID NO.59所示。
其中,扩增ppsA基因片段的引物包括ppsA-F和ppsA-R,序列分别如SEQ ID NO.60和SEQ ID NO.61所示。
更具体的,以模块化质粒pBbB8k-GFP作为中介质粒,分别构建单个模块质粒,利用模块原理将基因整合成串联基因pBbB8K-aroE-aroD-aroB-phzC-tktA-ppsA;
从pBbB8K-aroE-aroD-aroB-phzC-tktA-ppsA上切下串联基因,连接到整合质粒pUC18-mini-Tn7T-Gm上,在辅助质粒pTNS2协助下,通过pUC18-mini-Tn7T-Gm质粒整合至工程菌QPCN-6,获得菌株QPCN-7;
所述敲除pykF基因的方法与敲除phzO基因的方法相同。
其中,所述敲除pykF基因的方法中,
扩增pykF基因片段上游同源臂的引物包括pykF-F1和pykF-R1,序列分别如SEQ IDNO.62和SEQ ID NO.63所示;
扩增pykF基因片段下游同源臂的引物包括pykF-F2和pykF-R2,序列分别如SEQ IDNO.64和SEQ ID NO.65所示。
采用融合PCR法连接上下游同源臂获得的pykF基因上下游融合片段序列如SEQ IDNO.66所示。
本发明的又一具体实施方式中,提供上述基因工程菌株在生产吩嗪-1-甲酰胺中的应用。
本发明的又一具体实施方式中,提供一种吩嗪-1-甲酰胺的生产方法,所述方法包括:将上述高产吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株接种于发酵培养基中进行培养。
其中,所述发酵培养基可以是KB培养基。
为了更好的说明本发明的目的、技术方案和优点,下面将结合具体实施例对本发明做进一步说明。
实施例
1、将绿针假单胞菌Qlu-1接种进KB(A+)培养基,30℃摇床180rpm提取荡培养过夜,利用基因组提取试剂盒提取Qlu-1的基因组,-20℃下保藏备用。
2、在已经测序的Qlu-1基因组数据中搜索phzO基因及其基因上下游序列,利用Qlu-1菌株基因组为模板,以phzO-F1/phzO-R1,phzO-F2/phzO-R2分别为引物扩增phzO基因的上游片段phzO-U及线下游片段phzO-D;以phzO-U及phzO-D为模板,phzO-F1/phzO-R2为模板扩增phzO上下游融合片段phzO-UD。
3、将融合片段phzO-UD通过酶切连接的方法与敲除质粒pk18moBsacB构建重组质粒pk18-phzO-UD。
4、将重组质粒pk18-phzO-UD通过热击转化的方式导入大肠杆菌S17-1(λ)。
5、将大肠杆菌S17-1(λ)与假单胞菌Qlu-1进行双亲杂交培养,将重组质粒pk18-phzO-UD导入假单胞菌Qlu-1。
6、通过蔗糖平板筛选、影印筛选及PCR筛选等方法共同筛选Qlu-1phzO基因敲除株,发酵后经HPLC检测,发酵液中只积累吩嗪-1-羧酸,将菌株命名为QPCA-1。
7、以菌株QPCA-1基因组为模板,以phzO-F1/phzO-R1-2,phzO-F2-2/phzO-R2分别为引物扩增phzO基因的上游片段phzO-U2及下游片段phzO-D2,以合成的phzH基因为模板,phzH-F1/phzH-R1为引物扩增片段phzH-2,以phzO-U2、phzO-D2、phzH-2为模板,以phzO-F1/phzO-R2为模板,扩增融合phzO基因上下游的phzH导入片段phzH-IN。
8、将融合片段phzH-IN通过酶切连接的方法与敲除质粒pk18moBsacB构建重组质粒pk18-phzH-IN。
9、将重组质粒pk18-phzH-IN通过热击转化的方式导入大肠杆菌S17-1(λ)。
10、将大肠杆菌S17-1(λ)与假单胞菌QPCA-1进行双亲杂交培养,将重组质粒pk18-phzH-IN导入假单胞菌QPCA-1。
11、通过蔗糖平板筛选、影印筛选及PCR筛选等方法共同筛选QPCA-1phzH插入菌株,发酵后经HPLC检测,发酵液中48h后只积累吩嗪-1-甲酰胺(PCN),将菌株命名为QPCN-1经检测后得知,PCN产量达到270.4mg/L。
12、双元调控系统在假单胞菌吩嗪类物质的生产中起到重要作用,假单胞菌中双元调控系统众多,如RpeA/RpeB系统、ParS/ParR系统、GacS/GacA系统等,在QPCA-1的基础上,利用上述敲除phzO的方法先后累计无痕敲除了lon、rpeA、psrA、parS、rsmE双元调控相关基因,并命名为QPCN-2(QPCA-1Δlon)、QPCN-3(QPCA-1ΔlonΔrpeA)、QPCN-4(QPCA-1ΔlonΔrpeAΔpsrA)、QPCN-5(QPCA-1ΔlonΔrpeAΔpsrAΔparS)、QPCN-6(QPCA-1ΔlonΔrpeAΔpsrAΔparSΔrsmE),经发酵后,HPLC检测PCA产量相应提高至645.2mg/L、1558.2mg/L、3024.3mg/L、4132.2mg/L和5787.2mg/L,结果见图7;
13、提取Qlu-1的基因组,以基因组为模板,将吩嗪合成前导途径相关基因phzC,aroB,aroD,aroE及中心代谢相关基因tktA,ppsA分别扩增;
14、并通过模块化质粒pBbB8k-GFP作为中介质粒,分别构建单个模块质粒,利用模块原理将基因整合成串联基因pBbB8K-aroE-aroD-aroB-phzC--tktA-ppsA;
15、从pBbB8K-aroE-aroD-aroB-phzC--tktA-ppsA上切下串联基因,连接到整合质粒pUC18-mini-Tn7T-Gm上,在可以编码转座子酶的辅助质粒pTNS2协助下,将pUC18-mini-Tn7T-Gm-aroE-aroD-aroB-phzC--tktA-ppsA整合到假单胞菌QPCN-6(QPCA-1ΔlonΔrpeAΔpsrAΔparSΔrsmE)glmS基因处(假单胞菌特有基因),获得菌株QPCN-7,经发酵后,HPLC检测得知其PCN产量提升到8254.3mg/L;
16、为进一步提高PCN产量,在QPCN-7的基础上,利用上述敲除phzO的方法敲除丙酮酸激酶基因pykF获得菌株QPCN-8,发酵后HPLC检测PCN产量达到10378.5mg/L。
最后应该说明的是,以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明,对于本领域的技术人员来说,其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。上述虽然对本发明的具体实施方式进行了描述,但并非对本发明保护范围的限制,所属领域技术人员应该明白,在本发明的技术方案的基础上,本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。
SEQUENCE LISTING
<110> 齐鲁工业大学
<120> 用于生产吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌及其制备方法和用途
<130>
<160> 66
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1476
<212> DNA
<213> phzO基因
<400> 1
atgctagatc ttcaaaacaa gcgtaaatat ctgaaaagtg cagaatcctt caaagcttca 60
ctgcgtgatg accgcactgt tatttatcaa ggccaagttg ttgaggatgt gactacacac 120
ttctctacgg ctggaggcat atcgcaagtt gcagaaatct acgaagaaca attcagcggt 180
gaacacgacg acattctgac ttacgtacgc cccgacggtt acctggcctc ttctgcctat 240
atgcccccta gaaacaaaga agacttggcg ttgcgacgcc gcgcaatcac gtacgtctcg 300
caaaaaacct ggggcaccca ctgccgtaac ctggacatga tcgccagctt caccgtcggc 360
atgatgggat atcggccgac attcaggaaa aaatgccctg agtacgcaga aaacattacc 420
gaataccatg actacgccga gcgcaacagc ctgtatttgt ctgaggccat tgttgatcca 480
cagggctatc gggcacgtac ccacggcacc gacctcaacc tgccgccgcc cgatcgtgcc 540
gtgatgagga tcaacaagca gaacgccgag ggcatctgga tcagcggcgt caaaggcgtg 600
ggcacggtag caccgcagtc caatgaaata tttgttggca gcttgttccc cgcagcgccc 660
aacgagtcat tctgggctta cgtccctgcc gatgcgccgg gggtgaagat tttttgccga 720
gagattgtct cccagcctca cgccagcgcc tatgaccacc cgctcatatc caaaggtgaa 780
gaagccgagg cgatggtggt attcgataac gtgttcattc cacgctggcg aatcatggcg 840
gcgaacgtgc cggaactggc caacgccggc ttcttcagcc tgtggacctc atacagccat 900
tggtacacgc tcgtgcgcct ggaaaccaag gctgacctgt atgccggact ggccaaggtg 960
atcatggaag tcctgggcct tgaggggatt gcggtggttc gccagcgggt cagcgaaata 1020
gtgcagcttg cggaaatact caaaggcatg tgcatcgcct ccatcgaaac ggccgagatg 1080
tccgaaggcg acatattgct gcctggcccc aacgcactgg ccgccggaag gatttttgcc 1140
atggagaaat tgcctcgggt gctgcatttg ctcagagagc tgtgcggaca gggcttgatc 1200
ctcaggttca acgagaaaga cttggccacc gacgccgcct ttggccagaa gttctcctgg 1260
tttcttgaca cgcaaagcgt gggcgccaga gagaagaacc tgctgatgaa tctggtgtgg 1320
gacgtggctg ccagtgagca ctccacacgt gcattggtgt ttgaagaaca gcacgcactc 1380
agcgagcccc tgctgcgcga tagcctggtg ctggactacg actaccgcaa aagcacaagc 1440
ctgatacgcc gcatggtggg gctcaacgcc aaatag 1476
<210> 2
<211> 1833
<212> DNA
<213> phzH基因
<400> 2
atgtgcggtc tcgcgggttg ggtggattac acgcgcaagc tcgacgacga atttccggcg 60
atcttcgcca tgaccgatac gctcgccttg cgcgggccgg atgccgaggg catctggaag 120
caccgcaacg ccctgctggg tcaccggcgg ctggcggtca tcgacctcag cggcggcgtg 180
cagccgatgt cctatcgctt tcccaccggc caggaggtca ccctcgtcta caccggcgag 240
gtgtacaacc acgatgccct gcgcgagcgg ttgcgccggg ccggacatga gttccgcacc 300
cgcagcgata ccgaggtggt cctgcacgcc tatctgcaat ggggcgagcg ttgttgcgag 360
tacctgaccg ggatgttcgc cttcgccgtc ttcgatggcc gcgacggcca cctgctgctg 420
gtgcgcgacc gcctgggcat caagccgctg tattacgcgc ggcaccgcga gggactgctg 480
ttcggctcgg agatcaagtc catcctggcg catccggaat tcgccgccag gctcgacgcg 540
gtcggcctgg tcgacctcct gacgctgtcc cggggcactt cgcagacgcc gttccgcgag 600
gtccaggaac tgctgcccgg ccacctgctg tcctggcgtc ccaattccca ggcgaagttg 660
cgccgctact gggaggtgcg ccgccaggag catgccgacg acctgcagag caccgtgcag 720
cgcacccgcg aactggtcac ccgcgccctg ggggcgcaat tgcacgccga cgttccggtg 780
tgttcgctgc tatcgggtgg gctcgattcg accgccctga ccggcatcgc ccagcgcatc 840
gcgaaggcgg agcacggcgg cgacatcaat tcgttctcgg tggacttcgt cggccaggcc 900
gagcagttcc gcagcgacga cctgcgtccc gaccaggacc agccgttcgc cctgctggcc 960
gcgcagtaca tcggcagccg tcatcgcacc gtgctcatcg acaatgccga actggtctgc 1020
gaacgagcgc gcgaagaggt attccgggcc aaggacgtac ctttcacctt cggcgacatg 1080
gatacctcgc tgcacctgat gttcggcgag atccgccggc attccacggt ggccatctcc 1140
ggtgaaggcg ccgacgagct gttcggtggc tacggctggt tccgcgatcc gcaggcggtg 1200
gctgcggcgc gcttcccctg ggcctccagg gtgcgcctgc cggccggctt catcgacgcc 1260
ggtttcaacc gccgctgcga tctcctccag taccagcagg ccagctacga cgatgggctg 1320
cgccaggtcg aacacctggc cggcgacagc ccggaggagc ggcggatgcg cgagttcagc 1380
cacctgcatc tgaagcgctg gatggtgctg ctgctcgaac gcaaggatcg cctgagcatg 1440
tgcaacggcc tggaggtgcg ggtgccctac accgaccatg agctggtgga gtacgtctac 1500
aacgtgccct ggtcgatcaa gagccgggac ggcgaggaga agtggctgct caagcgggcc 1560
tgcgccgact atgtcccgga agccgtgctc aagcgccgca agagccctta tccgacttct 1620
gccaacctcg gctacgagcg tttcctgcgc gggagcgtgc ggcgcctgct ggaggacgcg 1680
gtgaacccgg tgttcggcat cgtttcgcga gagttcctgg ccgccgaact ggagcatccg 1740
gaggggtact tcaacaccca ggtgagccgc cacaacctgg agaccgcact ggcgctggaa 1800
ggctggctca ggttgtacgg gctctccgcc tga 1833
<210> 3
<211> 2421
<212> DNA
<213> lon基因
<400> 3
atgagcgacc agcaagaact tcctgaaacc atgagtgaat acgccgaccc ggaaaacgcc 60
gaactccata catcctccgg caagggtctg gccctgcccg ggcagaatct gccggacaag 120
gtctacatca tcccgatcca caatcggccg ttcttccccg cgcaagtctt gccggtgatc 180
gtcaacgaag aaccctgggc cgaaaccctg gaactggtga gcaagtccga acaccattcg 240
ctggcgctgt tcttcatgga caccccaccg gaagacccac ggcatttcga cacctcggcc 300
ctgccgctgt acggcaccct ggtcaaggtg caccacgcca gccgcgaaaa cggcaagttg 360
cagttcgtgg cccagggcct gacccgcgta cgcatccgca cctggctcaa gcaccatcgc 420
ccaccgtacc tggtggaggt cgagtacccg caccagccga gcgagccgac cgacgaggtc 480
aaggcctacg gcatggcgct gatcaacgcg atcaaggaac tgctgccgct caacccgctg 540
tacagcgaag agctgaagaa ctacctcaac cgcttcagcc ccaacgaccc gtcgccgctg 600
accgacttcg ccgccgcgct gacctcggcc accggcaacg aactgcagga agtgctggac 660
tgcgtaccga tgctcaagcg catggaaaaa gtcctgccga tgctgcgcaa ggaagtcgag 720
gtcgcgcgcc tgcagaaaga gatttccgcc gaggtcaatc gcaagatcgg cgagcatcag 780
cgcgagttct tcctcaagga acagctcaag gtcatccagc aggagctggg tctgaccaag 840
gacgatcgca gcgccgacat cgagcagttc gagcagcgcc tggcaggcaa ggtcctgccg 900
ccccaggccc agaagcgcat cgtggaagag atgaataaac tgtcgatcct cgagaccggc 960
tcgccggagt acgcggtcac ccgcaactac ctggaatggg ccaccgcggt gccctggggc 1020
gtgtacggcg aggacaagct cgacctcaag catgcgcgca aggtgctgga ccagcatcac 1080
gccgggctcg acgacatcaa gagccggatc ctcgaattcc tcgcagtcgg cgcctacaag 1140
ggcgagatca gcggttccat cgtactgctg gtgggcccgc ccggcgtggg caagaccagc 1200
gtcggcaagt ccatcgccga gtccctgggc cggccgttct accgcttcag cgtcggcggc 1260
atgcgtgacg aggccgagat caagggccac cgccgcacct acatcggcgc cctgccgggc 1320
aagctggtgc aggcgttgaa agacgtcgaa gtgatgaacc cggtgatcat gctcgacgag 1380
atcgacaaga tgggccagag ctaccagggc gacccggcct cggcgctgct ggaaaccctc 1440
gacccggaac agaacgtgga atttctcgac cactacctgg acctgcgcct ggacctgtcg 1500
aaagtgctgt tcgtgtgcac cgccaacacc ctggattcga ttcccggccc gttgctggac 1560
cggatggaag tgattcgcct gtcgggctac atcaccgagg aaaaactggc catcgccaag 1620
cgccacctgt ggcccaagca gctggaaaag gccggtgtgt ccaaggccca cctgagcatc 1680
agcgacgccg ccctgcgcgc ggtgatcgat ggttacgccc gcgaggccgg ggtgcgccag 1740
ctggaaaaac agctgggcaa actggtgcgc aaggccgtgg tgcggctgct ggaagatccg 1800
gatgcggtga tcaagctcgg caccaaggac ctggaagcct ccctgggcat gccggtgttc 1860
cgcaacgagc aggtgctcag cggcaccggg gtgatcaccg gcctggcctg gaccagcctg 1920
ggcggcgcca cgctgccgat cgaagccacg cggattcata ccctcaaccg tggtttcaag 1980
ctcaccgggc aactggggga tgtgatgaag gagtcggcgg aaatcgccta cagctacgtc 2040
acctcgcacc tcaagcagtt cggtggcgat gcgaagttct tcgacgaggc gttcgtccac 2100
ctgcacgtgc cggaaggcgc cacgccgaag gatggcccga gcgccggggt gaccatggcc 2160
agcgccctgc tgtccctggc gcgtaaccag ccgccgaaaa agggcgtggc catgaccggc 2220
gagctgaccc tgaccgggca tgtcctgccc atcggcgggg tgcgcgagaa agtcatcgcg 2280
gcgcgccggc agaagctcta cgagctgatc ctgccggaag ccaaccgcgg ccacttcgaa 2340
gagctgccgg actacctcaa ggaaggcatc accgtgcact tcgccaagcg tttcgccgat 2400
gtggcgaaag tgctgttcta a 2421
<210> 4
<211> 195
<212> DNA
<213> rsmE基因
<400> 4
atgctgatac tcacccgcaa agtcggtgaa agcataaata tcggtgacga catcacgatc 60
accattctgg gcgtgagcgg ccagcaagtc cggattggca tcaatgcccc gaaagacgtc 120
gcagtccatc gcgaagaaat ctaccaacgg atccaagccg gcctcaccgc cccggacaaa 180
cgcgaaacac cttga 195
<210> 5
<211> 708
<212> DNA
<213> psrA基因
<400> 5
atggcccagt cggaaaccgt tgaacgcatt ctcgatgctg ccgagcagtt gttcgcggaa 60
aaaggttttg ccgaaacctc attgcggctg atcaccagca aggccggggt caacctggcg 120
gcggtgaatt atcatttcgg ttccaagaag gccctgattc aggcagtgtt ctcgcgcttc 180
ctcgggccgt tctgcatcag cctcgaccgt gagctggagc ggcgttcggc caagccggac 240
agcaagccaa gcctcgaaga gctgctggaa atcctcgtcg agcaggccct ggtggtccag 300
cctcgcagcg gcaacgatct gtccatcttc atgcgtcttc tgggcctggc cttcagccag 360
agccaggggc acctgcggcg ttatctggaa gacatgtacg gcaaggtctt ccgccgctac 420
atgctgctgg tcaacgaagc tgcgccgcgc atccctccga tcgaactgtt ctggcgtgtg 480
cacttcatgc tcggagcggc ggcgttcagc atgtcgggga tcaaggcgtt gcgggcgatt 540
gccgagaccg acttcggggt caatacctcg atcgagcagg taatgcgcct gatggtgcca 600
ttcctcgcgg ccggcatgcg cgctgaaacc ggcgtcaccg acgatgccat ggctgcggcg 660
caactcaagc cgcgcagcaa atcgactccg gcggtcgcca aggcctga 708
<210> 6
<211> 1284
<212> DNA
<213> parS基因
<400> 6
atgctgcggc tgtttctggg tttgtacatt gtcctggcca taggttttgc cggggcgatc 60
accgcggtcg atcacatctt cacggccatc ctcgaagacc cgctggaagc ctacaaccgc 120
gatgcggtgc gcgggccggc ttatagcctg gtggaacagt tgcggccgtt cgacagcgcc 180
gagcgcgaac ggcaattgca ggcgttgcag ccgcattacg gcttgcagtt gcgtctggtg 240
aacgccgacg cgctgggcct gagcgcccgc gaacaggcct tgctggcctc caaccagttg 300
gtggtgcggc aagcgttcac cgagtttatc gccagcatcg accagggccc gcaattgctc 360
agcatcaagt tgccggaaga gccctcgctg acccgcttct ataccaccgc ggcctatttt 420
ctcctcgcta cgctggtggg catcgtcctg tatttctggg tgcgcccgca ctggcgcgat 480
ctggagcaac tgcggctggc ggccgaacgg ttcggcgaca acgacctgag tacgcgcctg 540
cacctgtcgc ggcgctcgaa cattcgcgag ctggccgagc acttcaaccg catggccagc 600
cgcatcgaag gcctgatcgc caatcagcgc gagctgacca acgcggtgtc ccatgagctg 660
cgcacgccca tcgcccgcct gtcgttcgaa ctcgaccagc tcaagcagtc cgatccgaaa 720
cacaaccgcg agctgatcgc cgacatgtac gccgacctcg gcgagctgga ggaaatggtc 780
tccgaactgc tgacctatgc cagcctggaa cacggcgcca cggtgatcaa ccgcgagact 840
atccaggccc acagctggct cgacagcgtg gtcggcagtg tcgccctgga ggcggaagcg 900
gcgggggtac agatcctgat ccgcgcctgc gaggtcgagt gcatcagcat cgagccgcgg 960
ttcatggcgc gggcggtgat caacctgctg cgcaacgcca ttcgctacgc cgagcggcgc 1020
gtcgaggtgt ccctggtgcg ggtcgggcag ggttatgaag tccaggtcaa cgacgacggc 1080
ccgggcgtgc cggtggaagg acgcaagaaa atcttcgagc cgttctcccg gctcgacgcc 1140
agccgcgacc gccgcaccgg cggcttcggc cttggcctgg cgctggtgcg gcgggtgtcg 1200
cagtcccacg gcggccaggt cgaggtgacg gattcgcagt ggggcggcgc gtcgtttcgc 1260
atgacctggg cgcaggtcga gtag 1284
<210> 7
<211> 1302
<212> DNA
<213> rpeA基因
<400> 7
atgctgagaa tcctgattcg cctgtacctg gtgaccatcg tctcgttcag cgcggcgatc 60
tacctggtcc cggagctggt ggtgaaggtc ttccacgagc gtttcatcac ctacaacctg 120
gactattccc ggggcctgca aagcctgatc gtcaaacagt ttcgcggcgt acccgcagag 180
cagtggccgg ccctggccgc ggaaatggac caggagttcc agccgctgca catcgtcctg 240
acccgcaacg acgatgccga tttcaccctg tacgagcgcg aacgcctgca acgcggcgag 300
aacgtggtgc gggtcggcga ctggggctgg cgcaccctcg cggtggcgcc gctggacgag 360
cagatggcgg tgcagatggt ggtgccgccg gacccgatcg acgtcagcct gctgtactgg 420
agcatcaacg tgctgatcgg cgcgaccatg cttgcctgcc tgttgctctg gctgcggccg 480
cactggcgcg acctggaacg cctgaaacac gccgccgagc gcttcggcaa gggccacttg 540
agcgagcgca cgcagatccc ctcgagctcc aacatcggca gcctggccaa tgtcttcgac 600
accatggccg gcgacatcga aaacctgctg aaccagcaac gcgacctgct caacgcggtg 660
tcccacgagc tgcgcacgcc cttgacccgg ctcgacttcg gcctggccct ggcgctctcc 720
gacgacctgc cggcgaccag ccgcgaacgc ctgcaagggc tggtggcgca cattcgcgag 780
ctcgacgaac tggtgctcga gctgctgtcc tacagccggt tgcagatccc ggcgcagttg 840
ccggagcagg tcgaggtgtc gctggacgag ttcatcgaca gcatcctcgg cagcgtcgac 900
gacgagctgg aatccccgga catcgtcatc gatgtgttgc tgctcggcag cctggagcgt 960
ttcaccctcg atccgcggct gaccgcccgg gcgatccaga acctgctgcg caacgccatg 1020
cgttattgcg aaaagcgcat caaggtcggg gtgcaggtca gcgacagcgg ctgtgaaatc 1080
tgggtcgacg acgatggcat cggcattccc gacgatgagc gtgagcgggt gttcgaaccg 1140
ttctaccgcc tggaccgcag ccgcgatcgc gccactggcg gcttcggcct cggcctggcg 1200
atcagccgcc gggccctgga agcccagggc gggaccctga ccgtcgaggc ctcgccgctg 1260
ggcggcgcgc gtttccgcct gtggctgccg acgccggcct ga 1302
<210> 8
<211> 36
<212> DNA
<213> PhzO-F1
<400> 8
gttgaattca cacgcatcgt ggtgatcagt gagatc 36
<210> 9
<211> 32
<212> DNA
<213> PhzO-R1
<400> 9
ctagcatggt agcagcctca gtaatgtctg ac 32
<210> 10
<211> 32
<212> DNA
<213> PhzO-F2
<400> 10
tgctaccatg ctagacctga ttgccgtgta gg 32
<210> 11
<211> 31
<212> DNA
<213> PhzO-R2
<400> 11
taggatccgt cagcaccgct tgcatggcaa t 31
<210> 12
<211> 1498
<212> DNA
<213> phzO基因上下游融合片段
<400> 12
acacgcatcg tggtgatcag tgagatcagt gacaccgggg tagtgttcag cacccatgcc 60
ggaagccaga aaggtcgcga actgacagaa aacccctggg cctcggggac gctgtattgg 120
cgcgaaacca gccagcagat catcctcaat ggccaggccg tgcgcatgcc ggatgccaag 180
gctgacgagg cctggttgaa gcgcccttat gccacgcatc cgatgtcatc ggcgtctcgc 240
cagagtgaag agctcacgga tgtcgaggcc ctgcgcaacg ccgccaggga actggccgag 300
gttccaggtc cgctgccgcg tcccgagggt tattgcgtgt ttgagttgcg gcttgaatcg 360
ctggagttct ggggtaacgg ccaggatcgc ctgcatgaac gcttgcgcta tgaccgcagc 420
gctgaaggct ggaaacatcg ccgattacag ccgtagggta ccgagataaa tatgctttga 480
agtgctggct gctccaactt cgaactcatt gcgcgaactt caacacttat gacacccggt 540
caacatgaga agagtccaga tgcgaaagaa cgcgtattcg aaataccaaa cagagagtcc 600
ggatcaccaa agtgtgtaac gacattaatt cctatctgaa tcttatagtt gctctagaac 660
gttgtccttg acccagcgat agacatcggg ccaaagacta cacaaacaaa gtcagacatt 720
actgaggctg ctaccatgct agacctgatt gccgtgtagg cgccgcgcaa cccttcattc 780
gtgccgactg aactcggcac gaatgaaggg ttgtccgcct ccggcccctg gcatcccgta 840
agtttccaac cttcaacggt agtacaccgc cccattagca tccaaatgaa tacagcagga 900
gcccgttaca gcgctggcgc tggatgcctg gctacgcttg catgggatct cggtccgaga 960
cgagccaggt ttaccggccc cccctttgtt cgagccatgc cacttggcag gctcgttcag 1020
tcgtagcggt cagcctgtcg ccggttggct tgccacccgc cacctccagg ccagcgtctg 1080
gcatcgggcc ttgcccggaa gcgccagcca tatcggcacc gtagcgatca acgaaaggct 1140
cagcatgggc ccgttcactg ctgtacattc ctccccacgg acgacacatc atttacccag 1200
tgaacggagt tcaacgcgtg ttctcgaccc tcaatccgcg tcaccgccgg cttgccagtt 1260
tctcgctgat agccgtcgcc ctcagcctcg ccgcctgcaa cgcttccgcc ccctcccaca 1320
ccgccctgcc ccccgccccg gaaatcgctt cgggttatcg caccgacctg caagtgcagc 1380
gcgccgacca gcatatggcg gccgcggcca acccgttggc ggccgaagcc gggcgcgaga 1440
tgttgcgcaa gggcggttcg gccatcgatg cggcgattgc catgcaagcg gtgctgac 1498
<210> 13
<211> 30
<212> DNA
<213> PhzO-R1-2
<400> 13
ggtagcagcc tcagtaatgt ctgactttgt 30
<210> 14
<211> 29
<212> DNA
<213> PhzO-F2-2
<400> 14
tacctgattg ccgtgtaggc gccgcgcaa 29
<210> 15
<211> 31
<212> DNA
<213> PhzH-F1
<400> 15
actgaggctg ctaccatgtg cggtctcgcg g 31
<210> 16
<211> 30
<212> DNA
<213> PhzH-R1
<400> 16
cggcaatcag gtatcaggcg gagagcccgt 30
<210> 17
<211> 3324
<212> DNA
<213> phzH-IN基因上下游融合片段
<400> 17
acacgcatcg tggtgatcag tgagatcagt gacaccgggg tagtgttcag cacccatgcc 60
ggaagccaga aaggtcgcga actgacagaa aacccctggg cctcggggac gctgtattgg 120
cgcgaaacca gccagcagat catcctcaat ggccaggccg tgcgcatgcc ggatgccaag 180
gctgacgagg cctggttgaa gcgcccttat gccacgcatc cgatgtcatc ggcgtctcgc 240
cagagtgaag agctcacgga tgtcgaggcc ctgcgcaacg ccgccaggga actggccgag 300
gttccaggtc cgctgccgcg tcccgagggt tattgcgtgt ttgagttgcg gcttgaatcg 360
ctggagttct ggggtaacgg ccaggatcgc ctgcatgaac gcttgcgcta tgaccgcagc 420
gctgaaggct ggaaacatcg ccgattacag ccgtagggta ccgagataaa tatgctttga 480
agtgctggct gctccaactt cgaactcatt gcgcgaactt caacacttat gacacccggt 540
caacatgaga agagtccaga tgcgaaagaa cgcgtattcg aaataccaaa cagagagtcc 600
ggatcaccaa agtgtgtaac gacattaatt cctatctgaa tcttatagtt gctctagaac 660
gttgtccttg acccagcgat agacatcggg ccaaagacta cacaaacaaa gtcagacatt 720
actgaggctg ctaccatgtg cggtctcgcg ggttgggtgg attacacgcg caagctcgac 780
gacgaatttc cggcgatctt cgccatgacc gatacgctcg ccttgcgcgg gccggatgcc 840
gagggcatct ggaagcaccg caacgccctg ctgggtcacc ggcggctggc ggtcatcgac 900
ctcagcggcg gcgtgcagcc gatgtcctat cgctttccca ccggccagga ggtcaccctc 960
gtctacaccg gcgaggtgta caaccacgat gccctgcgcg agcggttgcg ccgggccgga 1020
catgagttcc gcacccgcag cgataccgag gtggtcctgc acgcctatct gcaatggggc 1080
gagcgttgtt gcgagtacct gaccgggatg ttcgccttcg ccgtcttcga tggccgcgac 1140
ggccacctgc tgctggtgcg cgaccgcctg ggcatcaagc cgctgtatta cgcgcggcac 1200
cgcgagggac tgctgttcgg ctcggagatc aagtccatcc tggcgcatcc ggaattcgcc 1260
gccaggctcg acgcggtcgg cctggtcgac ctcctgacgc tgtcccgggg cacttcgcag 1320
acgccgttcc gcgaggtcca ggaactgctg cccggccacc tgctgtcctg gcgtcccaat 1380
tcccaggcga agttgcgccg ctactgggag gtgcgccgcc aggagcatgc cgacgacctg 1440
cagagcaccg tgcagcgcac ccgcgaactg gtcacccgcg ccctgggggc gcaattgcac 1500
gccgacgttc cggtgtgttc gctgctatcg ggtgggctcg attcgaccgc cctgaccggc 1560
atcgcccagc gcatcgcgaa ggcggagcac ggcggcgaca tcaattcgtt ctcggtggac 1620
ttcgtcggcc aggccgagca gttccgcagc gacgacctgc gtcccgacca ggaccagccg 1680
ttcgccctgc tggccgcgca gtacatcggc agccgtcatc gcaccgtgct catcgacaat 1740
gccgaactgg tctgcgaacg agcgcgcgaa gaggtattcc gggccaagga cgtacctttc 1800
accttcggcg acatggatac ctcgctgcac ctgatgttcg gcgagatccg ccggcattcc 1860
acggtggcca tctccggtga aggcgccgac gagctgttcg gtggctacgg ctggttccgc 1920
gatccgcagg cggtggctgc ggcgcgcttc ccctgggcct ccagggtgcg cctgccggcc 1980
ggcttcatcg acgccggttt caaccgccgc tgcgatctcc tccagtacca gcaggccagc 2040
tacgacgatg ggctgcgcca ggtcgaacac ctggccggcg acagcccgga ggagcggcgg 2100
atgcgcgagt tcagccacct gcatctgaag cgctggatgg tgctgctgct cgaacgcaag 2160
gatcgcctga gcatgtgcaa cggcctggag gtgcgggtgc cctacaccga ccatgagctg 2220
gtggagtacg tctacaacgt gccctggtcg atcaagagcc gggacggcga ggagaagtgg 2280
ctgctcaagc gggcctgcgc cgactatgtc ccggaagccg tgctcaagcg ccgcaagagc 2340
ccttatccga cttctgccaa cctcggctac gagcgtttcc tgcgcgggag cgtgcggcgc 2400
ctgctggagg acgcggtgaa cccggtgttc ggcatcgttt cgcgagagtt cctggccgcc 2460
gaactggagc atccggaggg gtacttcaac acccaggtga gccgccacaa cctggagacc 2520
gcactggcgc tggaaggctg gctcaggttg tacgggctct ccgcctgaac ctgattgccg 2580
tgtaggcgcc gcgcaaccct tcattcgtgc cgactgaact cggcacgaat gaagggttgt 2640
ccgcctccgg cccctggcat cccgtaagtt tccaaccttc aacggtagta caccgcccca 2700
ttagcatcca aatgaataca gcaggagccc gttacagcgc tggcgctgga tgcctggcta 2760
cgcttgcatg ggatctcggt ccgagacgag ccaggtttac cggccccccc tttgttcgag 2820
ccatgccact tggcaggctc gttcagtcgt agcggtcagc ctgtcgccgg ttggcttgcc 2880
acccgccacc tccaggccag cgtctggcat cgggccttgc ccggaagcgc cagccatatc 2940
ggcaccgtag cgatcaacga aaggctcagc atgggcccgt tcactgctgt acattcctcc 3000
ccacggacga cacatcattt acccagtgaa cggagttcaa cgcgtgttct cgaccctcaa 3060
tccgcgtcac cgccggcttg ccagtttctc gctgatagcc gtcgccctca gcctcgccgc 3120
ctgcaacgct tccgccccct cccacaccgc cctgcccccc gccccggaaa tcgcttcggg 3180
ttatcgcacc gacctgcaag tgcagcgcgc cgaccagcat atggcggccg cggccaaccc 3240
gttggcggcc gaagccgggc gcgagatgtt gcgcaagggc ggttcggcca tcgatgcggc 3300
gattgccatg caagcggtgc tgac 3324
<210> 18
<211> 29
<212> DNA
<213> lon-F1
<400> 18
cgtctagaag cacgaacagc tcgctgcca 29
<210> 19
<211> 24
<212> DNA
<213> lon-R1
<400> 19
tcgctcatgg ggcacctgcg caat 24
<210> 20
<211> 28
<212> DNA
<213> lon-F2
<400> 20
cccatgagcg aacgcagacc tgtaggag 28
<210> 21
<211> 34
<212> DNA
<213> lon-R2
<400> 21
ctaagcttag aacaacaggc cgaggctgat ccag 34
<210> 22
<211> 1493
<212> DNA
<213> lon基因上下游融合片段
<400> 22
agcacgaaca gctcgctgcc acgggtgcca gtgccatgct ggcgcagcgc ctcgagaatc 60
tgctgcgagt cgccgctgat caccgcctgg cgaaactgcg catccaccac cagccagtcc 120
acgccataac gcaagcgccg gccgcgcagt tcgagcaggc gttcgaagac ccgggtgccg 180
gtttgcagtt gcacttgcgc ctggttttcc actgcatggt tggtcgcggc cttgacggcg 240
aagtacacca ccccgatcac gatcaacagc aacaacgcca ataccccagt gatccttacc 300
tggaacgtat ggcgccactt catgagccgg ctctcgtcgc cgcgacctca ctgttgtcga 360
ctctgcacac ccacggcgac acccgccgct ccccgctgaa aagtcccttg atcattacgc 420
gtccctctgg gcagctaaag atgcgtcaaa taaatgccat ttccctgaca gcatttaatc 480
ggtccagatt agaccgccaa gacaagaaga tcacgcaata aaatcagggg gtttacaatg 540
tcatttttct gtcgccgcca atttaccagc gttcctgcgc agaaatgaca gcctcgccct 600
cgccgttttg gaggatgcac cgcgtcgcgg cgacaaggac tgaaataatt gatccggccc 660
gcccgccatt gaaaccgctc gtcacctgcc ccatctaacc tggcataccc cattgcgcag 720
gtgccccatg agcgaacgca gacctgtagg agcggagctt gctcgcgata gccgcacagc 780
ggcggtgtat ccgccgccca gcgctatcct tgatggctta tcgcgagcaa gctcgctcct 840
acaacgtctc gcctacccca ccacagattc ccccatcttc ggttatgctc gccctttgtc 900
atgaccggag ctttctgacc catgtcaccg attcgtctgt tgctacccct cagccttgcc 960
ctgctcgccg cctgcgccag ccaacccaag caaaacgtca cggtcgagaa ccagagcgaa 1020
tgcccagtgc aactgagcaa cgggcaaaac ctgatcctga ccctgccgag caacccgacc 1080
acgggttatc gctgggcgat ccaggactcg gccggcggcg tgctgcgcaa agtcagcccc 1140
gaggtctaca gcaatcccga agacagcggc ctggtgggca gcgccggcca gtccacctgg 1200
cgcttccagg ccttcgccgc cggcaccggg cgcctgttgc tgacctatca gcaaccctgg 1260
gccccggaag tcgcaccggt gaaagccttc gactgcgcca tttcggtcaa gtgacatggg 1320
ctggctgatc ctggcgctga tgggcgcggc gaccttcctc tacggcctga gcatccacgc 1380
caccctgctg tgcttgctgg tcaagccgct gccggtgctg gccctgctcg gctggctgca 1440
cgatgcgccc cccggcgact atcgccgctg gatcagcctc ggcctgttgt tct 1493
<210> 23
<211> 35
<212> DNA
<213> rsmE-F1
<400> 23
aactctagat caacctgaag gcctgcggct gattc 35
<210> 24
<211> 33
<212> DNA
<213> rsmE-R2
<400> 24
catgatcttc tccttgattg ctttgtaggg cac 33
<210> 25
<211> 31
<212> DNA
<213> rsmE-F2
<400> 25
tcaaggagaa gatcatggcg tcatgagcgg c 31
<210> 26
<211> 32
<212> DNA
<213> rsmE-R2
<400> 26
agaagcttag gcgctgttga tcgtgctgct gg 32
<210> 27
<211> 1514
<212> DNA
<213> rsmE基因上下游融合片段
<400> 27
tcaacctgaa ggcctgcggc tgattccgtc cggattaccg ataaacacct ggggcatgga 60
cagccccttc aagatgactg agcgccgacc aggccggtcg ctcaacgtcg ctgcgacgac 120
ctggcctggc actcagaaga acggcttact gcgcgacgcg gtgctcgatc acttgcggtt 180
cgatattgcg cttcttggcc ttggtcagct tttcgaccag ctcggttttc ttggcttcgg 240
cttcggcctg ggaatcgaac gggccgatca gcacccgatc cttgccctct tcgacgacga 300
cataggaaac gatcccgtgc tcgatcagcc agccagccag atcgctcgtc gcctgaggca 360
gggtgccggc gaccagcaca tcccattgcg gtttcgtggc ggcctgcggc ggctgtgcct 420
ggacgaccgg cgccaccttc ttgtcgacct cgaccttctt gccctcaccg catcccgcca 480
atgccaggac cgccatcatc atcgctactg tgcgcacaac ctaccccttg aaagtctgag 540
gcggcgattt tagcacccca atcccctgcg caaacgccac aaaatcagcg caaaacaagg 600
agaatgatat ttatcgcctc tgtatagttg cagctcggga attaataccg cgtctgcgcg 660
tcagaaagag gcacccacac agtggtactt cgcagtaatc tatacgcact actaccgaca 720
tctgcactgt ctgaatcagg tgccctacaa agcaatcaag gagaagatca tggcgtcatg 780
agcggccagc cctttgtctc atcacaatgg ctggcgcagc gtcgtcgttg attgattccc 840
ccgcagcaca ctcccctctt caaatggcag cggcgcagtt caggccgcca gcgccagccc 900
tggcaaagtg cgttacccaa gccctccacc gatagcgctc catcccggca atctgtcgat 960
acgactcggc cgggagaaag ccctccctcg tttttgtata aatactcagt agcgtggcaa 1020
cgagcaggag gagtaatttc aagacctacc gcctccgcga gcctgccgag gctccccctt 1080
gccaccggca gacgctttac gaacaaggag cggtcaatgc aagagttcgc ttaccttctg 1140
atcaccaacg acctgaatgc aatgcgcacc attgccgcct gctcgacgga ggggctctac 1200
gaagtcaaac gcggaatatt caccttccgc tcccaggcca acgtcgacta cctgcaccgt 1260
gcgctggcca tcgtcagcga cgagttcggc atcattcctg tgcagcaggc cgagttcaaa 1320
accaaccggg ccaccatcag caaggctttc agccaactct gctagcgcgc gcggcgctcg 1380
gtgatgcaca acaacccaca tcgagccaaa gcacactcga ctcgctgctc cttcctcacc 1440
tcatggctgg ctgaacatga ccccacgcgc catgccgctg gccgccacca ccagcagcac 1500
gatcaacagc gcct 1514
<210> 28
<211> 28
<212> DNA
<213> psrA-F1
<400> 28
gcggattcgt ttcacggtga cttcgtcg 28
<210> 29
<211> 25
<212> DNA
<213> psrA-R1
<400> 29
gtttccgact gggccatggc tactc 25
<210> 30
<211> 32
<212> DNA
<213> psrA-F2
<400> 30
atggcccagt cggaaacaag gcctgaccgt cc 32
<210> 31
<211> 31
<212> DNA
<213> psrA-R2
<400> 31
tcaagctttc gtcgttgggg atcgccacgt g 31
<210> 32
<211> 1505
<212> DNA
<213> psrA基因上下游融合片段
<400> 32
gtttcacggt gacttcgtcg ccaatgcggg cgacgacgac ctggccattg cgggcctcgc 60
gagtggtgtg caccgccagc aggtcgccat cgaagatgcc gatgtccttc atgctcatgc 120
cgtgaacccg cagcaggtag tccgcgcgtg gatggaagaa ggccgggttg atattgcagg 180
actcttcgat gtgctgctcg gcgaggatcg gcgcgccggc ggcaacccgg ccgatgatgg 240
gcaggctgga gtcgtcgggc ttggcttcga accccgggat gcgaatgccg cgggaggcgc 300
ctggagtcat ttcgatcgca cccttgcggg ccagcgcctt gaggtgttct tcggcggcgt 360
tgggcgactt gaaacccagt tcctgggcga tttccgcgcg ggtcggtggg tagccgttgt 420
cttcgaggca acgtttgata aaagccagaa tctcagcttg gcgtggcgtc agttttagca 480
tatcgatcgc tctgtctttt tatacagtga ctggaattat atacagtgaa tggcgcttgg 540
caatcctcct ttttccagtc gccgctggac ggtcgggtcg ccgctgcgca tgcctggtgt 600
cgcgtggctg gctacaggac gcggcaggta tggttaaata gctgactgac cggccgcaaa 660
acggacaggc aggcttgaca agactggggc tgaaacgtat gtttcaaaca agtgtttgtc 720
aggcggagta gccatggccc agtcggaaac aaggcctgac cgtccgggtg ggcgcggcag 780
cttacatccg ctaagctagc cgcccatgtc gactctcgtt tcctacctcc tttcacatct 840
ttcgccgatc gtcgcttgcc gggctttgcc gccggcaatg gactcgtgcg tccgcgccac 900
gccagcaccc tttgcgatgc cgtgcgcgca cttcgttact aaggaattgc tatgaccaca 960
ggcctgcaag gctccttgat ggtggatgtc gccggtacct ggctgacagc tgaagatcgc 1020
cagctcctgc gccagcccga agtgggtggg ttgatcatct ttgcccgcaa tatcgagcat 1080
ccgcggcagg tgcgtgagtt gagcgcgtcc attcgggcga ttcgcccgga cctgctgctg 1140
gcggtggacc aggagggcgg tcgcgtgcag cgcctgcgcc agggcttcgt gcggctgccg 1200
gccatgcgtg ccatcgccga caacccgaat gccgaatacc tggccgagca gtgcggctgg 1260
atcatggcca ccgaagtgct ggccgtcggc ctggacctga gcttcgcgcc ggtgctggac 1320
ctcgatcatc agcgcagcgc tgtggtgggt actcgttcct tcgagggcga ccccgagcgc 1380
gccgcgttgc tggcgggtgc ctttatccgt ggcatgaaca gtgccggcat ggcggccacg 1440
ggcaagcatt tccccgggca cggctgggcc gaggcggact cccacgtggc gatccccaac 1500
gacga 1505
<210> 33
<211> 37
<212> DNA
<213> parS-F1
<400> 33
ttggattccc caattgtgcg cactcagact ggtattt 37
<210> 34
<211> 26
<212> DNA
<213> parS-R1
<400> 34
atctagagct cccacgcgaa cggatt 26
<210> 35
<211> 36
<212> DNA
<213> parS-F2
<400> 35
gtgggagctc tagattcgag gtgacggatt cgcagt 36
<210> 36
<211> 33
<212> DNA
<213> parS-R2
<400> 36
aaaagcttgc aaggaccgca agagcggcta caa 33
<210> 37
<211> 1527
<212> DNA
<213> parS基因上下游融合片段
<400> 37
cccaattgtg cgcactcaga ctggtattta tggataaccc gggtcttggc aaagtattgc 60
tggtggaaga tgacgagaag ctcgccgggc tgatcgcgca cttcctgtcc caacacggtt 120
tcgaggtcct gacggtacat cgtggcgatg tggcgctggc ggcctttctc gagttcaagc 180
cgaaaatcgt cgtcctcgac ctgatgctgc cgggccagag cggcctgcac gtgtgccggg 240
agatccgcaa cgtggcggac acgcccatcg tcatcctcac cgccaaggaa gacgacctgg 300
accatatcct gggcctggag tccggcgccg acgactacgt gatcaagccg atcaagccag 360
cggtgctgct ggcccgcctg cgcgccctgc aacggcgcca gttgccggag ccgacggtgc 420
gcggcgcgct ggaattcggc cgcctgaccc tcgaccgcag ttgccgcgaa gtgcgcctgg 480
ccggcgagcc gatcgagctg accaccatgg agttcgagct gctgtggctg ctggccagtt 540
cggcgggcaa gatcctctcc cgcgacgaca tcctcaaccg catgcgcggc atcgccttcg 600
acggcctcaa ccgcagcgtc gatgtctaca tcagcaagct gcgcggcaaa ctccaggaca 660
accctcgcga gccggtgtgc atcaagacca tctggggcaa gggctatctg ttcaatccgt 720
tcgcgtggga gctctagatt cgaggtgacg gattcgcagt ggggcggcgc gtcgtttcgc 780
atgacctggg cgcaggtcga gtagccccgg cccataggca catacccgcg gaattgcgca 840
tgcttctgta ggagcgcagc ttgcgcgcga tgaacgataa cgcggtggat caggcggtcc 900
gcgtcgtggt catcgcgggc aagcctcgct cctacagaag cacgcggttc tgtaggagcg 960
agcgggcggc gatccgactt gcccgcgata gcgtcagaac ggccaacgcc gcttagaagc 1020
tgtactccag ggtcgtcgcc agcgacgtct gcagccgccg ctcgacaatc gggctgtccg 1080
ccgcttcccg gcccaggtac tgcagcgcca gtaccgtcga cacgttcatc tgttcgctga 1140
ccggcactgt ccaggtcagg tcgccgcccc ggctgagaaa gccgcccttg gggcgatagg 1200
ctgcgaaacg ggtcctgccg gcctgggccg tgctgacgcc ataccaggtg tgcaggtagt 1260
cgccgtcgcc gaactggctg ttgaggctgc cttcgaggcg gccgtagcgg ccttcataca 1320
gcgtgctgcc aatgctcagt tgcaggtggt tgtaggccga gccggtgtcc gggtcgtcat 1380
tcttcttcag cgcatgctgc agcgtggccc cgagctccac ggtgcccagg gtgtagccca 1440
ggtgggcgcc gaactgcgcg cgggacttga tcgagcccat gccggccaga tggtccgaac 1500
ccttgtagcc gctcttgcgg tccttgc 1527
<210> 38
<211> 33
<212> DNA
<213> rpeA-F1
<400> 38
ccaagcttac tcaaagacgc tcattcccat gcc 33
<210> 39
<211> 30
<212> DNA
<213> rpeA -F2
<400> 39
caggattctc agcatcgact cagcattccc 30
<210> 40
<211> 30
<212> DNA
<213> rpeA-R1
<400> 40
actcagcatt ccctgagcca tgccgggcat 30
<210> 41
<211> 31
<212> DNA
<213> rpeA-R2
<400> 41
aaatctagac cgtcgctcac gcaaggcgct g 31
<210> 42
<211> 1443
<212> DNA
<213> rpeA基因上下游融合片段
<400> 42
actcaaagac gctcattccc atgcccaaca ttcttctggt cgaagacgac cccgcgctct 60
ctgaactgat cgccagttac ctggagcgca acggctatca ggtcaatgtc atcagccgcg 120
gcgaccaggt gcgtgaacgg gcgcgggtca atccgccgga cctggtgatt ctcgacctga 180
tgctgccggg cctggacggc ctgcaggtct gccgcctgct gcgggccgac tcggcgtcgc 240
tgccgatcct gatgctgacc gcccgtgatg atagccacga tcaggtgctg ggtctggaaa 300
tgggcgccga cgattatgtg acaaaaccgt gcgaaccgcg cgtgctgctg gcgcgggtgc 360
gtaccctgtt gcgccgcagc agcctcggcg agccgcagac cgccagcgac cggatcctca 420
tgggcaacct gtgcatcgac ctgtcggagc gcaccgtgag ctggcgcgat caattggtgg 480
aactgtccag cggcgagtac aacctgctgg tggtgctggc ccggcatgcc ggcgaggtgc 540
tgagccgcga ccagatcctg caacgcctgc ggggcatcga gttcaacggc accgaccgct 600
cggtggacgt ggcgatttcc aagctgcggc gcaagttcga cgaccacgcc ggcgaggcgc 660
gcaagatcaa gaccgtatgg ggcaagggct acctgttcag ccgttccgaa tgggaatgct 720
gagtcgatgc tgagaatcct gtgagccatg ccgggcatcc ccagcgacgg gaaggcccgg 780
cagtcggcgt tatggaagag gctgcatcag cacagcgcgg tcggctgtag ctcgctggcc 840
ttgatcaggt tcacgcctgc cgcgcgcatc tgccgggtgg ccttgtccag cgagccgtcc 900
atgtcgatgg cccggcaggc atcgacgatc acgaaggtat tgaagcccgc cgcccgcgca 960
tccagcgccg accaggccac gcagtagtcc agggccagcc ccaccagata caccgtgtcg 1020
atgccgcgct ggctcaggta gccggccagg ccggtcgtgg tgctgcggtc cgcctcgacg 1080
aaggccgagt aactgtcgat atccggattg caacccttgc gcaggatcag ctgggcatgg 1140
ggcaggttga gtttcgggtg cagttcggcg ccacggctgg cctgcacgca atggtccggc 1200
cagagcacct gcgggccata gggcagctgg atgatgtcgt tcggcgcgtg gccttcgtgg 1260
ctggaggcga acgagatatg cccggccggg tgccagtcct gggcgatcac cacctgcttg 1320
aagtggccgc ccaggcgatt gatcaagggc acgatctggt cgccccccgg caccgccagc 1380
gcgccgccgg ggatgaagtc gttctgtacg tcgatgacca gcagcgcctt gcgtgagcga 1440
cgg 1443
<210> 43
<211> 1203
<212> DNA
<213> phzC基因
<400> 43
atggaagact tactgaaacg ggttttaagt tgtgaagcgt tccagcagcc tcaatggagc 60
gagccctcac aattgcacga cgcgcaggcc tacctcaggg acagcgcctc attgatacga 120
gtggaagaca tcctggtgct gcgcgccacg ctggcacgtg tagcggccgg cgaagcgatg 180
gtcatccagt ccggtgactg cgccgaggac atggatgaaa gcactcccga ccatgtggtc 240
cgcaaagccg cggtgctgga catcctggcc ggtacgttcc ggctggtgac ccagcaaccg 300
gtggtacggg tgggccggat tgccgggcag tttgccaagc cgcgctccaa caacaacgaa 360
cgcatcggcg atgtcgaatt gccggtgtat cgcggcgaca tggtcaacgg ccgcgaggcc 420
atctgcggtc atcgccagca cgatgcgcaa cgcctggttc gaggctatag cgccgcgcgg 480
gacatcatgc aacacctggg ctggaaagcg tcggcaagcc aggaacaact cagcggttca 540
ccggcctgga ccagtcacga aatgctggta ctcgactacg aactgccaca actgcgccag 600
gacgaacagg gccgggtatt tctcggttcg acccactggc cgtggatcgg cgagcgtacc 660
cgtcagttaa cgggcgctca cgtgacgctg ctcagcgaag tgctcaatcc ggtggcgtgc 720
aaggtcggcc cggacatcac ccgggaccag ttgctgagcc tgtgtgaacg cctggactcc 780
aagcgcgaac ccggccggct gaccctgatt gcccgcatgg gcgcgcaaaa ggtcgccgat 840
cgcctgccgc cgctggttga agcggtgcgc caggccggcc acaagatcat ctggctgagc 900
gacccgatgc acggcaacac catcgtcgcg ccctgcggca acaagacccg catggtgcag 960
gccatcaccg aggaaatcac cgccttcaag catgccgtga cctcagccgg tggcgtggcc 1020
gccggcctgc acctggaaac cacccctgac gacgtcagcg agtgcgcttc cgatgccgcc 1080
ggcctgcatc aggtcgccag ccgctacaag agcctgtgcg acccgcgcct gaacccctgg 1140
caggccatta ccgcggtgat ggcctggaag aaccagccca cctcaaccct tgcctccttt 1200
tga 1203
<210> 44
<211> 1101
<212> DNA
<213> aroB基因
<400> 44
atgcagacac ttaaggtcga tctaggcgag cgcagctacc cgattcatat tggcgaaggt 60
ttgttggacc ggcccgagtt gctggctccg cacatcgccg ggcggcaagt ggcgatcgtt 120
tccaatgaaa ccgtagcgcc gctgtacctt gagcgtctga aacgcagcct tgcgcagttc 180
tcggtgatct cggtggttct gcccgacggc gaagcattca agaactggga aaccctgcag 240
cttattttcg atggcctgct gaccgcacgg cacgaccgcc gcaccacgat catcgccctc 300
ggcggcgggg tgatcggcga catggccggc tttgccgctg cctgctacca gcgcggcgtc 360
gatttcatcc agattcctac caccttgctg tcccaggtcg attcgtcggt gggcggcaag 420
accggtatca accatccgct gggcaagaac atggtcggcg ccttctatca gccgaacgtg 480
gtgctgatcg ataccgcctc gctcaatacc ctgccggccc gcgagctgtc ggctggcctg 540
gcggaagtca tcaagtacgg tctgatctgc gacgagccct tcctgacctg gctcgaagac 600
aacgtcgacc gcttgcgagc cctggaccag caggcgctga cctatgccat cgaacgctcc 660
tgcgcggcca aggcggccgt ggtcggtgcc gacgagcgtg agtccggcgt gcgcgccacg 720
ctgaacctgg ggcatacctt cggccacgcc atcgaaaccc acatgggcta tggtgtctgg 780
ctgcatggtg aagcggtcgc tgctggcacc gtaatggcgc tggagatgtc cgcacgcctc 840
ggctggatca ccgccgagga gcgtgaccgc ggtattcgcc tgttccagcg cgcgggcttg 900
ccggtcattc cgccggagga aatgaccgaa gcggattttc tcgaacacat ggcaattgac 960
aagaaagtga tcgatggtcg tttgcgtctg gtgctgttgc gccgcatggg cgaagccgta 1020
gtgaccgacg attatccgaa agaggtttta caggccacgc tgggagcgga ttaccgcgcc 1080
ctggctcagc ttaaaggtta a 1101
<210> 45
<211> 450
<212> DNA
<213> aroD基因
<400> 45
atgcgcccta tcgttctggt gctcaacggc ccgaacctga acctgcttgg cacccgcgaa 60
cccgctactt acggtcacga gaccctggcc gacatttccg ccctgtgcgg gcgtgccgcc 120
gaggagttcg gcctgaccgt ggagtttcgc cagaccaacc acgaaggcga actgctggac 180
tggattcacg gcgcccgtgg ccgttgcgcc gggatcgtga tcaacccggc ggcctggacc 240
cacacctcgg tggcgatccg cgacgccctg gtggccagtg agctgccggt gatcgaagtg 300
cacctgtcga acgtccacgc ccgcgaaccg tttcgccatc actcctttgt ctcgggcatc 360
gccctggcgg taatgtgcgg cttcggcagc catggctatc gcctggcact ggcgcatttc 420
agccagcgtt ttcaaggagc ccaggcatga 450
<210> 46
<211> 822
<212> DNA
<213> aroE基因
<400> 46
atggatcagt acgtcgtttt tggtaacccg atcggccaca gcaagtcgcc gctgattcat 60
cggctgttcg ccgagcagac ggcgcagcgg ctggtctaca ccactctgct ggcgcccctc 120
gacgatttcg ccggctgtgc ccgcgggttc ttcgtggacg ggcgtggcgc caacgtcacg 180
gtgccgttca aggaagacgc ctaccgcctg gccgacagcc tgaccgcccg cgcccagcgc 240
gccggcgcgg tgaacacctt gagcaaactc gccgatggca gcctgttggg cgacaacacc 300
gacggcgccg gcctggtgcg tgacctgacg gtcaacgccg gcttcagcct caagggcaag 360
cgcattctgc tgctgggggc cggtggcgcg gtgcgtggcg cgctggagcc gctgctggcg 420
gagcagccgg cgtcggtgat catcgccaac cgcacggtgg aaaaggccga gctgctggcc 480
gagctgttca gcgacctggg gccggtgtcc gccagcggtt tcgactggtt gcgcgagccg 540
gtggacctga tcatcaacgc cacctcggcc agcctcaccg gcgacgtgcc gccgatcgcc 600
gccagcctga tcgagccggg caagacggtg tgctatgaca tgatgtatgg caaggagccg 660
accgccttct gtcgctgggc cagccaatac ggcgcggcga tttccatgga tggcctgggc 720
atgctcgccg aacaggcggc ggaagccttc ttcctgtggc gcggcgtgcg tccggacacc 780
gcgccggtgc tggcggagct gcggcgccag ctggggctct ga 822
<210> 47
<211> 1998
<212> DNA
<213> tktA基因
<400> 47
atgccaagcc gtcgtgagcg tgccaacgcc attcgtgccc tcagcatgga tgccgtgcaa 60
aaagccaaca gcggccatcc cggtgcccct atgggtatgg cggatatcgc cgaggtactt 120
tggcgtgact acctgaagca caacccgagc aatccatcct tcgccgaccg tgaccgcttc 180
gtgctgtcca acggccacgg ctcgatgctg atctactcgc tgctgcacct gactggctac 240
gacgtcacca tcgacgacct gaagagcttc cgccagctgc acagccgcac cccgggccac 300
ccggagttcg gctacacccc gggcgtcgag accactaccg gcccgctggg ccaaggcctg 360
gccaacgccg tgggcttcgc cctggcggaa aaggtcctgg cggcgcagtt caaccgtccc 420
ggccacaacg tcgtcgacca ccacacctac gtgttcctgg gcgatggctg catgatggaa 480
ggcatttccc atgaagtcgc gtccctggcc ggcaccctgg gcctgggcaa gctgatcgcc 540
ttctacgatg acaacggcat ctccatcgac ggcgaagtcg aaggctggtt caccgacgac 600
acgccaaagc gtttcgaagc ctacaactgg caggtgatcc gcaacgtcga cggtcacgac 660
cctgaagaga tcaagaccgc gatcgacacc gcgcgcaaaa gcgagcagcc gaccctgatc 720
tgctgcaaga ccaccatcgg tttcggttcg ccgaacaagc aaggcaagga agactgccac 780
ggcgcgccac tgggtgctga ggaaatcgcc ctgacccgcg ccgcgctgaa gtggaaccac 840
ggcccgttcg aaatcccggc cgacatctac gccgagtggg atgccaagga aaccggtcgc 900
gccgtcgaag ccgagtggga ccagcgtttc tccgcctact ccgccgaatt ccctgagctg 960
gccaacgagc tggtgcgtcg cctgagcggt gacctgccgg ccgacttctc cgagaaggcc 1020
gatgcctaca tcgccgaagt cgcggccaag ggcgaaacca tcgccagccg taaagccagc 1080
cagaacgccc tgaacgcgtt cggcccgctg ctgccggaat tcctcggcgg ttcggccgac 1140
ctggccggtt ccaacctgac cctgtggaaa ggctgcaagg gcgtcagcgc cgaagacgcc 1200
agcggcaact acatgtacta cggcgttcgc gagttcggca tgaccgccat catgaacggc 1260
gtggccctgc acggtggcct ggtgccttac ggcgcgacct tcctgatgtt catggaatac 1320
gcgcgcaacg cggtacgcat gtcggccctg atgaagcagc gcgtgatcca cgtctacacc 1380
cacgactcca tcggtctggg cgaagacggc ccgacgcacc agccgatcga gcagatcgcc 1440
agcctgcgct gcaccccgaa cctcgacacc tggcgtccag ccgatgccgt ggaatcggcg 1500
gtggcctgga agaacgcgat cgagcgcaag gacggtcctt cggcgctgat cttctcccgc 1560
cagaacctgc agcatcagac ccgcgatgcc gtgcagatcg ccgcaatcag ccgcggcggc 1620
tacgtgctca aggactgcgc aggcgagcct gagctgatcc tgatcgccac cggttccgaa 1680
gtcggcctgg cggtgcaggc cttcgacaaa ctgaccgagc agggccgcaa ggtgcgcgtg 1740
gtgtccatgc catgcaccag cgtgttcgat gctcaggacg ccggttacaa gcagtcggtc 1800
ctgccgctgc aggtcagcgc ccgtatcgcc atcgaggccg ctcacgcgga ctactggtac 1860
aagtacgtcg gcctggaagg tcgcgtcatc ggcatgacca cctacggcga gtcggcgcct 1920
gcgccggcct tgttcgaaga gttcggtttc accctggaga acatcctggg tcaggctgaa 1980
gagctgctgg aagactaa 1998
<210> 48
<211> 2322
<212> DNA
<213> ppsA基因
<400> 48
gtggggggca agaacgcatc cctgggcgag atgatcagta accttgcagg cgccggtgta 60
tcggtccctg gaggctttgc cacgacggcc caggcctatc gtgattttct cgaattgagc 120
ggtcttaacg accagatcca cgccgcgctc gacgccctgg acgtcgatga cgtgaatgcc 180
ctggccaaga ccggcgccca gatccgtcaa tggatcatgg aagccgaatt ccccgagcaa 240
ctgaataccg aaatccgcac cgcgttcgcc aaactgtccg cgggcaaccc tgacatggcc 300
gtggccgtgc gctcctcggc caccgccgaa gacctgccgg acgcttcctt cgccggccag 360
caggaaacct tccttaatat ccgtggcgtc gagaacgtca ttcgcgccgc caaggaagtc 420
ttcgcttccc tgttcaacga ccgcgccatt tcctaccgcg tgcaccaggg cttcgaccac 480
aagctggtcg ccctgtctgc cggcgtgcag cgcatggtgc gttcggaaac cggtaccgcc 540
ggcgtgatgt tcaccctcga caccgagtcg ggcttccgtg acgtggtgtt catcaccggc 600
gcctacggcc tgggtgaaac cgtcgttcaa ggtgcggtga acccggatga gttctacgtc 660
cacaagggca ccctgcaagc cggtcgcccg gccatcctgc gccgcaacct gggcagcaag 720
gcgatcaaga tgatctacgg cgacgaagcc aaggccggtc gctcggtcaa gaccgtcgac 780
gtcgacaagg ccgatcgcgc gcgtttctgc ctgaccgatg ccgaagtcag cgagctggcc 840
aagcaggcga tgatcatcga gaagcactac aagtgcccga tggacatcga gtgggccaaa 900
gacggcgatg acggcaagct gtatatcgtc caggcccgtc cggaaaccgt gaagagccgc 960
acccaggcca acgtcatgga gcgttacctg ttgaaggaaa ccggcaccgt gctggtggaa 1020
ggtcgtgcca tcggccagcg catcggcgcc ggcaaggtgc ggatcatcaa ggacgtgtcg 1080
gagatggaca aggtccaggc cggcgacgtg ctggtgtccg acatgaccga cccggactgg 1140
gaaccggtga tgaagcgcgc cagcgccatt gtcaccaacc gtggcggccg tacttgccac 1200
gccgcgatca tcgcgcgcga gctgggtatt ccagcggttg tcggttgcgg caatgccacc 1260
gaactgttga aagacggcca gggcgtgact gtgtcctgcg ctgaaggcga caccggtttc 1320
atcttcgaag gcgagttggg tttcgacgtg aagaaaaact ccgtcgacgc catgccggag 1380
ctgccgttca agatcatgat gaacgtcggc aacccggacc gcgccttcga cttcgcccag 1440
ttgccgaacg ccggtgtcgg cctggcccgc ctggagttca tcatcaaccg catgatcggc 1500
gtgcacccca aggcactgct gaactacgcc ggcctgcccc atgaaatcaa ggaaagcgtc 1560
gacaagcgca tcgccggtta caacgaaccg gtcggtttct acgtcgacaa gctggtcgaa 1620
ggcatcagca ccctggccgc ggcgttctgg ccgaaaaagg tcatcgtgcg cctgtcggac 1680
ttcaagtcca acgaatacgc caacctgatc ggcggcaagc tctacgagcc ggaagaagaa 1740
aacccgatgc tgggcttccg cggtgcttcg cgttacatca gcgaatcgtt ccgtgactgc 1800
ttcgaactcg agtgccgcgc cctcaagcgc gtgcgcaacg acatgggcct gaccaacgtc 1860
gagatcatgg tgccgttcgt ccgtactctg ggcgaagcca gccaggtggt ggatctgctg 1920
gccgaaaacg gtctcaagcg cggtgaaaac ggcctgcgcg tgatcatgat gtgcgagctg 1980
ccttccaacg cgatcctggc cgaagagttc ctcgagttct tcgacggttt ctccatcggc 2040
tccaacgacc tgacccagct gaccctgggc ctggaccgcg actcgggcat catcgcgcac 2100
ctgttcgacg agcgtaatcc ggcggtcaag aagctgctgg ccaacgccat cgccgcttgc 2160
aacaaggccg gcaaatacat cggtatttgc ggccagggcc cgtccgacca cccggacctg 2220
gccaagtggc tgatggagca gggcatcgaa agcgtctcgc tgaacccgga ttccgtactg 2280
gaaacctggt tcttcctggc cgaggggcag ggtgcggtct aa 2322
<210> 49
<211> 1452
<212> DNA
<213> pykF基因
<400> 49
atgtccgtcc gtcgtaccaa aatcgtcgct acccttggcc cggccagtaa ctcgccggaa 60
gttctcgaac agctgattct ggctggcctg gacgtcgccc gcctgaactt ctcccatggc 120
accccggacg agcacaaggc tcgcgccaag ctggtgcgtg acctggccgc caagcatggc 180
cgcttcgtcg cgctgctggg tgacctgcaa ggcccgaaga tccgtatcgc caaattcgcc 240
aacaagcgca tcgagctgaa gatcggtgac aagttcacct tctccaccag ccacccgctg 300
accgaaggta accaggacat cgtcggcatc gactatccgg acctggtcaa ggactgcggc 360
gtgggcgacg agctgctgct cgacgacggc cgcgtggtga tgcgcgtcga aaccgccacc 420
agcaccgaac tgcattgcgt cgtgaccatc ggcggcccgc tgtcggacca caagggcatc 480
aaccgtcgcg gtggcggcct gaccgccccg gccctgaccg aaaaagacaa ggccgacatc 540
aagctggccg cggccatgga cctggactac ctggccgtgt ccttcccgcg cgacgccgct 600
gacatggaat atgcccgcca actgcgcgac gaagccggcg gcaccgcctg gctggtggcg 660
aagatcgagc gcgccgaagc cgtggccaac gacgaaaccc tcgacggcct gatcaaggcc 720
tccgacgccg tgatggtggc ccgtggtgac ctgggtgtgg aaatcggcga cgccgagctg 780
gtgggcatcc agaagaaaat cattctgcac gcccgtcgcc acaacaaggc ggtgatcgtc 840
gcgacccaga tgatggagtc gatgatccag aacccgatgc caacccgcgc cgaagtgtcc 900
gacgtggcca acgccgtgct cgactacacc gacgccgtga tgctctcggc cgaatccgcc 960
gccggcgcct acccgctcga agcggtccag gccatggcgc gtatctgcat cggcgcggaa 1020
aaacacccga ccagcaagac ctccagccac cgcatcggca agaccttcga gcgctgcgac 1080
gagagcattg ccctggccac catgtacacc gccaaccact tcccgggcgt taaagcgatc 1140
atcgccttga ctgaaagcgg ctacaccccg ctgatcatgt cgcgtatccg ctcctcggtg 1200
ccgatctacg cgttcacccc gcaccgcgaa gcccaggccc gcaccgcgat gttccgtggc 1260
gtctacacca tcccgttcga cccggcatcc ctgccgccaa gcgaagtcag ccagaaggcc 1320
atcgacgagc tggtcaagcg cggcgtcgtg gagaaaggcg actgggtgat cctgaccaag 1380
ggcgacagct accacaccac cggcggcacc aacggcatga agatcctgca cgttggcgac 1440
ccgatggtct ga 1452
<210> 50
<211> 29
<212> DNA
<213> phzC-F
<400> 50
gggaattcat ggaagactta ctgaaacgg 29
<210> 51
<211> 25
<212> DNA
<213> phzC-R
<400> 51
ggaagctttc aaaaggaggc aaggg 25
<210> 52
<211> 27
<212> DNA
<213> AroB-F
<400> 52
cgggatccat gcagacactt aaggtcg 27
<210> 53
<211> 29
<212> DNA
<213> AroB-R
<400> 53
ccccaagctt ttaaccttta agctgagcc 29
<210> 54
<211> 28
<212> DNA
<213> AroD-F
<400> 54
ttggatccat gcgccctatc gttctggt 28
<210> 55
<211> 26
<212> DNA
<213> AroD-R
<400> 55
ggaagctttc atgcctgggc tccttg 26
<210> 56
<211> 25
<212> DNA
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<400> 56
ttggatccat ggatcagtac gtcgt 25
<210> 57
<211> 24
<212> DNA
<213> AroE-R
<400> 57
ttaagctttc agagccccag ctgg 24
<210> 58
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<212> DNA
<213> tktA-F
<400> 58
aaggatccat gccaagccgt cgtgag 26
<210> 59
<211> 31
<212> DNA
<213> tktA-R
<400> 59
ccccaagctt ttagtcttcc agcagctctt c 31
<210> 60
<211> 28
<212> DNA
<213> ppsA-F
<400> 60
ctaagcttgt ggggggcaag aacgcatc 28
<210> 61
<211> 25
<212> DNA
<213> ppsA-R
<400> 61
tttggatcct tagaccgcac cctgc 25
<210> 62
<211> 31
<212> DNA
<213> pykF-F1
<400> 62
cacgaattca tcggtcagcc gattgaacac t 31
<210> 63
<211> 29
<212> DNA
<213> pykF-R1
<400> 63
acggacggac atgcaaagac tcctgagtt 29
<210> 64
<211> 29
<212> DNA
<213> pykF-F2
<400> 64
ttgcatgtcc gtccgtatgg tctgagtcc 29
<210> 65
<211> 34
<212> DNA
<213> pykF-R2
<400> 65
aagtctagac aacgacattg ccgacttcct ccag 34
<210> 66
<211> 1522
<212> DNA
<213> pykF基因上下游融合片段
<400> 66
atcggtcagc cgattgaaca ctttcaaaaa acacggcaac tggtgccgct cgatccgccg 60
gtccgtgaac atgtcatgca tcgctattca agaaggtcat tcaacatcgt cgcgccgagg 120
actgtcggcc ccggtcggcc cattttagaa acaatactct aaaacaggct cacagatgtt 180
agctcaaggc tcatgcggga tcagcaatag cctgatgacg attgttacaa cgcggtcgga 240
cgcgcttgag cgctgccgcg cgaagggaaa tgccccagtt gctgcagggt ttccaggcgc 300
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tgcgccgcat cgaggaacag cttctgccgc tccaggcact gtccgcgcag catcgatacc 420
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acccgttcgc agttgccggc gtcataggcg cggtaggcgg tattcagatg atggtccatc 540
gaccagcggg tacagccgac aacactgacg gccagggcag caatgagcac gaatcgcatg 600
ggggttctcc tgtcttgtgc acgttatcga cccgcgttgg aaaatcttca ggaatgttcg 660
tttaaagaaa caaacgaata agtagtgcaa acgaacaatg actacagctg cggaccatag 720
tagcctctcg ttgcgcttga actcaggagt ctttgcatgt ccgtccgtat ggtctgagtc 780
cccctgatgc aacaataaaa agccccgcag tgaagactgc ggggcttttt tatggatcct 840
gcgaacctgt aggagcaagc gggcggcgat ccgacttgcc cgcgatagct acaccgcggt 900
ccaccagaaa caacgcgttg cccgcgatcg cgagcaagct tcgttcctac aaggctggaa 960
tcagcccttg gcaagaaacc ccgacaaggc agccagtgct tccggcgaat gcaggcgctg 1020
ggtgaacagg gtgccctcct cctcgatcac cttgcgcagt tgttcgcgat cgggcgtgcg 1080
catcagctgc ttgctgatct gcaccgcctg cggcgccagc ttctcgaaac gcagcgccat 1140
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cagggtggtg ccgatcccca cggccgggcc cgcgaccgcg gcgaccaccg gcttgcggca 1440
ttcgaacagg ctgcgcatga actggaagac cgggctgtcg agcccgctgg gcggctgctg 1500
gaggaagtcg gcaatgtcgt tg 1522
Claims (12)
1.一株生产吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌,其特征在于,具体是将绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)Qlu-1基因组中的phzO基因替换为外源的phzH基因,并敲除lon基因、rsmE基因、psrA基因、parS基因和rpeA基因;然后导入phzC基因、aroB基因、aroD基因、aroE基因、tktA基因和ppsA基因,敲除pykF基因即得;
其中,所述绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)Qlu-1已送至中国典型培养物保藏中心,保藏日期为2020年05月08日,保藏编号为CCTCC NO:M 2020108;
所述phzC基因、aroB基因、aroD基因、aroE基因、tktA基因和ppsA基因的碱基序列分别如SEQ ID NO.43、SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.45、SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.47和SEQ IDNO.48所示;
所述外源phzH基因碱基序列如SEQ ID NO.2所示。
2.如权利要求1所述的基因工程菌,其特征在于,所述phzO基因的碱基序列如SEQ IDNO.1所示;
所述lon基因、rsmE基因、psrA基因、parS基因和rpeA基因的碱基序列分别如SEQ IDNO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示;
所述pykF基因的碱基序列如SEQ ID NO.49所示。
3.权利要求1或2所述生产吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌的制备方法,其特征在于,所述方法包括:
将绿针假单胞菌Qlu-1基因组中的phzO基因替换为外源的phzH基因,然后再敲除lon基因、rsmE基因、psrA基因、parS基因和rpeA基因;然后导入phzC基因、aroB基因、aroD基因、aroE基因、tktA基因和ppsA基因,敲除pykF基因即得。
4.如权利要求3所述的制备方法,其特征在于,“所述phzO基因替换为外源的phzH基因”的具体步骤包括:敲除phzO基因后得菌株QPCA-1,然后将外源phzH基因导入菌株QPCA-1中。
5.如权利要求4所述的制备方法,其特征在于,所述敲除phzO基因步骤包括:
i、扩增phzO基因片段的上下游同源臂;采用融合PCR法连接上下游同源臂并插入pK18mobsacB质粒中得phzO基因重组质粒;
ii、将phzO基因重组质粒导入大肠杆菌S17-1(λ)后与绿针假单胞菌Qlu-1进行双亲杂交培养,从而将phzO基因重组质粒导入绿针假单胞菌Qlu-1;
iii、筛选阳性克隆,即得菌株QPCA-1。
6.如权利要求5所述的制备方法,其特征在于,扩增phzO基因片段上游同源臂的引物包括phzO-F1和phzO-R1,序列分别如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示;
扩增phzO基因片段下游同源臂的引物包括phzO-F2和phzO-R2,序列分别如SEQ IDNO.10和SEQ ID NO.11所示;
采用融合PCR法连接上下游同源臂获得的phzO基因上下游融合片段序列如SEQ IDNO.12所示;
筛选阳性克隆的方法具体包括蔗糖平板筛选、影印筛选和PCR筛选。
7.如权利要求4所述的制备方法,其特征在于,所述外源phzH基因导入菌株QPCA-1中具体方法为:
i、以QPCA-1基因组为模板,以 phzO-F1/ phzO-R1-2,phzO-F2-2/ phzO-R2分别为引物扩增phzO基因的上游片段phzO-U2及下游片段phzO-D2;以合成的phzH基因为模板,phzH-F1/phzH-R1为引物扩增片段phzH-2;以phzO-U2、phzO-D2、phzH-2为模板,以phzO-F1/phzO-R2为引物,扩增融合phzO基因上下游的phzH导入片段phzH-IN;将融合片段phzH-IN插入pK18mobsacB质粒中得phzH基因重组质粒;
ii、将phzH基因重组质粒导入大肠杆菌S17-1(λ)后与菌株QPCA-1进行双亲杂交培养,从而将phzH基因重组质粒导入菌株QPCA-1;
iii、筛选阳性克隆,即得;
phzO-F1和phzO-R1-2的序列分别如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.13所示;
phzO-F2-2和phzO-R2的序列分别如SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.11所示;
phzH-F1和phzH-R1的序列分别如SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示;
phzH-IN基因上下游融合片段的序列如SEQ ID NO.17所示。
8.如权利要求7所述的制备方法,其特征在于,筛选阳性克隆的方法具体包括蔗糖平板筛选、影印筛选和PCR筛选。
9.如权利要求5或6所述的制备方法,其特征在于,敲除lon基因、rsmE基因、psrA基因、parS基因和rpeA基因的方法与敲除phzO基因的方法相同;
其中,敲除lon基因方法中,
扩增lon基因片段上游同源臂的引物包括lon-F1和lon-R1,序列分别如SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.19所示;
扩增lon基因片段下游同源臂的引物包括lon-F2和lon-R2,序列分别如SEQ ID NO.20和SEQ ID NO.21所示;
采用融合PCR法连接上下游同源臂获得的lon基因上下游融合片段序列如SEQ IDNO.22所示;
其中,敲除rsmE基因方法中,
扩增rsmE基因片段上游同源臂的引物包括rsmE-F1和rsmE-R1,序列分别如SEQ IDNO.23和SEQ ID NO.24所示;
扩增rsmE基因片段下游同源臂的引物包括rsmE-F2和rsmE-R2,序列分别如SEQ IDNO.25和SEQ ID NO.26所示;
采用融合PCR法连接上下游同源臂获得的rsmE基因上下游融合片段序列如SEQ IDNO.27所示;
其中,敲除psrA基因方法中,
扩增psrA基因片段上游同源臂的引物包括psrA-F1和psrA-R1,序列分别如SEQ IDNO.28和SEQ ID NO.29所示;
扩增psrA基因片段下游同源臂的引物包括psrA-F2和psrA-R2,序列分别如SEQ IDNO.30和SEQ ID NO.31所示;
采用融合PCR法连接上下游同源臂获得的psrA基因上下游融合片段序列如SEQ IDNO.32所示;
其中,敲除parS基因方法中,
扩增parS基因片段上游同源臂的引物包括parS-F1和parS-R1,序列分别如SEQ IDNO.33和SEQ ID NO.34所示;
扩增parS基因片段下游同源臂的引物包括parS-F2和parS-R2,序列分别如SEQ IDNO.35和SEQ ID NO.36所示;
采用融合PCR法连接上下游同源臂获得的parS基因上下游融合片段序列如SEQ IDNO.37所示;
其中,敲除rpeA基因方法中,
扩增rpeA基因片段上游同源臂的引物包括rpeA-F1和rpeA-R1,序列分别如SEQ IDNO.38和SEQ ID NO.39所示;
扩增rpeA基因片段下游同源臂的引物包括rpeA-F2和rpeA-R2,序列分别如SEQ IDNO.40和SEQ ID NO.41所示;
采用融合PCR法连接上下游同源臂获得的rpeA基因上下游融合片段序列如SEQ IDNO.42所示。
10.权利要求1或2所述基因工程菌和/或权利要求3-9任一项所述制备方法获得的基因工程菌在生产吩嗪-1-甲酰胺中的应用。
11.一种吩嗪-1-甲酰胺的生产方法,其特征在于,所述方法包括:将权利要求1或2所述基因工程菌和/或权利要求3-9任一项所述制备方法获得的基因工程菌接种于发酵培养基中进行培养。
12.如权利要求11所述一种吩嗪-1-甲酰胺的生产方法,其特征在于,所述发酵培养基为KB培养基。
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Date | Code | Title | Description |
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PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant | ||
CP03 | Change of name, title or address |
Address after: 250353 University Road, Changqing District, Ji'nan, Shandong Province, No. 3501 Patentee after: Qilu University of Technology (Shandong Academy of Sciences) Country or region after: China Address before: 250353 University Road, Changqing District, Ji'nan, Shandong Province, No. 3501 Patentee before: Qilu University of Technology Country or region before: China |