KR20190005707A - 디옥시바이오라세인 생산능이 향상된 재조합 미생물 및 그를 이용한 디옥시바이오라세인을 생산하는 방법 - Google Patents
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Abstract
디옥시바이오라세인 생산능이 증가된 재조합 미생물, 및 그를 이용한 디옥시바이오라세인을 생산하는 방법에 관한 것이다. 일 양상에 따른 디옥시바이오라세인 생산능이 증가된 재조합 미생물을 사용하면 미생물의 생장 속도가 지연되지 않아 디옥시바이오라세인의 생산 단계를 단축할 수 있으므로 짧은 시간 동안 고효율 및 고수율로 디옥시바이오라세인을 생산할 수 있다.
Description
디옥시바이오라세인 생산능이 증가된 재조합 미생물, 및 그를 이용한 디옥시바이오라세인을 생산하는 방법에 관한 것이다.
인류의 항생제 사용으로부터 항생제에 내성을 갖는 슈퍼박테리아 문제가 대두되었으며 항생제의 사용량이 늘어날 때마다 슈퍼박테리아의 종류와 양이 늘어난다. 항생제 내성 균주 경우 기존의 항생제를 이용해 효과적인 살균, 정균 작용이 불가능하며 이로 인해 병원내 감염 또한 크게 증가하기 때문에 항생제 내성균에 대한 항생 작용을 할 수 있는 물질에 대한 요구가 증가하고 있다.
한편, 디옥시바이오라세인(Deoxyviolacein)은 바이오라세인의 공대사물질(co-metabolite)로, 항종양 활성이 있으며, 그람 양성균, 항생제 내성균(methicillin-resistant Staphylococcus aureus: MSRA) 및 곰팡이 식물 병원체에 대한 생물학적 활성을 갖는 물질로 알려져 있다. 이처럼 디옥시바이오라세인이 현재 병원내 감염의 대부분을 차지하는 MRSA를 효과적으로 제거하기 때문에 디옥시바이오라세인의 수요가 매우 증가하고 있는 추세이다. 그런데, 디옥시바이오라세인은 야생형 박테리아에서 내인적으로 생산되지만 매우 낮은 농도로 생산되기 때문에 이를 분리정제하여 대량생산 하지는 못하고 있는 실정이다.
따라서, MRSA를 효과적으로 제거할 수 있는 디옥시바이오라세인을 대량생산하기 위하여 디옥시바이오라세인 생산능이 증가된 재조합 미생물과 이러한 미생물로부터 디옥시바이오라세인을 생산하는 방법에 대한 연구가 필요하다.
일 양상은 모세포에 비하여 vioABCE 유전자 클러스터(gene cluster)의 활성이 증가되도록 하는 유전적 변형을 포함하는 재조합 미생물을 제공하는 것이다.
다른 양상은 상기 미생물을 배양하여 디옥시바이오라세인을 생산하는 방법을 제공한다.
다른 양상은 디옥시바이오라세인 생산능이 증가된 미생물을 제조하는 방법을 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "활성 증가 (increase in activity)", 또는 "증가된 활성 (increased activity)"은 세포, 폴리뉴클레오티드, 단백질, 또는 효소의 활성의 검출가능한 증가를 나타낼 수 있다. "활성 증가 (increase in activity)", 또는 "증가된 활성 (increased activity)"은 주어진 유전적 변형 (genetic modification)을 갖지 않은 세포, 폴리뉴클레오티드, 단백질, 또는 효소 (예, 본래 또는 "야생형 (wild-type)"의 세포, 폴리뉴클레오티드, 단백질, 또는 효소)와 같은, 동일한 타입의 비교 세포, 폴리뉴클레오티드, 단백질, 또는 효소의 수준 보다 더 높은 변형된 (예, 유전적으로 조작된) 세포, 폴리뉴클레오티드, 단백질, 또는 효소의 활성을 나타낼 수 있다. "세포의 활성 (cell activity)"이란 세포의 특정 폴리뉴클레오티드, 단백질 또는 효소의 활성을 나타낼 수 있다. 예를 들면, 상기 변형된 또는 조작된 세포, 폴리뉴클레오티드, 단백질, 또는 효소의 활성은 동일 타입의 조작되지 않은 세포, 폴리뉴클레오티드, 단백질, 또는 효소, 예를 들면, 야생형 세포, 폴리뉴클레오티드, 단백질, 또는 효소의 활성보다 약 5% 이상, 약 10% 이상, 약 15% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 또는 약 100% 이상 증가된 것일 수 있다. 세포 중 특정 폴리뉴클레오티드, 단백질 또는 효소의 활성은 모세포, 예를 들면, 조작되지 않은 세포 중의 동일 폴리뉴클레오티드, 단백질 또는 효소의 활성보다 약 5% 이상, 약 10% 이상, 약 15% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 또는 약 100% 이상 증가된 것일 수 있다. 폴리뉴클레오티드, 단백질 또는 효소의 증가된 활성을 갖는 세포는 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 확인될 수 있다. 상기 증가된 활성을 갖는 세포는, 유전적 변형을 갖지 않은 세포에 비하여 하나 이상의 폴리뉴클레오티드, 효소 또는 폴리펩티드의 활성을 증가시키는 유전적 변형 (genetic modification)을 갖는 것일 수 있다.
본 명세서에 있어서, 용어 "유전적 변형 (genetic modification)"은 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입하는 변형 (예, 유전자의 카피수의 증가), 모세포의 유전물질에 대한 하나 이상의 뉴클레오티드의 치환, 부가, 삽입, 또는 결실, 또는 모세포의 유전물질에 대한 화학적 변이를 포함한다. 그러한 유전적 변형은 언급된 종 (referenced species)에 대한 이질성 (heterologous), 동질성 (homologous), 또는 이질성 및 동질성 폴리펩티드를 위한 코딩 영역 (coding region) 및 그의 기능적 단편 (functional fragments thereof)에 대한 것을 포함한다. 또한, 상기 유전적 변형은 유전자 또는 오페론의 발현을 변경시키는 비코딩 조절 영역 (non-coding regulatory regions)의 변형을 포함한다. 비코딩 영역은 5'-비코딩 서열 (5'-non coding sequence) 및/또는 3'-비코딩 서열 (3'-non coding sequence)을 포함한다.
용어 "카피 수 증가 (copy number increase)"는 유전자의 도입 또는 증폭에 의한 것일 수 있으며, 조작되지 않은 세포에 존재하지 않는 유전자를 유전적 조작에 의해 갖게 되는 경우도 포함한다. 상기 유전자의 도입은 벡터와 같은 비히클을 매개하여 이루어질 수 있다. 상기 도입은 상기 유전자가 게놈에 통합되지 않은 임시적 (transient) 도입이거나 게놈에 삽입되는 것일 수 있다. 상기 도입은 예를 들면, 목적하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 삽입된 벡터를 상기 세포로 도입한 후, 상기 벡터가 세포 내에서 복제되거나 상기 폴리뉴클레오티드가 게놈으로 통합됨으로써 이루어질 수 있다.
외부에서 도입되거나 또는 카피 수가 증가되는 폴리뉴클레오티드는 내인성 (endogenous) 또는 외인성 (exogenous)일 수 있다. 상기 내인성 유전자는 미생물 내부에 포함된 유전물질 상에 존재하던 유전자를 말한다. 외인성 유전자는 숙주 세포 게놈으로 도입 (integration)되는 등의 숙주 세포 내로 유전자가 도입되는 것을 의미하며, 도입되는 유전자는 도입되는 숙주세포에 대해 동종 (homologous) 또는 이종 (heterologous)일 수 있다.
"이종성 (heterologous)"은 천연 (native)이 아닌 외인성 (foreign)을 의미할 수 있다.
용어 "유전자"는 전사 및 번역 중 하나 이상에 의하여 발현 산물, 예를 들면, mRNA 또는 단백질을 생성할 수 있는 핵산 단편을 의미하며, 코딩영역 또는 코딩영역 외 5'-비코딩 서열 (5'-non coding sequence)과 3'-비코딩 서열(3'-non coding sequence) 등의 조절 (regulatory) 서열을 포함할 수 있다.
"세포 (cell)", "균주 (strain)", 또는 "미생물 (microorganism)"은 교체 사용이 가능한 것으로서, 대장균, 효모, 박테리아, 또는 곰팡이 등을 포함할 수 있다.
반면, 본 명세서에서 사용된 용어 "활성 감소 (decrease in activity)" 또는 "감소된 활성 (decreased activity)"은 모세포 (예, 유전적으로 조작되지 않은 세포) 중에서 측정된 것보다 더 낮은 폴리뉴클레오티드, 효소 또는 폴리펩티드의 활성을 갖는 세포를 나타낸다. 또한, "활성 감소 (decrease in activity)" 또는 "감소된 활성 (decreased activity)"은 본래의 (original) 또는 야생형 (wild-type)의 폴리뉴클레오티드, 효소 또는 폴리펩티드보다 더 낮은 활성을 갖는 분리된 폴리뉴클레오티드, 효소 또는 폴리펩티드를 나타낸다. 활성 감소 또는 감소된 활성은 활성이 없는 것 (no activity)을 포함한다. 예를 들면, 변형된 (예, 유전적으로 조작된) 세포, 또는 효소에 대한 기질로부터 생성물로의 효소 전환 활성이 상기 변형을 갖지 않은 세포 또는 효소, 예를 들면, 모세포 또는 "야생형 (wild-type)"의 세포 또는 효소의 효소 전환활성에 비하여 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 또는 약 100% 감소된 것일 수 있다. 효소 또는 세포의 감소된 활성은 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 확인될 수 있다. 상기 활성 감소는 변형되지 않은 유전자를 갖는 세포, 예를 들면, 모세포 또는 야생형 세포에 비하여, 효소가 발현되더라도 효소의 활성이 없거나 감소된 경우, 효소를 코딩하는 유전자가 발현되지 않거나 발현되더라도 본래 유전자 조작이 되지 않은 유전자에 비하여 발현량이 감소된 경우를 포함한다. 상기 감소된 활성을 갖는 세포는, 유전적 변형을 갖지 않은 세포에 비하여 하나 이상의 폴리뉴클레오티드, 효소 또는 폴리펩티드의 활성을 감소시키는 유전적 변형 (genetic modification)을 갖는 것일 수 있다.
용어 "모세포 (parent cell)"는 본래 세포 (original cell), 예를 들면, 조작된 대장균 세포에 대하여 동일 타입의 유전적으로 조작되지 않은 세포를 나타낸다. 특정한 유전적 변형에 대하여, 상기 "모세포"는 상기 특정 유전적 변형 (genetic modification)을 갖지 않은 세포이지만, 다른 상황에 대하여는 동일한 것일 수 있다. 따라서, 상기 모세포는 주어진 폴리뉴클레오티드, 단백질의 증가된 활성을 갖는 유전적으로 조작된 대장균 세포를 생산하는데 출발 물질 (starting material)로 사용된 세포일 수 있다.
용어 “모세포(parent cell)” 또는 “모균주 (parent strain)”는 해당 유전적 변형(subject genetic modification)을 위해 사용된 것일 수 있다. 상기 모세포는 상기 유전적 변형을 제외하고는 해당 세포(subject cell)와 동일하기 때문에, 상기 유전적 변형에 대한 기준 세포(reference cell)일 수 있다. 상기 “유전적 변형(genetic modification)”은 세포의 유전물질의 구성 또는 구조가 인위적으로 변경된 것을 의미한다. 상기 모세포는 해당 유전적 변형, 예를 들면 활성이 증가되도록 하는 유전적 변형을 갖지 않는 세포일 수 있다. 상기 모세포는 모 대장균 세포(parent Escherichia cell)일 수 있다.
용어 “야생형(wild-type)” 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 특정 유전적 변형을 갖지 않는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드일 수 있고, 상기 유전적 변형은 유전적으로 조작된 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 수득할 수 있게 하는 것일 수 있다.
용어 "파괴 (disruption)"는 언급된 유전자 (referenced gene)의 발현이 감소되도록 하는 유전적 변형을 나타낸다. 상기 파괴는 언급된 유전자의 발현이 없도록 하는 유전적 변형 (이하, 유전자의 "불활성화 (inactivation)"이라고 한다.) 또는 유전자의 발현은 있으나 감소된 수준으로 발현되도록 하는 유전적 변형 (이하, 유전자의 "감쇄 (attenuation)"이라고 한다.)을 포함한다. 상기 불활성화는 유전자의 기능적 산물 (functional product)이 발현되지 않는 것뿐만 아니라 발현은 되지만 기능적 산물이 발현되지 않는 것을 포함한다. 상기 감쇄는 유전자의 기능적 산물의 발현량 감소를 포함한다. 즉, 상기 감쇄는 유전자의 순 발현량은 증가하였더라도 기능적 산물의 발현량이 감소되는 것을 포함한다. 여기서 유전자의 기능적 산물이란 모세포 또는 야생형 세포에서 상기 유전자의 산물 (예, 효소)이 갖는 생화학적 또는 생리적 기능 (예, 효소 활성)을 보유하고 있는 것을 말한다. 따라서, 상기 파괴는 유전자의 기능적 파괴 (functional disruption)를 포함한다. 상기 유전적 변형은 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입하는 변형, 모세포의 유전물질에 대한 하나 이상의 뉴클레오티드의 치환, 부가, 삽입, 또는 결실, 또는 모세포의 유전물질에 대한 화학적 변이를 포함한다. 그러한 유전적 변형은 언급된 종 (referenced species)에 대한 이질성 (heterologous), 동질성 (homologous), 또는 이질성 및 동질성 폴리펩티드를 위한 코딩 영역 (coding region) 및 그의 기능적 단편 (functional fragments thereof)에 대한 것을 포함한다. 또한, 상기 유전적 변형은 유전자 또는 오페론의 발현을 변경시키는 비코딩 조절 영역 (non-coding regulatory regions)의 변형을 포함한다. 비코딩 영역은 5'-비코딩 서열(5'-non coding sequence) 및/또는 3'-비코딩 서열(3'-non coding sequence)을 포함한다.
상기 유전자의 파괴는 상동 재조합, 지향된 돌연변이유발 (directed mutagenesis), 또는 분자 진화 (molecular evolution)와 같은 유전적 조작법에 의해 달성될 수 있다. 세포가 복수 개의 동일 유전자, 또는 유전자의 2 이상의 파라로그 (paralogs)를 포함한 경우, 하나 이상의 유전자는 파괴될 수 있다. 예를 들면, 상기 유전적 변형은 유전자의 일부 서열을 포함하는 벡터를 세포에 형질전환하고, 세포를 배양하여 상기 서열이 세포의 내인성 유전자와 상동 재조합이 일어나도록 하여 상기 유전자를 파괴되도록 한 후, 상동 재조합이 일어난 세포를 선별 마커를 사용하여 선별함으로써 이루어질 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "유전자"는 특정 단백질을 발현하는 핵산 단편을 의미하며, 5'-비코딩 서열 (5'-non coding sequence) 및/또는 3'-비코딩 서열 (3'-non coding sequence)의 조절 서열 (regulatory sequence)을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.
본 발명에서 사용된 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 "서열 동일성 (sequence identity)"은 특정 비교 영역에서 양 서열을 최대한 일치되도록 얼라인시킨 후 서열간의 아미노산 잔기 또는 염기의 동일한 정도를 의미한다. 서열 동일성은 특정 비교 영역에서 2개의 서열을 최적으로 얼라인하여 비교함으로써 측정되는 값으로서, 비교 영역 내에서 서열의 일부는 대조 서열 (reference sequence)과 비교하여 부가, 삭제되어 있을 수 있다. 서열 동일성 백분율은 예를 들면, 비교 영역 전체에서 두 개의 최적으로 정렬된 서열을 비교하는 단계, 두 서열 모두에서 동일한 아미노산 또는 핵산이 나타나는 위치의 갯수를 결정하여 일치된 (matched) 위치의 갯수를 수득하는 단계, 상기 일치된 위치의 갯수를 비교 범위 내의 위치의 총 갯수 (즉, 범위 크기)로 나누는 단계, 및 상기 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 수득하는 단계에 의해 계산될 수 있다. 상기 서열 동일성의 퍼센트는 공지의 서열 비교 프로그램을 사용하여 결정될 수 있으며, 일례로 BLASTN(NCBI), CLC Main Workbench (CLC bio), MegAlignTM(DNASTAR Inc) 등을 들 수 있다.
여러 종의 동일하거나 유사한 기능이나 활성을 가지는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 확인하는데 있어 여러 수준의 서열 동일성을 사용할 수 있다. 예를 들어, 50%이상, 55%이상, 60%이상, 65%이상, 70%이상, 75%이상, 80%이상, 85%이상, 90%이상, 95%이상, 96%이상, 97%이상, 98%이상, 99%이상 또는 100% 등을 포함하는 서열 동일성이다.
본 명세서에 사용된 용어 "외인성 (exogenous)"은 언급된 분자 (referenced molecule) 또는 언급된 활성 (referenced activity)이 숙주 세포로 도입된 것을 의미한다. 분자는 예를 들면, 숙주 염색체 내로의 삽입에 의하는 것과 같은 코딩 핵산 (encoding nucleic acid)의 숙주 유전 물질 내로의 도입 또는 플라스미드와 같은 비염색체 유전물질로서 도입될 수 있다. 코딩 핵산의 발현과 관련하여, 상기 용어 "외인성"은 상기 코딩 핵산이 개체 내로 발현 가능한 형태로 도입된 것을 나타낸다. 생합성 활성과 관련하여, 상기 용어 "외인성"은 숙주 모세포에 도입된 활성을 나타낸다. 그 기원 (source)는 예를 들면, 숙주 모세포에 도입된 후 언급된 활성을 발현하는 동질성 (homologous) 또는 이질성 (heterologous) 코딩 핵산일 수 있다. 그러므로, 용어 "내인성 (endogenous)"은 상기 숙주 세포에 존재하는 언급된 분자 또는 활성을 나타낸다. 비슷하게, 코딩 핵산의 발현과 관련하여, 상기 용어 "내인성"은 개체 내에 포함된 코딩 핵산의 발현을 나타낸다. 용어 "이질성 (heterologous)"은 언급된 종 외의 다른 기원으로부터의 분자 또는 활성을 나타내고 용어 "동질성 (homologous)"은 숙주 모세포로부터의 분자 또는 활성을 나타낸다. 따라서, 코딩 핵산의 외인성 발현은 이질성 (heterologous) 또는 동질성 (homologous) 코딩 핵산 중 어느 하나 또는 둘 다를 이용할 수 있다.
또한, 본 명세서에서 사용된 용어 "유전적 조작 (genetic engineering)" 또는 "유전적으로 조작된 (genetically engineered)"은 세포에 대하여 하나 이상의 유전적 변형 (genetic modification)을 도입하는 행위 또는 그에 의하여 만들어진 세포를 나타낸다.
본 명세서에 사용된 용어 디옥시바이오라세인(Deoxyviolacein)은 바이오라세인(Violacein)의 공대사물질로, IUPAC 명칭은 (3E)-3-[5-(1H-indol-3-yl)-2-oxo-1H-pyrrol-3-ylidene]-1H-indol-2-one이고, 하기와 같은 구조를 갖는다.
본 명세서에 사용된 용어 유전자 클러스터(gene cluster)는 특정 물질 대사에서 서로 관련된 유전자들이 게놈 내에서 긴밀하게 연결되어 있는 유전자 군을 의미할 수 있다.
일 양상은 모세포에 비하여 vioABCE 유전자 클러스터(gene cluster)의 활성이 증가되도록 하는 유전적 변형을 포함하는 재조합 미생물을 제공한다.
vioABCE 유전자 클러스터는 디옥시바이오라세인 생산에 관여하는 유전자 클러스터일 수 있다. 상기 vioABCE 유전자 클러스터는 vioA, vioB, vioC, 및 vioE 유전자를 지칭하는 것일 수 있다. 상기 vioABCE 유전자 클러스터의 활성 증가는 vioABCE 유전자 클러스터 발현의 증가를 포함할 수 있다.
상기 재조합 미생물은 vioABCE 유전자 클러스터의 활성이 증가되도록 하는 유전적 변형을 포함하거나, 외인성 vioABCE 유전자를 포함하는 것일 수 있다.
상기 재조합 미생물은 모세포에 비하여 vioABCE 유전자 클러스터의 활성이 증가되어 있는 유전적으로 조작된 세포일 수 있다. 상기 유전적으로 조작된 세포는 디옥시바이오라세인을 생산할 수 있다. 상기 세포는 vioABCE 유전자 클러스터를 코딩하는 유전자를 포함할 수 있다.
상기 재조합 미생물은 상기 vioABCE 유전자의 카피 수 증가를 갖는 것일 수 있다. 상기 재조합 미생물은 상기 vioABCE 유전자를 코딩하는 외인성(exogenous) 유전자를 포함하는 것일 수 있다. 즉, 상기 카피 수 증가는 상기 vioABCE 유전자의 세포 외부로부터 내부로의 도입에 의한 것일 수 있다. 상기 vioABCE 유전자 클러스터는 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드 서열과 약 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 염기 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
상기 외인성 유전자는 유전자에 작동 가능하도록 연결된 외인성 프로모터에 의해 적절히 조절되는 것일 수 있다. 상기 프로모터에 관해서는 후술할 바와 같다.
또한, 상기 재조합 미생물은 상기 vioABCE 유전자 클러스터의 발현 조절 서열의 변형을 갖는 것일 수 있다. 상기 유전자의 발현 조절 서열은 상기 유전자 발현을 위한 프로모터 또는 터미네이터일 수 있다. 상기 발현 조절 서열은 유전자 발현에 영향을 줄 수 있는 모티프를 코딩하는 서열일 수 있다. 상기 모티프는 예를 들면, 이차 구조-안정화 모티프, RNA 불안정화 모티프, 스플라이스-활성화 모티프, 폴리아데닐화 모티프, 아데닌-풍부 서열 (adenine-rich sequence), 또는 엔도뉴클레아제 인식 부위일 수 있다.
상기 프로모터는 상기 vioABCE 유전자와 작동가능하게 연결된 외인성 프로모터일 수 있다. 상기 프로모터는 구성적 프로모터(constitutive promoter)일 수 있다. 상기 프로모터는 숙주 세포 유전자에 대하여 천연인 프로모터와 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 95% 이상 상동(homologous)인 것일 수 있다. 또한 상기 프로모터는 숙주 세포에 대하여 천연인 유전자에 대한 프로모터와 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 95% 이상 상동인 것일 수 있다.
상기 터미네이터는 숙주 세포 유전자에 대하여 천연인 터미네이터와 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 95% 이상 상동(homologous)인 것일 수 있다. 또한 상기 프로모터는 숙주 세포에 대하여 천연인 유전자에 대한 터미네이터와 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 95% 이상 상동인 것일 수 있다.
상기 미생물은 Escherichia 속에 속하는 것일 수 있다.
상기 미생물은 대장균(Escherichia coli)일 수 있다. 상기 대장균은 대장균 W3110, GT 1002, MG1655, 또는 BL21 종을 포함할 수 있다.
상기 vioABCE 유전자 클러스터는 박테리아, 대장균, 진균, 포유동물 또는 파충류로부터 유래한 것을 포함할 수 있다. 상기 유전자 클러스터는 대장균과 같은 Escherichia 속, Chromobacterium 속, 또는 Janthinobacterium 속에서 유래한 vioABCE 유전자일 수 있으나 이제 제한되는 것은 아니다.
상기 vioABCE 유전자 클러스터는 벡터 내 포함될 수 있다. 상기 벡터는 복제개시점, 프로모터, vioABCE 유전자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 터미네이터를 포함할 수 있다. 상기 프로모터는 상술한 바와 동일하다. 상기 터미네이터는 상술한 바와 동일하다. 상기 벡터는 서열번호 1의 서열을 갖는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 벡터는 플라스미드 BBa_J72214-BBa_J72090(Addgene Plasmid # 40782)을 포함할 수 있다. 상기 플라스미드 BBa_J72214-BBa_J72090는 BBa_J72214 벡터에 vioABCE 유전자를 도입하여 제조된 것일 수 있다. 또한 상기 플라스미드 BBa_J72214-BBa_J72090는 도 7의 구조를 가질 수 있다. vioABCE 유전자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 세포 내에서 활성 폴리뉴클레오티드를 생산하기 위해 기능하는 경우, 상기 폴리뉴클레오티드는 세포 내에서 "기능성 (functional)"인 것으로 고려된다.
상기 재조합 미생물은 단일의 vioABCE 유전자 클러스터, 또는 2 내지 10 카피수의 복수의 vioABCE 유전자 클러스터를 포함할 수 있다. 상기 재조합 미생물은 예를 들면 1 내지 8, 1 내지 7, 1 내지 6, 1 내지 5, 1 내지 4, 또는 1 내지 3 카피의 vioABCE 유전자 클러스터를 포함할 수 있다. 상기 재조합 미생물이 복수의 vioABCE 유전자 클러스터를 포함하는 경우, 각각의 폴리뉴클레오티드는 동일하거나 둘 이상의 상이한 vioABCE 유전자의 조합일 수 있다. 외인성 vioABCE 유전자의 복수의 카피는 숙주 세포의 게놈 내에 동일한 유전자좌 (locus) 또는 여러 유전자좌에 포함될 수 있고, 각 카피의 프로모터나 터미네이터가 동일하거나 상이할 수 있다.
상기 미생물은 모세포에 비해 증가된 디옥시바이오라세인 생산능을 갖는 것일 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "증가된 디옥시바이오라세인 생산능을 갖는 재조합 미생물"이란, 자연적으로 디옥시바이오라세인 생산능이 없는 야생형 미생물에 디옥시바이오라세인의 생산능이 부여된 미생물 또는 자연적으로 디옥시바이오라세인 생산능을 가지고 있는 야생형 미생물에 디옥시바이오라세인의 생산능이 증가된 미생물을 의미한다.
본 발명에서 용어 "생산능 증가"는 디옥시바이오라세인 생산의 검출가능한 증가를 나타낼 수 있다. 디옥시바이오라세인 생산 증가는 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 확인할 수 있다.
상기 재조합 미생물은 유전적 변형에 의하여 모세포에 비하여 생장 속도가 지연되지 않으므로 디옥시아비오라세인 생산의 단계에 소요되는 시간을 단축할 수 있다. 따라서, 짧은 시간 동안 고효율 및 고수율로 디옥시바이오라세인을 생산하는데 사용할 수 있다.
다른 양상은 상기한 재조합 미생물을 배양하여 디옥시바이오라세인을 생산하는 단계를 포함하는 디옥시바이오라세인을 생산하는 방법을 제공한다.
상기 “디옥시바이오라세인 생산능이 증가된 재조합 미생물”에 대해서는 상기한 바와 같다.
상기 배양은 탄소원, 예를 들면, 글루코스를 함유하는 배지에서 수행될 수 있다. 미생물 배양에 사용되는 배지는 적절한 보충물을 함유한 최소 또는 복합 배지와 같은, 숙주 세포의 성장에 적합한 임의의 통상적인 배지일 수 있다. 적합한 배지는 상업적인 판매자로부터 입수 가능하고 또는 공지된 제조법에 따라 제조될 수 있다.
상기 배지는 배양에 선택되는 산물에 따라 특정한 미생물의 요구 조건을 만족시킬 수 있는 배지일 수 있다. 상기 배지는 탄소원, 질소원, 염, 미량 원소, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 배지일 수 있다. 상기 배지는 예를 들면 MR 배지, LB 배지, HS 배지 또는 그의 조합인 것일 수 있다.
배양 조건은 미생물을 배양하기 위한 조건을 의미한다. 이러한 배양 조건은 예를 들어, 미생물이 이용하는 탄소원, 질소원 또는 산소 조건일 수 있다. 미생물이 이용할 수 있는 탄소원은 단당류, 이당류 또는 다당류가 포함할 수 있다. 상기 탄소원은 자화가능한 당으로서, 글루코스, 프럭토스, 만노스, 또는 갈락토스를 포함할 수 있다. 상기 질소원은 유기 질소 화합물, 또는 무기 질소 화합물일 수 있다. 상기 질소원은 아미노산, 아미드, 아민, 질산염, 또는 암모늄염 일 수 있다. 미생물을 배양하는 산소 조건에는 정상 산소 분압의 호기성 조건, 대기중에 0.1% 내지 10%의 산소를 포함하는 저산소 조건, 또는 산소가 없는 혐기성 조건이 있다. 대사 경로는 미생물이 실제로 이용 가능한 탄소원 및 질소원에 맞추어 수정될 수 있다.
상기 배양 조건은 선택되는 산물, 예를 들면, 디옥시바이오라세인 생산에 적합하게 적절히 조절될 수 있다. 상기 배양은 세포 증식을 위하여 호기성 또는 혐기성 조건에서 이루어질 수 있다. 상기 배양은 교반 없이 정치 배양 (static culture)하는 것일 수 있다.
상기 방법은 배양물로부터 디옥시바이오라세인을 분리하는 단계를 포함한다.
상기 분리는 예를 들면 침전된 디옥시바이오라세인에 에탄올을 첨가하여 추출함으로써 수행할 수 있다.
상기 분리하는 단계는 정제 공정을 포함할 수 있다. 정제는 당업계에서 일반적으로 사용되는 정제 공정을 선택하여 수행할 수 있다.
다른 양상은 미생물에 vioABCE 유전자 클러스터를 코딩하는 유전자를 도입하는 단계를 포함하는, 디옥시바이오라세인 생산능이 증가된 미생물을 제조하는 방법을 제공한다.
상기 유전자를 도입하는 단계는 상기 유전자를 포함하는 플라스미드를 상기 미생물에 도입하는 것일 수 있다. 상기 방법에 있어서, 상기 유전적 변형은 상기 유전자를 증폭하는 것, 유전자의 조절 서열을 조작하는 것, 또는 유전자 자체의 서열을 조작하는 것을 포함할 수 있다. 상기 유전자 증폭은 유전자의 카피 수 증가에 의한 것일 수 있다. 상기 조작은 뉴클레오티드의 삽입, 치환, 전환 또는 부가일 수 있다.
일 양상에 따른 재조합 미생물에 의하면, 디옥시바이오라세인을 고효율로 생산하는데 사용할 수 있다.
다른 양상에 따른 디옥시바이오라세인을 생산하는 방법에 의하면, 디옥시바이오라세인을 효율적으로 생산할 수 있다.
다른 양상에 따른 디옥시바이오라세인의 생산능이 증가된 미생물을 제조하는 방법에 의하면, 디옥시바이오라세인 생산능이 증가된 미생물을 효율적으로 제조할 수 있다.
일 양상에 따른 바이오라세인 생산능이 증가된 재조합 미생물을 사용하면 미생물의 생장 속도가 지연되지 않아 2차 대사산물인 디옥시바이오라세인의 생산 단계를 단축할 수 있으므로 짧은 시간 동안 고효율 및 고수율로 디옥시바이오라세인을 생산할 수 있다.
도 1은 일 구체예의 E. coli w3110 Dvio 균주를 배양한 배양기에서 생산된 미생물과 침전된 디옥시바이오라세인의 사진이다.
도 2는 일 구체예의 E. coli w3110 Dvio 균주를 24시간 동안 배양하여 얻은 1L 당 생산된 디옥시바이오라세인의 총량(g/L)을 계산한 그래프이다.
도 3은 일 구체예의 E. coli w3110 Dvio 균주의 시간에 따른 생장 곡선(OD600) 및 디옥시바이오라세인의 생산 곡선(디옥시바이오라세인(g/L)) 그래프이다.
도 4는 4 종의 재조합 대장균 균주(MG1655, W3110, BW25113, BL21)의 생장 정도를 나타낸 그래프이다(No BH: BH 플라스미드를 삽입하지 않음, BH1: BH1 플라스미드를 삽입, BH2: BH2 플라스미드를 삽입).
도 5는 4 종의 디옥시바이오라세인 생산 플라스미드를 삽입한 재조합 대장균 균주에서 디옥시바이오라세인의 생산량을 나타낸 그래프이다(No BH: BH 플라스미드를 삽입하지 않음, BH1: BH1 플라스미드를 삽입, BH2: BH2 플라스미드를 삽입).
도 6은 GPT Dvio 균주의 시간에 따른 생장 정도(OD600) 및 GPT Dvio 균주에서 디옥시바이오라세인 생산량(mg/L)을 나타낸 그래프이다.
도 7은 디옥시바이오라세인 생산 플라스미드의 구조도이다.
도 2는 일 구체예의 E. coli w3110 Dvio 균주를 24시간 동안 배양하여 얻은 1L 당 생산된 디옥시바이오라세인의 총량(g/L)을 계산한 그래프이다.
도 3은 일 구체예의 E. coli w3110 Dvio 균주의 시간에 따른 생장 곡선(OD600) 및 디옥시바이오라세인의 생산 곡선(디옥시바이오라세인(g/L)) 그래프이다.
도 4는 4 종의 재조합 대장균 균주(MG1655, W3110, BW25113, BL21)의 생장 정도를 나타낸 그래프이다(No BH: BH 플라스미드를 삽입하지 않음, BH1: BH1 플라스미드를 삽입, BH2: BH2 플라스미드를 삽입).
도 5는 4 종의 디옥시바이오라세인 생산 플라스미드를 삽입한 재조합 대장균 균주에서 디옥시바이오라세인의 생산량을 나타낸 그래프이다(No BH: BH 플라스미드를 삽입하지 않음, BH1: BH1 플라스미드를 삽입, BH2: BH2 플라스미드를 삽입).
도 6은 GPT Dvio 균주의 시간에 따른 생장 정도(OD600) 및 GPT Dvio 균주에서 디옥시바이오라세인 생산량(mg/L)을 나타낸 그래프이다.
도 7은 디옥시바이오라세인 생산 플라스미드의 구조도이다.
이하 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
1.
vioABCE
유전자 클러스터가 도입된 대장균의 제작
본 실시예에서는 야생형 대장균 균주인 E. coli W3110에 vioABCE 유전자 클러스터를 도입하여 제작한 재조합 미생물에서 디옥시바이오라세인 생산능이 증가되는지 여부를 확인하였다. 구체적인 과정은 다음과 같다.
E. coli W3110 균주(ATCC 17325)를 글리세롤 10% 용액에서 세척하여 염류를 제거한 뒤, 1800V 전기천공법을 활용하여 플라스미드 BBa_J72214-BBa_J72090(Addgene, Plasmid #40782)(서열번호 1)를 상기 균주에 삽입하였다. 삽입 후 클로람페니콜을 포함하는 배지에서 배양함으로써 수행한 스크리닝으로 vioABCE 유전자 클러스터가 삽입된 균주를 선발하였다.
상기와 같이 제작한 디옥시바이오라세인 생산능이 증가된 균주를 E. coli w3110 Dvio로 명명하였다.
실시예
2.
vioABCE
유전자 클러스터가 도입된 대장균의
디옥시바이오라세인
생산량 확인
상기 실시예 1에서 제작한 vioABCE 유전자 클러스터가 도입된 대장균의 디옥시바이오라세인 생산성을 분석하기 위하여 3L 발효기를 이용해 배양하였다. 구체적인 과정은 다음과 같다.
2.1 미생물의 준비
스트리킹으로 접종하고자 하는 미생물인 E. coli w3110 Dvio를 LB 플레이트에 배양하여 준비하였다. 배양된 상기 균주의 콜로니 1개를 채취하여 배양하였다. 250 ml 플라스크에서 LB 배양액 100 ml를 넣고 250 RPM, 37℃에서 24시간 동안 배양하여 사전배양액을 준비하였다.
2.2 배양액의 준비
펩톤 35g/L, 효모추출물 20g/L, 염화나트륨 5g/L, 트립톤 1g/L를 이용하여 배양액 0.9L를 제작하였다. 상기 배양액에 대해 수산화나트륨을 통해 7.2로 pH를 적정하였다.
상기와 같이 제작한 액체를 배양기에 넣은 후, 클로람페니콜을 100mg/L의 농도가 되도록 추가하고, 안티폼(antifoam) 204를 0.5mL 추가하여 최종 배양액을 준비하였다.
2.3 미생물의 배양
상기 2.1에서 준비한 100 ml의 LB 사전배양액을 상기 2.2에서 준비한 배양액에 넣고 37℃, 500RPM에서 1.5vvm으로 대기공급을 통해 24시간 동안 배양하였다. pH는 수산화나트륨과 염산을 통해 pH 7.2±0.4이내에서 조절되도록 하였다.
2.4 미생물의 생장 및
디옥시바이오라세인의
생산 농도 확인
E. coli w3110 Dvio를 배양 중인 배양액을 채취하고 OD600으로 측정하여 대장균의 생장 정도를 측정하였다. 구체적으로, 대장균의 생장 정도는 OD600을 기준으로 OD의 값에 따라 생장 정도를 측정하였다. OD600 흡광도가 1일때 약 8×108 CFU/ml가 존재하며 이는 산술적으로 증가하는 값을 갖는다.
추가로 1mL의 배양액을 원심분리 한 뒤 같은 부피의 에탄올을 활용하여 디옥시바이오라세인을 추출하고, 농도를 측정하였다. 구체적으로, 원심분리된 배양액을 통해 형성된 펠렛을 에탄올로 세척하였다. 2~3회 세척하는 것으로 펠렛의 색상이 희게 변하며 생산량이 많을 경우 세척 횟수를 늘려 디옥시바이오라세인을 추출하였다. 이후 세척한 디옥시바이오라세인 추출 에탄올 용액을 OD575에서 흡광도를 측정하였다. 51.056L/(g*cm)의 흡광 파장을 통해 농도를 확인하였다.
도 1은 배양기에서 생산된 미생물과 침전된 디옥시바이오라세인의 사진이다.
도 2는 24시간 동안 1L당 생산된 디옥시바이오라세인의 총량을 계산한 그래프이다(총 12회 측정하여 계산, N=12).
도 3은 E. coli w3110 Dvio의 생장 곡선 및 디옥시바이오라세인의 생산 곡선 그래프이다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명에서 제작한 재조합 미생물이 디옥시바이오라세인을 과량 생산하여 보라색을 나타내며 침전된 것을 확인하였다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 일 실시예에서 제작한 재조합 미생물이 24시간 동안 1.12 g/L의 디옥시바이오라세인을 생산하였다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 일 실시예에서 제작한 재조합 미생물은 생장 속도가 지연되지 않고 디옥시바이오라세인을 생산하였다.
따라서, 본 발명의 E. coli w3110 Dvio는 디옥시바이오라세인 생산능이 야생형 대장균에 비하여 매우 향상되었음을 확인하였다. 또한 E . coli w3110 Dvio는 생장 속도가 지연되지 않아 2차 대사산물인 디옥시바이오라세인의 생산 단계를 단축할 수 있으므로 짧은 시간 동안 고효율 및 고수율로 디옥시바이오라세인을 생산할 수 있다.
비교예
1.
E.
coli
종에 따른
디옥시바이오라세인
생산능
비교
상이한 4종의 E. coli에서 디옥시바이오라세인의 생산능을 비교하였다. 구체적인 비교 과정은 다음과 같다.
상기 실시예 1에 기재한 바와 같이, 야생형 대장균 균주 MG1655, W3110, BW25113, 및 BL21 종에 플라스미드 BBa_J72214-BBa_J72090를 삽입하여 vioABCE 유전자 클러스터가 삽입된 재조합 대장균을 제작하였다. 동시에, 박테리아 헤모글로빈을 통한 추가 산소 활용이 디옥시바이오라세인 생산량과 관계가 있는지 여부를 확인하기 위하여, 삽입된 플라스미드 BBa_J72214-BBa_J72090 이외에 추가적인 플라스미드인 박테리아 헤모글로빈 플라스미드 BH1(pUC8:16 vgb, S.C. Liu et al. 1994), 및 BH2(pTrc_VHb_His, Byung Hoon Jo et al. 2014)를 도입하여 재조합 대장균을 제작하였다. 상기 재조합 대장균 각각을 24시간 또는 48시간 동안 배양하여 미생물의 생장 정도 및 디옥시바이오라세인 생산량을 측정하고, 미생물의 생장 정도를 도 4에, 디옥시바이오라세인 생산량을 도 5에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 추가적인 플라스미드 삽입에 의해 미생물의 생장 정도가 유의적으로 변화하지 않았으므로, vioABCE 유전자 클러스터의 삽입이 대장균의 생장 정도에 유의적인 영향을 주지 않았음을 확인하였다.
또한, 도 5에 나타낸 바와 같이, 추가적인 플라스미드 삽입에 의해 디옥시바이오라세인의 생산 정도가 유의적으로 변하지 않았으므로, 박테리아 헤모글로빈을 통한 추가 산소 활용이 디옥시바이오라세인 생산량과 관계가 없음을 확인하였다.
또한, 미생물의 생장 정도와 디옥시바이오라세인 생산량을 비교한 결과, 생장 정도 대비 디옥시바이오라세인 생산능이 상기 4종의 E. coli 종 중 W3110 균주에서 가장 우수함을 확인하였다.
비교예
2. 트립토판 생산 대장균 균주에서
디옥시바이오라세인
생산능
비교
트립토판 생산 대장균 균주에서 디옥시바이오라세인 생산능을 확인하였다. 구체적인 확인 과정은 다음과 같다.
E. coli w3110 균주에서 일부 유전자를 변형하여 제조한 트립토판을 생산하는 대장균 균주인 GPT 1002에 상기 실시예 1에 기술한 바와 같이 플라스미드 BBa_J72214_BBa_J72090를 삽입하여 재조합 대장균을 제작하고, 이를 GPT Dvio로 명명하였다. GPT Dvio 균주의 생장 정도(OD600) 및 GPT Dvio 균주에서 디옥시바이오라세인 생산량(디옥시바이오라세인(mg/L))을 측정하여 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 트립토판을 과생산하는 대장균 균주에 vioABCE 유전자 클러스터를 도입한 후, 도입 전(도 2, 약 1.1g/L)보다 디옥시바이오라세인 생산량이 감소(약 0.55g/L)하였음을 확인하였다.
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productivity of deoxyviolacein and method for producing
deoxyviolacein using the same
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<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 12793
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> plasmid BBa_J72214-BBa_J72090
<400> 1
gaattcatga gatctttaag gaggtaaaaa aaatgaaaca ttcttccgat atctgcattg 60
ttggtgctgg tatttctggt ttgacgtgcg caagccatct gctggacagc ccggcatgcc 120
gtggtctgag cctgcgtatc tttgacatgc agcaagaagc cggtggccgt atccgcagca 180
aaatgctgga tggtaaggca agcattgaac tgggcgcagg tcgctactcc cctcagttgc 240
acccgcattt ccaaagcgca atgcagcact atagccaaaa gagcgaagtc tatccgttca 300
cccagttgaa gttcaaatct cacgtgcagc aaaagctgaa gcgcgccatg aatgaactgt 360
ccccgcgtct gaaagagcat ggtaaagaga gctttttgca gtttgtcagc cgttatcaag 420
gtcacgatag cgcggttggt atgatccgct ctatgggtta cgacgcactg ttcctgccgg 480
atatcagcgc agaaatggcc tacgacattg tgggtaagca cccggagatc cagagcgtga 540
cggacaacga cgcgaaccaa tggtttgcag cggaaacggg ctttgctggt ctgattcagg 600
gcatcaaggc taaggttaag gcggcaggtg cgcgttttag cctgggttat cgtctgctga 660
gcgtccgtac cgacggtgac ggctacctgc tgcaactggc aggtgacgac ggctggaaac 720
tggagcaccg tacccgccat ctgattctgg cgattccgcc gagcgcgatg gcgggtttga 780
atgttgattt tccagaagcc tggtccggtg cgcgctatgg cagcctgccg ctgtttaagg 840
gctttctgac gtacggtgag ccgtggtggt tggactacaa actggacgat caggtgctga 900
ttgttgacaa cccgctgcgc aaaatctatt tcaaaggcga taagtacctg ttcttctata 960
ccgatagcga gatggcgaat tactggcgcg gttgtgtcgc ggagggcgag gacggttacc 1020
tggagcaaat tcgcacccat ttggctagcg cactgggtat cgtccgtgaa cgtatcccgc 1080
aaccgctggc acacgttcac aagtattggg cgcacggcgt tgagttttgc cgtgattctg 1140
atattgacca cccgagcgca ctgtctcatc gcgacagcgg tatcatcgcg tgctccgatg 1200
cgtacacgga gcattgtggt tggatggagg gcggtctgct gagcgcccgt gaggcaagcc 1260
gtctgctgtt gcagcgtatc gccgcgtgat taaggaggta aaaaaaatga gcattctgga 1320
tttcccgcgt atccacttcc gtggctgggc ccgtgtcaat gcgccgaccg cgaaccgcga 1380
tccgcacggc cacatcgata tggccagcaa taccgtggcg atggcgggtg agccgttcga 1440
cctggcacgc catcctacgg agttccaccg tcacctgcgc tccctgggtc cgcgcttcgg 1500
cttggatggt cgtgctgacc cggaaggccc gttcagcctg gccgagggct acaacgctgc 1560
cggtaacaac cacttttcgt gggagagcgc aaccgttagc cacgtgcaat gggatggcgg 1620
tgaggcggat cgtggtgacg gtctggtcgg tgctcgtttg gcactgtggg gtcactacaa 1680
tgattatctg cgtaccacct tcaatcgtgc tcgttgggtc gacagcgacc cgacgcgccg 1740
tgacgctgca caaatctatg cgggccaatt caccattagc ccggctggtg ccggtccggg 1800
tacgccgtgg ctgtttacgg cagacattga tgatagccat ggtgcacgtt ggacgcgtgg 1860
cggccacatt gcagagcgtg gcggccactt cttggatgaa gagtttggtc tggcacgcct 1920
gtttcagttc tctgtgccga aagatcaccc acattttctg tttcacccgg gtccgtttga 1980
ttccgaggcc tggcgtcgtc tgcaattggc tctggaggat gacgacgttc tgggtctgac 2040
cgtgcaatat gcgttgttca atatgagcac cccgcctcag ccgaacagcc cggtttttca 2100
cgatatggtc ggtgttgtcg gtctgtggcg tcgtggtgaa ctggcgagct acccggctgg 2160
tcgtctgctg cgtccgcgtc aaccgggtct gggtgacctg accctgcgcg tcaacggtgg 2220
tcgcgttgcg ctgaatttgg cgtgtgccat tccgttcagc actcgtgccg cgcagccaag 2280
cgcaccggac cgcctgaccc cggacctggg tgccaaactg ccgctgggcg atctgctgct 2340
gcgtgatgag gacggcgcac tgttggcacg tgtgccgcag gctctgtacc aagactattg 2400
gacgaatcac ggtattgtgg acctgccgct gctgcgcgaa ccgcgtggta gcttgaccct 2460
gagcagcgaa ctggcggagt ggcgtgagca agactgggtc acccaaagcg acgcgtctaa 2520
cctgtacctg gaggcaccgg atcgccgtca cggtcgcttt ttccctgaga gcatcgcgct 2580
gcgcagctac tttcgcggtg aagcgcgtgc gcgtccggat atcccgcatc gtatcgaggg 2640
catgggcctg gtcggcgtcg aatctcgtca ggatggcgac gctgcggaat ggcgtctgac 2700
gggtctgcgt ccgggtccgg cacgcattgt tctggacgat ggtgccgagg cgatccctct 2760
gcgtgttctg cctgacgatt gggcgctgga tgacgcgacc gtcgaagaag tggattacgc 2820
ctttttgtac cgccacgtta tggcgtatta cgagctggtg tatccattca tgagcgacaa 2880
ggtgttttcc ctggctgatc gttgcaaatg tgaaacgtac gcacgtctga tgtggcagat 2940
gtgtgatccg cagaaccgca acaagtccta ttacatgccg agcacccgcg aactgtcggc 3000
accgaaagct cgtttgttct tgaagtatct ggcccacgtg gaaggccagg cacgcctgca 3060
agcacctccg ccagcgggtc cggcacgcat tgaatctaaa gcccagttgg cggcagagct 3120
gcgtaaagcc gtcgacctgg agctgtctgt gatgctgcaa tacctgtacg cggcgtatag 3180
cattccgaac tatgcacagg gccaacaacg tgttcgtgac ggtgcgtgga ccgccgagca 3240
gctgcaactg gcgtgcggta gcggtgaccg tcgccgtgat ggcggtattc gtgcagcact 3300
gctggaaatt gctcatgaag aaatgattca ttacctggtc gttaacaacc tgctgatggc 3360
cctgggcgag ccgttctacg cgggtgtccc gctgatgggc gaagcggcac gtcaggcgtt 3420
tggcctggac accgagttcg ctctggaacc gtttagcgaa agcacgctgg cacgttttgt 3480
tcgtctggaa tggccgcact ttatcccagc accgggcaaa tccatcgcgg actgctatgc 3540
cgccattcgt caggcgtttt tggatctgcc ggacttgttt ggtggcgagg caggtaagcg 3600
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taatccggtt ctggatgaga gcccgggttg ccaacgtgtc gcagacggtc gtgcgcgtgc 3900
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cgccgtgaaa ccgctgggta gcttgcgtcg cagccgcctg atgaacgcag caatcgatct 4020
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cggtcgcacg gccggtccgc cgctgccggg tccggttgac acccgtagct atgacgacta 4140
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gctggaaccg ggttggctgc cggatgcgca gatggagctg ctggatttct atcgtcgcca 4260
aatgctggac ttggcgtgcg gcaaactgag ccgcgaggcc taatgatcct taaggaggta 4320
aaaaaaatga aacgtgcgat tatcgttggt ggcggcctgg cgggtggcct gaccgcgatc 4380
tacctggcga agcgtggcta cgaagtgcac gtcgtggaga agcgtggtga tcctctgcgc 4440
gatctgagct cttacgtgga cgttgttagc agccgtgcga tcggcgtgag catgaccgtt 4500
cgtggtatca agagcgtttt ggctgcgggc attccgcgtg cagagctgga tgcgtgtggc 4560
gaaccgatcg tggcaatggc tttctccgtg ggtggtcagt atcgcatgcg cgaactgaag 4620
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ggtggcctgt tcgcgggtcg tgcggctacg atcccagatg gtagcgtcag catcgccgtt 5040
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agactggccc ttttgccgaa ttgttcctgc cacgcgatgt cctgcgccgt ctgggtgccc 6000
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caggtaaagg tccgagcacc ctgtacctgg atgcggcgag cggcactcca ctgcgcatgg 6120
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attactggat ctatcaacag gagtccaagc gagctcgata tcaaattacg ccccgccctg 6360
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agggaaatag gccaggtttt caccgtaaca cgccacatct tgcgaatata tgtgtagaaa 6660
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gttctacgcg ggtgtcccgc tgatgggcga agcggcacgt caggcgtttg gcctggacac 3960
cgagttcgct ctggaaccgt ttagcgaaag cacgctggca cgttttgttc gtctggaatg 4020
gccgcacttt atcccagcac cgggcaaatc catcgcggac tgctatgccg ccattcgtca 4080
ggcgtttttg gatctgccgg acttgtttgg tggcgaggca ggtaagcgtg gcggtgaaca 4140
ccacctgttc ctgaatgagc tgaccaaccg tgcgcatccg ggttatcaac tggaagtttt 4200
cgatcgcgac tcggcgctgt ttggtattgc atttgtgacc gatcagggcg aaggtggcgc 4260
tctggacagc ccgcactacg aacatagcca ttttcaacgt ctgcgtgaaa tgagcgcgcg 4320
tatcatggct caaagcgcac cgttcgaacc ggcgctgccg gcgttgcgta atccggttct 4380
ggatgagagc ccgggttgcc aacgtgtcgc agacggtcgt gcgcgtgcgc tgatggcatt 4440
gtaccaaggc gtttatgagc tgatgtttgc gatgatggcg cagcacttcg ccgtgaaacc 4500
gctgggtagc ttgcgtcgca gccgcctgat gaacgcagca atcgatctga tgaccggtct 4560
gttgcgtccg ctgagctgcg cgctgatgaa cctgccaagc ggcatcgccg gtcgcacggc 4620
cggtccgccg ctgccgggtc cggttgacac ccgtagctat gacgactacg cgctgggctg 4680
tcgcatgctg gcacgccgtt gcgagcgtct gctggagcag gcgagcatgc tggaaccggg 4740
ttggctgccg gatgcgcaga tggagctgct ggatttctat cgtcgccaaa tgctggactt 4800
ggcgtgcggc aaactgagcc gcgaggccta atgatcctta aggaggtaaa aaaaatgaaa 4860
cgtgcgatta tcgttggtgg cggcctggcg ggtggcctga ccgcgatcta cctggcgaag 4920
cgtggctacg aagtgcacgt cgtggagaag cgtggtgatc ctctgcgcga tctgagctct 4980
tacgtggacg ttgttagcag ccgtgcgatc ggcgtgagca tgaccgttcg tggtatcaag 5040
agcgttttgg ctgcgggcat tccgcgtgca gagctggatg cgtgtggcga accgatcgtg 5100
gcaatggctt tctccgtggg tggtcagtat cgcatgcgcg aactgaagcc gttggaggat 5160
ttccgtccgc tgagcttgaa ccgtgcggcg tttcaaaagc tgctgaacaa atacgcgaac 5220
ctggcaggcg ttcgttacta ctttgagcat aagtgcctgg atgttgacct ggatggtaag 5280
agcgtgttga ttcagggcaa agatggtcag ccgcagcgtc tgcaaggtga catgattatc 5340
ggtgcggatg gcgcccacag cgccgtccgt caggcgatgc agagcggcct gcgtcgtttc 5400
gagttccagc aaacgttctt ccgccatggc tacaaaaccc tggttttgcc ggacgcgcaa 5460
gcactgggtt accgtaaaga cacgctgtac tttttcggca tggattccgg tggcctgttc 5520
gcgggtcgtg cggctacgat cccagatggt agcgtcagca tcgccgtttg cctgccgtac 5580
tcgggtagcc cttccctgac gaccaccgac gaaccgacga tgcgtgcgtt cttcgatcgt 5640
tacttcggtg gcctgccgcg tgacgcgcgt gacgaaatgc tgcgtcagtt tctggcgaag 5700
ccgagcaacg acctgattaa cgtgcgctct agcacctttc actataaggg taatgtgctg 5760
ttgctgggtg atgctgcgca tgcgactgcg ccgttcctgg gtcagggtat gaacatggcg 5820
ctggaggacg cccgcacgtt tgtcgagctg ctggaccgcc accagggcga ccaagacaaa 5880
gcctttccgg agttcacgga gctgcgcaaa gtccaggcag acgcaatgca agacatggct 5940
cgcgccaact atgacgtttt gagctgctcg aacccgatct ttttcatgcg tgcgcgttac 6000
acgcgttaca tgcattccaa gtttccgggc ctgtatccgc cggatatggc cgagaaactg 6060
tactttacga gcgagccgta cgatcgtctg caacaaatcc agcgtaaaca gaatgtttgg 6120
tacaagattg gtcgcgtgaa ttgatgatct ttaaggaggt aaaaaaaatg gagaaccgtg 6180
agccaccact gttgccagcc cgttggagca gcgcctatgt ctcttattgg agcccgatgc 6240
tgccggatga ccagctgacc agcggctatt gctggttcga ctatgaacgt gacatctgtc 6300
gtattgacgg cctgttcaat ccgtggagcg agcgtgatac tggttatcgc ctgtggatgt 6360
cggaggttgg taatgcggcc agcggccgta cctggaaaca aaaagtcgcc tatggtcgtg 6420
agcgtaccgc cctgggtgaa cagctgtgtg agcgtccgct ggatgatgag actggccctt 6480
ttgccgaatt gttcctgcca cgcgatgtcc tgcgccgtct gggtgcccgt cacattggcc 6540
gtcgcgtggt tctgggtcgc gaagcggacg gttggcgtta ccagcgccca ggtaaaggtc 6600
cgagcaccct gtacctggat gcggcgagcg gcactccact gcgcatggtc accggcgatg 6660
aagcgtcgcg tgcaagcctg cgtgattttc cgaatgtgag cgaggcggag atcccggacg 6720
cggttttcgc ggccaagcgc taa 6743
Claims (11)
- 모세포에 비하여 vioABCE 유전자 클러스터(gene cluster)의 활성이 증가되도록 하는 유전적 변형을 포함하는 재조합 미생물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 유전적 변형은 상기 vioABCE 유전자 클러스터의 카피 수 증가, 상기 vioABCE 유전자 클러스터의 발현 조절 서열의 변형, 또는 그 조합인 것인 미생물.
- 청구항 2에 있어서, 상기 카피 수 증가는 상기 vioABCE 유전자 클러스터의 세포 외부로부터 내부로의 도입에 의한 것인 미생물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 vioABCE 유전자 클러스터는 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 것인 미생물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 미생물은 Escherichia 속에 속하는 것인 미생물.
- 청구항 5에 있어서, 상기 미생물은 대장균(Escherichia coli )인 것인 미생물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 미생물은 모세포에 비해 증가된 디옥시바이오라세인(Deoxyviolacein) 생산능을 갖는 것인 미생물.
- 청구항 1의 미생물을 배양하여 디옥시바이오라세인(Deoxyviolacein)을 생산하는 단계를 포함하는 디옥시바이오라세인을 생산하는 방법.
- 청구항 8에 있어서, 배양물로부터 디옥시바이오라세인을 회수하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
- 청구항 8에 있어서, 상기 미생물은 대장균(Escherichia coli )인 것인 방법.
- 미생물에 vioABCE 유전자 클러스터를 코딩하는 유전자를 도입하는 단계를 포함하는 디옥시바이오라세인 생산능이 증가된 미생물을 제조하는 방법.
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