CN1989255A - 降低细胞中的自发突变率 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及降低细胞或生物体中自发突变频率的方法以及制备所述细胞和生物体的方法，本发明还涉及自发突变频率降低的细胞和/或生物体，以及产生蛋白质表达系统的方法，以及通过利用自发突变频率降低的细胞来制备蛋白质以及制备发酵产物的方法。

Description

降低细胞中的自发突变率
技术领域
本发明涉及降低细胞或生物体中自发突变频率的方法以及制备所述细胞和生物体的方法，本发明还涉及自发突变频率降低的细胞和/或生物体，以及产生蛋白质表达系统的方法，以及通过利用自发突变频率降低的细胞来制备蛋白质以及制备发酵产物的方法。
背景技术
突变是生活系统的特征，提供自然选择的材料。诸如细菌之类的生物体不断经历自发突变。突变率随生物体，以及例如具体基因的大小，基因对于每次取代中碱基对的失活作用的敏感性而有很大差异。在大肠杆菌细胞中，对于4.6×106碱基对的基因组大小，每次基因组复制每个基因组的突变值为μg＝0,0025，每次复制每个碱基对的突变率为μb＝5,4×10-1。在单个基因的不同位点，诸如G-CoA-T的单个确定途径的频率甚至可变化超过2000倍，推定在局部DNA序列和DNA结构的仍然大的神秘影响力之下造成上述情况。突变的种类以及产生它们的方法多种多样并且仅仅发现了一部分。
突变在多细胞生物体中也是重要的。但是遗传物质中两种不同种类的变化必须被区分，即配子中的突变，也即种系突变，以及体细胞中的变化，即体细胞突变。种系突变传至生物体的后代，体细胞突变则不传代。但是，体细胞突变也是重要的，因为它们对于癌症的进展有作用。在种系突变的检测中，具体是在人中，以及人突变率的测定中，存在二倍性的问题。大多数前向突变是隐性的，并由此不能被检测到，除非合子获得两个拷贝的突变等位基因。回复的频率通常低得多，因为导致基因突变的途径比使现存突变回复的途径多得多。对于利用人体外细胞的体内研究，预计总人突变率与在各种原核与真核微生物中测定到的那些非常相似。
突变，诸如遗传物质中可遗传的改变，可以是宏观改变，具体在染色体水平，或者是点突变，其作为细胞异常可能不能被观察到。点突变包括碱基取代，诸如转换(transistion)和颠换(transversion)以及移码突变。基因的蛋白质编码区中的碱基取代突变的结果有赖于取代类型及其位置。所述碱基对取代可能是沉默的，即不导致蛋白序列中出现新的氨基酸残基。但是，它们可也可导致氨基酸取代。所述错义突变途径具有非常严重的后果(例如镰刀细胞贫血中)，较弱的后果或根本没有后果。最后，蛋白质编码区中的碱基取代可使得氨基酸密码子突变成终止密码子或反之。前一种形式导致成熟前缩短的蛋白质，称为无义突变。碱基取代突变也可出现在参与基因表达的调控的序列诸如在启动子或基因的5’调节区或内含子中，并可影响它们的转录，翻译或剪接。许多β-地中海贫血是这种类型非结构突变的结果，其影响球蛋白基因的表达水平。移码突变是由基因编码区中一或多个(但不是3的倍数)核苷酸的插入或缺失导致的。这导致读框改变。这种改变导致所有下游氨基酸改变，并很可能导致非功能产物，原因是其与正常蛋白质差异很大。
自发突变可作为细胞中的自然过程出现，其可与诱导的突变区分，即作为DNA与外界因子或诱变原相互作用的结果出现的突变。自发突变的重要来源是DNA复制中的错误，例如由于DNA聚合酶的错误作用。DNA聚合酶犯错误的频率将影响自发突变频率，由此观察到不同DNA聚合酶的准确性不同。影响DNA聚合酶的准确性的一个主要因素是校对型3’-5’核酸外切酶的存在，该酶将去除聚合酶插入的错误配对的碱基。3’-5’核酸外切酶的功能是防止DNA复制过程中的错误掺入以及防止突变。
自发突变的另一主要来源是称为互变异构现象的核酸碱基的结构改变。碱基能以两种可相互转变的形式存在。例如，鸟苷酸可以酮型和烯醇形式存在。碱基的各种互变异构形式有不同的配对性质。如果DNA复制过程中G是烯醇形式，DNA聚合酶将添加T与其配对而不是通常的C。因此，互变异构导致转换突变。另一种出现在细胞中的诱变过程是自发碱基降解。胞嘧啶脱氨成尿嘧啶以很高的比率在细胞中发生。脱氨可通过特定的修复过程得以修复，所述过程检测通常不存在DNA中的尿嘧啶，否则U将导致A插入其对侧并可导致DNA复制时C:G改变成T:A。第三种频繁出现的自发DNA破坏是氧自由基破坏碱基。这在细胞中作为氧化代谢的结果出现，并也通过物理因子诸如照射形成。重要的氧化产物是8-羟基鸟苷酸，其与腺苷酸错配，导致G:C颠换成T:A。另一种自发DNA损伤的类型是碱基化，即将碱性基团添加到DNA的碱基或骨架。碱基化可通过化合物诸如S-腺苷蛋氨酸与DNA的反应出现。碱基化的碱基可出现自发降解或错配。
此外，自发移码突变也可作为DNA复制过程中模板链与新合成的链之间的称为“滑移(slipped)错配”的机制出现。
自发突变在基因组的任何位点随机出现，由此大多数自发出现的突变对于受影响的生物体而言是有害的，并且出现自发突变的可能性非常低。因此，生物体发展出保护自己以防过度突变的机制。这些保护机制识别并校正作为DNA复制或自发脱氨的结果在DNA中出现的错配，并识别并去除作为DNA与外源性或内源性诱变原反应的结果而出现的可能的诱变性(mutagenic)改变。
具体在生物技术方法诸如发酵方法中，突变是非常不利的。由于突变可在发酵用细胞的基因组的任何部分中出现，它们可影响发酵产物的形成或组成。如果，例如发酵产物是蛋白质，编码该蛋白质的核酸序列的突变可导致氨基酸序列改变的蛋白质变体。即使仅仅一小部分发酵用细胞受到突变的影响，这也可能导致最终的蛋白质制品被变体污染。在蛋白质用于人的疾病治疗的情况中，这可能具有严重的不可预见的后果，例如如果蛋白质的抗原性质被改变的情况。发酵型细胞群体中突变的产生也可影响产物形成的速率，条件是所述突变例如影响上游调控途径诸如参与发酵产物形成的酶或控制所需发酵产物表达的调控单元。
此外，即使突变是仅仅影响少部分发酵型细胞群体的少见事件，如果它们赋予受影响的细胞相对于非突变的细胞选择性优势则它们可在所述群体中快速播散。具体在持续取出细胞以保证稳态的连续培养中，这可导致随着培养持续非突变细胞相对于突变细胞的持续减少。
突变在发酵中尤其非常不利的另一原因是所谓的稳定期突变的现象，其也称为适应性(adaptive)突变。当微生物群体暴露于非致死性选择诸如在发酵稳定期中出现的那些时，缓解选择压力的突变以高频率出现(Cairnsetal.，Genetics，128(1991)，695-701)。尽管原来看似只出现有用的突变，现在明确所选的突变伴随有非选择的突变，即所述过程不针对有用的基因(Foster，J.Bacteriol.，179(1997)，1550-1554)。对于适应性突变的大多数研究的焦点在于当乳糖是唯一的碳源时不能利用乳糖(Lac-)的大肠杆菌的菌株很容易回复成乳糖利用型(Lac+)。产生适应性突变的过程与在正常生长过程中产生Lac+突变的过程不同。与生长依赖性突变不同，几乎所有适应性Lac+突变有赖于重组功能，诸如大肠杆菌的RecBCD双链断裂(DSB)修复系统的同源重组功能(Cairns et at.，Genetics，128(1991)，695-701；Foster，Annu.Rev.licrobiol.47(1993)，467-504；Harris et al.，Science，264(1994)，258-260)。
因此，本发明的技术问题是提供通过细胞或生物体制备发酵产物，诸如蛋白的手段和方法，其中制备型细胞或生物体受到保护和/或针对自发出现的突变而被稳定化，具体是在发酵方法的稳定期中，并由此发酵产物具体是蛋白质的形成速率和组成得以稳定并在长期范围内得到保护。
本发明通过提供减少细胞或生物体中自发突变频率的方法解决该技术问题，所述方法通过向细胞或生物体中引入至少两个突变进行，所述两个突变的组合作用导致至少两种增强的细胞DNA修复机制。
本发明也通过提供用于制备自发突变频率降低的细胞或生物体的方法来解决技术问题，所述方法通过将至少两个突变引入生物体的至少一个细胞，并从该细胞产生有机体(如果所述有机体是多细胞有机体的话)来进行，所述两个突变的组合作用导致至少两种增强的细胞DNA修复机制。
根据本发明，细胞DNA修复机制校正自发出现的突变的能力大大提高，由此影响不同修复系统的至少两种不同的突变被导入细胞。有利地，细胞通过本发明所述引入至少两个突变导致DNA修复机制校正自发出现的突变的能力增强使得细胞中稳定遗传的突变的频率降低，并由此导致总体细胞突变率降低。
因此，根据本发明，吃惊发现通过改变一些细胞DNA修复机制，具体通过引入增强这些DNA修复系统更为有效地修复自发出现的突变的能力的具体细胞突变，野生型细胞的自发突变率可明显降低。例如，根据本发明，吃惊地发现MutS蛋白在生长期的过表达导致宿主细胞的突变力明显降低。但是，这与现有技术描述的结果不同。根据美国专利6,656,736，从酵母或其他生物体过表达野生型或突变MMR蛋白导致缺陷的错配修复系统，由此具有所述缺陷型错配修复系统的酵母细胞是高变的。此外，携带缺失dinB10以及抗增变基因等位基因dnaE911的细菌菌株显示与相应的野生型菌株相比其突变力降低10倍。参与该错配修复系统的另一种蛋白MutL的额外过表达导致突变力降低50倍。另一系统中，显示特定的移码突变的回复甚至可降低1000倍。在这种途径中，不仅生长依赖性突变率得以明显降低，适应性突变过程中的突变率即稳定期依赖性突变率也明显降低。吃惊的是观察到几种突变对于宿主细胞自发突变率的影响似乎以协同方式而非相加方式组合。
此外，根据本发明，吃惊地发现将这些突变导入不仅导致细胞DNA修复系统校正自发出现的突变的能力增强，也有利地导致细胞存活力大大增加。例如，发现MutL蛋白在发酵型细菌菌株中的过表达使得细胞存活力增加大约103。
本发明中通过引入增强细胞DNA修复机制校正自发出现的能力的几种突变来降低细胞中自发突变率以及增强细胞存活力对于用于表达和/或产生发酵产物诸如蛋白质的细胞或菌株具有尤其大的价值。通过使用所述细胞例如所得蛋白质产物的氨基酸序列，可有利地在许多代制备型细胞或生物体中保持不变。通过利用所述细胞获得的蛋白质制备物不受到由于突变产生的蛋白质变体的污染，由此在应用作为治疗剂时不导致任何问题并且不在受体身体内导致的不良效应。本发明细胞DNA修复机制的能力增强的细胞的应用对于制备重组蛋白质尤其有用。
但是，本发明的细胞DNA修复机制增强的细胞的应用不限于通过发酵细胞制备蛋白质。原则上，本发明的细胞可用于所有种类的发酵产物诸如抗生素，有机酸等。这些细胞中大大降低的自发突变率不仅使得可长期保持产物的保真性，并且保持了产物的高发酵率，这是由于宿主细胞中降低的突变率，控制产物形成率的这些因子也将保持稳定和不变。
本发明背景中，术语“导致细胞DNA修复机制的能力增强的突变”指细胞的部分基因组的任何可遗传改变，所述部分基因组编码参与至少一种具体的DNA修复机制的蛋白质和酶，或参与细胞DNA修复机制的所述组分的表达调控，其导致作为DNA复制或自发脱氨或任何其他导致自发出现的突变的天然过程的结果，细胞或生物体的DNA中的全基因组错误的识别与校正增强。“导致细胞DNA修复机制的能力增强的突变”由此提供对于给定细胞或生物体中自发出现错误的更为有效且更为准确的校正.
“导致细胞DNA修复机制的能力增强的突变”由此导致群体内稳定遗传的突变的频率降低，即导致群体的突变频率降低。本发明中“突变频率”定义为突变体的数目相对于群体的个体总数的比例。“导致细胞DNA修复机制的能力增强的突变”也导致突变率降低，其定义为给定基因在复制过程中突变以及该基因的突变被稳定遗传的可能性。此外，本发明中，导致细胞DNA修复机制的能力增强的突变也导致转运子介导的诱变减少。
由此细胞或生物体由于存在导致细胞DNA修复机制的能力增强的突变而显示非常低的自发突变率，其具体明显低于不具有所述突变的相应细胞或生物体的情况。导致细胞DNA修复机制的能力增强的突变包括，但不限于，编码参与细胞DNA修复的酶的结构基因的缺失，例如易错DNA聚合酶的结构基因的缺失；编码参与细胞DNA修复的结构基因中碱基的取代、缺失、倒位(inversion)和/或添加(其例如可导致抗增变基因表型或DNA聚合酶保真度增加)，蛋白质的过表达(其在细胞或生物体的生长、分化或增殖的特定阶段成为限制性的)，蛋白质例如易错DNA聚合酶的表达降低等。但本发明中，每个导致细胞DNA修复机制的能力增强的单独的突变也可导致第二或第三细胞DNA修复机制的能力增强。此外，每个导致细胞DNA修复机制的能力增强的单独的突变也可导致细胞存活力增加。
本发明中术语“其组合的作用导致至少两种增强的细胞DNA修复机制的两个突变”意指两个突变均影响至少两种不同的DNA，使得这些DNA修复系统更为有效和/或更为精确地修复自发出现的全基因组突变的能力与非突变的DNA修复系统相比增强。
本发明中，术语“细胞DNA修复机制”意指这样的的酶促机制或系统，通过所述机制或系统，细胞或生物体能识别并校正DNA复制中出现的和/或由于碱基改变和碱基损伤导致的基因组中的任何错误。本发明优选实施方案中，这些细胞DNA修复机制包括错配修复系统，复制后(重组)修复系统，以及SOS修复系统。导致错配修复增强的突变具体是克服参与错配修复的蛋白质之一受限的情况的那些突变。
“错配修复系统”(MMR)导致细胞中所有修复事件的99％。该系统是大肠杆菌中复制保真度的最大贡献因子，由此其也在其它DNA修复途径中通过其组分蛋白参与转录偶联的DNA修复和非常短的补片(very-short-patch)修复来起作用。MMR还通过抑制不精确的同源物之间的重组加强遗传稳定性，否则其可导致基因组重排。错配修复也通过编排转运子切割来促进遗传稳定性。大肠杆菌MMR蛋白的同源物在其他细菌、酵母、小鼠和人中起相似的作用(Modrich，Science，266(1994)，1995-1960；Radman et al.，Phil.Trans..R.Soc.London，347(1995)，97-103)。在大肠杆菌中，mutH，mutL，mutS和mutU的基因产物参与MMR。该系统由于甲基化识别新合成的链而不是亲本链。MutS的基因产物识别并结合DNA碱基错配。MutL基因产物与MutS在错配结合之后相互作用并被认为使得MutS与MutH协同作用。MutH核酸外切酶随后在未甲基化的新DNA链中产生缺口。MutU螺旋酶进入DNA的单链缺口并取代该有缺口的链。导致错配修复增强的突变具体是克服了参与错配修复的蛋白之一受到限制的情况的那些突变。
复制后修复是这样的系统，其中DNA中的损伤在以下复制循环中得以修复。由于子链中受损DNA复制，产生缺口。缺失的遗传信息通过来自亲本链的相应DNA区域通过重组添补。受损DNA的复制是也称为跨损伤合成的过程，是点突变的主要来源。最近，该方法由于参与的DNA聚合酶得到鉴定而被进一步认识(Friedberg etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97(2000)，5681-5683).
SOS反应将细胞暴露于通常干扰DNA复制的多种基因毒性和代谢压力诱导的一组细胞反应。SOS系统的调节是由LexA和RecA蛋白介导的。LexA作为大约30种不同基因包括recA和lexA的阻抑物起作用的。SOS诱导型信号是单链DNA，其与RecA结合并作为辅蛋白酶(coprotease)活化(RecA*)。RecA*促进LexA阻抑物以及一些阶段阻抑物的蛋白水解自我裂解，由此抑制SOS调节。大肠杆菌具有至少3种SOS诱导型聚合酶：聚合酶II(Pol11)，聚合酶IV(Pol IV)和聚合酶V(PoIV)。
根据本发明，至少两个突变选自导致MutL蛋白或其同源蛋白的表达上调的突变，导致MutS蛋白或其同源蛋白的表达上调的突变，编码DNA聚合酶IV或其同源蛋白的基因的抗增变基因等位基因，以及编码DNA聚合酶III的亚基或其同源蛋白的基因的抗增变基因等位基因。本发明中，“抗增变基因等位基因”指导致细胞或生物体与野生型细胞相比其中自发突变频率减少的等位基因。
本发明具体优选的实施方案中，MutL或其蛋白同源物的表达上调以及MutS或其同源物的表达上调分别通过将载体导入细胞实现，其中所述载体包含MutL基因或编码MutL的同源蛋白的基因或MutS基因或编码MutS的同源蛋白的基因，所述基因在允许各种Mut蛋白的过表达的一或多种调控单元的功能控制下。优选，所述载体是多拷贝质粒。优选，所述调控单元是可诱导型或组成型启动子。
本发明另一优选实施方案中，MutL或其蛋白同源物的表达上调以及MutS或其同源物的表达上调分别通过改变指导宿主细胞或宿主生物体的天然Mut蛋白的表达的那些调控单元来实现，使得细胞中产生的天然Mut蛋白的量高于在细胞中通常观察到的量。这表明，指导位于染色体并编码各种Mut蛋白的天然核苷酸序列转录成互补RNA序列和/或由此获得的编码RNA序列翻译成Mut蛋白的多肽链的调控元件被突变或被其他适宜同源或异源调控单元取代，使得天然Mut蛋白的产量高于在相应的野生型细胞或生物体中观察到的情况。
本发明另一实施方案中，各种Mut蛋白的过表达通过将在适宜控制单元的功能控制下的一或多个额外拷贝的各种mut基因导入宿主细胞染色体，由此其他mut基因可为天然基因或源自另一物种的异源基因。
本发明优选实施方案中，编码DNA聚合酶IV或其同源蛋白的基因的抗增变基因等位基因是dinB10，其实际上是dinB基因的缺失。dinB编码的DNA聚合酶IV(Pol IV)属于最近鉴定的Y家族或易错DNA聚合酶的UmuG/DinB核苷酸转移酶家族。该家族的代表为UmuC，DinB，Rad30和Revl亚家族(Gerlach etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，96 81999)，11922-11927)。已经显示dinB编码的大肠杆菌DNA聚合酶IV参与自发诱变以及受损DNA的复制，其称为跨损伤合成(TLS)，是点突变的主要来源。和DNA聚合酶V一样，Pol IV也作为对DNA损伤的SOS反应的一部分而被诱导。
本发明另一优选实施方案中，使用编码DNA聚合酶III亚基的基因的抗增变基因等位基因，其优选是dnaE911。DNA聚合酶III全酶(Pol III HE)负责超过90％的细胞DNA合成并且是主要复制后错配校正途径所需的。聚合酶III全酶显示可使得经过无碱基位点(abasic site)有效进行跨损伤DNA合成。大肠杆菌的dnaE基因具有DNA聚合酶III全酶的α-亚基，其提供聚合酶活性。该α-亚基由此是保真度的主要决定因子之一。根据Fijatkowskaand SchMutLper，J.Bact.，177(1995)，5979-5986，已知多种dnaE抗增变基因等位基因，其抑制错配修复缺陷的mutL菌株的升高的突变力。
根据本发明，突变dinB10和dnaE911的组合的作用使得细胞与野生型细胞或野生型生物体相比自发突变频率降低至少10倍。本发明另一优选实施方案中，dinB10，dnaE911以及过表达的MutL蛋白的组合的作用使得细胞与野生型细胞或野生型生物体相比自发突变频率降低至少50倍。
其组合作用导致细胞DNA修复机制增强和/或细胞存活力增强的至少两个突变可通过任何方法引入细胞，具体通过对给定细胞进行诱变以使得已知参与细胞DNA修复系统之一的基因突变或通过将已知的突变或等位基因导入所述细胞来进行。
存在多种不同诱变方法，包括但不限于，随机诱变，定点诱变，寡核苷酸盒式诱变，或通过易错PCR的点诱变。随机诱变，例如使得需要通过用化学物质诸如硝酸，肼处理等处理在克隆的DNA片段中产生大量随机分布的、核苷酸取代突变。易错PCR已经被开发用于将随机点突变引入克隆的基因。降低PCR反应的保真度的修饰包括降低MgCl2浓度，添加MnCl2，或改变四种dNTP的相对浓度。这些传统的诱变方法集中在具有离散且可选的表型的单个基因。常见策略是克隆基因，建立通过其可监测基因和/或其功能的测定法，在基因中诱变所选的位点，并选择功能改变的基因变体。功能改变的基因变体随后被导入并在所需的细胞类型中表达。诱变方法可重复循环以获得基因的所需功能。另一种改变基因功能的方法是通过利用多种确定的系统之一进行重组。
可以肯定的是，现存的等位基因或突变可用于本发明的目的。所述现存的等位基因或突变可通过任何已知方法引入细胞。根据本发明，将至少两种突变引入细胞可受到包括但不限于转化，偶联，转导，性导，感染和/或电穿孔的任何已知适宜方法来实现。
本发明中，术语“转化”意指细胞从环境中吸收分离的、优选纯化的核酸分子，例如微生物细胞。“偶联”意指质粒介导的通过细胞-细胞接触进行的细菌质粒从一个细菌细胞向另一细菌细胞中的转移。涉及的转移装置通常由质粒或偶联转座子编码。所述质粒的实例是偶联质粒或辅助质粒。偶联是在系统发生上不同的原核生物的组之间以及原核生物与真核生物之间的遗传交换的主要途径之一。“转导”意指核酸分子通过噬菌体从一个细菌细胞转移到另一细菌细胞中，包括从一个细胞释放噬菌体以及随后感染到另一细胞。有两种类型的转导。专门的(specialized)转导可在温和噬菌体的溶原性生命周期中出现，由此细菌的遗传物质可取代噬菌体的部分基因组。细菌DNA的该片段作为噬菌体基因组的一部分可通过噬菌体转移到另一受体细胞中。在一般的转导情况中，裂解性噬菌体的整个基因组可被细菌DNA取代。“电穿孔”是细胞与核酸分子混合，然后短时间暴露于高电压脉冲的过程。宿主细胞的细胞膜由此可通透，允许外来核酸进入宿主细胞。
本发明用于减少自发突变率的细胞的方法以及本发明用于产生自发突变率降低的细胞或生物体的方法中所用的细胞可以是任何原核或真核细胞。
术语“真核细胞”和“真核宿主细胞”包括任何具有膜结合的细胞核以及细胞器以及在染色体中排列的遗传物质的细胞，所述遗传物质中DNA与组蛋白结合。细胞骨架是真核细胞的另一独特特征，其是蛋白丝的网络，主要是激动蛋白和微管蛋白，其固定于细胞膜并包绕(criss-cross)在细胞的外周。“真核生物”包括原生生物(Protista)，真菌，植物和动物界的那些。真核生物可以使单细胞生物体诸如原生生物(protest)，例如草履虫(paramecium)和变形虫(amoebae)，或多细胞生物体诸如各种真菌、动物和植物。本发明优选实施方案中，降低自发突变率的方法中，使用动物细胞、植物细胞或真菌细胞。
术语“原核细胞”和“原核宿主细胞”包括作为环状结构任何其中基因组游离存在细胞质中的细胞，即这样的细胞，其中基因组周围没有核膜包围。原核细胞的特征还在于其不依赖于氧，并且其核糖体小于真核细胞的核糖体。原核细胞包括古细菌和真细菌。根据细胞壁的组成，真细菌可分成革兰氏阳性细菌，革兰氏阴性细菌和蓝细菌。本发明减少自发突变率以及产生相应生物体的方法的优选实施方案中，所用原核细胞是古细菌或真细菌的细胞，具体优选所述原核细胞是革兰氏阴性细菌，革兰氏阳性细菌或蓝细菌。
本发明还涉及自发突变频率降低和/或细胞存活率升高的细胞，其可通过本发明用于降低细胞或生物体中的自发突变频率的方法或通过本发明制备自发突变频率降低的细胞或生物体的方法来获得，其中所述细胞包含至少两个突变，其组合的作用导致至少两种细胞DNA修复机制增强。本发明优选实施方案中，所述细胞是细菌细胞，例如革兰氏阴性细菌诸如大肠杆菌或革兰氏阳性细菌诸如枯草芽孢杆菌，真菌细胞，植物细胞或动物细胞诸如昆虫细胞或哺乳动物细胞。
本发明具体优选的实施方案中，所述细菌是大肠杆菌MG1655dinB10，其含有质粒pmutL，大肠杆菌MG1655dinB10mutL::tet，其含有质粒pmutL，大肠杆菌MG1655dnaE zae::cm，其含有质粒pmutL，大肠杆菌MG1655 dnaEzae::cm mutL::tet，其含有质粒pmutL，大肠杆菌MG1655dinB10dnaE zae::cm，大肠杆菌MG1655dinB10dnaE zae::cm mutL::tet，大肠杆菌MG1655dinB10dnaE zae::cm，其含有质粒pmutL或大肠杆菌MG1655dinB10dnaE zae::cm mutL::tet，其含有质粒pmutL。
本发明还涉及自发突变率降低和/或细胞存活力升高的细胞在产生自发突变率降低的生物体中的用途，本发明的细胞作为宿主细胞表达蛋白质的用途，本发明的细胞作为发酵型生物体制备发酵产物的用途，本发明的细胞作为模型系统研究候选药物效应的用途，本发明细胞作为模型系统研究人、动物或植物疾病的用途，本发明细胞在产生具体是育种或培养转基因生物体中的用途。
本领域熟练技术人员已知多种从单个细胞产生完整多细胞生物体具体是植物或动物的方法。产生自本发明细胞的多细胞生物体的特征同样是总体降低的自发突变率。
本发明还涉及自发突变频率降低的生物体，其可通过本发明用于减少细胞或生物体中的自发突变频率的方法获得，或通过制备自发突变频率降低的细胞或生物体获得，其中所述生物体的细胞包含两个突变，其组合的作用导致至少两种增强的细胞DNA修复机制和/或增强的细胞存活力。本发明优选实施方案中，所述多细胞生物体是真菌，诸如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisia)或黑曲霉(Aspergillus nidulans)，植物具体是具有农业用途的植物诸如玉蜀黍(Zea mays)或动物，具体是哺乳动物，例如可用作模型系统来研究给定疾病或药物候选物对给定疾病的治病性治疗效果的哺乳动物。
本发明还涉及本发明生物体作为宿主表达和/或制备蛋白质诸如具有经济、医疗或农业重要性的蛋白质的用途，本发明生物体用于育种或培养转基因生物体的用途，本发明生物体作为模型系统研究疾病的用途，以及本发明生物体作为模型系统研究候选药物的效果的用途。
本发明的技术问题也通过提供产生蛋白质表达系统的方法来解决，所述蛋白质的氨基酸序列针对自发出现的突变而被稳定化，该方法包括：
a)在允许所述蛋白的诱导型或组成型表达的一或多种调控单元的功能控制下，将编码蛋白质的核酸序列插入宿主细胞基因组，该宿主细胞基因组中含有至少两个突变，其组合的作用导致至少两种细胞DNA修复机制修复自发出现的突变的能力增强，或
b)在允许所述蛋白的诱导型或组成型表达的一或多种调控单元的功能控制下，将编码所述蛋白的核酸序列插入载体并将所述载体转移到宿主细胞中，该宿主细胞含有至少两个突变，其组合的作用导致至少两种细胞DNA修复机制修复自发出现的突变的能力增强，和
c)在适宜培养基中培养和/或维持所述宿主细胞。
本发明产生蛋白质表达系统的方法具体涉及产生宿主细胞，在其中表达蛋白质并且其特征是自发突变率非常低，具体低于其他已知宿主细胞中的情况。本发明的方法产生的表达系统由此保证编码给定蛋白的核苷酸序列以及该蛋白的氨基酸序列被突变改变的可能性大大降低。本发明方法提供并基于本发明自发突变率降低且细胞生存力增加的宿主细胞的表达系统由此可用于表达和产生其保真性(integrity)长期稳定的蛋白质。本发明的表达系统尤其可用于这样的蛋白质，其将用于治疗目的且其中任何对氨基酸序列的改变例如导致蛋白质生物活性改变或蛋白质抗原性质改变的那些对于蛋白质的治疗益处可能有不良影响。本发明产生表达系统的方法由此可用于防止待产生蛋白质制备物中即使很少的污染，所述污染由突变的异常蛋白质产生。优选，本发明方法提供并基于低自发突变率的宿主细胞的表达系统可用于长期保持编码具体蛋白质的核苷酸序列，以避免通过测序常规检查以确定核苷酸序列是否改变的需要。
本发明中“表达系统”意指允许给定蛋白质有效表达的细胞系统，即在细胞中大量产生蛋白。具体的，“表达系统”涉及这样的细胞环境，其使得编码所需蛋白质的核苷酸序列转录成互补RNA序列，RNA序列的剪接以去除非编码序列部分以及由此获得的编码RNA序列部分的翻译成蛋白的多肽链。“表达系统”也涉及使得翻译后加工步骤诸如蛋白质糖基化或从蛋白质去除存在的前导序列成为可能的细胞环境。“产生表达系统”由此意指，编码所需蛋白的核苷酸序列需与控制并指导编码的基因产物在给定细胞环境中的表达的适宜调控单元相连，并且适宜宿主细胞必须被提供，其中所用调控单元将起作用使得蛋白质得以最佳表达。
根据本发明，用于蛋白质表达系统的宿主细胞中降低的自发突变率和增强的存活力通过利用至少两个突变获得，其组合的作用导致任何存在宿主细胞中的核酸的至少两种细胞DNA修复机制修复自发出现的突变的能力增强。具体的，所述至少两个突变增强错配修复系统的能力，校对功能和、和SOS修复系统修复自发出现的突变的能力。本发明优选实施方案中，这些突变选自导致MutL蛋白或其同源蛋白的上调的突变，导致MutS蛋白的或其同源蛋白的表达上调的突变，编码DNA聚合酶IV或其同源蛋白的基因的抗增变基因等位基因，以及编码DNA聚合酶III的亚基或其同源蛋白的基因的抗增变基因等位基因。
本发明实施方案中，MutL或其同源蛋白的表达的上调或MutS或其同源蛋白的表达的上调分别可通过在允许与相应野生型宿主细胞相比各种Mut蛋白的过表达的一或多种调控单元的功能控制下，将载体导入宿主细胞实现，其中所述载体包含MutL基因或编码MutL的同源蛋白的基因或MutS基因或编码MutS的同源蛋白的基因。优选，用于MutL或MutS蛋白的过表达的载体是多拷贝质粒，其包含在一或多个调控单元的功能控制下的各种mut基因。本发明的一个优选实施方案中，控制各种mut基因的过表达的调控单元是可诱导型或组成型启动子。
本发明另一实施方案中，MutL或其同源蛋白的表达的上调或MutS或其同源蛋白的表达的上调分别可通过将各种mut基因的一或多个另外的拷贝导入细胞染色体或对指导位于天然染色体的mut基因的转录的控制单元的一或多个突变来实现，使得细胞与野生型细胞相比产生更多的各种mut蛋白。
本发明优选实施方案中，编码DNA聚合酶IV的基因的抗增变基因等位基因是dinB10。另一优选实施方案中，编码DNA聚合酶III的基因的抗增变基因等位基因是dnaE911。
根据本发明，产生的表达系统可用于表达任何蛋白。本发明中，“蛋白”是包含至少两个被酰胺键连接的氨基酸的分子。因此，本发明术语“蛋白质”也包含肽，例如寡肽，多肽或天然存在的蛋白质的一部分诸如结构域。待表达蛋白质的氨基酸序列可为天然存在蛋白质的氨基酸序列，即可具有野生型序列。当然，将由表达系统表达的蛋白质可具有与野生型蛋白质相比改变的氨基酸序列，例如氨基酸组成不同和/或长度不同。与野生型蛋白相比，待表达的蛋白质因此可在一或多个氨基酸位置上具有不同的氨基酸残基。与野生型蛋白质相比，待表达的蛋白质可为截短或延长的。此外，待表达的蛋白质可具有与相应野生型蛋白质不同的性质。这些不同的性质可涉及改变的热稳定性，不同的底物特异性，不同的活性，改变的或新的催化位点等，但不限于此。待表达的蛋白质也可为包含两个或多个单独的多肽或还包含第二多肽的一或多个结构域的融合蛋白。蛋白质的所述改变或突变可通过如本领域已知那样适当操作编码所述蛋白的核苷酸序列然后将该蛋白质编码核苷酸序列插入自发突变率降低的宿主细胞或随后被导入宿主细胞的载体来进行。本发明的优选实施方案中，待表达的蛋白质是重组蛋白，即通过遗传改造方法和/或DNA重组技术改变的蛋白质。
本发明的优选实施方案中，待表达的蛋白质可以是酶，其可用于工业着制备天然或非天然化合物。酶或通过酶的辅助制备的化合物可用于制备药物，化妆品，食品等。待表达的蛋白质也可为可治疗性应用于人和动物健康领域的物质。医药重要的蛋白质的重要种类例如包括细胞因子和生长因子。
根据本发明的方法，在一或多个调控单元的功能控制下，编码蛋白质的核酸序列被插入基因组或载体。控制并指导基因和基因产物表达的调控单元分别包括但不限于，启动子，核糖体结合位点，增强子，沉默子和/或3’-转录终止子。调控单元也可包含前导或信号序列，其指导蛋白质表达进入宿主细胞的给定隔室或到细胞以外。所述调控单元的使用有赖于所用宿主细胞的类型。可用于给定原核或真核细胞的调控单元是已知的(见例如Sambrook etaL，Molecular cloning：A Laboratory Handbook，second edition(1989)，-Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY，USA)。
本发明优选实施方案中，编码蛋白质的核苷酸序列被克隆入载体。优选质粒，噬菌体，病毒或粘粒被用作载体。本领域技术人员也已知大量适于真核或原核宿主细胞的适宜载体，其用于将蛋白质编码型核苷酸序列引入给定宿主细胞。
此外，本领域技术人员知道多种用于克隆蛋白质编码型核苷酸序列使其功能上连接于调控单元的方法，以及将核苷酸序列引入宿主细胞的方法(见例如Sambrook et al.，1989)。
本发明另一方面涉及制备蛋白质的方法，其中所述蛋白质的氨基酸序列针对自发出现的突变而被稳定化，包括：
a)在允许所述蛋白的诱导型或组成型表达的一或多种调控单元的功能控制下，将编码蛋白质的核酸序列插入宿主细胞基因组，该宿主细胞基因组中含有至少两个突变，其组合作用导致至少两种细胞DNA修复系统修复自发出现的突变的能力增强，或
b)在允许所述蛋白的诱导型或组成型表达的一或多种调控单元的功能控制下，将编码所述蛋白的核酸插入载体，并将所述载体转移到宿主细胞中，该宿主细胞含有至少两个突变，其组合作用导致至少两种细胞DNA修复系统修复自发出现的突变的能力增强，和
c)在允许所述蛋白质表达的条件下于适宜培养基中培养所述宿主细胞，和
d)分离表达的蛋白质。
根据编码蛋白质的核酸序列是否在功能上连接于前导或信号序列，表达的蛋白质被转运到具体的细胞器，具体的细胞隔室，细胞外间隙以及进入培养细胞的培养基。因此，所述蛋白质可聚集在细胞内或分泌到细胞外。本发明制备蛋白质的方法的优选实施方案中，所述蛋白质由此分离自培养基。本发明制备蛋白质的另一优选实施方案中，所述蛋白质提取自宿主细胞，例如提取自具体的细胞器。此外，本领域技术人员了解多种用于从细胞、细胞器或培养基分离蛋白质的方案。
根据本发明，任何真核或原核细胞可用作表达或产生蛋白质的宿主细胞。具体优选的实例包括真菌细胞，动物细胞，植物细胞，古细菌，蓝细菌，革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌。
本发明还涉及可通过本发明制备蛋白质的方法获得的蛋白质。
本发明另一方面涉及通过在培养基中培养产生发酵产物的细胞和/或至少一种参与发酵产物形成的酶制备发酵产物的方法，其中细胞基因组相对于自发出现的序列改变稳定化，所述序列改变由至少两种突变造成，所述突变的组合的作用导致至少两种细胞DNA修复机制修复自发出现的突变的能力增强。
因此，本发明的方法涉及利用细胞实现发酵目的，即用于产生发酵产物，由此细胞基因组相对于自发出现的序列改变稳定化并且因此显示非常低的自发突变率。此外，所用细胞的细胞存活力增强。通过利用自发突变率降低的细胞，本发明的方法保证编码给定蛋白的核苷酸序列和该蛋白质的氨基酸序列将被突变改变的可能性大大降低。由于这些细胞显示大大增强的细胞存活力，这些细胞的使用进一步保证发酵过程中不出现干扰并获得高产率的发酵产物。
本发明术语“发酵”包括用于制备规定产物的任何方法，其是微生物、真菌细胞、植物细胞或动物细胞的无氧或有氧代谢的结果或可通过使用来自这些细胞并可被分离和/或纯化和/或固定的酶进行。“发酵”包括微生物、植物、真菌和/或动物细胞的一或多种酶作用导致的有机底物的所有酶-化学改变。所需的发酵产物可在细胞本身内制备，例如由于蛋白质的表达或作为细胞代谢的结果，由此发酵产物可在细胞内累积或可被转运出细胞进入其环境中，或细胞产生一或多种酶，其一旦分泌到细胞外就催化培养基中存在的底物转化成所需的发酵产物。如果发酵产物是核酸或核酸编码的蛋白质，本发明的方法可用于防止突变对发酵产物的即使非常小的污染，并由此保证发酵产物的长期保真。如果发酵产物的产生是由于细胞产生的一或多种酶的作用，本发明的方法可用于保持各种酶的保真性并保持导致发酵产物生成的那些代谢途径的特异性和有效性。
本发明用于产生发酵产物的方法也可用于保持基因群和/或所述基因群编码的基因产物的保真性，所述产物参与某种途径，并由此保持该途径的特异性和有效性。所述基因群的实例包括，但不限于，多聚乙酰(polyketide)合酶(PKS)群。多聚乙酰代谢物是大的天然产物组，其由细菌诸如放线菌(actinomyces)和粘杆菌(myxobacteria)以及具有多种结构和生物活性的真菌产生。复杂的多聚乙酰由多功能PKS产生，其与类似动物中的长链脂肪酸合成的机制有关。对Saccharopolyspora erythraea中红霉素PKS的研究揭示模块组成。复杂的多聚乙酰合成遵循逐步反应机制，其中PKS内的每个模块具有3到6个酶结构域的串，其以接近的线性顺序(linear order)催化反应。
根据本发明，用于发酵目的的细胞的自发突变率降低和细胞存活力升高通过至少两个突变获得，其组合的作用导致至少两种细胞DNA修复机制修复细胞中存在的任何核酸中自发出现的突变的能力增强。具体的，所述至少两个突变增强错配修复系统、校对功能和/或SOS修复系统修复细胞的自发出现的突变的能力。本发明优选实施方案中，这些突变选自导致MutL蛋白或其同源蛋白的上调的突变，导致MutS蛋白的或其同源蛋白的表达上调的突变，编码DNA聚合酶IV或其同源蛋白的基因的抗增变基因等位基因，以及编码DNA聚合酶III的亚基或其同源蛋白的基因的抗增变基因等位基因。
本发明实施方案中，MutL或其同源蛋白的表达的上调或MutS或其同源蛋白的表达的上调分别可通过在允许与相应野生型宿主细胞相比各种Mut蛋白的过表达的一或多种调控单元的功能控制下，将载体导入宿主细胞实现，其中所述载体包含MutL基因或编码MutL的同源蛋白的基因或MutS基因或编码MutS的同源蛋白的基因。优选，用于MutL或MutS蛋白的过表达的载体是多拷贝质粒，其包含在一或多个调控单元的功能控制下的各种mut基因。本发明的一个优选实施方案中，控制各种mut基因的过表达的调控单元是可诱导型或组成型启动子。
本发明另一实施方案中，MutL或其同源蛋白的表达的上调或MutS或其同源蛋白的表达的上调分别可通过将各种mut基因的一或多个另外的拷贝导入细胞染色体或指导位于天然染色体的mut基因的转录的调控单元的一或多个突变来实现，使得细胞与野生型细胞相比产生更多的各种mut蛋白。
本发明优选实施方案中，编码DNA聚合酶IV的基因的抗增变基因等位基因是dinB10。另一优选实施方案中，编码DNA聚合酶III的基因的抗增变基因等位基因是dnaE911。
根据本发明，突变dinB10和dnaE911的组合的作用使得细胞与野生型细胞或野生型生物体相比的自发突变频率降低至少10倍。本发明另一优选实施方案中，dinB10，cKnaFD11以及过表达的MutL蛋白的组合的作用使得细胞与野生型细胞或野生型生物体相比的自发突变频率降低至少50倍。
本发明方法获得的发酵产物可为细胞的一级代谢物或二级代谢物。一级代谢物是由生活细胞合成的并且是所述细胞形成细胞结构和维持代谢过程所必需的那些物质。与一级代谢物相反，二级代谢物是这样的化合物，具体是低分子化合物，由细胞合成，并且不是保持细胞功能所必需的。通常，在具体环境中，二级代谢物可赋予细胞或生物体选择性优势。本发明方法所得的发酵产物可为常规意义上的发酵产物，即微生物仅利用氧对碳水化合物的酶促降解，诸如醇发酵、乳酸发酵、丙酸发酵等的产物。
发酵产物的实例包括但不限于，核酸，核苷，核苷酸，蛋白质，氨基酸，有机酸，乙醇，碳水化合物，维生素，抗生素和生物碱。
本发明的优选实施方案中发酵产物是核酸，具体可用于治疗，例如可用于疫苗的核酸。
本发明中“核酸”是包含至少两个由磷酸二酯键连接的核苷酸。术语“核酸”由此还意指寡核苷酸。核酸可为DNA或RNA。核酸可为单链或双链的。
本发明的优选实施方案中发酵产物是蛋白质，具体是酶或具有治疗用途的蛋白质或其部分诸如结构域。酶的优选实例包括但不限于，蛋白酶，淀粉酶，果胶酶和葡萄糖异构酶。具有治疗用途的蛋白质的优选实例包括但不限于细胞因子诸如干扰素，白介素，生长因子，凝血因子，抗体等。
有机酸的优选实例包括但不限于柠檬酸，乳酸或醋酸。醇的优选实例包括但不限于乙醇，丙醇和丁醇。碳水化合物的优选实例包括但不限于糖类诸如蔗糖，麦芽糖或palatinose。或糖醇类诸如木糖醇(xylitol)或麦芽糖醇(maltitol)。维生素的优选实例包括但不限于维生素B12或核黄素。抗生素的优选实例包括但不限于青霉素，头胞霉素，链霉素，多聚乙酰，抗生素诸如红霉素等。
发酵产物可分离自发酵细胞或用于培养的培养基。
因此，本发明还涉及可通过本发明用于制备发酵产物的方法获得的发酵产物。
本发明用于产生发酵产物的方法中可使用真核细胞和原核细胞。本发明用于制备发酵产物的方法的优选实施方案中所用真核细胞是真菌细胞，动物细胞或植物细胞，用于本发明制备发酵产物的方法的原核细胞是兰细菌，古细菌，革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌。
当然可在本发明的方法中使用任何细胞来产生发酵过程其与相应的野生细胞相比优选大大降低自发突变率。具体优选使用这样的细胞或生物体其自发突变频率已经通过本发明降低自发突变率的方法或通过本发明产生自发突变频率降低的细胞或生物体的方法得以降低。
本发明方法的优选实施方案中细胞在适宜液体培养基中培养。本领域技术人员已知多种液体培养基，其中可培养细胞例如原核细胞或真核细胞以产生发酵产物。根据本发明，细胞可培养在连续培养或分批培养中。分批培养是这样培养，其从接种有细胞的液体培养基开始，在培养过程中，培养基不是连续交换的，并且可选仅引入诸如氧气的气体。分批培养可以是补料培养，以防止产物形成的代谢抑制作用。在补料分批培养的情况中，基质诸如给定的糖将通过递送额外量的该基质得以补偿。连续培养是这样培养，其中所述培养物仅用细胞接种一次。然后根据细胞质量的增加或产物的聚集利用新鲜培养基连续置换消耗的培养基，由此发酵产物和消耗的培养基以及可选细胞同时从培养基移除。连续培养可在发酵罐中进行。
本发明优选实施方案中细胞可以固定的形式存在培养物中。本发明方法的另一实施方案中，细胞培养在固体或半固体培养基中。
一个优选实施方案中本发明涉及生物体，具体是原核生物体最优选大肠杆菌中，其选自下组：
大肠杆菌MGl655dinB10，其含有质粒pmutL(DSM17016)，
大肠杆菌MG1655dinB10mutL::tet，其含有质粒pmutL(DSM17017)，
大肠杆菌MG1655dnaE zae::cm，其含有质粒pmutL(DSM17018)，
大肠杆菌MG1655dnaE zae::cm mutL::tet，其含有质粒pmutL(DSM17019)，
大肠杆菌MG1655dinB10dnaEzae::cm(DSM17015)，
大肠杆菌MG1655dinB10dnaEzae::cm mutL::tet(DSM17014)，
大肠杆菌MG1655dinB10dnaE zae::cm，其含有质粒pmutL(DSM17020)以及
大肠杆菌MG1655dinB10dnaE zae::cm mutL::tet，其含有质粒pmutL(DSM17021)。
上述鉴定的微生物已经根据布达佩斯条约于2005年1月3日保藏在DSMZ(Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH inBraunschweig，Germany)，保藏号如上文所示。
本发明通过以下序列，附图和实施例举例说明。
图1显示质粒pmutL的物理结构，其基本上与质粒pmutS的结构相同。
图2是野生型，dinB10，dnaE911，dinB10dnaE911，mutL-，mutL-dinB10，mutL-dnaE911和mutL-dinB10dnaE911菌株中立福平抗性的自发突变频率值。如图所示，突变受到MutL表达的强烈抑制。数据显示为SMF值。质粒pmutL是质粒pTrcHis2/lacZ的mutL+衍生物。选择野生型菌株MG1655(wt)用于整个遗传操作。显示相关基因型。将柱分成一式三份，其中每一份显示相同的基因型并由a)第一柱：细菌菌株，b)携带质粒pTrcHis2/lacZ的相应细菌菌株，和c)携带质粒pmutL的相应细菌菌株组成。
图3是野生型，dinB10，dnaE911，dinB10dnaE911，mutS-，mutS-dinB10，mutS-dnaE911和mutS-dinB10dnaE91菌株中立福平抗性的自发突变频率值。该图显示在mutS-背景中，dinB10，dnaE911和dinB10dna911对突变力的抑制。数据显示为SMF值。显示相关基因型。
图4显示质粒pdapAIF(A)和质粒pSU40dapA(B)的物理结构。
图5显示产生质粒pSU40mutL的策略。
图6是菌株Top10(野生型；dapA+)，MG1655dinB10dapA::kn(dapA-)，AT997(dapA15，dapA-)，AT997pdapAIF pTrc(dapA+)，AT997 pdapAIF pmutL(dapA+)，AT997 pdapA+1 pTrc(dapA)，AT997 pdapA+1 pmutL(dapA-)，MG 1655dinB10dapA::kn pdapA15 pSU40(dapA)，MG1655dinB10dapA::kn pdapA15pSU40mutL(dapA-)中dapA点突变的回复的图示。该图显示mutL的表达抑制突变力。突变值表示为赋予DAP抗性除以存活细胞总数。质粒pmutL是质粒pTrcHis2/lacZ或pSU40的mutL+衍生物。野生型菌株MG1655(wt)被选用于整个遗传操作。显示相关基因型。将柱分成一式三份，研究三分菌株对。每份菌株对由a)第一柱：细菌菌株，b)携带mutL+衍生物的细菌菌株组成。所用所有细菌菌株均表达染色体野生型MutL。
图7显示pXX7的衍生物。
A)将氯霉素盒子克隆入pXX7，由此获得质粒pXX7cm。通过利用EcoRI和NcoI(预期的片段：1677 bps和3292 bps)通过限制消化分析所得克隆的9个。所有受试克隆显示正确的迁移模式。
B)将沉默tetA基因克隆入质粒pXX7，由此获得质粒pXX7tet。通过利用EcoRI(预期片段：4141 bp和3113 bp)通过限制消化分析所得克隆中的24个。所有受试克隆之一显示正确的迁移模式。
图8显示菌株JM83 pXX7，JM83 pXX7 pTrc和JM83 pXX7 pmutL的立福平抗性的自发突变频率。质粒pmutL是质粒pTrc的mutL+衍生物。SMF值是立福平抗性细胞相对于总存活细胞数的值。野生型菌株JM83表达染色体野生型MutL。
图9显示菌株JM83 pXX7，JM83 pXX7 pTrc和JM83 pXX7 pmutL的磷霉素抗性的自发突变频率的值。质粒pmutL是质粒pTrc的mutL+衍生物。SMF值是磷霉素抗性细胞相对于总存活细胞数的值。野生型菌株JM83表达染色体野生型MutL。
图10显示由于菌株JM83 pXX7cm，JM83 pXX7cm pTrc和JM83 pXX7cmpmutL的氯霉素抗性报道基因中的自发突变频率产生的cmR集落数。质粒pXX7cm是pXX7的cm+衍生物。质粒pmutL是质粒pTrc的mutL+衍生物。显示导入氯霉素敏感性的突变数除以总存活细胞数的值。对照菌株JM83pXX7，JM83pXX7 pTrc和JM83pXX7pmutL显示预期的氯霉素敏感性(不携带氯霉素抗性基因)。
图11显示由于菌株JM83 pXX7tet，JM83 pXX7tet pTrc和JM83 pXX7tetpmutL的沉默tetA报道基因中的自发突变频率产生的tetR集落数。质粒pX)C7tet是携带沉默tetA的pXX7衍生物质粒pmutL是质粒pTrc的mutL+衍生物。所示的值是导入的四环素抗性的突变相对于总存活细胞数的值。对照菌株JM83 pXX7，JM83 pXX7 pTrc和JM83 pXX7 pmutL显示预期的四环素敏感性(不携带四环素抗性基因)。对于两种菌株JM83 pXX7和JM83pXX7tet，突变力值是0.43或0,39(Δ1.1)。MutL的表达使得突变力降低到0.25(Δ1.72)。
图12显示“发酵条件”中改良的制备菌株JM83 pXX7cm的突变力。显示G-CSF受到抑制(A)或被表达(B)时，细胞的氯霉素抗性的频率。在每个受试情况中，MutL由染色体表达。对照菌株JM83pXX7，JM83pXX7pTrc和JM83 pXX7pTrc pmutL在情况(A)和(B)中均显示预期的氯霉素敏感性。
图13显示“发酵条件”中改良的制备菌株JM83 pXX7tet的突变力。显示G-CSF受到抑制(A)或被表达(B)时，细胞的氯霉素抗性的频率。在每个受试情况中，MutL自染色体表达。
SEQ ID No.1和2分别显示引物MutLNcoIhin和MutLXholher的序列，其用于扩增编码MutL蛋白的DNA片段。
SEQ ID No.3和4分别显示引物MutSBamHIhin和MutSXholher，的序列，其用于扩增编码MutS蛋白的DNA片段。
SEQ ID No.5-SEQID No.10分别显示引物dapABamHIIF，dapABamHI+1，dapABamHI+2，dapAXhoI，dapAEcoRIhin和dapAHindIIIher的序列，其用于扩增编码DapA的DNA片段。
SEQ ID No.11和12分别显示引物cmBbvCI和cmAhdIher的序列，其用于扩增编码氯霉素抗性的DNA片段。
实施例
实施例1
测定不同大肠杆菌菌株中立福平抗性的自发突变频率(SMF)
大肠杆菌的细胞通常对抗生素立福平敏感；即它们不能在含有该抗生素的培养基上生长。但是，赋予立福平抗性的突变以低频率天然出现在大肠杆菌的基因组中。因此，如果将大量细胞(108)在含有立福平的培养基上铺板，一些集落将生长，而大多数细胞将被抗生素杀死。这是可能的，因为赋予立福平抗性的突变可自发出现的细胞的基因组中。所述突变反过来遗传给原是突变体的子代。需要注意的时该突变仅仅在存在立福平的环境中有益，并且其可能在大多数其他条件下不能赋予变体优势。立福平是主要用于治疗结核以及麻风病的抗生素，有时也用于治疗其他疾病。抗性是由于膜通透性的改变或由于编码mRNA聚合酶的rpoB基因中的突变。这些机制均源于染色体细胞突变。但是，大肠杆菌染色体中存在多种靶基因，其可赋予细菌立福平抗性。
通过用赋予立福平抗性的自发突变的频率除以培养基中的存活细胞总数来计算自发突变频率(SMF)。
Figure A20058001329600281
A)MutL在显示强增变基因表型(mutL和/或dnaQ染色体缺失)的大肠杆菌菌株中的过表达，将细胞铺于抗生素立福平上。
试验概要
1.构建MutL和MutS过表达质粒
a)在pTrcHis2/lacZ中克隆mutL
构建该质粒以实现MutL在大肠杆菌中高度且“受控制的”表达。
自大肠杆菌菌株MG1655制备基因组DNA，其用于通过引物1(SEQ IDNo.1)和2(SEQID No.2)(见表1)扩增编码MutL蛋白的1848bp的DNA片段。该PCR片段经消化并作为NcoI-XhoI片段克隆入质粒pTrcHis2/lacZ以产生质粒pmutL。质粒pmutL的物理结构显示于图1。PCR条件如下(温度为℃/时间为min)：(98/10)(96/0,75；55/0.50；72/2,5)35(72/10)；关系(Taq/Pfu)(5/1)。
分离所得克隆中的六个，并通过EcoRV进行限制消化来分析(预期的片段：871bp和5373bp)。所有六个克隆显示正确的迁移模式。
b)在pTrcHis2/lacZ中克隆mutS
构建该质粒以实现MutL在大肠杆菌中高度且“控制的”表达。
自大肠杆菌菌株MG1655制备基因组DNA，其用于通过引物3(SEQ IDNo.3)和4(SEQID No.4)(见表1)扩增编码MutL蛋白的2562bp的DNA片段。该PCR片段经消化并作为BamHI-XhoI片段克隆入质粒pTrcHis2/lacZ以产生质粒pmutS。质粒pmutS的物理结构基本上与显示于图1的质粒pmutL的结构相同。PCR条件如下(温度为℃/时间为min)：(98/10)(96/0,75；55/0.58；72/3)35(72/10)；Herculase。
分离所得克隆中的六个，并通过EcoRV进行限制消化来分析(预期的片段：1186bp和5775bp)。所有六个克隆显示正确的迁移模式。
表1：分别用于扩增编码MutL和MutS蛋白的DNA片段的引物列表
    引物  序列
    1234   MutLNcol-hinMutLXhol-herMutS-BamHlhinMutSXhol-her  CATG CCATGGCGCCAATTCAGGTCTTACCGCCACAACCCG CTCGAGCCTCATCTTTCAGGGCTTTTATCGCCGGCGC GGATCCGAGTGCAATAGAAAATTTCGACGCCCATACCG CTCGAGCCACCAGGCTCTTCAAGCGATAAATCCAC
2.Western印迹分析
a)检测MutL
将20μl ES568过夜培养物(mutL13；Mut-)pmutL接种到含有)0.4％葡萄糖和氨苄西林(100μg/m)的10ml LB中直到OD达到大约0.5。为了去除葡萄糖，离心细胞并溶解于含有所需抗生素的5ml LB中。添加IPTG直到终浓度为1mM，诱导自pmutL的Plac的表达。培养物在37℃保温16小时，然后离心并准备用于SDS-PAGE分析。Western印记分析利用AP偶联的抗His-tac抗体进行(数据未显示)。
b)检测MutS
野生型菌株Top10利用构建的质粒pmutS转化，并纯化所得转化体。将这些细菌的20μl过夜培养物接种到含有氨苄西林(ampicillin)(100μg/ml)和0.4％葡萄糖的10ml LB直到OD达到大约0.5。为了去除葡萄糖，离心细胞并溶解于含有所需抗生素的5ml LB中。添加IPTG直到终浓度为1mM，诱导自pmutS的Plac的表达。培养物在37℃保温16小时，经离心并准备用于SDS-PAGE分析。Western印记分析利用AP偶联的抗His-tac抗体进行(数据未显示)。
3.生长研究
细菌菌株ES568(mutL13；Mut-)，MG1655dnaQ::kn(Mut-)和野生型菌株MGl655(Mut+)利用质粒pmutL或亲本质粒pTrcHis2/lacZ转化。获得的单个集落在含有100μg/ml氨苄西林的LB琼脂板上纯化，然后接种到含有100μg/ml的氨苄西林的LB中在37℃过夜。
将这些细菌的20μl过夜培养物接种到含有0.4％葡萄糖和所需抗生素(氨苄西林100μg/ml，卡那霉素50μg/ml)的5ml LB中直到OD达到大约0.5。为了去除葡萄糖，离心细胞并溶解于含有相应抗生素的5ml LB中。添加IPTG直到终浓度为1mM，诱导自pmutL的Plac的表达。培养物在37℃保温过夜，细胞经离心，培养基体积减少到1/10(v/v)。
最后，稀释培养物并在含有100μg/ml氨苄西林或100μg/ml氨苄西林加100μg/ml立福平的琼脂板上铺板，在30℃保温3天。
MutL的表达通过Western印迹分析证实。
总结和结论：观察到MutL的过表达(在mutL+背景中)降低自发突变的频率约20倍。类似的效应在mutL-或dnaQ-细胞中观察到，其显示高突变率(数据未显示)。
B)MutL在携带不同组合的dinB缺失和/或dnaE911抗增变基因等位基因的大肠杆菌中的过表达
1.菌株构建
a)P1vir裂解物自大肠杆菌菌株ES1484(mutL218::Tn10)制备以感染来自大肠杆菌菌株MG1655和MG1655dinB10的细菌细胞。
制备P1vir
大肠杆菌菌株ES1484(mutL218::tet)的过夜培养物的等分试样在37℃接种于含有CaCl2(5mM)的LB中。指数生长期间，添加P1vir(野生型菌株MG1655的)。感染的培养物在37℃培养ca.4h直到观察到细胞裂解。添加CHCl3，离心裂解物，将上清转移到含有CHCl3的新试管中并保存在4℃.
P1-转导：
宿主菌株MG1655和MG1655 dinB10的过夜培养物等分试样在37C接种于LB中直到达到指数生长期。离心细胞，重悬于含有CaCl2(CE＝5mM)的MgSO4(CE＝10mM)中，加入制备的P1vir裂解物并将细胞混合物在RT保温30min。添加柠檬酸钠(以终止噬菌体感染)并添加SOC作为营养源。在37C保温1h后，将细胞等分试样在含有四环素(12.5μg/ml)的琼脂板上铺板。纯化并检测所得单个集落，保存分离的菌株。
b)P1vir裂解制备自dnaE菌株NR10171(dnaE911 zae::cm)以感染大肠杆菌菌株MG1655，MG1655dinB10，MG1655mutL::tet和MG1655dinB10mutL::tet的细菌细胞。纯化并检测所得单个集落，保存分离的菌株。
2.生长研究
细菌菌株MG1655，MG1655dinB10，MG1655dnaE911zae::cm，MG1655dinB10 dnaE911 zae::cm，MG1655mutL::tet，MG1655dinB10mutL::tet，MG1655dinB10 dnaE911 zae::cmmutL::tet和MG1655dinB10 dnaE911 zae::cm mutL::tet利用质粒pTrcHis2A或pmutL转化。所得单个集落经纯化接种于含有100μg/ml氨苄西林的LB中，在30℃过夜。
将这些细菌的20μl的过夜培养物在30℃接种于含有100μg/ml氨苄西林的5ml LB中。在指数生长期间，添加IPTG直到终浓度为1mM，诱导自pmutL的Plac的表达。培养物在30℃保持1h，然后将温度改变为37℃，并将细胞在37℃保温过夜。
离心细胞，培养基体积减少到1/10(v/v)。
最后，稀释培养物并在含有100μg/ml氨苄西林或100μg/ml氨苄西林加100μg/ml立福平的琼脂板上铺板，在30℃保温3天。
立福平抗性的自发突变频率(SMF)值显示于表2，图2显示mutL的表达对突变力的抑制。
表2：rif抗性集落的SMF值
 菌株  质粒   SMF(rif抗性/107)
 MG1655MG1655MG1655 pTrcHis2ApmutL   0.310.250.034
 MG1655dinB10MG1655dinB10MG1655dinB10 pTrcHis2ApmutL   0.0830.110.068
 MG1655 dnaE zae::cmMG1655 dnaE zae::cmMG1655 dnaE zae::cm pTrcHis2ApmutL   0.100.080.045
 MG1655dinB10 dnaEzae::cmMG1655dinB10 dnaEzae::cmMG1655dinB10 dnaEzae::cm pTrcHis2ApmutL   0.0320.0110.024
 MG1655 mutL::tetMG1655 mutL::tetMG1655 mutL::tet pTrcHis2ApmutL   11.8611.80.25
 MG1655 dinB10 mutL::tetMG1655 dinB10 mutL::tetMG1655 dinB10 mutL::tet pTrcHis2ApmutL   2.564.200.19
 MG1655 dnaE zae::cmmutL::tetMG1655 dnaE zae::cmmutL::tetMG1655 dnaE zae::cmmutL::tet pTrcHis2ApmutL   3.591.740.093
 MG1655 dinB10 dnaEzae::cm mutL::tetMG1655 dinB10 dnaEzae::cm mutL::tetMG1655 dinB10 dnaEzae::cm mutL::tet pTrcHis2ApmutL   1.181.310.12
突变力(SMF值)通过抗增变基因样dinB10(缺失)或dnaE911(等位基因)的作用分别降低4和3倍。此外，观察到通过mutL在所述菌株中的表达突变力进一步降低(2-7倍)。携带两种抗增变基因dinB10和dnaE911的细菌菌株，显示与野生型菌株MG1655相比突变力降低10倍。MutL的额外表达似乎不改变突变力。
MutL基因的染色体缺失使宿主菌株的突变力明显增加大约103倍。该突变力通过抗增变基因dinB10(5倍)，dnaE911(3倍)，dinB10和dnaE911(10倍)得以降低。MutL的进一步诱导使得突变力降低达50倍(对于MG1655mcstL::tet为50倍；对于MG1655dinB10mutL::tet为22倍；对于MG1655dnaE911 zae::cm；mutL::tet为20倍，对于MG1655dinB10dnaE911zae::cmmutL::tet为11倍)。
总结和结论：抗增变基因dinB10和dnaE911降低自发突变频率3-4倍。MutL在这些菌株中的表达使得该频率进一步降低2-7倍。
C)携带dinB缺失和/或dnaE911抗增变基因的不同组合的mutS-菌株中的突变力
为了证实上述结果，dinB10(聚合酶IV缺失)和/或dnaE911(编码聚合酶III的α亚基的编码序列中的等位基因)在mutS-背景中检测。
2.菌株构建
a)P1vir裂解物自大肠杆菌菌株ES1484(mutL218::Tn10)制备以感染来自大肠杆菌菌株MG1655，MG1655dinB10，MG1655dnaE911 zae::cm和MG1655dinB10dnaE911 zae::cm的细胞。纯化并检测所得单个集落，保存分离的菌株。
2.生长研究
10μl这些细菌的过夜培养物在30℃接种于含有12.5μg/ml四环素的10ml LB中。指数生长期间(生长8h后)，温度改变为37℃，细胞在37℃接种过夜。
离心细胞，培养基体积减少到1/10(v/v)。
最后，稀释培养物并在含有或不含有100μg/ml立福平的琼脂板上铺板，在30℃保温5天。
立福平抗性的自发突变频率(SMF)值显示于表3，图3显示mutS-中对突变力的抑制。
表3.rif抗性集落的SMF值
 菌株 质粒     SMF(rif抗性/107)
 MG1655MG1655 dinB10MG1655 dnaE911 zae::cmMG1655 dinB10 dnaE911zae::cmMG1655 mutS::tetMG1655 dinB10 mutS::tetMG1655 dnaE911 zae::cmmutS::tetMG1655 dinB10 dnaEzae::cm mutS::tet --------     0.2180.1450.180.048252.6720.1624.844.24
与野生型相比，突变力(SMF值)在抗增变基因如dinB10或dnaE911的存在下降低(大约1.5倍)。此外，携带抗增变基因dinB10或dnaE911的细菌菌株显示与野生型MG1655相比突变力降低4.5倍。
MutS基因的染色体缺失使得宿主细胞中的突变力显著降低。该突变力通过抗增变基因dinB10(12.5倍)，dnaE911(10倍)，dinB10和dnaE911(60倍)降低。
结论和总结：dinB10或dnaE911的抗增变基因效应部分弥补了mutS染色体缺失导致的Mut-表型。
实施例II
dapA突变的回复
为了研究点和移码突变(具体是靶基因中的)的回复，利用在大肠杆菌中具有营养缺陷型表型的系统(dapA-菌株)。
dapA基因编码dihydrodipicolinate合酶，其催化L-天冬酰胺-β-半醛以及丙酮酸经由ping-pong机制缩合成dihydropicolinic acid，其中丙酮酸通过与赖氨酸残基形成Schiff-碱基结合于酶。dapA基因中存在导致无功能基因产物的突变的细菌细胞不能在不含有DL-二氨基庚二酸(diaminopimelic acid)(DAP)的培养基上生长。
在存在编码dapAIF(wt ORF)，dapA+1(移码突变)，dapA+2，或dapA15(点突变)的质粒的情况下，MutL在dapA-背景中表达(dapA15(点突变具有DapA表型)或dapA::kn)。回复体在缺乏DL-二氨基庚二酸的板上检测。
试验概要
1.构建质粒
a)克隆dapA
将dapA(dapA15)，dapA+1(dapA15+1)，dapA+2(dapA15+2)克隆入pTrcHis2/lacZ
制备自大肠杆菌MG1655(wt)或AT997(dapA15)基因组DNA用于扩增编码DapA蛋白的732bp DNA片段，所述扩增通过引物5(SEQ ID No.5)，6(SEQ ID No.6)，7(SEQ ID No.7)和8(SEQ ID No.8)(见表4)。这些PCR片段经消化作为BamHI-XhoI片段克隆入质粒pTrcHis2/lacZ，产生质粒pdapAIF，pdapA+1和pdapA+2。质粒pdapAIF的物理结构见图4A。PCR条件如下(温度为℃/时间为min)：(98/10)(96/0,75；55/0.50；72/2)35(72/10)；Herculase。
每种情况中，利用BstEII对所得克隆的八个通过限制消化进行分析(预期的片段：1314 bps和3964 bps)。24个受试克隆中总共有23个显示正确的迁移模式。
将dapA15克隆入pSU19和pSU40
利用制备自大肠杆菌菌株AT997的基因组DNA扩增编码DapA蛋白的732 bpDNA片段，其中利用引物9(SEQ ID No.9)和10(SEQ ID No.10)(见表4)。消化该PCR片段并作为HindIII-EcoRI片段克隆入质粒pSU19和pSU40产生质粒pSU19dapA15和pSU40dapA15。质粒pSU40dapA的物理结构显示于图4B。
PCR条件如下(温度为℃/时间为min)：(98/10)(96/0,75；55/0.50；72/2)35(72/10)；关系(Taq/Pfu)(5/1)
观察的克隆中有10个被分离并通过利用NheI(对于pSU40，预期的片段为1122 bps和2557 bps)或Apo3(预期的片段：478 bps和3192 bps)进行限制消化进行分析。所有克隆显示正确的迁移模式。
2)克隆mutL
a)将mutL亚克隆入pSU40
质粒pmutL用SpHI-XmnI消化，通过凝胶电泳分离3629 bp的片段。质粒pSU40用SphI-HincII消化，通过凝胶电泳分离2680bp片段。两种纯化的片段粘板(sticky-plank)连接，产生质粒pSU40mutL。产生质粒pSU40mutL的策略显示于图5。
所得克隆中有6个通过利用NcoI(预期的片段：2675 bps.和3634 bps)，PVuI(预期的片段：1368 bps和4941 bps)和BglI(预期的片段：1828 bps和4481 bps)的限制消化分析。6个受试克隆中有3个显示正确的迁移模式。
b)质粒pmutLspec：用spec取代bla
在质粒pmutL中用壮观霉素抗性基因取代氨苄西林抗性基因。
制备自质粒pIC156的DNA利用FspI-XmnI消化，并利用凝胶电泳分离1304 bp片段，制备自质粒pmutL的DNA利用ScaI-XmnI消化，并利用凝胶电泳分离5443 bp片段。两种纯化的片段通过空-空(blank-blank)连接产生质粒mutLspec。
所得克隆中的12中通过利用EcoRI(预期的片段：1291 bps和5456 bps)进行限制消化来分析。12中受试克隆中有两种显示正确的大小。
表4：用于克隆编码DapA蛋白的DNA片段的引物列表
  引物  序列
  5678910  DapABamHllFdapABamHl+1dapABamHl+2DapAXholDapAEcoRlhindapAHindlllher  CGC GGATCCGTTCACGGGAAGTATTGTCGCGATTGCGC GGATCCGCTTCACGGGAAGTATTGTCGCGATTGCGC GGATCCGCGTTCACGGGAAGTATTGTCGCGATTGCCG CTCGAGCCAGCAAACCGGCATGCTTAAGCGCCCCG GAATTCCGGGCATACAACAATCAGAACGGTTCTGTCCCC AAGCTTGGGCGAAACACCCGCAACCTTTGCCAGGCG
2.Western印迹分析
a)检测DapA/DapA15
菌株dapA::kn用pdapAIF，pdapA+1，pdapA+2，pdapA15IF，pdapA15+1和pdapA15+2转化，纯化观察到的转化体。
将这些细菌的20μl过夜培养物接种到含有0.4％葡萄糖和DL-二氨基庚二酸100μg/ml，氨苄西林100μg/ml，卡那霉素50μg/ml的5ml LB中直到OD达到大约0.5。为了去除葡萄糖，离心细胞并溶解于含有相应抗生素的5ml LB中。添加IPTG直到终浓度为1mM，诱导不同的pTrcHis2/lacZ衍生物自Plac的表达。培养物在37℃保温16h，细胞经离心，准备用于SDS-PAGE分析。Western印迹分析利用AP偶联的抗-His-tac抗体进行(数据未显示)。
b)检测MutL
野生型菌株Top10用质粒pmutLspec转化，纯化所得转化体。将这些细菌的20μl过夜培养物接种到含有壮观霉素(75μg/ml)的10ml LB直到OD达到大约0.5。将培养物分成5ml的等份，添加IPTG直到终浓度为1mM，诱导pmutL自Plac的表达。培养物在37℃保温4小时，经离心并准备用于SDS-PAGE分析。Western印记分析利用AP偶联的抗-His-tac抗体进行(数据未显示)。
3.菌株构建
a)P1vir裂解物自大肠杆菌菌株dapa::kn制备以感染来自大肠杆菌菌株MG1655，MG1655dinB10，MG1655dnaE9111zae::cm，MG1655dinB10dnaE911zae::cm，MG1655mutL::tet，MG1655dinB10mutL::tet，MG1655dnaE911zae::cm mutL::tet，MG1655dinB10dnaE911zae::cmmutL::tet的细菌细胞。纯化所得单个集落，进行检测并保存分离的菌株。
4.生长研究
a).点突变的回复：
细菌菌株AT997(dapA15)和MG1655dinB10dapA::kn用质粒pTrcHis2/lacZ和pSU19dapA15，或质粒pmutL和pSU19dapA15转化。所得单个集落经纯化接种于含有以下物质的LB中：100μg/ml氨苄西林；30pg/ml氯霉素和50μg/ml DAP，37℃过夜。
b)移码突变的回复：
细菌菌株AT997(dapA15；dapA-)用质粒pSU40和pdapAIF，质粒spSU40mutL和pdapAIF，质粒pSU40和pdapA+1，质粒pSU40mutL和pdapA+1，质粒pSU40和pdapA+2，或质粒s pSU40mutL和pdapA+2转化。所得单个集落经纯化接种于含有以下物质的LB中：100μg/ml氨苄西林；50μg/ml卡那霉素和50μg/ml DAP，37℃过夜。
将这些细菌的20μl的过夜培养物在30℃接种于含有100μg/ml氨苄西林，50μg/ml氯霉素和50μg/ml DAP的10ml LB中。在指数生长期间，添加IPTG直到终浓度为1mM，诱导pmutL自Plac启动子的表达。培养物在30℃保持1h，然后将温度改变为37℃，并将细胞在37℃保温过夜。
最后，离心培养物，去除9ml培养基，稀释余下的细胞并将其在含有以下物质的琼脂板上铺板：100g/ml氨苄西林加30μg/ml氯霉素或100μg/ml氨苄西林加30μg/ml氯霉素加50μg/ml DAP，30℃保温5天。
野生型和MutL过表达型菌株中dapA蛋白的回复4值显示于表5，图6显示经由MutL表达对突变力的抑制。
表5：野生型和MutL过表达菌株中dap-/dap+值
菌株 质粒   dap-/dap+
  1-Top10(wt)2-AT997(dapA15)3-MG1655dinB10dapA::kn   0.820.000.00
  4-AT997(dapA15)5-AT997(dapA15)6-AT997(dapA15)7-AT997(dapA15)8-AT997(dapA15)9-AT997(dapA15)   pdapAlF，pSU40pdapAlF，pSU40mutLpdapA+1，pSU40pdapA+1，pSU40mutLpdapA+2，pSU40pdapA+2，pSU40mutL   0.810.720.090.0000980.000.00
  10-MG1655dinB10dapA::kn11-MG1655dinB10dapA::kn   pSU19dapA(AT997)；pTrcHis2/lacZpSU19dapA(AT997)；pmutL   0.570.051
对照菌株(1-3)Top10(wt，DapA+)，AT997(dapA15+；dapA-)以及MG1655dapA::kn(dapA-)显示预期的dap-/dap+值：对于野生型菌株(在缺乏DL-二氨基庚二酸的条件下生长)为1，对于dapA-菌株(不在缺乏DL-二氨基庚二酸的条件下生长)为0。
两种菌株AT997(dapA15)pdapAIF pTrc(4)和AT997(dapA15)pdapAIFpmutL(5)显示预期的野生型表型，这是由于功能性dapA基因位于质粒pdapAIF。编码dapA-(10)宿主中的dapA的质粒的移码突变体(6，8)或点突变在缺乏DAP时抑制细胞生长，而导入点突变的回复赋予在DAP缺乏时的生长(7，11)。
总结和结论：在两种情况(移码和点突变)下，缺乏MutL时，观察到突变的回复。对于移码突变，dap-/dap+值下降达1000倍，对于点突变下降达10倍，表明MutL的表达抑制突变回复，由此对染色体中自发突变的修复起相反作用。
实施例III
“发酵条件”过程中MutL的表达
携带色氨酸控制的G-CSF表达载体的制备型菌株JM83 pXX7的突变力通过以下方法分析：A)通过将细胞在利福平上铺板计算自发突变率，B)通过将细胞在磷霉素上铺板计算自发突变和C)将报道基因导入制备型质粒pXX7(编码G-CSF)。
对于B)，利福平用磷霉素替代，这是由于在试验条件下大肠杆菌中对于磷霉素的抗性的产生要快得多。磷霉素是主要用于治疗非并发性尿道感染的细胞壁抑制物。
试验概要
1克隆
a)将氯霉素盒克隆入pXX7：
利用制备自质粒pSU19的DNA扩增编码氯霉素抗性的DNA片段，所述扩增利用引物11(SEQ ID No.11)和12(SEQ ID No.12)(表6)。这些PCR片段经消化作为BSvcI-Ahd1片段克隆入质粒pXX7产生质粒pXX7cm。产生质粒pXX7cm的策略显示于图7A。为简化选择过程，仅仅克隆″ShineDalgarno″序列的-10区域。
PCR条件如下(温度为℃/时间为min)：(98/10)(96/0,75；55/0.50；72/1)35(72/10)；Herculase。
表6：用于扩增编码氯霉素抗性基因的DNA片段的引物
 引物  序列
1112  cmBbvClhinCmAhdl-her  AAC CCTCAGCATAATGAAATAAGATCACTACCGGCAA GACGATCTCGTCAAGATCATCTTATTAATCAGATAA
b)将沉默tetA基因克隆入质粒pXX7：
分离质粒pGBG1的选择筒(cartridge)，并作为MslI-SmaI片段克隆入质粒pXX7产生质粒pXX7tet(空-空连接)。产生质粒pXX7tet的策略显示于图7B。
质粒pGBG1用于分离并定性各种革兰氏阴性细菌中的活动性元件以及其它自发突变(Schneideret aL，Plasmid 44，201-207(2000))。含有诱变靶的选择筒由在噬菌体入的PR启动子控制下的沉默tetA基因组成，其受到入CI抑制子的抑制。灭活cI或消除CI结合位点的自发突变(点突变，缺失和插入)将抑制PR并由此引发tetA的表达。诱变靶为ca.l kb长。在这种情况中，MutL的表达可降低突变率并由此降低给定宿主菌株中的四环素抗性。
2.生长研究
A)通过将细胞铺于利福平确定大肠杆菌中的自发突变频率(SMF)
细菌菌株JM83 pXX7利用质粒pTrcHis2/lacZ(对照质粒)和pmutL转化。纯化所得单个集落并将细胞接种于含50μg/ml卡那霉素(如需要还含有100μg/ml氨苄西林)的LB中，30℃过夜。在30℃将这些细菌的3ml过夜培养物接种在含有50μg/ml卡那霉素(如需要还含有100μg/ml氨苄西林)的100ml RMG中。指数生长期间，以终浓度1mM添加IPTG增加MutL自质粒pmutL的Plac启动子的表达，加入终浓度100μg/ml的色氨酸诱导G-CSF自质粒pXX7的表达。诱导一小时后，接种温度从30℃变为37℃，然后将细胞在37℃过夜。
离心细胞并将培养基体积减少到10ml。
最后，稀释培养物并铺于A)LBA板，B)RMG板和C)M9板，其中含有
a)100μg/ml氨苄西林以及如果需要含有50μg/ml卡那霉素
b)100μg/ml氨苄西林以及如果需要含有50μg/ml卡那霉素和100μg/ml利福平
并在30℃保温3天。
菌株JM83pXX7，JM83 pXX7 pTrc和JM83 pXX7 pmutL的利福平抗性的自发突变频率的值显示于图8。制备型菌株JM83 pXX7显示约0.45的SMF值。该SMF值通过进一步将“空”载体引入该制备型菌株来保持。但将pmutL进一步引入JM83 pXX7导致MutL过表达2倍时SMF值降低。
B)通过将细胞铺于磷霉素确定大肠杆菌中的自发突变频率(SMF)
细菌菌株JM83 pXX7利用质粒pTrcHis2A和pmutL转化。纯化所得单个集落并且对于每种菌株(JM83 pXX7，JM83 pXX7 pTrcA和JM83 pXX7pmutL)，将20个独立且唯一的细胞接种于含有50μg/ml卡那霉素(如需要还含有100μg/ml氨苄西林)的LB，30℃过夜。
在30℃将这些细菌的10μl过夜培养物接种在含有50μg/ml卡那霉素(如需要还含有100μg/ml氨苄西林)的10ml RMG中。指数生长期间，以终浓度1mM添加IPTG增加MutL自质粒pmutL的Plac启动子的表达，加入终浓度100μg/ml的色氨酸诱导G-CSF自质粒pXX7的Ptrp的表达。诱导一小时后，接种温度从30℃变为37℃，然后将细胞在37℃过夜。
离心细胞并将培养基体积减少到10ml。
最后，稀释培养物并铺于LB琼脂板，其中含有
a)100μg/ml氨苄西林以及如果需要含有50μg/ml卡那霉素
b)100μg/ml氨苄西林以及如果需要含有50μg/ml卡那霉素和100μg/ml利福平
并在30℃保温3天。
菌株JM83pXX7，JM83 pXX7 pTrc和JM83 pXX7 pmutL的利福平抗性的自发突变频率的值显示于图8。制备型菌株JM83 pXX7显示约4.9的SMF值。该SMF值通过进一步将“空”载体引入该制备型菌株来保持。但将pmutL进一步引入JM83 pXX7导致MutL过表达3倍时SMF值降低。
总结和结论：MutL过表达降低G-CSF制备型菌株的突变力大约3倍，并使得细胞存活力增加达103倍。
C)通过引入报道基因测定大肠杆菌菌株JM83pXX7中的自发突变
a)G-CSF的表达
b)G-CSF的表达和抑制
由于G-CSF活性不能被监测，将报道基因引入质粒pXX7。
诱变在两个不同系统中测定。在第一个系统中，使用弱启动子控制的氯霉素抗性基因。减活cm基因表达的自发突变诸如点突变，缺失，以及插入将降低氯霉素抗性。缺乏MutL导致自发突变率降低，其赋予对氯霉素的抗性的自发突变相对于培养物中的存活细胞总数的比率。第二系统中，使用盒，其含有在噬菌体入的PR启动子控制下的沉默tet基因，以及阻止tetA表达的入cI阻抑物。减活cI或消除cI结合位点的自发突变诸如点突变，缺失，以及插入将导致PR的抑制，由此激发tetA的表达。MutL的表达导致赋予对四环素的抗性的自发突变相对于培养物中的存活细胞总数的比率降低。
a) G-CSF的表达
细菌菌株JM83利用质粒pXX7cm，pXX7cm pTrcHis2/lacZ，pXX7cmpmutL，pXX7tet，和pXX7tetpTrcHis2/lacZ和pXX7tet pmutL转化。纯化所得单个集落并将细胞接种于含50μg/ml卡那霉素(如需要还含有100μg/ml氨苄西林)的LB中，30℃过夜。
在30℃将这些细菌的10μl过夜培养物接种在含有50μg/ml卡那霉素(如需要还含有100μg/ml氨苄西林)的10ml RMG中。指数生长期间，以终浓度1mM添加IPTG，增加MutL自质粒pmutL Plac启动子的表达，加入终浓度100μg/ml的色氨酸诱导G-CSF自质粒pXX7的表达。诱导一小时后，接种温度从30℃变为37℃，然后将细胞在37℃过夜。
离心细胞并将培养基体积减少到10ml。
最后，稀释培养物并铺于LB琼脂板，其中含有不同的抗生物(示于表7)并在30℃保温4天。
表7：使用的抗生素
 菌株 抗生素
 JM83 pXX7JM83 pXX7 pTrcAJM83 pXX7 pmutLJM83 pXX7cmJM83 pXX7cmpTrcAJM83 pXX7cmpmutLJM83 pXX7tetJM83 pXX7tetpTrcAJM83 pXX7tetpmutL 50μg/ml卡那霉素50μg/ml卡那霉素100μg/ml氨苄西林50μg/ml卡那霉素100μg/ml氨苄西林50μg/ml卡那霉素50μg/ml卡那霉素100μg/ml氨苄西林50μg/ml卡那霉素100μg/ml氨苄西林50μg/ml卡那霉素50μg/ml卡那霉素100μg/ml氨苄西林50μg/ml卡那霉素100μg/ml氨苄西林 50μg/ml卡那霉素30μg/ml氯霉素50μg/ml卡那霉素30μg/ml氯霉素100μg/ml氨苄西林50μg/ml卡那霉素30μg/ml氯霉素100μg/ml氨苄西林50μg/ml卡那霉素30μg/ml氯霉素50μg/ml卡那霉素30μg/ml氯霉素100μg/ml氨苄西林50μg/ml卡那霉素30ug/ml氯霉素100μg/ml氨苄西林 50μg/ml卡那霉素12.5μg/ml四环素50μg/ml卡那霉素12.5μg/ml四环素100μg/ml氨苄西林50μg/ml卡那霉素12.5μg/ml四环素100μg/ml氨苄西林50ug/ml卡那霉素12.5μg/ml四环素50ug/ml卡那霉素12.5μg/ml四环素100μg/ml氨苄西林50μg/ml卡那霉素12.5μg/ml四环素100μg/ml
菌株JM83 pXX7cm，JM83pXX7cmpTrc和JM83 pXX7cm pmutL的氯霉素抗性报道基因中的自发突变频率的值显示于图10，对于两种菌株JM83pXX7cm和JM83 pXX7cm pTrc，突变力值为0.28或0,35(Δ1.25)。MutI的表达使得突变力值降低到0.49(Δ1.75)。这表明MutL的表达抑制氯霉素抗性转化为氯霉素敏感性，并由此对染色体中自发突变的修复起对抗性作用(act against the fixation of spontaneous mutations in chromosome)。
菌株JM83p)OC7tet，JM83 pXX7tet pTrc和JM83 pXX7tet pmutL中沉默tetA报道基因的自发突变频率值显示于图11。对于两种菌株JM83 pXX7tet和JM83pXX7tet pTrc，突变力值为0.43或0,39(Δ1.1)。MutL的表达使得突变力的值降低到0.25(Δ1.72)。这表明MutL表达抑制四环素敏感性转化为四环素抗性，并由此对染色体中自发突变的修复起对抗性作用。
b)G-CSF的表达和抑制
野生型细菌菌株JM83利用质粒pXX7cm，pXX7cm pTrcHis2/lacZ，pXX7cm pmutL，pXX7tet和pXX7tetpTrcHis2/lacZ和pXX7tet pmutL转化。纯化所得单个集落并将细胞接种于含50μg/ml卡那霉素(如需要还含有100μg/ml氨苄西林)的LB中，30℃过夜。
在30℃将这些细菌的10μl过夜培养物接种在含有50μg/ml卡那霉素(如需要还含有100μg/ml氨苄西林)的100ml RMG中。指数生长期间，以终浓度1mM添加IPTG增加MutL自质粒pmutL的Plac启动子d表达。将培养物一分为二，一次性加入终浓度100μg/ml的色氨酸诱导G-CSF自质粒pXX7的Ptrp表达。诱导一小时后，接种温度从30℃变为37℃，然后将细胞在37℃过夜。
离心细胞并将培养基体积减少到1ml。
最后，稀释培养物并铺于LB琼脂板，其中含有不同的抗生素(示于表7)并在37℃保温过夜。
修饰的制备型菌株JM83 pXXcm在发酵条件过程中的突变力显示于图12。缺乏C-GSF时，测定的氯霉素抗性转变的频率对于JM83pXX7cm，JM83pXX7cm pTrc和JM83pXX7cm pmutL为50-55。G-CSF的诱导使得JM83pXX7tet和JM83 pXX7tet pTrc的值降低达3倍。对于菌株JM83 pXC7pmutL，氯霉素抗性在G-CSF表达的情况下得以保持。
MutL的表达抑制氯霉素抗性转化为氯霉素敏感性，并由此对染色体中自发突变的修复起对抗性作用。
图13显示修饰的制备型菌株JM83 pXX7在发酵条件过程中的突变力明显增加。但是对于表达质粒编码的MutL的菌株JM83 pXX7 pmutL四环素抗性在G-CSF表达时得以保持。MutL的表达抑制氯霉素抗性转化为氯霉素敏感性，并由此对染色体中自发突变的修复起对抗性作用。
结论和总结：所得结果显示MutL的过表达降低G-CSF制备过程中G-CSF发酵菌株中的突变力3倍。此外，发现MutL的过表达增加细胞存活力103倍。
G-CSF的诱导增加受试制备型菌株中的自发突变率大约2-3倍。
序列表
<110>麦克西斯法国股份有限公司(Mixis France S.A.)
<120>降低细胞中的自发突变率
<130>25187
<140>
<141>
<160>12
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>1
catgccatgg cgccaattca ggtcttaccg ccacaac    37
<210>2
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>2
ccgctcgagc ctcatctttc agggctttta tcgccgg    37
<210>3
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>3
cgcggatccg agtgcaatag aaaatttcga cgcccata   38
<210>4
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>4
ccgctcgagc caccaggctc ttcaagcgat aaatccac   38
<210>5
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>5
cgcggatccg ttcacgggaa gtattgtcgc gattg    35
<210>6
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>6
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<210>7
<211>37
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<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>7
cgcggatccg cgttcacggg aagtattgtc gcgattg  37
<210>8
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>8
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<210>9
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<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>9
ccggaattcc gggcatacaa caatcagaac ggttctgtc 39
<210>10
<211>39
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<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>10
cccaagcttg ggcgaaacac ccgcaacctt tgccaggcg  39
<210>11
<211>34
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<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>11
aaccctcagc ataatgaaat aagatcacta ccgg       34
<210>12
<211>39
<212>DNA
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<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>12
caagacgatc tcgtcaagat catcttatta atcagataa   39

Claims (62)

1.通过向细胞或生物体中导入至少两个突变来降低细胞或生物体中的自发突变频率的方法，所述突变的组合的作用导致至少两种增强的细胞DNA修复机制。
2.制备自发突变频率降低的细胞或生物体的方法，其如下进行：向该生物体的至少一个细胞中导入至少两个突变，并且如果所述生物体是多细胞生物体，由所述细胞再生成生物体，其中所述突变的组合的作用导致至少两种增强的细胞DNA修复机制。
3.权利要求1或2的方法，其中所述细胞是原核细胞。
4.权利要求3的方法，其中所述原核细胞是古细菌或真细菌的细胞。
5.权利要求4的方法，其中所述真细菌的细胞是革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌的细胞。
6.权利要求1或2的方法，其中所述细胞是真核细胞。
7.权利要求6的方法，其中所述真核细胞是真菌细胞，动物细胞或植物细胞。
8.权利要求1，2或5-7之一的方法，其中所述生物体是真菌、动物或植物。
9.权利要求1-8之一的方法，其中所述至少两个突变的组合的作用导致至少两种细胞DNA修复机制修复自发出现的突变的能力增强。
10.权利要求9的方法，其中所述错配修复系统，复制后修复系统和/或SOS修复系统修复自发出现的突变的能力增强。
11.权利要求1-10之一的方法，其中所述至少两个突变选自导致MutL蛋白或其同源蛋白的表达上调的突变，导致MutS蛋白或其同源蛋白的表达上调的突变，编码DNA聚合酶IV或其同源蛋白的基因的抗增变基因等位基因，以及编码DNA聚合酶III的亚基或其同源蛋白的基因的抗增变基因等位基因。
12.权利要求11的方法，其中MutL，MutS或其同源蛋白的表达上调通过将载体导入细胞来实现，所述载体包含MutL基因，编码MutL同源蛋白的基因，MutS基因或编码MutS同源蛋白的基因，并且所述基因在允许MutL，MutS或其同源蛋白过表达的一或多种调控单元的功能控制下。
13.权利要求12的方法，其中所述载体是多拷MutS基因贝质粒。
14.权利要求11或12的方法，其中所述调控单元是可诱导型或组成型启动子。
15.权利要求11的方法，其中MutL，MutS或其同源蛋白的上调通过将在一或多种调控单元的功能控制下的各种mut基因的一或多个附加拷贝导入宿主细胞染色体和/或通过将一或多个突变导入控制天然Mut蛋白的表达的调控单元来实现，使得与相应的野生型细胞相比各种Mut蛋白的生成增加。
16.权利要求11的方法，其中所述编码DNA聚合酶IV的基因的抗增变基因等位基因是dinB10。
17.权利要求11的方法，其中所述编码DNA聚合酶III的基因的抗增变基因等位基因是dnaE911。
18.权利要求1-17之一的方法，其中dinB10和dnaE911的组合的作用使得与野生型细胞或野生型生物体相比自发突变频率降低至少10倍。
19.权利要求1-18之一的方法，其中dinB10，dnaE911和过表达的mutL的组合作用使得与野生型细胞或野生型生物体相比自发突变频率降低至少50倍。
20.权利要求1-19之一的方法，其中至少两个突变的组合的作用使得细胞存活力增强。
21.自发突变频率降低和/或细胞存活力增强并且可通过权利要求1-20之一的方法获得的细胞，其中所述细胞包含至少两个突变，其组合的作用导致至少两种增强的细胞DNA修复机制。
22.权利要求21的细胞，其中所述细胞是细菌，真菌，植物或动物细胞。
23.自发突变频率降低并可通过权利要求1-20之一的方法获得的生物体，其中所述生物体的细胞包含至少两个突变，其组合的作用导致至少两种增强的细胞DNA修复机制。
24.大肠杆菌MG1655dinB10，其含有质粒pmutL(DSM 17016)。
25.大肠杆菌MG1655dinB10 mutL∷tet，其含有质粒pmutL(DSM17017)。
26.大肠杆菌MG1655 dnaE zae∷cm，其含有质粒pmutL(DSM 17018)。
27.大肠杆菌MG1655 dnaE zae∷cm mutL∷tet，其含有质粒pmutL(DSM 17019)。
28.大肠杆菌MG1655dinB10 dnaE zae∷cm(DSM 17015)。
29.大肠杆菌MG1655dinB10 dnaE zae∷cm mutL∷tet(DSM 17014)。
30.大肠杆菌MG1655dinB10 dnaE zae∷cm，其含有质粒pmutL(DSM17020)。
31.大肠杆菌MG1655dinB10 dnaE zae∷cm mutL∷tet，其含有质粒pmutL(DSM 17021)。
32.产生蛋白质表达系统的方法，其中所述蛋白质的氨基酸序列针对自发出现的突变而被稳定化，所述包括：
a)在允许所述蛋白的诱导型或组成型表达的一或多种调控单元的功能控制下，将编码蛋白质的核酸序列插入宿主细胞基因组，该宿主细胞基因组中含有至少两个突变，其组合的作用导致至少两种细胞DNA修复机制修复自发出现的突变的能力增强，或
b)在允许所述蛋白的诱导型或组成型表达的一或多种调控单元的功能控制下，将编码所述蛋白的核酸序列插入载体并将所述载体转移到宿主细胞中，该宿主细胞含有至少两个突变，其组合的作用导致至少两种细胞DNA修复机制修复自发出现的突变的能力增强，和
c)在适宜培养基中培养和/或维持所述宿主细胞。
33.制备蛋白质的方法，其中所述蛋白质的氨基酸序列针对自发出现的突变而被稳定化，所述方法包括：
a)在允许所述蛋白的诱导型或组成型表达的一或多种调控单元的功能控制下，将编码蛋白质的核酸序列插入宿主细胞基因组，该宿主细胞基因组中含有至少两个突变，其组合作用导致至少两种细胞DNA修复系统修复自发出现的突变的能力增强，或
b)在允许所述蛋白的诱导型或组成型表达的一或多种调控单元的功能控制下，将编码所述蛋白的核酸插入载体，并将所述载体转移到宿主细胞中，该宿主细胞含有至少两个突变，其组合作用导致至少两种细胞DNA修复系统修复自发出现的突变的能力增强，和
c)在允许所述蛋白质表达的条件下于适宜培养基中培养所述宿主细胞，和
d)分离表达的蛋白质。
34.权利要求33的方法，其中所述蛋白质分离自培养基。
35.权利要求33的方法，其中所述蛋白质提取自宿主细胞。
36.权利要求32-35之一的方法，其中所述蛋白质是可用于治疗的蛋白质，具体是细胞因子或生长因子。
37.权利要求32-36之一的方法，其中所述载体是质粒，噬菌体或粘粒。
38.权利要求32-37之一的方法，其中所述调控单元是启动子，核糖体结合位点，增强子，沉默子和/或3’-转录终止子。
39.权利要求32-38之一的方法，其中编码所述蛋白质的核酸序列在功能上连接于前导序列，该前导序列指导表达的蛋白质转运到细胞器，细胞隔室，细胞外间隙或进入培养基。
40.制备发酵产物的方法，其通过在培养基中培养产生发酵产物和/或至少一种参与发酵产物形成的酶的细胞来进行，其中该细胞的基因组通过至少两个突变针对自发出现的序列改变而被稳定化，所述突变的组合的作用导致至少两种细胞DNA修复机制修复自发出现的突变的能力增强。
41.权利要求40的方法，其中所述发酵产物是核酸，核苷，核苷酸，氨基酸，蛋白质，酸，碳水化合物，维生素，抗生素或生物碱。
42.权利要求32-41之一的方法，其中所述错配修复系统，校对功能和/或SOS修复系统修复自发出现的突变的能力增强。
43.权利要求32-42之一的方法，其中所述至少两个突变选自导致MutL蛋白或其同源蛋白的表达上调的突变，导致MutS蛋白或其同源蛋白的表达上调的突变，编码DNA聚合酶IV或其同源蛋白的基因的抗增变基因等位基因，以及编码DNA聚合酶III的亚基或其同源蛋白的基因的抗增变基因等位基因。
44.权利要求43的方法，其中MutL，MutS或其同源蛋白的表达上调是由于载体在细胞内的存在，所述载体包含MutL基因，编码MutL同源蛋白的基因，MutS基因或编码MutS同源蛋白的基因，所述基因处在允许MutL，MutS或其同源蛋白过表达的一或多种调控单元的功能控制下。
45.权利要求43的方法，其中MutL，MutS或其同源蛋白的表达上调通过将在一或多种调控单元的功能控制下的各种mut基因的一或多个附加拷贝导入宿主细胞染色体和/或通过将一或多个突变导入控制天然Mut蛋白的表达的调控单元来实现，使得与相应的野生型细胞相比各种Mut蛋白的生成增加。
46.权利要求43的方法，其中所述编码DNA聚合酶IV的基因的抗增变基因等位基因是dinB10。
47.权利要求43的方法，其中所述编码DNA聚合酶III的亚基的基因的抗增变基因等位基因是dnaE911。
48.权利要求32-47之一的方法，其中dinB10和dnaE911的组合的作用使得与野生型细胞相比自发突变频率降低至少10倍。
49.权利要求32-48之一的方法，其中dinB10，dnaE911和过表达的mutL的组合作用使得与野生型细胞相比自发突变频率降低至少50倍。
50.权利要求32-49之一的方法，其中至少两个突变的组合作用使得细胞存活力增强。
51.权利要求32-50之一的方法，其中所述细胞是原核或真核细胞。
52.权利要求51的方法，其中所述细胞是革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌的细胞。
53.权利要求51的方法，其中所述细胞是真菌细胞，动物细胞或植物细胞。
54.权利要求32-53之一的方法，其中所述细胞是权利要求21，22，或24-31之一的细胞或可通过权利要求1-20之一的方法获得的细胞。
55.权利要求32-54之一的方法，其中所述细胞培养在液体培养基中。
56.权利要求55的方法，其中所述细胞在连续培养或分批培养中培养。
57.权利要求32-56之一的方法，其中所述细胞是固定化的。
58.权利要求32-54之一的方法，其中所述细胞培养在固体或半固体培养基上。
59.权利要求40一58之一的方法，其中所述发酵产物分离自细胞。
60.权利要求40-58之一的方法，其中所述发酵产物分离自培养基。
61.蛋白质，其可通过权利要求32-60的方法之一获得。
62.发酵产物，其可通过权利要求40-60之一的方法获得。
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