EA009058B1

EA009058B1 - Уменьшение частоты спонтанных мутаций в клетках

Info

Publication number: EA009058B1
Application number: EA200601557A
Authority: EA
Inventors: Хайке Штробель; Вольфганг Шенфельд
Original assignee: Миксис Франс С.А.
Priority date: 2004-02-26
Filing date: 2005-02-26
Publication date: 2007-10-26
Also published as: WO2005083108A1; AU2011201470A1; ZA200606111B; EP1718758A1; JP2007523657A; CN1989255A; CA2557729A1; KR20070007288A; AU2005217094A1; JP2012115276A; EA200601557A1; NZ548685A; US20070184520A1

Abstract

Настоящее изобретение относится к способам уменьшения частоты спонтанных мутаций в клетках или организмах, к способам получения таких клеток и организмов, к клеткам и/или организмам с уменьшенной частотой спонтанных мутаций, к способам создания экспрессирующих систем для белков, к способам продуцирования белков и продуктов ферментации с использованием клеток с уменьшенной частотой спонтанных мутаций.

Description

Мутация является отличительным признаком живых систем и создает материал для естественной селекции. Такие организмы как бактерии постоянно подвергаются спонтанным мутациям. Частота мутаций изменяется в широких пределах в зависимости от организма, например от величины определенного гена и чувствительности гена к инактивации парой оснований в положениях замещения. В ЕксБепсЫа со11 число мутаций в геноме на одну репликацию генома равно μ_μ = 0,0025, и частота мутаций в паре оснований на одну репликацию соответствует μι_|:, = 5,4 х 10^-10 при величине генома, составляющей 4,6 х 10⁶пар оснований. Частота мутаций даже в одном хорошо определенном пути, таком как С-С^А-Т. может изменяться более 2000 раз на разных сайтах в одном гене, главным образом под мало изученным влиянием последовательности локальной ДНК и структуры ДНК. Как типы мутаций, так и вызывающие их процессы являются весьма разнобразными и исследованы лишь частично.

Мутации имеют также важное значение в многоклеточных организмах. Однако здесь необходимо различать два разных типа изменений генетического материала, а именно мутации в гаметах, то есть гаметические мутации, и изменения в клетках организма, то есть соматические мутации. Если гаметические мутации передаются по наследству, то соматические мутации таким свойством не обладают. Однако соматические мутации могут иметь важное значение, так как они способствуют развитию рака.

При обнаружении гаметических мутаций, в частности, у человека, и измерении частоты мутаций у человека возникают трудности, связанные с проблемой диплоидии. Большинство прямых мутаций являются рецессивными, и поэтому не могут быть обнаружены, если в зиготе не образуются две копии мутантного аллеля. Реверсии обычно происходят гораздо реже, так как существует намного больше способов мутации гена по сравнению с реверсией существующей мутации. В результате выполнения исследований ίη νίνο с использованием клеток человека ίη νίίτο установлено, что общая частота мутаций у человека аналогична частоте мутаций, измеренной в разных прокариотических и эукариотических микроорганизмах.

Мутации, такие как наследуемые изменения генетического материала, могут представлять собой обширные мутации, в частности, на уровне хромосомы, или точковые мутации, которые не могут рассматриваться как цитологические аномалии. Точковые мутации включают в себя замены пар оснований, такие как транзиции, трансверсии и мутации со сдвигом рамки. Последствия мутаций, связанных с заменой оснований, в областях, кодирующих белок гена, зависят от типа замены и ее места. Такие замены пар оснований могут быть молчащими, то есть не вызывающими появления нового аминокислотного остатка в белковой последовательности. Однако они могут также вызывать замену аминокислот. Такие миссенсмутации могут иметь очень серьезные последствия, как, например, в случае серповидно-клеточной анемии, незначительные последствия или могут вообще не иметь последствий. И наконец, замены оснований в области, кодирующей белок, могут вызывать мутацию аминокислотного кодона с превращением в терминирующий кодон или наоборот. Мутация первого типа, вызывающая образование преждевременно укороченного белка, определяется как нонсенс-мутация. Мутации, связанные с заменой оснований, могут также возникать в последовательностях, участвующих в регуляции экспрессии гена, например в промоторах, 5'-концевых регуляторных областях генов или в интронах, и могут влиять на их транскрипцию, трансляцию или сплайсинг. Многие β-талассемии являются результатом неструктурных мутаций данного типа, которые влияют на уровень экспрессии генов гемоглобинов. Мутации со сдвигом рамки возникают в результате инсерции или делеции одного или нескольких (но не более трех) нуклеотидов в кодирующей области гена. Подобная мутация вызывает изменение рамки считывания. Мутация такого типа изменяет все аминокислоты в нижней области и с высокой степенью вероятности создает нефункциональный продукт, так как такой белок может существенно отличаться от нормального белка.

Спонтанные мутации могут возникать в результате естественных процессов в клетке, и их следует отличать от индуцированных мутаций, то есть от мутаций, возникающих в результате взаимодействия ДНК с внешним агентом или мутагеном. Важным источником спонтанных мутаций являются ошибки в репликации ДНК, например, возникающие вследствие неправильного действия ДНК-полимеразы. Частота, с которой ДНК-полимеразы вызывают ошибки, влияет на частоту спонтанных мутаций, при этом было установлено, что разные ДНК-полимеразы обладают разной степенью точности. Одним важным фактором, влияющим на точность ДНК-полимеразы, является наличие исправляющей ошибки 3'-5'-концевой экзонуклеазы, которая удаляет неправильно спаренные основания, вставленные полимеразой. Функцией 3'-5'-концевой экзонуклеазы является предотвращение неправильного введения оснований во время репликации ДНК и мутаций.

Другим важным источником спонтанных мутаций являются структурные изменения оснований нуклеиновых кислот, именуемые таутомеризацией. Основания могут существовать в двух формах, с превращением из одной формы в другую, и наоборот. Например, гуанин может существовать в кето-форме и

- 1 009058 форме енола. Разные таутомерные формы оснований обладают разными свойствами спаривания. Если во время репликации ДНК остаток С находится в форме енола, ДНК-полимераза добавляет к нему остаток Т вместо нормального остатка С. Поэтому таутомеризация является причиной транзиций. Другим мутагенным процессом, происходящим в клетках, является спонтанное разрушение оснований. В клетках достаточно часто происходит дезаминирование цитозина, с образованием урацила. Дезаминирование может быть устранено в результате специального процесса репарации, который позволяет обнаружить урацил, обычно отсутствующий в ДНК; в противном случае произойдет спаривание и с А, которое может вызвать транзицию С:С в Т:А во время репликации ДНК. Третьим типом часто возникающего спонтанного повреждения ДНК является разрушение оснований свободными радикалами кислорода. Указанный процесс возникает в клетках в результате окислительного метаболизма, а также вызывается физическими агентами, такими как радиация. Важным продуктом окисления является 8-гидроксигуанин, который ошибочно спаривается с аденином, вызывая трансверсии С:С в Т:А. Еще одним типом спонтанного повреждения ДНК является алкилирование, добавление алкильных групп к основаниям или остову ДНК. Алкилирование происходит в результате взаимодействия с ДНК таких соединений как 8аденозилметионин. Алкилированные основания могут подвергаться спонтанному разрушению или ошибочному спариванию.

Кроме того, спонтанные мутации со сдвигом рамки могут быть также вызваны механизмом, именуемым смещенным ошибочным спариванием между матричной цепью и вновь синтезированной цепью во время репликации ДНК.

Спонтанные мутации возникают произвольно на любом сайте генома, при этом большинство спонтанных мутаций являются вредными для пораженного организма, и вероятность появления благоприятной мутации очень низка. Поэтому организмы создали механизмы самозащиты от слишком большой частоты мутаций. Такие защитные механизмы распознают и исправляют ошибочные спаривания, возникшие в ДНК в результате репликации или спонтанного дезаминирования ДНК, а также распознают и удаляют потенциально мутагенные изменения, происходящие в результате взаимодействия ДНК с экзогенными или эндогенными мутагенами.

В частности, мутации являются крайне нежелательными в биотехнологических процессах, таких как процессы ферментации. Поскольку мутации могут возникать в любой части генома ферментирующей клетки, они могут влиять на образование или состав продукта ферментации. Например, если продуктом ферментации является белок, мутация последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей данный белок, может вызывать образование варианта белка с измененной аминокислотной последовательностью. Даже если мутация возникает в незначительной части ферментирующих клеток, это может привести к получению конечного белка, загрязненного таким вариантом. Подобный результат может иметь серьезные непредсказуемые последствия в тех случаях, когда белок предназначен для лечения человека, например, при изменении антигенных свойств белка. Возникновение мутаций в популяции ферментирующих клеток может также повлиять на скорость образования продукта, если, например, такая мутация поражает регуляторный путь в верхней области, в частности, фермент, участвующий в образовании продукта ферментации, или регуляторную единицу, контролирующую экспрессию требуемого продукта ферментации.

Кроме того, даже если мутации являются редкими и поражают лишь незначительную часть популяции ферментирующих клеток, такие мутации могут быстро распространяться в такой популяции, если они сообщают пораженным клеткам избирательное преимущество по сравнению с немутировавшими клетками. В частности, в непрерывных культурах с постоянным удалением клеток для поддержания устойчивого состояния при длительном культивировании может происходить постепенное сокращение числа немутировавших клеток по сравнению с мутировавшими клетками.

Другой причиной, по которой мутации, в частности, в процессе ферментации, являются весьма нежелательными, является феномен так называемой мутации в стационарной фазе, который именуется также адаптивной мутацией. Когда популяции микроорганизмов подвергают нелетальному отбору во время стационарной фазы ферментации, очень часто возникают мутации, ослабляющие давление отбора (Са1ти8 е! а1., Сспсбех. 128 (1991), 695-701). Даже если первоначально кажется, что возникают только полезные мутации, в настоящее время установлено, что отобранные мутации сопровождаются неотобранными мутациями, то есть данный процесс не направлен на полезные гены (Ройег, 1. Вас1етю1., 179 (1997), 1550-1554). Большинство исследований в области адаптивных мутаций было выполнено с использованием штамма ЕксйепсЫа сой, который не может утилизировать лактозу (Бас^-) , но легко приобретает такую способность (Ьас⁺), когда лактоза является единственным источником углерода. Процесс возникновения адаптивной мутации не аналогичен процессу, вызывающему мутации Ьас⁺ во время нормального роста. В отличие от мутаций, обусловленных ростом, почти все адаптивные мутации Ьас⁺ зависят от функций рекомбинации, таких как гомологичная функция рекомбинации системы репарации двунитевого разрыва (Ό8Β) РесВСЭ Е.сой (Саппк е! а1., СепеДск, 128 (1991), 695-701; Ро81ет, Аппи. Реу. М1стоЫо1., 47 (1993), 467-504; Нате е! а1., 8аепсе, 264 (1994), 258-260).

Поэтому техническая проблема, лежащая в основе настоящего изобретения, состоит в создании средств и способов продуцирования клеткой или организмом продукта ферментации, такого как белок,

- 2 009058 которые защищают и/или стабилизируют клетку или организм от спонтанных мутаций, в частности, во время стационарной фазы процесса ферментации, благодаря чему в течение длительного времени сохраняется постоянная скорость образования и состав продукта ферментации, такого как белок.

Настоящее изобретение позволяет решить вышеуказанную техническую проблему благодаря созданию способа уменьшения частоты спонтанных мутаций в клетке или организме путем введения в указанную клетку или организм по меньшей мере двух мутаций, объединенное действие которых вызывает усиление по меньшей мере двух механизмов репарации клеточной ДНК.

Настоящее изобретение позволяет также решить вышеуказанную техническую проблему благодаря созданию способа получения клетки или организма с уменьшенной частотой спонтанных мутаций путем введения по меньшей мере в одну клетку организма по меньшей мере двух мутаций, объединенное действие которых вызывает усиление по меньшей мере двух механизмов репарации клеточной ДНК, если такой организм является многоклеточным организмом.

В соответствии с настоящим изобретением, способность механизмов репарации клеточной ДНК исправлять спонтанные мутации значительно усиливается при введении в клетку по меньшей мере двух разных мутаций, которые воздействуют на разные системы репарации. Усиление способности механизмов репарации клеточной ДНК исправлять спонтанные мутации, достигаемое в результате введения по меньшей мере двух разных мутаций согласно настоящему изобретению, уменьшает частоту устойчиво наследуемой мутации в клетке и, следовательно, общую частоту мутаций.

Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением, было обнаружено, что в результате изменения определенных механизмов репарации клеточной ДНК, в частности, путем введения специфических мутаций, усиливающих способность указанных систем репарации ДНК более эффективно исправлять спонтанные мутации, можно значительно уменьшить частоту спонтанных мутаций в клетках дикого типа. Например, в соответствии с настоящим изобретением, было обнаружено, что сверхэкспрессия белка Ми18 во время фазы роста значительно уменьшает мутабильность клетки-хозяина. Однако подобный вывод противоречит результатам, ранее полученным в данной области. В патенте США № 6656736 указано, что сверхэкспрессия диких или мутантных белков ММК. в дрожжах или других организмах вызывает нарушение системы репарации ошибочно спаренных оснований, в результате чего дрожжевые клетки с такой нарушенной системой репарации ошибочно спаренных оснований становятся гипермутабильными. Кроме того, бактериальный штамм, несущий делецию άίπΒΙΰ и аллель-антимутатор биаЕ911, характеризуется 10-кратным уменьшением мутабильности по сравнению с соответствующим штаммом дикого типа. Дополнительная сверхэкспрессия белка Ми1Ь, имеющего непосредственное отношение к системе репарации ошибочно спаренных оснований, снижает мутабильность в 50 раз. Можно показать, что в другой системе реверсия специфических мутаций со сдвигом рамки может быть уменьшена даже в 1000 раз. Подобным образом можно значительно уменьшить не только частоту мутаций, обусловленных ростом, но и частоту адаптивных мутаций, то есть частоту мутаций, обусловленных стационарной фазой. Весьма удивительным является то, что влияние нескольких мутаций на частоту спонтанных мутаций в клетке-хозяине носит синергичный, а не аддитивный характер.

Кроме того, в соответствии с настоящим изобретением было обнаружено, что введение указанных мутаций не только усиливает способность механизмов репарации клеточной ДНК исправлять спонтанные мутации, но и значительно повышает жизнеспособность клетки. Например, было установлено, что сверхэкспрессия белка Ми1Ь в ферментирующем бактериальном штамме повышает жизнеспособность клетки примерно в 10³ раз.

Уменьшение частоты спонтанных мутаций в клетках и повышение жизнеспособности клеток согласно настоящему изобретению путем введения нескольких мутаций, усиливающих способность механизмов репарации клеточной ДНК исправлять спонтанно возникающие мутации, имеет, в частности, важное значение для клеток или штаммов, используемых для экспрессии и/или образования продуктов ферментации, таких как белки. При использовании таких клеток аминокислотная последовательность полученных белковых продуктов может оставаться неизменной на протяжении многих поколений продуцирующих клеток или организмов. Белковые препараты, полученные с использованием таких клеток, не загрязняются вариантами белка вследствие мутации и поэтому не создают проблем при применении в качестве лечебных средств и не вызывают нежелательных эффектов в организме реципиента. Использование клеток согласно настоящему изобретению с усиленными механизмами репарации клеточной ДНК является особенно полезным при продуцировании рекомбинантных белков.

Однако использование клеток согласно настоящему изобретению с усиленными механизмами репарации клеточной ДНК не ограничено продуцированием белков ферментирующими клетками. Клетки согласно настоящему изобретению можно использовать для получения продуктов ферментации всех типов, таких как антибиотики, органические кислоты и т.д. Значительно уменьшенная частота спонтанных мутаций в таких клетках позволяет не только сохранять постоянный состав продукта в течение длительного времени, но и поддерживать высокие темпы образования продукта, так как благодаря уменьшению частоты мутаций в клетках-хозяевах стабильными и неизменными остаются факторы, контролирующие эффективную скорость образования продукта.

В контексте настоящего изобретения термин мутация, усиливающая механизм репарации клеточ

- 3 009058 ной ДНК, означает любое наследуемое изменение той части генома клетки, которая кодирует белки или ферменты, относящиеся по меньшей мере к одному специфическому механизму репарации ДНК, или любое наследуемое изменение той части генома, которая участвует в регуляции экспрессии компонентов механизма репарации клеточной ДНК, определяющих лучшее узнавание и исправление ошибок в геноме клетки или организма, произошедших в ДНК вследствие репликации, спонтанного дезаминирования ДНК или любых других естественных процессов, вызывающих спонтанные мутации. Поэтому мутация, усиливающая механизм репарации клеточной ДНК, обеспечивает более эффективную и более точную коррекцию спонтанно возникающих ошибок в геноме данной клетки или организма.

Поэтому мутация, усиливающая механизм репарации клеточной ДНК, уменьшает частоту устойчиво наследуемых мутаций в популяции, то есть уменьшает частоту мутаций в такой популяции. В контексте настоящего изобретения термин частота мутаций определяется как отношение числа мутаций к общему числу особей в популяции. Мутация, усиливающая механизм репарации клеточной ДНК, также уменьшает частоту мутаций, определяемую как вероятность мутации данного гена во время репликации и устойчивое наследование данной мутации гена. Кроме того, в контексте настоящего изобретения мутация, усиливающая механизм репарации клеток ДНК, вызывает также уменьшение мутагенеза, опосредуемого транспозоном.

Поэтому благодаря наличию мутации, усиливающей механизм репарации клеточной ДНК, клетка или организм характеризуется очень низкой частотой спонтанных мутаций, которая, в частности, является значительно ниже аналогичного показателя соответствующей клетки или организма без мутации. Мутации, усиливающие механизм репарации клеточной ДНК, включают, не ограничиваясь ими, делеции структурных генов, кодирующих ферменты, участвующие в репарации клеточной ДНК, например, делецию структурного гена вызывающей ошибки ДНК-полимеразы; замены, делеции, инверсии и/или добавления оснований в структурном гене, кодирующем фермент, участвующий в репарации клеточной ДНК, которые, например, могут создавать антимутаторный фенотип или повышать точность ДНК-полимеразы, вызывать сверхэкспрессию белка, продуцирование которого сокращается во время определенной фазы роста, дифференцировки или размножения клетки или организма, уменьшать экспрессию белка, например, вызывающей ошибки ДНК-полимеразы и т.д. Из контекста настоящего изобретения следует, что каждая отдельная мутация, усиливающая механизм репарации клеточной ДНК, может также усиливать второй или третий механизм репарации клеточной ДНК. Кроме того, каждая отдельная мутация, усиливающая механизм репарации клеточной ДНК, может также повышать жизнеспособность клетки.

В контексте настоящего изобретения термин две мутации, объединенное действие которых вызывает усиление по меньшей мере двух механизмов репарации клеточной ДНК означает, что обе мутации влияют по меньшей мере на два разных механизма репарации ДНК, благодаря чему указанные системы репарации ДНК приобретают способность более эффективно и/или более точно исправлять спонтанно возникающие мутации в геноме по сравнению с немутировавшими системами репарации ДНК.

В контексте настоящего изобретения термин механизм репарации клеточной ДНК означает ферментативный механизм или систему, с помощью которых клетка или организм может распознавать и исправлять любую ошибку в геноме, возникающую в результате репликации ДНК и/или измененений и повреждений оснований. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения указанные механизмы репарации клеточной ДНК включают систему репарации ошибочно спаренных оснований, систему пострепликативной (рекомбинационной) репарации и систему 808-репарации. Мутации, усиливающие репарацию ошибочно спаренных оснований, в частности, представляют собой такие мутации, которые позволяют устранить ситуацию, когда сокращается количество одного из белков, участвующих в репарации ошибочно спаренных оснований.

На долю системы репарации ошибочно спаренных оснований (ММК) приходится 99% всех случаев репарации в клетках. Указанная система в наибольшей степени способствует точности репликации в Е. сой, где она также использует другие пути репарации ДНК, привлекая свои белки к репарации ДНК в процессе транскрипции и репарации очень коротких участков. ММК также усиливает генетическую устойчивость, подавляя рекомбинацию между случаями неточной гомологии, которая в противном случае может вызывать перестройку генома. Репарация ошибочно спаренных пар также стимулирует генетическую устойчивость, редактируя вырезание транспозонов. Гомологи белков ММК Е.сой выполняют аналогичные функции в других бактериях, дрожжах, мышах и человеке (Мобпсй 8с1епсе, 266 (1994), 19591960; Кабшап е! а1., РЫ1. Тгапк. К. 8ос. Ьопбоп, 347 (1995), 97-103). В Е.сой в ММК участвуют генные продукты ши1Н, ти1Ь, ти!8 и ши1и. Система узнает вновь синтезированную цепь, а не исходную цепь благодаря метилированию. Генный продукт ши!8 узнает ошибочно спаренные основания ДНК и связывается с ними. Генный продукт пиПЙ взаимодействует с Ми!8 после связывания с ошибочно спаренными основаниями и, как считается, координирует Ми!8 с Ми!Н. Затем экзонуклеаза Ми!Н разрывает неметилированную новую цепь ДНК. Хеликаза Ми1И проникает в ДНК на месте одноцепочечного разрыва и заменяет разорванную цепь. Мутации, усиливающие репарацию ошибочно спаренных пар, в частности, представляют собой такие мутации, которые позволяют устранить ситуацию, когда сокращается количество одного из белков, участвующий в репарации ошибочно спаренных оснований.

Система пострепликативной репарации представляет собой систему, которая устраняет поврежде

- 4 009058 ния ДНК в следующем цикле репликации. В результате репликации поврежденной ДНК в дочерних цепях образуются разрывы. Отсутствующая генетическая информация заполняется соответствующими областями ДНК из родительской цепи путем рекомбинации. Репликация поврежденной ДНК, процесс, который именуется также синтезом с замещением разрывов, является основным источником точковых мутаций. В последнее время было достигнуто гораздо большее понимание указанного процесса благодаря идентификации участвующих в нем ДНК-полимераз (ГпебЬегд с1 а1., Ргос. №111. Асаб. 8с1. И8А, 97 (2000), 5681-5683).

Реакция 808 представляет собой совокупность клеточных реакций, индуцируемых клетками под воздействием разных генотоксических и метаболических стрессов, которые обычно препятствуют репликации ДНК. Действие системы 808-репарации опосредовано белками ЬехЛ и ВесА. Белок ЬехЛ действует в качестве репрессора примерно 30 разных генов, включая гесА и 1ехА. Сигнал 808 индуцирует одноцепочечная ДНК, с которой связывается К.есА и активируется в виде копротеазы (Вес А*). Вес А* стимулирует протеолитическое саморасщепление репрессора 1ехА и некоторых репрессоров фага, осуществляя таким образом дерепрессию регулона 808. ЕксйепсЫа сой имеет по меньшей мере три 808индуцибельные полимеразы: полимераза II (Ро1 II), полимераза IV (Ро1 IV) и полимераза V (Ро1 V).

В соответствии с настоящим изобретением по меньшей мере две мутации выбирают из мутации, повышающей экспрессию белка Ми1й или гомологичного белка, из мутации, повышающей экспрессию белка Ми18 или гомологичного белка, аллеля-антимутатора гена, кодирующего ДНК-полимеразу IV или гомологичный белок, и аллеля-антимутатора гена, кодирующего субъединицу ДНК-полимеразы III или гомологичного белка. В контексте настоящего изобретения термин аллель-антимутатор означает аллель, который вызывает уменьшение частоты спонтанных мутаций в клетке или организме по сравнению с соответствующей клеткой дикого типа.

В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения повышение экспрессии Ми1Ь или гомологичного белка и экспрессии Ми18 или гомологичного белка достигается путем введения в клетку вектора, содержащего ген ти1Ь или ген, кодирующий гомологичный белок Ми1Ь, и ген ти(8 или ген, кодирующий гомологичный белок Ми18, под функциональным контролем одной или нескольких регуляторных единиц, обеспечивающих сверхэкспрессию соответствующего белка Ми1. Указанный вектор предпочтительно является многокопийной плазмидой. Регуляторная единица предпочтительно является индуцибельным или конститутивным промотором.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения повышение экспрессии Ми1Ь или гомологичного белка и экспрессии Ми18 или гомологичного белка достигается путем изменения указанных регуляторных единиц, направляющих экпрессию нативного белка Ми1 клетки-хозяина или организма-хозяина на продуцирование клеткой больших количеств нативного белка Ми1 по сравнению с обычно продуцируемыми количествами. Из вышеизложенного следует, что регуляторные единицы, направляющие транскрипцию локализованной в хромосоме нативной нуклеотидной последовательности, кодирующей соответствующий белок Ми1. в комплементарную последовательность РНК, и/или трансляцию полученной кодирующей последовательности РНК в полипептидную цепь белка Ми1, мутируют или заменяются другими приемлемыми гомологичными или гетерологичными регуляторными единицами с достижением более высокого продуцирования нативного белка Ми1 по сравнению с имеющим место в соответствующей клетке или организме дикого типа.

В другом варианте осуществления изобретения сверхэкспрессия соответствующего белка Ми1 достигается путем введения одной или нескольких дополнительных копий соответствующего гена ти1 под функциональным контролем соответствующих регуляторных единиц в хромосому (хромосомы) клеткихозяина, при этом дополнительный ген(ы) ιηιιΐ может быть нативным или гетерологичным геном, выделенным из другого вида.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения аллель-антимутатор гена, кодирующего ДНК-полимеразу IV или гомологичный белок, представляет собой б1пВ10, который фактически является делецией гена 6ίηΒ. б1пВ-кодированная ДНК-полимераза IV (Ро1 IV) относится к недавно идентифицированному Υ-семейству или семейству нуклеотидилтрансфераз ИтиС/ОшВ вызывающих ошибки ДНКполимераз. Указанное семейство представлено подсемействами ИтиС, ΌίηΒ, Ваб30 и Веу1 (Оег1асй е1 а1., Ргос. №111. Асаб. 8сг И8А, 96 (1999), 11922-11927). Установлено, что бшВ-кодированная ДНКполимераза IV Е.сой участвует в спонтанном мутагенезе и в процессе репликации поврежденной ДНК, который известен как синтез с замещением разрывов (ТЬ8) и является основным источником точковых мутаций. Подобно ДНК-полимеразе V полимераза IV также индуцируется как часть реакции 808 на повреждение ДНК.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения использован аллель-антимутатор гена, кодирующего субъединицу ДНК-полимеразы III, который предпочтительно является бпаЕ911. На долю холофермента ДНК-полимеразы III (Ро1 III НЕ) приходится более 90% синтеза клеточной ДНК, и указанный фермент необходим также для пострепликативного исправления ошибочно спаренных оснований. Установлено, что холофермент полимераза III эффективно осуществляет синтез ДНК с замещением разрывов после неосновных сайтов. Ген бпаЕ Е.соИ кодирует α-субъединицу холофермента ДНК

- 5 009058 полимеразы III, которая сообщает активность полимеразе. Поэтому α-субъединица является одним из главных определителей точности. В публикации Е|)а1ко\\ъка апб §сйаарет, I. Васй., 177 (1995), 5979-5986, описаны несколько аллелей-антимутаторов бпаЕ, которые подавляют повышенную мутабильность штамма с дефектным геном шийЬ, подвергнутым репарации ошибочно спаренных оснований.

В соответствии с настоящим изобретением объединенное действие мутаций бшВ10 и бпаЕ911 уменьшает частоту спонтанных мутаций в клетке по сравнению с клеткой или организмом дикого типа по меньшей мере в 10 раз. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения объединенное действие бшВ10, бпаЕ911 и сверхэкспрессированного белка МийЬ уменьшает частоту спонтанных мутаций в клетке по сравнению с клеткой или организмом дикого типа по меньшей мере в 50 раз.

По меньшей мере две мутации, объединенное действие которых усиливает механизмы репарации клеточной ДНК и/или повышает жизнеспособность клетки, могут быть введены в клетку любым известным методом, в частности, путем мутагенеза данной клетки с целью мутации гена, который, как известно, относится к одной из систем репарации клеточной ДНК, или путем введения уже известных мутаций или аллелей в указанную клетку.

Существует целый ряд разных методов мутагенеза, которые включают, не ограничиваясь ими, неспецифический мутагенез, сайт-направленный мутагенез, мутагенез олигонуклеотидного кластера или точковый мутагенез при помощи вызывающей ошибку РСК. Неспецифический мутагенез, например, вызывает образование большого числа произвольно распределенных мутаций с заменой нуклеотидов во фрагментах клонированной ДНК в результате обработки химическими веществами, такими как азотистая кислота, гидразин и т.д. Была создана вызывающая ошибку РСК. для введения произвольных точковых мутаций в клонированные гены. Модификации, которые уменьшают точность реакции РСК, включают увеличение концентрации МдОЕ. добавление МдСТ или изменение относительных концентраций четырех 6ΝΤΡ. Указанные традиционные методы мутагенеза сфокусированы на изменении отдельных генов, обладающих дискретными и селектируемыми фенотипами. Сущность данных методов заключается в клонировании гена, выполнении анализа, позволяющего контролировать ген и/или его функцию, мутировании выбранных положений в гене и отборе вариантов гена для изменения функции данного гена. Вариант, обладающий измененными функциями, затем может быть введен и экспрессирован в клетке желаемого типа. Для получения требуемых функций гена могут быть выполнены повторные циклы методов мутагенеза. Другим методом изменения функции гена является рекомбинация с использованием одной из многочисленных хорошо известных систем.

В соответствии с целями настоящего изобретения можно использовать уже существующие аллели или мутации. Такие существующие аллели или мутации могут быть введены в клетку любыми известными методами. По меньшей мере две мутации согласно настоящему изобретению можно ввести в клетку любыми известными приемлемыми методами, которые включают, не ограничиваясь ими, трансформацию, конъюгацию, трансдукцию, сексдукцию, инфицирование и/или электропорацию.

В контексте настоящего изобретения термин трансформация означает поглощение клеткой, например, микробной клеткой, выделенной предпочтительно очищенной молекулы нуклеиновой кислоты из окружающей среды. Термин конъюгация означает опосредуемый плазмидой перенос бактериальной плазмиды из одной бактериальной клетки в другую бактериальную клетку в результате межклеточного контактирования. Механизм переноса обычно кодируется плазмидами или конъюгирующими транспозонами. Примерами таких плазмид являются конъюгирующие или хелперные плазмиды. Конъюгация является одним из основных путей генетического обмена между разными филогенетическими группами прокариотических клеток и между прокариотами и эукариотами. Термин трансдукция означает перенос молекулы нуклеиновой кислоты из одной бактериальной клетки в другую бактериальную клетку бактериофагом, который включает высвобождение бактериофага из одной клетки и последующее инфицирование другой клетки. Существуют два типа трансдукции. Специализированная трансдукция может происходить во время лизогенного жизненного цикла умеренного бактериофага, в результате чего генетический материал бактерий может заменить часть генома бактериофага. Указанный фрагмент бактериальной ДНК, реплицирующийся в виде части генома фага, может быть перенесен фагом в другую клеткуреципиент. В случае генерализованной трансдукции весь геном литического фага может быть заменен бактериальной ДНК. Термин электропорация означает способ, в соответствии с которым клетки смешивают с молекулами нуклеиновой кислоты и затем в течение короткого времени подвергают воздействию импульсов высокого электрического напряжения. Мембрана клетки-хозяина становится проницаемой, позволяя чужеродным нуклеиновым кислотам проникать в указанную клетку-хозяина.

Клетка, используемая в способе уменьшения частоты спонтанных мутаций согласно настоящему изобретению и в способе создания клетки или организма с уменьшенной частотой спонтанных мутаций согласно настоящему изобретению, может быть любой прокариотической или эукариотической клеткой.

Термины эукариотическая клетка и эукариотическая клетка-хозяин означают любые клетки, которые имеют мембраносвязанное ядро, органеллы и генетический материал, локализованный в хромасомах, где ДНК объединена с гистонами. Цитоскелет является другим отличительным признаком, присущим эукариотам, который представляет собой сеть белковых нитей, состоящих в основном из актина и тубулина, которые присоединены к клеточной мембране и пересекают периферию клетки. Эукариоты

- 6 009058 включают таксономические царства одноклеточных организмов, грибов, растений и животных. Эукариоты могут представлять собой одноклеточные организмы, такие как протисты, например парамеции и амебы, или многоклеточные организмы, такие как разнообразные грибы, животные и растения. Предпочтительный вариант осуществления способов уменьшения частоты спонтанных мутаций согласно настоящему изобретению относится к использованию животных клеток, растительных клеток или грибных клеток.

Термины прокариотическая клетка и прокариотическая клетка-хозяин означают любую клетку, в которой геном свободно локализован в цитоплазме в виде кольцевой структуры, то есть клетку, в которой геном не окружен ядерной мембраной. Прокариотическая клетка далее отличается тем, что она необязательно нуждается в кислороде и ее рибосомы меньше, чем у эукариотических клеток. Прокариотические клетки включают архебактерии и эубактерии. В зависимости от состава оболочки клетки эубактерии можно разделить на грамположительные бактерии, грамотрицательные бактерии и цианобактерии. В предпочтительном варианте осуществления способа уменьшения частоты спонтанных мутаций или создания соответствующих организмов согласно настоящему изобретению используемой прокариотической клеткой является клетка архебактерии или эубактерии, причем особенно предпочтительными прокариотическими клетками являются грамотрицательные бактерии, грамположительные бактерии или цианобактерии.

Настоящее изобретение относится также к клетке с уменьшенной частотой спонтанных мутаций и/или с повышенной жизнеспособностью, которую получают способом уменьшения частоты спонтанных мутаций в клетке или организме согласно настоящему изобретению или способом создания клетки или организма с уменьшенной частотой спонтанных мутаций согласно настоящему изобретению, при этом указанная клетка содержит по меньшей мере две мутации, объединенное действие которых усиливает по меньшей мере два механизма репарации клеточной ДНК. В предпочтительном варианте осуществления изобретения клетка является бактериальной клеткой, например грамотрицательной бактерией, такой как Е.сой, или грамположительной бактерией, такой как ВасШик δυόΐίΐίδ. грибной клеткой, растительной клеткой или животной клеткой, такой как клетка насекомого или клетка млекопитающего.

В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения бактерия относится к штаммам, включающим Е.сой Μ616556ίηΒ10, содержащий плазмиду рти1Ь, Е.сой Μ616556ίηΒ10 ти1й::1е1 содержащий плазмиду рти1Ь, Е.сой Μ61655 6иаЕ хас::ст, содержащий плазмиду ртиГО, Е.сой Μ61655 6иаЕ хас::ст пШЙДсТ содержащий плазмиду рти1Ь, Е.сой Μ616556ίηΒ10 6иаЕ хассст, Е.сой Μ616556ίηΒ10 6иаЕ хас::ст тШЙ::1с1 Е.сой Μ616556ίηΒ10 6иаЕ хассст, содержащий плазмиду ртиГО, или Е.сой Μ616556ίηΒ10 6иаЕ хас::ст тШЙДсТ содержащий плазмиду ртШЙ.

Настоящее изобретение относится также к использованию клеток согласно настоящему изобретению с уменьшенной частотой спонтанных мутаций и/или повышенной жизнеспособностью для создания организмов с уменьшенной скоростью спонтанных мутаций, к использованию клеток согласно настоящему изобретению в качестве клеток-хозяев для экспрессии белка, к использованию клеток согласно настоящему изобретению в качестве ферментирующих организмов для продуцирования продуктов ферментации, к использованию клеток согласно настоящему изобретению в качестве модельной системы для изучения влияния лекарственных средств-кандидатов, к использованию клеток согласно настоящему изобретению в качестве модельной системы для изучения заболеваний, поражающих человека, животных или растения, и к использованию клеток согласно настоящему изобретению для создания, в частности, для селекции или культивирования трансгенных организмов.

Специалисту в данной области должно быть известно много способов создания многоклеточного организма, в частности, растения или животного, из одиночных клеток. Многоклеточные организмы, созданные из клеток согласно настоящему изобретению, также должны характеризоваться уменьшенной частотой спонтанных мутаций.

Настоящее изобретение относится также к организму с уменьшенной частотой спонтанных мутаций, полученному способом уменьшения частоты спонтанных мутаций в клетке или организме согласно настоящему изобретению или способом создания клетки или организма с уменьшенной частотой спонтанных мутаций согласно настоящему изобретению, причем клетки такого организма содержат по меньшей мере две мутации, объединенное действие которых усиливает по меньшей мере два механизма репарации клеточной ДНК и/или повышает жизнеспособность клеток. В предпочтительном варианте осуществления изобретения многоклеточным организмом является гриб, такой как Бассйаготусек ссгсуыас или ЛкрегдШик ηιάπίπηκ, растение, в частности, растение сельскохозяйственного назначения, такое как кукуруза (Аса таук), или животное, в частности, млекопитающее, например, млекопитающее, которое может быть использовано в качестве модельной системы для изучения данного заболевания или действия лекарственных средств-кандидатов при терапевтическом лечении данного заболевания.

Настоящее изобретение относится также к использованию организмов согласно настоящему изобретению в качестве хозяина для экспрессии и/или продуцирования белков, имеющим экономическое, медицинское или сельскохозяйственное значение, к использованию организмов согласно настоящему изобретению для селекции или культивирования трансгенных организмов, к использованию организмов согласно настоящему изобретению в качестве модельных систем для изучения заболеваний и к исполь

- 7 009058 зованию организмов согласно настоящему изобретению в качестве модельной системы для изучения действия лекарственных средств-кандидатов.

Техническая проблема, лежащая в основе настоящего изобретения, может быть решена с помощью способа создания экспрессирующей системы для белка, содержащего аминокислотную последовательность, стабилизированную в отношении спонтанно возникающих мутаций, который включает:

a) введение последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей данный белок, в геном клеткихозяина, содержащей по меньшей мере две мутации, объединенное действие которых усиливает способность по меньшей мере двух механизмов репарации ДНК исправлять спонтанно возникающие мутации под функциональным контролем одной или нескольких регуляторных единиц, обеспечивающих индуцибельную или конститутивную экспрессию белка; или

b) введение последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей данный белок, в вектор под функциональным контролем одной или нескольких регуляторных единиц, обеспечивающих индуцибельную или конститутивную экспрессию белка, и перенос указанного вектора в клетку-хозяина, содержащую по меньшей мере две мутации, объединенное действие которых усиливает способность по меньшей мере двух механизмов репарации клеточной ДНК исправлять спонтанно возникающие мутации; и

c) культивирование и/или поддержание клетки-хозяина в соответствующей среде.

Способ создания экспрессирующей системы для белка согласно настоящему изобретению относится, в частности, к созданию клетки-хозяина, в которой может происходить экспрессия белка и которая характеризуется очень низкой частотой спонтанных мутаций, в частности, более низкой, чем в других известных клетках-хозяевах. Поэтому экспрессирующая система, созданная способом согласно настоящему изобретению, значительно уменьшает вероятность того, что нуклеотидная последовательность, кодирующая данный белок и, следовательно, аминокислотную последовательность указанного белка, будет изменена мутациями. Экспрессирующая система, созданная способом согласно настоящему изобретению на основе клетки-хозяина согласно настоящему изобретению с низкой частотой спонтанных мутаций и повышенной жизнеспособностью, может быть использована для экспрессии и генерации белков, целостность которых будет сохранена в течение длительного времени. Экспрессирующая система согласно настоящему изобретению может быть особенно пригодна для продуцирования белков, предназначенных для использования в лечебных целях, в которых любые изменения аминокислотной последовательности, например, вызывающие изменение биологической активности или антигенных свойств белка, могут оказывать вредное влияние на терапевтическую пользу белка. Поэтому способ создания экспрессирующей системы согласно настоящему изобретению пригоден для устранения даже минимальных загрязнений получаемого белкового препарата мутировавшими, аберрантными белками. Экспрессирующая система, получаемая способом согласно настоящему изобретению на основе клетки-хозяина согласно настоящему изобретению с низкой частотой спонтанных мутаций, может быть использована для долговременного сохранения нуклеотидных последовательностей, кодирующих определенный белок, без необходимости регулярной проверки секвенированием наличия или отсутствия изменений в нуклеотидной последовательности.

В контексте настоящего изобретения термин экспрессирующая система означает, в частности, клеточную систему, которая обеспечивает эффективную экспрессию белка, то есть продуцирование больших количеств данного белка в клетке. Термин экспрессирующая система относится, в частности, к клеточной среде, которая делает возможной транскрипцию нуклеотидной последовательности, кодирующей требуемый белок, в комплементарную последовательность РНК, сплайсинг данной последовательности РНК для удаления некодирующих фрагментов последовательности и трансляцию полученных таким образом кодирующих фрагментов последовательности РНК в полипептидную цепь белка. Термин экспрессирующая система относится также к клеточной среде, которая позволяет выполнять стадии посттрансляционного процессинга, такие как гликозилирование белка или удаление существующей лидерной последовательности из белка. Поэтому создание экспрессирующей системы означает, что нуклеотидная последовательность, кодирующая требуемый белок, должна быть функционально связана с соответствующими регуляторными единицами, контролирующими и направляющими экспрессию кодированного генного продукта в данной клеточной среде, и что должна быть получена соответствующая клетка-хозяин, в которой используемые регуляторные единицы функционируют с достижением оптимальной экспрессии белка.

В соответствии с настоящим изобретением уменьшение частоты спонтанных мутаций и повышение жизнеспособности клетки-хозяина в системе для экспрессии белка достигается в результате использования по меньшей мере двух мутаций, объединенное действие которых усиливает способность по меньшей мере двух механизмов репарации клеточной ДНК исправлять спонтанно возникающие мутации в любой нуклеиновой кислоте, присутствующей в клетке-хозяине. В частности, по меньшей мере две указанные мутации усиливают способность системы репарации ошибочно спаренных оснований, функции исправления ошибок и/или системы 808-репарации исправлять спонтанно возникающие мутации. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения указанные мутации выбирают из мутации, повышающей экспрессию белка Ми1Ь или гомологичного белка, мутации, повышающей экспрессию белка Ми!8 или гомологичного белка, аллеля-антимутатора гена, кодирующего ДНК-полимеразу IV или гомологич

- 8 009058 ный белок, и аллеля-антимутатора гена, кодирующего субъединицу ДНК-полимеразы III или гомологичного белка.

В одном варианте осуществления изобретения повышение экспрессии Ми1Ь или гомологичного белка и повышение экспрессии Ми!§ или гомологичного белка можно быть достигнуто путем введения в клетку-хозяина вектора, содержащего ген ти1Ь или ген, кодирующий гомологичный белок, и ген ти!§ или ген, кодирующий гомологичный белок, под функциональным контролем одной или нескольких регуляторных единиц, в результате чего происходит сверхэкспрессия соответствующего белка Ми! по сравнению с соответствующей клеткой-хозяином дикого типа. Вектор, используемый для сверхэкспрессии белка Ми1Ь или Ми!§, предпочтительно является многокопийной плазмидой, содержащей соответствующий ген ши! под функциональным контролем одной или нескольких регуляторных единиц. В предпочтительном варианте осуществления изобретения регуляторная единица, контролирующая сверхэкспрессию соответствующего гена ти!, может быть индуцибельным или конститутивным промотором.

В другом варианте осуществления изобретения повышение экспрессии Ми1Ь или гомологичного белка и повышение экспрессии Ми!§ или гомологичного белка соответственно может быть достигнуто путем введения одной или нескольких дополнительных копий соответствующего гена ти! в хромосому (хромосомы) клетки или введения одной или нескольких мутаций в регуляторные единицы, направляющие транскрипцию нативного, локализованного в хромосоме гена ти!, благодаря чему указанная клетка продуцирует большее количество соответствующего белка Ми! по сравнению с соответствующей клеткой дикого типа.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения аллелем-антимутатором гена, кодирующего ДНК-полимеразу IV, является άίπΒΙΰ. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения аллелем-антимутатором гена, кодирующего субъединицу ДНК-полимеразы III, является биаБ911.

В соответствии с настоящим изобретением созданная экспрессирующая система может быть использована для экспрессии любого белка. В контексте настоящего изобретения термин белок означает молекулу, содержащую по меньшей мере две аминокислоты, соединенные амидной связью. Поэтому в соответствии с настоящим изобретением термин белок означает также пептид, например олигопептид, полипептид или часть природного белка, такую как домен. Аминокислотная последовательность экспрессируемого белка может соответствовать аминокислотной последовательности природного белка, то есть может представлять собой последовательность дикого типа. Белок, предназначенный для экспрессии экспрессирующей системой, может содержать аминокислотную последовательность, которая изменена по сравнению с аминокислотной последовательностью белка дикого типа, например, имеет другой аминокислотный состав и/или другую длину цепи. По сравнению с белком дикого типа экспрессируемый белок может иметь другие аминокислотные остатки в одном или нескольких положениях. По сравнению с белком дикого типа экспрессируемый белок может иметь усеченную или удлиненную цепь. Кроме того, экспрессируемый белок может обладать характеристиками, отличающимися от характеристик соответствующего белка дикого типа. Вышеуказанные отличающиеся признаки могут включать, не ограничиваясь ими, измененную теплостойкость, другую субстратную специфичность, другую активность, измененные или новые каталитические сайты и т.д.

Экспрессируемый белок может также быть слитым белком, содержащим два или более отдельных полипептидов и, кроме того, содержащим один или несколько доменов второго полипептида. Такие изменения или мутации белка могут быть получены в результате выполнения соответствующих манипуляций в отношении нуклеотидной последовательности, кодирующей белок, известных в данной области, до введения кодирующей белок нуклеотидной последовательности в геном клетки-хозяина с уменьшенной частотой спонтанных мутаций или в вектор, который затем вводят в клетку-хозяина. В предпочтительном варианте осуществления изобретения экспрессируемый белок является рекомбинантным белком, то есть белком, измененным методами генетической инженерии и/или методами рекомбинантных ДНК.

В предпочтительных вариантах осуществления изобретения экспрессируемый белок может быть ферментом, который может быть использован для промышленного производства природных и неприродных соединений. Ферменты или соединения, продуцированные с помощью ферментов, могут быть использованы для производства лекарственных средств, косметических средств, продуктов питания и т.д. Экспрессируемый белок может также представлять собой вещество, применяемое для лечения человека и животных. Важными классами приемлемых в медицинском отношении белков являются, например, цитокины и факторы роста.

В соответствии со способом согласно настоящему изобретению последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую белок, вводят в геном или вектор под функциональным контролем одной или нескольких регуляторных единиц. Регуляторные единицы, которые контролируют и направляют экспрессию гена и генного продукта, включают, не ограничиваясь ими, промоторы, сайты связывания рибосомы, энхансеры, сайленсеры, сайты полиаденилирования и/или З'-концевые терминаторы транскрипции. Регуляторные единицы могут также включать лидерные или сигнальные последовательности, направляющие экспрессированный белок в соответствующий компартмент клетки-хозяина или из клетки. Использование таких регуляторных единиц зависит от типа клетки-хозяина. Хорошо известны регуляторные едини

- 9 009058 цы, которые могут быть использованы в определенной прокариотической или эукариотической клеткехозяине (см., например, ЗатЬтоок е! а1., Мо1еси1аг с1ошид: А ЬаЬота1огу НаибЬоок, зесоиб οάίΐίοη (1989), СоИ 8рппд НагЬог ЬаЬота1оту Ртезз, ΝΥ, ИЗА).

В предпочтительном варианте осуществления изобретения нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, клонируют в векторе. В качестве вектора предпочтительно используют плазмиды, бактериофаги, вирусы или космиды. Специалистам в данной области должно быть известно большое число приемлемых векторов для эукариотических или прокариотических клеток-хозяев, которые могут быть использованы для введения кодирующей белок нуклеотидной последовательности в данную клетку-хозяина.

Кроме того, специалисту в данной области должны быть известны многочисленные методы клонирования кодирующей белок нуклеотидной последовательности, в соответствии с которыми указанную последовательность функционально связывают с регуляторными единицами, и введения нуклеотидных последовательностей в клетку-хозяина (см., например, 8атЬтоок е! а1., 1989).

Другим объектом настоящего изобретения является способ продуцирования белка, содержащего аминокислотную последовательность, стабилизированную в отношении спонтанно возникающих мутаций, который включает:

b) введение последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей данный белок, в вектор под функциональным контролем одной или нескольких регуляторных единиц, обеспечивающих индуцибельную или конститутивную экспрессию белка, и перенос указанного вектора в клетку-хозяина, содержащую по меньшей мере две мутации, объединенное действие которых усиливает способность по меньшей мере двух механизмов репарации клеточной ДНК исправлять спонтанно возникающие мутации;

c) культивирование клетки-хозяина в соответствующей среде в условиях, обеспечивающих экспрессию данного белка; и

ά) выделение экспрессированного белка.

В зависимости от функционального связывания последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, с лидерной или сигнальной последовательностью, экспрессированный белок переносится в определенную клеточную органеллу, в определенный клеточный компартмент, во внеклеточное пространство или в среду, в которой культивируются клетки. Поэтому указанный белок может накапливаться в клетке или секретироваться из клетки. В предпочтительном варианте осуществления способа продуцирования белка согласно настоящему изобретению указанный белок выделяют из среды. В другом предпочтительном варианте осуществления способа продуцирования белка согласно настоящему изобретению белок экстрагируют из клетки-хозяина, например, из определенной клеточной органеллы. Кроме того, специалисту в данной области должны быть известны многочисленные методы выделения белка из клетки, клеточной органеллы или среды.

В соответствии с настоящим изобретением любая эукариотическая или прокариотическая клетка может быть использована в качестве клетки-хозяина для экспрессии или генерации белка. Особенно предпочтительные примеры включают грибные клетки, животные клетки, растительные клетки, архебактерии, цианобактерии, грамположительные бактерии и грамотрицательные бактерии.

Настоящее изобретение относится также к белку, получаемому способом согласно настоящему изобретению.

Другим объектом настоящего изобретения является способ получения продукта ферментации путем культивирования клетки, продуцирующей продукт ферментации, и/или по меньшей мере одного фермента, участвующего в образовании продукта ферментации в среде, при этом геном клетки стабилизирован в отношении спонтанно возникающих изменений последовательности по меньшей мере двумя мутациями, объединенное действие которых усиливает способность по меньшей мере двух механизмов репарации клеточной ДНК исправлять спонтанно возникающие мутации.

Таким образом, способ согласно настоящему изобретению относится к использованию клетки для ферментативных целей, то есть для продуцирования продукта ферментации, при этом геном клетки стабилизирован в отношении спонтанно возникающих изменений последовательности и поэтому характеризуется очень низкой частотой спонтанных мутаций. Кроме того, используемая клетка обладает повышенной жизнеспособностью. Благодаря использованию клеток с уменьшенной частотой спонтанных мутаций способ согласно настоящему изобретению гарантирует гораздо меньшую вероятность того, что нуклеотидная последовательность, кодирующая данный белок, и следовательно аминокислотная последовательность данного белка будут изменены мутациями. Поскольку указанные клетки характеризуются повышенной жизнеспособностью, использование таких клеток гарантирует отсутствие осложнений во время процесса ферментации и высокопродуктивное получение продукта ферментации.

В контексте настоящего изобретения термин ферментация означает любой способ получения оп

- 10 009058 ределенного продукта вследствие анаэробного или аэробного метаболизма микробов, грибных клеток, растительных клеток или животных клеток или при помощи ферментов, полученных из таких клеток, которые могут быть выделены, очищены и/или иммобилизованы. В определение термина ферментация входят все ферментативно-химические изменения органического субстрата, вызываемые действием одного или нескольких ферментов микробных, растительных, грибных и/или животных клеток. Требуемый продукт ферментации может быть продуцирован в самой клетке благодаря экспрессии белка или в результате метаболизма клетки, при этом продукт ферментации может накапливаться в клетке или может быть перенесен из клетки в среду, либо клетка продуцирует один или несколько ферментов, которые в процессе секреции из клетки катализируют конверсию субстрата в среде в требуемый продукт ферментации. В том случае, когда продуктом ферментации является нуклеиновая кислота или белок, кодированный нуклеиновой кислотой, способ согласно настоящему изобретению позволяет избежать даже минимальных загрязнений продукта ферментации мутациями и, таким образом, в течение длительного времени сохранить целостность продукта ферментации. Когда продукт ферментации образуется под действием одного или нескольких ферментов, продуцируемых клеткой, способ согласно настоящему изобретению позволяет сохранить целостность соответствующих ферментов и, таким образом, сохранить специфичность и эффективность метаболических процессов, вызывающих образование продукта ферментации.

Способ получения продукта ферментации согласно настоящему изобретению может быть также пригоден для сохранения целостности полигенных кластеров и/или генных продуктов, кодированных таким полигенным кластером, участвующим в данном процессе, и, таким образом, для сохранения специфичности и эффективности процесса, в котором участвуют генные продукты, кодированные таким полигенным кластером. Примеры такого полигенного кластера включают, не ограничиваясь ими, поликетидсинтазный кластер (РК8). Метаболиты поликетидов образуют большую группу природных продуктов, образуемых бактериями, такими как актиномицеты и миксобактерии, и грибами с разными структурами и биологическими активностями. Комплексные поликетиды продуцируются многофункциональными РК8 при помощи механизма, аналогичного синтезу длинноцепочечной жирной кислоты у животных. Исследование РК8 эритромицина в 8ассйаторо1у5рога етуШтаеа позволило выявить модульную организмацию. Синтез комплексного поликетида происходит в соответствии с механизмом реакций, в котором каждый модуль в РК8 образует цепочку из трех-шести ферментативных доменов, катализирующих реакции почти в линейном порядке.

В соответствии с настоящим изобретением уменьшение частоты спонтанных мутаций и повышение жизнеспособности клетки, используемой для ферментации, достигается благодаря использованию по меньшей мере двух мутаций, объединенное действие которых усиливает способность по меньшей мере двух механизмов репарации клеточной ДНК исправлять спонтанно возникающие мутации в любой нуклеиновой кислоте, присутствующей в клетке. В частности, по меньшей мере две указанные мутации усиливают способность системы репарации ошибочно спаренных оснований, функции исправления ошибок и/или системы 808-репарации исправлять спонтанно возникающие мутации в клетке. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения указанные мутации выбирают из мутации, повышающей экспрессию белка Ми1Ь или гомологичного белка, мутации, повышающей экспрессию белка Ми18 или гомологичного белка, аллеля-антимутатора гена, кодирующего ДНК-полимеразу IV или гомологичный белок, и аллеля-антимутатора гена, кодирующего субъединицу ДНК-полимеразы III или гомологичного белка.

В одном варианте осуществления изобретения повышение экспрессии Ми1Ь или гомологичного белка и повышение экспрессии Ми!8 или гомологичного белка может быть достигнуто путем введения в клетку, используемую для ферментации, вектора, содержащего ген ти1Ь или ген, кодирующий гомологичный белок, и ген ши18 или ген, кодирующий гомологичный белок, под функциональным контролем одной или нескольких регуляторных единиц, обеспечивающих сверэкспрессию соответствующего белка ши! по сравнению с соответствующей клеткой-хозяином дикого типа. Вектор, используемый для сверхэкспрессии белка Ми1Ь или Ми!8, предпочтительно является многокопийной плазмидой, которая содержит соответствующий ген ти!, находящийся под функциональным контролем одной или нескольких регуляторных единиц. В предпочтительном варианте осуществления изобретения регуляторная единица, контролирующая сверхэкспрессию соответствующего гена ти!, может быть индуцибельным или конститутивным промотором.

В другом варианте осуществления изобретения повышение экспрессии Ми1Ь или гомологичного белка и повышение экспрессии Ми!8 или гомологичного белка может быть достигнуто путем введения одной или нескольких дополнительных копий соответствующего гена ти! в хромосому (хромосомы) клетки либо одной или нескольких мутаций в регуляторные единицы, направляющие транскрипцию нативного, локализованного в хромосоме гена ти!, благодаря чему клетка продуцирует большее количество соответствующего белка Ми! по сравнению с клеткой дикого типа.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения аллелем-антимутатором гена, кодирующего ДНК-полимеразу IV, является άίπΒΙΰ. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения аллелем-антимутатором гена, кодирующего субъединицу ДНК-полимеразы III, является

- 11 009058 йпаЕ911.

В соответствии с настоящим изобретением присутствие άίηΒΙΟ и йпаЕ911 в клетке, используемой для ферментации, уменьшает частоту спонтанных мутаций в данной клетке по сравнению с клеткой дикого типа по меньшей мере в 10 раз. Присутствие άίηΒ10 и йпаЕ911 в клетке, которая, кроме того, сверхэкспрессирует белок ши1Ь, уменьшает частоту спонтанных мутаций в данной клетке по сравнению с клеткой дикого типа по меньшей мере в 50 раз.

Продукты ферментации, полученные способом согласно настоящему изобретению, могут быть первичными или вторичными метаболитами клетки. Первичными метаболитами являются вещества, синтезируемые живой клеткой и необходимые клетке для образования клеточных структур и поддержания обменных процессов. В отличие от первичных метаболитов вторичными метаболитами являются соединения, в частности, низкомолекулярные соединения, синтезированные клеткой, которые не обязательно требуются для выполнения функций клетки. Как правило, вторичные метаболиты могут сообщать клетке или организму селективное преимущество в определенной среде. Продукты ферментации, полученные способом согласно настоящему изобретению, могут быть продуктами ферментации в классическом смысле, то есть получаемыми в результате ферментативного расщепления углеводов кислородом, осуществляемого исключительно микробами, такими как продукты спиртового брожения, молочнокислого брожения, пропионовокислого брожения и т. д.

Примеры продуктов ферментации включают, не ограничиваясь ими, нуклеиновые кислоты, нуклеозиды, нуклеотиды, белки, аминокислоты, органические кислоты, спирты, углеводы, витамины, антибиотики и алкалоиды.

В предпочтительных вариантах осуществления изобретения продуктами ферментации являются нуклеиновые кислоты, в частности, пригодные для терапевтического применения, например, нуклеиновые кислоты, предназначенные для использования в качестве вакцины.

В контексте настоящего изобретения термин нуклеиновые кислоты означает молекулы, которые содержат по меньшей мере два нуклеотида, связанных фосфодиэфирной связью. Поэтому термин нуклеиновая кислота означает также олигонуклеотид.

Нуклеиновая кислота может представлять собой ДНК или РНК. Нуклеиновая кислота может быть одноцепочечной или двухцепочечной.

В предпочтительных вариантах осуществления изобретения продуктами ферментации являются белки, в частности, ферменты или белки, пригодные для терапевтического применения, или их части, такие как домены. Предпочтительные примеры ферментов включают, не ограничиваясь ими, протеазы, амилазы, пектиназы и глюкозоизомеразы. Предпочтительные примеры белков, пригодных для терапевтического применения, включают, не ограничиваясь ими, цитокины, такие как интерфероны, интерлейкины, фаторы роста, факторы свертывания крови, антитела и т.д.

Предпочтительные примеры органических кислот включают, не ограничиваясь ими, лимонную кислоту, молочную кислоту или уксусную кислоту. Предпочтительные примеры спиртов включают, не ограничиваясь ими, этанол, пропанол и бутанол. Предпочтительные примеры углеводов включают, не ограничиваясь ими, сахара, такие как сахароза, мальтоза или палатиноза, или сахарные спирты, такие как ксилит или мальтит. Предпочтительные примеры витаминов включают, не ограничиваясь ими, витамин В12 или рибофлавин. Предпочтительные примеры антибиотиков включают, не ограничиваясь ими, пенициллин, цефалоспорин, стрептомицин, поликетидный антибиотик, такой как эритромицин, и т. д.

Продукт ферментации может быть выделен из ферментирующих клеток или из среды, используемой для культивирования.

Поэтому настоящее изобретение относится также к продукту ферментации, получаемому способом согласно настоящему изобретению, предназначенному для получения продукта ферментации.

В способе получения продукта ферментации согласно настоящему изобретению могут быть использованы как эукариотические, так и прокариотические клетки. В предпочтительном варианте осуществления способа получения продукта ферментации согласно настоящему изобретению использумой эукариотической клеткой является грибная клетка, животная клетка или растительная клетка. Прокариотической клеткой, используемой при осуществлении способа получения продукта ферментации согласно настоящему изобретению, является цианобактерия, архебактерия, грамположительная бактерия или грамотрицательная бактерия.

При осуществлении способа ферментации согласно настоящему изобретению можно использовать любую клетку, которая предпочтительно обладает значительно меньшей частотой спонтанных мутаций по сравнению с соответствующей клеткой дикого типа. В частности, предпочтительными являются клетки или организмы, у которых частота спонтанных мутаций была уменьшена способом уменьшения частоты спонтанных мутаций согласно настоящему изобретению или которые были получены способом создания клетки или организма с уменьшенной частотой спонтанных мутаций согласно настоящему изобретению.

В предпочтительном варианте осуществления способа согласно настоящему изобретению клетку культивируют в приемлемой жидкой среде. Специалисту в данной области должны быть известны многие жидкие среды, в которых можно культивировать клетки, например прокариотические или эукариоти

- 12 009058 ческие клетки, для получения продукта ферментации. В соответствии с настоящим изобретением клетку можно культивировать в непрерывной или периодической культуре. Периодической культурой является культура, которая образуется в жидкой среде, засеянной клетками, причем во время культивирования среду не подвергают постоянной замене и в нее необязательно вводят только газ, такой как кислород. Периодическая культура может быть культурой с подпиткой для устранения катаболической репрессии при образовании продукта. Поэтому в случае культуры с подпиткой потребление субстрата, такого как сахар, должно компенсироваться введением дополнительных количеств указанного субстрата. Непрерывной культурой является культура, которую инокулируют клетками только один раз, после чего в зависимости от увеличения массы клеток или накопления продукта потребляемую культуральную среду постоянно заменяют свежей средой, при этом из культуры одновременно удаляют продукт ферментации вместе с потребленной средой и необязательно с клетками. Непрерывные культуры можно культивировать в бродильных чанах.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения клетки могут находиться в культуре в иммобилизованной форме. В другом варианте осуществления способа согласно настоящему изобретению клетку культивируют на твердой или полутвердой среде.

Предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения относится к организму, в частности, к прокариотическому организму, наиболее предпочтительно штамму ЕксБепсЫа сой, который выбирают из группы, включающей штамм Е.соБ МС1655йшВ10, содержащий плазмиду ртШБ (Ό8Μ 17016);

штамм Е.соБ МС1655йшВ10 щЩБ::1е1 содержащий плазмиду ртШБ (Ό8Μ 17017); штамм Е.соБ МС1655 йпаЕ хае::ст, содержащий плазмиду ртШБ (Ό8Μ 17018) ;

штамм Е.соБ МС1655 йпаЕ хае::ст ти1Б:1еБ содержащий плазмиду ртШБ (Ό8Μ 17019);

штамм Е.соБ МС1655йшВ10 йпаЕ /ае::ст (Б8М 17015);

штамм Е.соБ МС1655йшВ10 йпаЕ /ае::ст тЩБ::1е1 (Б8М 17014);

штамм Е.соБ МС1655й1пБ10 йпаЕ хае::ст, содержащий плазмиду ртШБ (Б8М 17020); и штамм Е.соБ МС1655йшВ10 йпаЕ хае::ст 1пЩБ::1е1 содержащий плазмиду ртШБ (Б8М 17021).

Вышеуказанные микроорганизмы депонированы на основании Будапештского соглашения в Б8М2 (БеиБсБе 8атт1ипд £иг М1кгоогдаш8теп ипй 2е11кБкигеп СтБН ш Вгаип8сБете1д, Сегтапу) 3-го января 2005 г. под вышеуказанными номерами Б8М.

Настоящее изобретение иллюстрировано нижеследующим списком последовательностей, фигурами и примерами.

На фиг. 1 изображена физическая структура плазмиды ртикБ, которая по существу аналогична плазмиде рши18.

На фиг. 2 графически представлены значения частоты спонтанных мутаций в отношении устойчивости к рифампицину в штаммах дикого типа, йшВ10, йпаЕ911, йшВ10 йпаЕ911, тикБ^-, тШБ^- й1пВ10, тШБ^- йпаЕ911 и тШБ^- йшВ10 йпаЕ911. Как показано на данной фигуре, мутабильность сильно подавлена экспрессией МшБ. Данные представлены в виде значений 8МЕ. Плазмида рти1Б является производным тЮБ' плазмиды рТгсНщ2/1ас2. Во всех генетических манипуляциях был использован штамм дикого типа МС1655 (\\1). На фигуре показаны родственные генотипы. В колонках изображены по три столбца, относящихся к одному генотипу, из которых: а) первый столбец означает бактериальный штамм, |) второй столбец означает соответствующий бактериальный штамм, несущий плазмиду рТгсН182/1ас2, и с) третий столбец означает соответствующий бактериальный штамм, несущий плазмиду ртШБ.

На фиг. 3 графически представлены значения частоты спонтанных мутаций в отношении устойчивости к рифампицину в штаммах дикого типа, йшВ10, йпаЕ911, йшВ10 йпаЕ911, шиЙ^-, пи18^- йшВ10, тиЙ^- йпаЕ911 и ти18^- йшВ10 йпаЕ911. На данной фигуре показано подавление мутабильности в фенотипе ший^- под действием мутаций й1пВ10, йпаЕ911 и йшВ10 йпаЕ911. Данные представлены в виде значений 8МЕ. На фигуре показаны родственные генотипы.

На фиг. 4 изображена физическая структура плазмиды рйарЛ1Е (А) и плазмиды р§И40йарЛ (В).

На фиг. 5 показана стратегия создания плазмиды р8Б40пи1Б.

На фиг. 6 графически изображена реверсия точковых мутаций йарЛ в штаммах Тор10 (дикого типа; йарЛ⁺), МС1655 йшВ10 йарЛ::кп (йарЛ^-), АТ997 (йарА15, йарА^-), АТ997 рйарАШ рТгс (йарА⁺), АТ997 рйарА1Е ртШБ (йарА⁺), АТ997 рйарА+1 рТгс (йарА^-), АТ997 рйарА+1 ртШБ (йарА^-), МС1655 йшВ10 йарА::кп рйарА15 р§И40 (йарА^-), МС1655 йшВ10 йарА::кп рйарА15 р8Б401пЩБ (йарА^-). На данной фигуре показано подавление мутабильности в результате экспрессии МикБ. Приведены значения мутаций, сообщающих устойчивость к ΌΆΡ, деленные на общее число жизнеспособных клеток. Плазмида ртШБ является производным тЮБ' плазмиды рТгсН1§2/1ас2 или р§И40. Во всех генетических манипуляциях был использован штамм дикого типа МС1655 (\\1). На фигуре показаны родственные генотипы. На фигуре изображена одна колонка, включающая три столбца для контрольных образцов, и три колонки, включающие по два столбца для исследуемых штаммов. В колонке, состоящей из двух столбцов, а) первый столбец означает бактериальный штамм, несущий исходный вектор, и |) второй столбец означает бактериальный штамм, несущий производную плазмиду тЮБ'. Все использованные бактериальные штаммы экспрессируют в хромосоме МикБ дикого типа.

- 13 009058

На фиг. 7 показаны производные плазмиды рХХ7.

А) Клонирование хлорамфеникольного кластера в плазмиде рХХ7, в результате чего была получена плазмида рХХ7ст. Девять полученных клонов анализировали путем расщепления рестрикционными ферментами ЕсоШ и Ысо1 (ожидаемые фрагменты: 1677 п.о. и 3292 п.о.). Все испытанные клоны характеризовались правильным паттерном миграции.

Β) Клонирование молчащего гена 1е1А в плазмиде рХХ7, в результате чего была получена плазмида рХХ71е1. Двадцать четыре полученных клона анализировали путем расщепления рестрикционным ферментом ЕсоКЮ (ожидаемые фрагменты: 4141 п.о. и 3113 п.о.). Один из испытанных клонов характеризовался правильным паттерном миграции.

На фиг. 8 показаны значения частоты спонтанных мутаций в отношении устойчивости к рифампицину для штаммов 1М83 рХХ7, 1М83 рХХ7 рТгс и 1М83 рХХ7 рти1Ь. Плазмида рти1Ь является производным ти1Ь⁺ плазмиды рТгс. Значения 8МЕ представлены в виде устойчивости к рифампицину в зависимости от общего числа жизнеспособных клеток. Штамм дикого типа 1М83 экспрессирует в хромосоме Ми1Ь дикого типа.

На фиг. 9 показаны значения частоты спонтанных мутаций в отношении устойчивости к фосфомицину для штаммов 1М83 рХХ7, 1М83 рХХ7 рТгс и 1М83 рХХ7 рти!Ь. Плазмида рти1Ь является производным тИЙ плазмиды рТгс. Значения 8МЕ представлены в виде устойчивости к фосфомицину в зависимости от общего числа жизнеспособных клеток. Штамм дикого типа 1М83 экспрессирует в хромосоме Ми!Ь дикого типа.

На фиг. 10 показано число колоний ст^к. образовавшихся в зависимости от частоты спонтанных мутаций в гене-репортере устойчивости к хромамфениколу, для штаммов 1М83 рХХ7ст, 1М83 рХХ7ст рТгс и 1М83 рХХ7ст рти1Ь. Плазмида рХХ7ст является производным ст⁺ плазмиды рХХ7. Плазмида рти1Ь является производным ти1Ь⁺ плазмиды рТгс. На данной фигуре представлены значения мутаций, вызывающих чувствительность к хлорамфениколу, деленные на общее число жизнеспособных клеток. Контрольные штаммы !М83рХХ7, 1М8 3рХХ7 рТгс и !М83рХХ7 рти1Ь характеризуются ожидаемой чувствительностью к хлорамфениколу (при отсутствии гена устойчивости к хлорамфениколу).

На фиг. 11 показано число колоний 1еР, образовавшихся в зависимости от частоты спонтанных мутаций в молчащем гене-репортере 1е(А, для штаммов 1М83 рХХ71еЕ 1М83 рХХ71е1 рТгс и 1М83 рХХ71е1 рти1Ь. Плазмида рХХ71е1 является производным плазмиды рХХ7, несущей молчащий ген 1е1А. Плазмида рти1Ь является производным те1й плазмиды рТгс. На данной фигуре представлены значения мутаций, вызывающих устойчивость к тетрациклину, деленные на общее число жизнеспособных клеток. Контрольные штаммы !М83рХХ7, !М83рХХ7 рТгс и !М83рХХ7 рти1Ь характеризуются ожидаемой чувствительностью к тетрациклину (при отсутствии гена устойчивости к тетрациклину). Для двух штаммов 1М83 рХХ7 и 1М83 рХХ71е1 значения мутабильности были равны 0,43 или 0,39 (Δ1,1). Экспрессия Ми1Ь уменьшает значение мутабильности до 0,25 (Δ1,72).

На фиг. 12 показана мутабильность модифицированного штамма-продуцента 1М83 рХХ7ст в условиях ферментации. На данной фигуре показана частота спонтанных мутаций в отношении устойчивости к хлорамфениколу в клетках при подавлении О-С8Е (А) или экспрессии С-С8Е (В). Во всех испытаниях белок Мп1Б был экспрессирован в хромосоме. Контрольные штаммы 1М83 рХХ7, 1М83 рХХ7рТгс и 1М83 рХХ7рТгс рти1Е характеризуются ожидаемой чувствительностью к хлорамфениколу в случае (А) и (В).

На фиг. 13 показана мутабильность модифицированного штамма-продуцента ДМ83 рХХ71е1 в условиях ферментации. На данной фигуре показана частота спонтанных мутаций в отношении устойчивости к тетрациклину в клетках при подавлении С-С8Е (А) или экспрессии С-С8Е (В). Во всех испытанных случаях белок Ми1Ь был экспрессирован в хромосоме.

8ЕО ΙΌ N0:1 и 2 представляют собой последовательности затравок №пЕ№о1йш и МиЮХйоШет, используемых для амплификации фрагмента ДНК, кодирующего белок Ми1Ь.

8ЕО ΙΌ N0:3 и 4 представляют собой последовательности затравок Ми18ВашН1Ып и Ми18Хйо1йет, используемых для амплификации фрагмента ДНК, кодирующего белок Мп18.

Последовательности 8Е0 ΙΌ N0:5 - 8Е0 ΙΌ N0:10 представляют собой последовательности затравок барАВатНПЕ, барАВатН1+1, барАВатН1+2, барАХйо1, барАЕсоКбйш и барАНшбШйет, используемых для амплификации фрагмента ДНК, кодирующего белок ЭарА.

8Е0 ΙΌ N0:11 и 12 представляют собой последовательности затравок сшВЬуСПип и стАйб^ет, используемых для амплификации фрагмента ДНК, кодирующего ген устойчивости к хлорамфениколу.

Пример Ι. Определение частоты спонтанных мутаций (8МР) в отношении устойчивости к рифампицину в разных штаммах Е.сой

Клетки бактерий ЕксйепсЫа сой обычно чувствительны к антибиотику рифампицину, то есть они не могут расти на средах, содержащих данный антибиотик. Однако в геноме Е.сой обычно наблюдается низкая частота мутаций, сообщающих устойчивость к рифампицину. Таким образом, при культивировании большого числа клеток (10⁸) на среде, содержащей рифампицин, образуется лишь несколько колоний, в то время как большинство клеток будет уничтожено антибиотиком. Образование колоний возможно потому, что в геноме клеток возникают спонтанные мутации, сообщающие устойчивость к ри

- 14 009058 фампицину. Указанные мутации в свою очередь наследуются потомством исходного мутанта. Важно отметить, что такая мутация является благоприятной только в среде, где присутствует рифампицин, и, вероятно, не сообщает преимуществ образовавшемуся варианту в большинстве других условий. Рифампицин является антибиотиком, который применяется главным образом для лечения туберкулеза, лепры и иногда других заболеваний. Устойчивость возникает вследствие изменений проницаемости мембраны или мутаций в гене гроВ, кодирующем мРНК-полимеразу. Оба вышеуказанных механизма запускаются мутацией в хромосоме. Однако в хромосоме Е.со11 существует несколько генов-мишеней, которые могут сообщать бактериям устойчивость к рифампицину.

Для вычисления частоты спонтанных мутаций (8МР) определяли частоту спонтанных мутаций, сообщающих устойчивость к рифампицину, и полученное значение делили на общее число жизнеспособных клеток в культуре.

Число мутантов гх£^кЗМЕ =--------------------------------Общее число жизнеспособных клеток

А) Сверхэкспрессия Ми1Р в штамме Е.со11, вызывающая образование сильного фенотипа генамутатора (делеция в хромосоме ιηιιΐΡ и/или ОпаО), и культивирование клеток на антибиотике рифампицине.

Описание эксперимента

1. Создание плазмиды сверхэкспрессии Ми1Р и Ми!8

a) Клонирование ιιηιΐΡ в рТгсНЬ2/1ас2

Указанная плазмида была создана для достижения высокой и контролируемой экспрессии Ми1Р в Е.со11.

Геномную ДНК, полученную из штамма Е.со11 МС1655, использовали для амплификации фрагмента ДНК длиной 1848 п.о., кодирующего белок Ми1Р, при помощи затравок 1 (8ЕР ΙΌ N0:1) и 2 (8ЕР ΙΌ N0:2) (см. также табл. 1). Указанный фрагмент, полученный при помощи РСВ, расщепляли и клонировали в плазмиде рТгсН1з2/1ас2 в виде фрагмента №о1-Х1ю1 с образованием плазмиды рти1Р. Физическая структура плазмиды ршШР показана на фиг. 1. Полимеразную реакцию синтеза цепи (РСК) выполняли в нижеследующих условиях (температура в °С/время в минутах): (98/10), (96/0,75; 55/0,50; 72/2,5)₃₅ (72/10); соотношение (Тац/РГи) (5/1).

Были выделены шесть полученных клонов, которые анализировали путем расщепления рестрикционным ферментом ЕсоВУ (ожидаемые фрагменты: 871 п.о. и 5373 п.о.). Все шесть клонов характеризовались правильным паттерном миграции.

b) Клонирование ши!8 в рТгсН1з2/1ас2

Указанная плазмида была создана для достижения высокой и контролируемой экспрессии Ми!8 в Е.со11.

Геномную ДНК, полученную из штамма Е.со11 МС1655, использовали для амплификации фрагмента ДНК длиной 2562 п.о., кодирующего белок Ми!8, при помощи затравок 3 (8ЕР ΙΌ N0:3) и 4 (8ЕР ΙΌ N0:4) (см. также табл. 1). Указанный фрагмент, полученный при помощи РСК, расщепляли и клонировали в плазмиде рТгсН1з2/1ас2 в виде фрагмента ВашН1-ХГо1 с образованием плазмиды рши!8. Плазмида рши!8 по существу имеет такую же физическую структуру, что и плазмида рти1Р, показанная на фиг. 1.

Полимеразную реакцию синтеза цепи (РСК) выполняли в нижеследующих условиях (температура в °С/время в минутах): (98/10), (96/0,75; 55/0,58; 72/3)₃₅ (72/10); геркулаза.

Были выделены шесть полученных клонов, которые анализировали путем расщепления рестрикционным ферментом ЕсоВУ (ожидаемые фрагменты: 1186 п.о. и 5775 п.о.). Все шесть клонов характеризовались правильным паттерном миграции.

Таблица 1. Перечень затравок, используемых для амплификации фрагментов ДНК, кодирующих соответственно белок Ми1Р и Ми!8

Затравка		Последовательность
1	МиБЬЦсо1-111п	САТСССАТССССССААТТСАССТСТТАССС ССАСААС
2	МиБЪХНо1-1лег	ССССТССАСССТСАТСТТТСАССССТТТТА тсссссс
3	МиБЗ-ВатНИзгп	СССССАТСССАСТССААТАСААААТТТССА СССССАТА
4	МиБЗХНо1-кег	ССССТССАСССАССАСССТСТТСААСССАТ АААТССАС

- 15 009058

2. Анализ методом вестерн-блоттинга

a) Обнаружение Мн1Б мкл ночной культуры Е8568 (ти1Ь13; Ми!^-) рти!Ь инокулировали в 10 мл среды ЬВ, содержащей 0,4% глюкозы и ампициллин (100 мкг/мл), до достижения оптической плотности (ОЭ). равной примерно 0,5. Для удаления глюкозы клетки центрифугировали и растворяли в 5 мл среды ЬВ, содержащей требуемые антибиотики. Добавление ΙΡΤΟ в конечной концентрации 1 мМ индуцировало экспрессию белка из Р_1ас плазмиды рти!Ь. Культуры инкубировали в течение 16 ч при 37°С, центрифугировали и готовили к выполнению анализа методом БЭ8-РАОЕ. Анализ методом вестерн-блоттинга выполняли, используя АР-конъюгированные антитела против Н18-!ас (данные не показаны).

b) Обнаружение Ми!§

Клетки штамма Тор10 дикого типа трансформировали созданной плазмидой рти!§ и очищали полученные трансформанты. 20 мкл ночных культур указанных бактерий инокулировали в 10 мл среды ЬВ, содержащей ампициллин (100 мкг/мл) и 0,4% глюкозы, до достижения оптической плотности (ОЭ), равной примерно 0,5. Для удаления глюкозы клетки центрифугировали и растворяли в 5 мл среды ЬВ, содержащей требуемые антибиотики. Добавление ΙΡΤΟ в конечной концентрации 1 мМ индуцировало экспрессию белка из Р_1ас плазмиды рти!§. Культуры инкубировали в течение 16 ч при 37°С, центрифугировали и готовили к выполнению анализа методом БЭ8-РАОЕ. Анализ методом вестерн-блоттинга выполняли, используя АР-конъюгированные антитела против Н18-!ас (данные не показаны).

3. Исследования роста

Бактериальные штаммы Е8568 (ти!Ь13; Ми!^-), МС1655бпаО::кп (Ми!^-) и штамм МО1655 (Ми!⁺) дикого типа трансформировали плазмидой ртШБ или исходной плазмидой рТтсН182/1ас2. Полученные единичные колонии очищали на агаровых пластинках со средой ЬВ, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, и затем инокулировали в среде ЬВ, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, в течение ночи при 37°С.

мкл ночных культур указанных бактерий инокулировали в 5 мл среды ЬВ, содержащей 0,4% глюкозы и требуемый антибиотик (100 мкг/мл ампициллина; 50 мкг/мл канамицина), до достижения оптической плотности (ОЭ), равной примерно 0,5. Для удаления глюкозы клетки центрифугировали и растворяли в 5 мл среды ЬВ, содержащей соответствующие антибиотики. Добавление ΙΡΤΟ в конечной концентрации 1 мМ индуцировало экспрессию белка из Р_1ас плазмиды ртШБ. Культуры инкубировали в течение ночи при 37°С, затем клетки центрифугировали и объем среды уменьшали до 1/10 (об./об.).

И наконец, культуры разводили и культивировали на агаровых пластинках, содержащих 100 мкг/мл ампициллина, или 100 мкг/мл ампициллина и 100 мкг/мл рифампицина, и инкубировали в течение трех дней при 30°С.

Экспрессию МшБ подтверждали, выполняя анализ методом вестерн-блоттинга.

Краткий обзор и заключение: было установлено, что сверхэкспрессия МшБ (фенотип тШБ ) уменьшает частоту спонтанных мутаций примерно в 20 раз. Аналогичный эффект наблюдался для клеток тШБ^- или биаО^-, которые характеризуются высокой частотой мутаций (данные не показаны).

В) Сверхэкспрессия МшБ в штаммах Е.сой, несущих разные комбинации делеции бшВ и/или аллеля-антимутатора биаЕ911.

1. Создание штамма

a) Из штамма Е.сок Е81484 (ти!Е218::Тп10) получали лизат Р1_У1Г для инфицирования клеток штаммов Е.соБ МО1655 и МО1655бшВ 10.

Получение Ρ1_νίΓ

Аликвоту ночной культуры штамма Е.сок Е81484 (ти!Е218::!е!) инокулировали в среде ЬВ, содержащей СаС1₂ (5 мМ), при 37°С. Во время фазы экспоненциального роста добавляли Р1_У1Г (штамм МО1655 дикого типа). Инфицированную культуру инкубировали в течение примерно 4 ч при 37°С до обнаружения лизиса клеток. Затем добавляли СНС1₃, лизат центрифугировали, супернатант переносили в новую пробирку, содержащую СНС1₃, и хранили при 4°С.

Р1-опосредованная трансдукция

Аликвоты ночных культур из штаммов-хозяев МО1655 и МО1655 б1иВ10 инокулировали в среде ЬВ при 37°С до достижения фазы экспоненциального роста. Клетки центрифугировали, вторично суспендировали в Мд§О₄ (С_Е = 10 мМ), содержащем СаС1₂ (С_Е = 5 мМ), добавляли полученный лизат Р1_У1Г и смеси клеток инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре. Добавляли цитрат натрия (для прекращения инфицирования фагом) и 8ОС в качестве источника питательных веществ. После инкубации в течение 1 ч при 37°С аликвоты клеток культивировали на агаровых пластинках, содержащих тетрациклин (12,5 мкг/мл). Полученные единичные колонии очищали, тестировали и хранили выделенные штаммы.

b) Из штамма ΝΚ10171 биаЕ (биаЕ911 хае::ст) получали лизаты Р1_У1Г, ипользуемые для инфицирования бактериальных клеток из штаммов Е.соБ МО1655, МО1655бшВ 10, МО1655ти!Е::!е! и МО1655б1иВ10 ти!Ь::!е!. Полученные единичные колонии очищали, тестировали и хранили выделенные штаммы.

- 16 009058

2. Исследования роста

Бактериальные штаммы ΜΟ1655, ΜΟ1655άΐηΒ10, МО1655йпаЕ911 ζае::ст, ΜΟ1655άΐηΒ10 биаЕ911 7ае::еш, МС1655ти1Ь::1е1, ΜΟ1655άΐηΒ10 ти1Ь::1е1, ΜΟ1655άΐηΒ10 биаЕ911 7ае::ст ти1Ь::1е1 и ΜΟ1655άΐηΒ10 биаЕ911 7ае::ет ти1Ь::1е1 трансформировали плазмидами рТгсН182Л или рти1Е. Полученные единичные колонии очищали и инокулировали в среде ΕΒ, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, в течение ночи при 30°С.

мкл ночных культур указанных бактерий инокулировали в 5 мл среды ΕΒ, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, при 30°С. Во время фазы экспоненциального роста добавляли 1РТО в конечной концентрации 1 мМ для усиления экспрессии ΜυΕ из Р_1ас. Культуры выдерживали в течение 1 ч при 30°С, затем температуру повышали до 37°С и клетки инкубировали в течение ночи при 37°С.

Клетки центрифугировали и объем среды уменьшали до 1/10 (об./об.).

И наконец, культуры разводили и культивировали на агаровых пластинках, содержащих 100 мкг/мл ампициллина или 100 мкг/мл ампициллина и 100 мкг/мл рифампицина, и инкубировали в течение трех дней при 30°С.

Значения частоты спонтанных мутаций (3ΜΕ) в отношении устойчивости к рифампицину, представленные в табл. 2 и на фиг. 2, свидетельствуют о подавлении мутабильности вследствие экспрессии ΜΦΕ.

Таблица 2. Значения 3ΜΕ в колониях, устойчивых к рифампицину

Штамм	Плазмида	ЗМЕ (устойчивость к рифампицину/10'⁷)
N<31655		0, 31
МС1655	рТгсН1з2А	0,25
МС1655	ршиРЬ	0,034
МС1655сИпВ10		0,083
МС1655сИпВ10	рТгсН1з2А	0, 11
Μ(31655άίηΒ10	ртиРЬ	0,068
МС1655 с1паЕ гае::ст		0, 10
МС1655 с1паЕ гае::ст	рТгсН1з2А	0,08
М31655 с1паЕ гае:: ст	ртиРЬ	0, 045
Μ<31655άίηΒ10 с1паЕ		0,032
гае: : ст
МС1655сИпВ10 дпаЕ	рТгсН1з2А	0,011
гае::ст
Μ<31655άίπΒ10	ршиРЬ	0,024
гае: : ст
МС1655 ти£Ъ::РеР		11,86
МС1655 ти£Ь::РеР	рТгсН1з2А	11,8
МС1655 тикЕ::РеР	ршиРЬ	0,25
Μ61655άίηΒ10		2,56
тиЁЪ: : РеР
МС1655сИпВ10	рТгсН1з2А	4,20
лшРА .· : РеР
МС1655сИпВ10	ршиРЬ	0,19
ти^Ь::РеР
МС1655 дпаЕ гае::ст		3,59
ти£Ъ::РеР
М31655 с1паЕ гае:: ст	рТгсН1з2А	1,74
тиЬЬ:: РеР
МС1655 с1паЕ гае:: ст	ртиРЬ	0,093

- 17 009058


ΜΘ1655άίηΒ10 дпаЕ гае:: ст ти£Ъ:: ЪеТ: МЦ1655сИпВ10 с1паЕ гае::ст ти£Ъ: Μ61655άίηΒ10 0паЕ гае:: ст тиЪЬ::	рТгсН±з2А ртиЬЬ	1, 18 1,31 0, 12

Мутабильность (значения 8МБ) уменьшается под действием антимутаторов, таких как бшВ10 (делеция) или бпаЕ911 (аллель), соответственно в 4 и 3 раза. Кроме того, в указанных штаммах наблюдалось дополнительное уменьшение мутабильности в результате экспрессии Ми1Б (в 2-7 раз). Бактериальный штамм, несущий оба антимутатора, бтВ10 и бпаЕ911, характеризуется 10-кратным уменьшением мутабильности по сравнению со штаммом МО 1655 дикого типа. Дополнительная экспрессия Ми1Б, повидимому, не изменяет мутабильность.

Делеция гена ши1Б в хромосоме увеличивает мутабильность штамма-хозяина примерно в 10³ раз. Мутабильность уменьшается под действием антимутаторов бтВ10 (в 5 раз), бпаЕ911 (в 3 раза), бтВ10 и бпаЕ911 (в 10 раз). Дополнительная индукция Ми1Б снижает мутабильность в 50 раз (для МО1655 ши1Б::1е1 в 50 раз; для МО1655бтВ10 ти1Б::1е! в 22 раза; для МО1655 бпаЕ911 /ае::ст; ти1Б::1е! в 20 раз и для МО1655бтВ10 бпаЕ911 /ае::ст ти1Б::1е! в 11 раз).

Краткий обзор и заключение: антимутаторы бтВ10 и бпаЕ911 уменьшают частоту спонтанных мутаций в 3-4 раза. Экспрессия Ми1Б в указанных штаммах далее уменьшает частоту спонтанных мутаций в 2-7 раз.

С) Мутабильность в штамме ти18^-, несущем разные комбинации делеции бтВ и/или антимутатора бпаЕ911

Для подтверждения приведенных выше результатов исследовали эффект антимутатора бшВ10 (делеция полимеразы IV) и/или бпаЕ911 (аллель в кодирующей последовательности для α-субъединицы полимеразы III) в фенотипе ти18^-.

1. Создание штаммов

Из штамма Е.сой Е81481 (ти1Б215::Тп10) получали лизат Ρ1_νΐΓ, используемый для инфицирования бактериальных клеток из штаммов Е.сой МО1655, МО1655бшВ10, МО1655бпаЕ911 /ае::ст и МО1655бтВ10 бпаЕ911 /ае::ст. Полученные единичные колонии очищали, тестировали и хранили вы деленные штаммы.

2. Исследования роста мкл ночных культур указанных бактерий инокулировали в 10 мл среды БВ, содержащей 12,5 мкг/мл тетрациклина, при 30°С. Во время фазы экспоненциального роста (после выращивания в течение 8 ч) температуру повышали до 37°С и клетки инкубировали в течение ночи при 37°С.

И наконец, культуры разводили, культивировали на агаровых пластинках с рифампицином (100 мкг/мл) или без рифампицина и инкубировали в течение пяти дней при 30°С.

Значения частоты спонтанных мутаций (8МБ) в отношении устойчивости к рифампицину, представленные в табл. 3 и на фиг. 3, свидетельствуют о подавлении мутабильности в фенотипе ти18^-.

Таблица 3. Значения 8МБ в колониях, устойчивых к рифампицину

Штамм	Плазмида	БМЕ (устойчивость к рифампицину/10'⁷)
МС1655	-	0,218
МС1655<ИпВ10	-	0,145
МС1655 с1паЕ911 гае:: ст	-	0,18
ΜΟ1655άίηΒ10 с1паЕ911 гае::ст		0,048
МО1655 ти1:8: : ЬеГ	-	252,67
Μ31655άϊηΒ10 тиСЗ::ЕеЕ	-	20,16
МС1655 с1паЕ911 гае:: ст ти!3:		24,84

ΜΟ1655άίηΒ10 с1паЕ - 4,24

ΜΟ1655άίηΒ10 с!паЕ гае::ст ти&З::ЬеЕ

4,24

- 18 009058

Мутабильность (значения БМР) уменьшается в присутствии антимутаторов, таких как άίηΒ10 или 6иаЕ911, (примерно в 1,5 раза) по сравнению со штаммом дикого типа. Кроме того, бактериальный штамм, несущий антимутаторы 6ίηΒ10 и 6иаЕ911, характеризуется 4,5-кратным уменьшением мутабильности по сравнению со штаммом МС1655 дикого типа.

Делеция гена ти!Б в хромосоме значительно увеличивает мутабильность в штамме-хозяине. Мутабильность уменьшается под действием антимутаторов 6ίηΒ10 (в 12,5 раза), 6иаЕ911 (в 10 раз), 6ίηΒ10 и 6иаЕ911 (в 60 раз).

Заключение и краткий обзор: антимутаторное действие, вызываемое 6ίηΒ10 или 6наЕ911. частично дополняет фенотип Ми!^-, получаемый в результате делеции ти!Б в хромосоме.

Пример II. Реверсия мутаций барА

Для исследования реверсии точковых мутаций и мутаций со сдвигом рамки в определенном генемишени использовали систему, обладающую ауксотрофным фенотипом в Е.сой (штамм барА^-).

Ген барА кодирует дигидродипиколинат-синтазу, которая катализирует конденсацию Ь-аспартат-βсемиальдегида и пуривата в дигидропиколиновую кислоту при помощи пинг-понгового механизма, в соответствии с которым пируват связывается с ферментом, образуя шиффово основание с остатком лизина. Бактериальные клетки с мутацией в гене барА, вызывающей образование нефункционального генного продукта, не могут расти на среде, которая не содержит ПЬ-диаминопимелиновую кислоту (ПАР).

Белок Ми!Ь экспрессируется в фенотипе барА^- (барА15 (точковая мутация имеет фенотип ПарА^-) или барА::кн) в присутствии плазмид, кодирующих барАГР (открытая рамка считывания (0КР) дикого типа), барА+1 (мутация со сдвигом рамки), барА+2 или барА15 (точковая мутация). Ревертанты обнаружены на планшетах без ПБ-диаминопимелиновой кислоты.

Описание эксперимента

1. Создание плазмид

а) Клонирование барА

Клонирование барА (барА15), барА+1 (барА15+1), барА+2 (барА15+2) в рТгсН1к2/1ас2

Геномную ДНК, полученную из штамма Е.сой МС1655 (дикого типа) или АТ997 (барА15), использовали для амплификации фрагмента ДНК длиной 732 п.о., кодирующего белок ПарА, с помощью затравок 5 (БЕЦ ГО N0:5), 6 (БЕЦ ГО N0:6), 7 (БЕЦ ГО N0:7) и 8 (БЕЦ ГО N0:8) (см. табл. 4). Указанные фрагменты, полученные при помощи РСК, расщепляли и клонировали в плазмиде рТтсНщ2/1ас2 в виде фрагмента ΒатНI-X11оI. в результате чего были получены плазмиды рбарАГР, рбарА+1 и рбарА+2. Физическая структура плазмиды рбарАГР показана на фиг. 4А. Полимеразную реакцию синтеза цепи (РСК) выполняли в нижеследующих условиях (температура в °С/время в минутах): (98/10), (96/0,75; 55/0,50; 72/2)₃₅ (72/10); геркулаза.

Восемь клонов, полученных в каждом случае, анализировали путем расщепления рестрикционным ферментом ЕкГЕП (ожидаемые фрагменты: 1314 п.о. и 3964 п.о.). В общей сложности двадцать три из двадцати четырех испытанных клонов характеризовались правильным паттерном миграции.

Клонирование барА15 в р8Ш9 и ρ8ϋ40

Геномную ДНК, полученную из штамма Е.сой АТ997, использовали для амплификации фрагмента ДНК длиной 732 п.о., кодирующего белок ПарА, с помощью затравок 9 (БЕЦ ГО N0:9) и 10 (БЕЦ ГО N0:10) (см. табл. 4). Указанный фрагмент, полученный при помощи РСК, расщепляли и клонировали в плазмидах рБИ19 и рБИ40 в виде фрагмента НшбШ-ЕсоКЕ, в результате чего были получены плазмиды рБи 19барА15 и рБИ40барА15. Физическая структура плазмиды рБИ40барА показана на фиг. 4В.

Полимеразную реакцию синтеза цепи (РСК) выполняли в нижеследующих условиях (температура в °С/время в минутах): (98/10) (96/0,75; 55/0,50; 72/2)₃₅ (72/10); соотношение (Тас|/РГи) (5/1).

Десять полученных клонов выделяли и анализировали путем расщепления рестрикционным ферментом N1101 (ожидаемые фрагменты: 1122 п.о. и 2557 п.о. для рБИ40) или Аро1 (ожидаемые фрагменты: 478 п.о. и 3192 п.о.). Все клоны характеризовались правильным паттерном миграции.

2) Клонирование ши1Ь

a) Субклонирование ши1Ь в рБИ40

Плазмиду рти1Ь расщепляли БрНГ-ХтлЕ и методом гель-электрофореза выделяли фрагмент длиной 3629 п.о. Плазмиду рБИ40 расщепляли БрЫ-Ншс11 и методом гель-электрофореза выделяли фрагмент длиной 2680 п.о. Два очищенных фрагмента лигировали по липким концам, получая при этом плазмиду рБи40ти1Ь. Стратегия создания плазмиды рБи40ти1Ь показана на фиг. 5.

Шесть полученных клонов анализировали путем расщепления рестрикционными ферментами №о1 (ожидаемые фрагменты: 2675 п.о. и 3634 п.о.), Руи1 (ожидаемые фрагменты: 1368 п.о. и 4941 п.о.) и Β§1Ι (ожидаемые фрагменты: 1828 п.о. и 4481 п.о.). Три из шести испытанных клонов характеризовались правильным паттерном миграции.

b) Плазмида ртиГОкрес: замена гена Ыа геном крес

Замена гена устойчивости к ампициллину геном устойчивости к спектомицину в плазмиде рти1Ь

ДНК, полученную из плазмиды р1С156, расщепляли РкрГ-ХтпГ и методом гель-электрофореза выделяли фрагмент длиной 1304 п.о.; ДНК, полученную из плазмиды рти1Ь, расщепляли БсаГ-Хтгй и ме

- 19 009058 тодом гель-электрофореза выделяли фрагмент длиной 5443 п.о. Два очищенных фрагмента лигировали по тупым концам, получая при этом плазмиду шийЬзрес.

Двенадцать полученных клонов анализировали путем расщепления рестрикционным ферментом ЕсоК1 (ожидаемые фрагменты: 1291 п.о. и 5456 п.о.). Два из двенадцати испытанных клонов характеризовались правильной величиной.

Таблица 4. Перечень затравок, используемых для амплификации фрагментов ДНК, кодирующих белок ОарЛ

Затравка		Последовательность
5	ОарАВатНИГ	СССССАТСССТТСАССССААСТАТТСТС СССАТТС
б	<1арАВатН1 + 1	СССССАТССССТТСАССССААСТАТТСТС СССАТТС
7	с!арАВатН1+2	СССССАТСССССТТСАССССААСТАТТСТС СССАТТС
8	ОарАХЬо1	ССССТССАСССАССАААСССССАТССТТА АССССС
9	ОарАЕсоК1И1п	ССССААТТССССССАТАСААСААТСАСААССС ТТСТСТС
10	άθρΑΗϊηάΙΙΙΕθΓ	СССААССТТСССССАААСАССССААССТТТС ССАСССС

2. Анализ методом вестерн-блоттинга

a) Обнаружение 0арЛ/0арА15

Штамм барЛ::кп трансформировали плазмидами рбарЛШ, рбарЛ+1, рбарЛ+2, рбарЛ15Ш, рбарЛ15+1 и рбарЛ15+2 и очищали полученные трансформанты.

мкл ночных культур указанных бактерий инокулировали в 10 мл среды ЬВ, содержащей 0,4% глюкозы, ОЕ-диаминопиме'линовую кислоту (100 мкг/мл), ампициллин (100 мкг/мл) и канамицин (50 мкг/мл), до достижения оптической плотности (ΟΏ), равной примерно 0,5. Для удаления глюкозы одну часть клеток центрифугировали и растворяли в 5 мл среды ЬВ, содержащей требуемые антибиотики. Добавление ΙΡΤΟ в конечной концентрации 1 мМ индуцировало экспрессию белка из Р_1ас разных производных рТгс! Нз2/1ас/. Культуры инкубировали в течение 16 ч при 37°С, центрифугировали и готовили к выполнению анализа методом 8Ώ8-ΡΆΟΕ. Анализ методом вестерн-блоттинга выполняли, используя АРконъюгированные антитела против Ηΐδ-йас (данные не показаны).

b) Обнаружение МийЬ

Штамм Тор10 дикого типа трансформировали плазмидой ршийЬзрес и очищали полученные трансформанты. 20 мкл ночных культур указанных бактерий инокулировали в 10 мл среды ЬВ, содержащей спектиномицин (75 мкг/мл), до достижения оптической плотности (ОО), равной примерно 0,5. Культуру делили на 5 мл аликвоты и один раз добавляли 1РТО в конечной концентрации 1 мМ для индукции экспрессии МийЬ из промотора Р_1ас. Культуры инкубировали в течение 4 ч при 37°С, центрифугировали и готовили к выполнению анализа методом 8Ώ8-ΡΆΟΕ. Для подтверждения экспрессии МийЬ выполняли анализ методом вестерн-блоттинга, используя АР-конъюгированные антитела против Ηΐδ-йас (данные не показаны).

3. Создание штаммов

Из штамма Е.сой барЛ::кп были получены лизаты Р1_иг, используемые для инфицирования бактериальных клеток из штаммов Е.сой МО1655, МО1655бтВ10, МО1655бпаЕ9117ае::сш, МО1655бтВ10 бпаЕ911 7ае::сш, МО1655шийЬ::йей, МО1655бтВ10 шийЬ::йей, МО1655бпаЕ911 7ае::сш шийЬ::йей, МО1655бтВ10 бпаЕ911/ае::ст шийЬ::йей. Полученные единичные колонии очищали, тестировали и хранили выделенные штаммы.

4. Исследования роста

a) Реверсия точковых мутаций

Бактериальные штаммы АТ997 (барЛ15) и МО1655бтВ10 барЛ::кп трансформировали плазмидами рТгс! 1182/1ас/ и р8и19барЛ15 или плазмидами ршийЬ и р8и19барЛ15. Полученные единичные колонии очищали и инокулировали в среде ЕВ, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, 30 мкг/мл хлорамфеникола и 50 мкг/мл ПАР, в течение ночи при 37°С.

b) Реверсия мутаций со сдвигом рамки

Бактериальный штамм АТ997 (барЛ15; ОарЛ^-) трансформировали плазмидами р8Е40 и рбарЛШ, плазмидами р8и40шийЬ и рбарЛШ, плазмидами р8Е40 и рбарЛ+1, плазмидами р8Е40шн1Е и рбарЛ+1,

- 20 009058 плазмидами ρ8ϋ40 и рбарА+2 или плазмидами р8Е40ти1Р и рбарА+2. Полученные единичные колонии очищали и инокулировали в среде ЬВ, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, 50 мкг/мл канамицина и 50 мкг/мл ПАР, в течение ночи при 37°С.

мкл ночных культур бактериальных клеток инокулировали в 10 мл среды ЬВ, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, 50 мкг/мл хлорамфеникола и 50 мкг/мл ПАР, при 30°С. Во время фазы экспоненциального роста добавляли ΙΡΤΘ в конечной концентрации 1 мМ для усиления экспрессии ΑΙιιΐΡ из промотора Р1_ас. Культуры инкубировали в течение одного часа при 30°С, затем температуру повышали до 37° С и культуры выдерживали в течение ночи при 37° С.

И наконец, культуры центрифугировали и удаляли 9 мл среды, остальные клетки разводили и культивировали на агаровых пластинках, содержащих 100 мкг/мл ампициллина и 30 мкг/мл хлорамфеникола или 100 мкг/мл ампициллина и 30 мкг/мл хлорамфеникола и 50 мкг/мл ПАР, и инкубировали в течение пяти дней при 30°С.

Значения реверсии мутаций барА в штамме дикого типа и в штаммах, сверхэкспрессирующих Ми1Ь, приведенные в табл. 5 и на фиг. 6, свидетельствуют о подавлении мутабильности в результате экспрессии Ми1Ь.

Таблица 5 Значения с!ар~/с1ар⁺ в штамме дикого типа и штаммах, сверхэкспрессирующих МиЕЬ
Штамм	Плазмида	<1ар/с1ар⁺
1 - ТорЮ (мР)		0,82
2 - АТ997 (с1арА15)		0,00
3 - ΜΘ1655άίηΒ10 с1арА: :кп		0, 00
4 - АТ 9 97 (с1арА15)	рс1арА1Г, ρ3ϋ40	0, 81
5 - АТ997 (с1арА15)	рс!арА1Е, рЗи40шиРЬ	0, 72
6 - АТ997 (<5арА15)	рбарА+1, ρ3ϋ40	0, 09
7 - АТ997 (с!арА15)	рбарА+1, рЗи40тиСЬ	0,000098
8 - АТ997 (с1арА15)	рбарА+ 2, рЗи4 0	0,00
9 - АТ997 (<5арА15)	рйарА+2 , ρ3Ό4 ОтпиРЪ	0,00
10 - ΜΟ1655άίηΒ10 дарА::кп	рЗШЭбарА (АТ997); рТгсН1з2/1асг	0,57
11 - ΜΟ1655άίηΒ10 дарА::кп	рЗи19йарА (АТ997);ртиРЬ	0,051

Контрольные штаммы (1-3) Тор 10 (дикого типа; ЭарА⁺), АТ997 (барА15; [)ар.А) и МО1655барА:: кп (ОарА^-) имеют ожидаемые значения бар^-/бар⁺: примерно 1 для штамма дикого типа (наличие роста при отсутствии 1)1 .-диаминопимелиновой кислоты) и 0 для штаммов барА^- (отсутствие роста при отсутствии 1)1 .-диаминопимелиновой кислоты).

Два штамма АТ997 (барА15) рбарА1Р рТгс (4) и АТ997 (барА15) рбарА1Р ртиН, (5) характеризуются ожидаемым фенотипом дикого типа при наличии функционального гена барА в плазмиде рбарА1Р. Мутации со сдвигом рамки (6,8) или точковые мутации плазмиды, кодированной барА, в штаммехозяине барА^- (10) должны подавлять рост клеток при отсутствии ПАР, в то время как реверсия введенных мутаций индуцирует рост при отсутствии ПАР (7,11).

Краткий обзор и заключение: в обоих случаях (мутация со сдвигом рамки и точковая мутация) более высокая реверсия мутации наблюдалась при отсутствии ΑΙιιΐΡ. Значение бар^-/бар⁺ для мутации со сдвигом рамки уменьшается в 1000 раз и для точковой мутации в 10 раз, из чего следует, что экспрессия ΑΙιιΐΡ подавляет реверсию мутаций и, следовательно, противодействует закреплению спонтанных мутаций в хромосоме.

Пример III. Экспрессия ΑΙιιΐΡ в условиях ферментации

Мутабильность штамма-продуцента 1М83 рХХ7, несущего вектор экспрессии О-С8Е, контролируемый триптофаном, анализировали путем А) вычисления частоты спонтанных мутаций, культивируя клетки на рифампицилине, В) вычисления частоты спонтанных мутаций, культивируя клетки на фосфомицине, и С) введения генов-репортеров в плазмиду-продуцент рХХ7 (кодирующую О-С8Р).

При выполнении анализа В) рифампицилин заменяли фосфомицином, так как в экспериментальных

- 21 009058 условиях устойчивость к фосфомицину возникает в Е.сой гораздо быстрее. Фосфомицин является ингибитором клеточной оболочки, применяемым главным образом для лечения неосложненных инфекционных заболеваний нижнего отдела мочевых путей.

Описание эксперимента

1. Клонирование

а) Клонирование хлорамфеникольного кластера в плазмиде рХХ7

ДНК, полученную из плазмиды ρ8ϋ19, использовали для амплификации фрагмента ДНК, кодирующего ген устойчивости к хлорамфениколу, с помощью затравок 11 (8ЕР ΙΌ N0:11) и 12 (8ЕР ΙΌ N0:12) (табл. 6). Указанные фрагменты, полученные при помощи РСК, расщепляли и клонировали в плазмидах рХХ7 в виде фрагмента ВЬус1-АЪЛ, в результате чего были получены плазмиды рХХ7ст. Стратегия создания плазмиды рХХ7ст показана на фиг. 7А. Для упрощения отбора клонировали только область -10 последовательности Шина Дальгарно.

Полимеразную реакцию синтеза цепи (РСК) выполняли в нижеследующих условиях (температура в °С/время в минутах): (98/10) (96/0,75; 55/0,50; 72/1)₃₅ (72/10); геркулаза.

Таблица 6. Затравки, используемые для амплификации фрагмента ДНК, кодирующего ген устойчивости к хлорамфениколу

Затравка		Последовательность
11	сшВЬуС1	ААСССТСАССАТААТСАААТААСАТСАСТАС
	Ып	ССС
12	стАБсИ	СААСАССАТСТССТСААСАТСАТСТТАТТАА
	Ьег	ТСАСАТАА

Ь) Клонирование молчащего гена 1е1А в плазмиде рХХ7

Обойму селекции плазмиды рОВО1 выделяли и клонировали в плазмиде рХХ7 в виде фрагмента М§11-8та1, получая при этом плазмиду рХХ71е1 (лигирование по тупым концам).

Стратегия создания плазмиды р.ХХ71е1 показана на фиг. 7В.

Плазмиду рОВО1 выделяли и исследовали мобильные элементы и другие спонтанные мутации в разных грамотрицательных бактериях (8сйпеМег е1 а1., Р1а§т1й 44, 201-207 (2000)). Обойма селекции, содержащая ген-мишень для мутагенеза, состоит из молчащего гена 1еЧА, контролируемого промотором Р_К бактериофага λ, который подавляется репрессором λ С1. Спонтанные мутации (точковые мутации, делеции и инсерции), которые инактивируют С1 или удалают сайт связывания С1, подавляют Р_К и, таким образом, запускают экспрессию 1е1А. Ген-мишень для мутагенеза имеет цепь длиной около 1 т.п.о. В данном случае экспрессия Ми1Ь должна уменьшить частоту мутаций и следовательно снизить устойчивость к тетрациклину в указанном штамме-хозяине.

2. Исследования роста

А) Определение частоты спонтанных мутаций (8МГ) в Е.сой при культивировании клеток на рифампицилине

Бактериальный штамм .1М83 рХХ7 трансформировали плазмидой рТгсН1§2/1ас2 (контрольная плазмида) и ριιιιιΐΐ,. Полученные единичные колонии очищали и клетки инокулировали в среде БВ, содержащей 50 мкг/мл канамицина и при необходимости 100 мкг/мл ампициллина, в течение ночи при 30°С. 3 мл ночных культур указанных бактерий инокулировали в 100 мл среды КМО, содержащей 50 мкг/мл канамицина и при необходимости 100 мкг/мл ампициллина, при 30°С. Во время фазы экспоненциального роста добавляли 1РТО в конечной концентрации 1 мМ для усиления экспрессии МиП, из промотора 1\_1сплазмиды ριιιιιΐΐ,, после чего добавляли триптофан в конечной концентрации 100 мкг/мл для индукции экспрессии О-С8Г из плазмиды рХХ7. Через один час после индукции температуру инокуляции повышали с 30 до 37°С и выдерживали клетки в течение ночи при 37°С.

Клетки центрифугировали и объем среды уменьшали до 10 мл.

И наконец, культуры разводили и культивировали на А) пластинках с ВВА, В) пластинках с КМО и С) пластинках с М9, содержащих:

a) 100 мкг/мл ампициллина и при необходимости 50 мкг/мл канамицина;

b) 100 мкг/мл ампициллина и при необходимости 50 мкг/мл канамицина и 100 мкг/мл рифампицина;

и инкубировали в течение трех дней при 30°С.

Значения частоты спонтанных мутаций в отношении устойчивости к рифампицину для штаммов .1М83 рХХ7, .1М83 рХХ7 рТгс и .1М83 рХХ7 ριιιιιΐΐ, приведены на фиг. 8. Штамм-продуцент .1М83 рХХ7 имеет значение 8МГ, равное примерно 0,45. Указанное значение 8МГ сохраняется при дополнительном введении пустого вектора рТгс в штамм-продуцент. Но дальнейшее введение ριπιιΐΐ, в штамм .1М83 рХХ7 вызывает уменьшение значения 8МГ при сверхэкспрессии Мн1В примерно в 2 раза.

- 22 009058

B) Определение частоты спонтанных мутаций (8МЕ) в Е.сой при культивировании клеток на фосфомицине

Бактериальный штамм 1М83 рХХ7 трансформировали плазмидой рТгсШйЛ и ртиГЬ. Полученные единичные колонии очищали и для каждого штамма (1М83 рХХ7, ГМ83 рТгсА и ГМ83 рХХ7 ртиГЬ) 20 независимых однозначно определяемых клеток инокулировали в среде ЬВ, содержащей 50 мкг/мл канамицина и при необходимости 100 мкг/мл ампициллина, в течение ночи при 30°С.

мкл ночных культур указанных бактерий инокулировали в 10 мл среды ВМС, содержащей 50 мкг/мл канамицина и при необходимости 100 мкг/мл ампициллина, при 30°С. Во время фазы экспоненциального роста добавляли ГРТО в конечной концентрации 1 мМ для усиления экспрессии МиГЬ из Р_1асплазмиды ртиГЬ и затем добавляли триптофан в конечной концентрации 100 мкг/мл для индукции экспрессии О-С8Е из Рц_р, плазмиды рХХ7. Через один час после индукции температуру инокуляции повышали с 30 до 37°С и выдерживали клетки в течение ночи при 37°С.

Клетки центрифугировали и объем среды уменьшали до 1 мл.

И наконец, культуры разводили и культивировали на агаровых пластинках со средой ЕВ, содержащей:

b) 100 мкг/мл ампициллина и при необходимости 50 мкг/мл канамицина и 30 мкг/мл фосфомицина; и инкубировали в течение трех дней при 30°С.

Значения частоты спонтанных мутаций в отношении устойчивости к фосфомицину для штаммов 1М83 рХХ7, ГМ83 рХХ7 рТгс и ГМ83 рХХ7 ртиГЬ приведены на фиг. 9. Штамм-продуцент ГМ83 рХХ7 имеет значение 8МЕ, равное примерно 4,9. Указанное значение 8МЕ сохраняется при дополнительном введении пустого вектора рТгс в штамм-продуцент. Но дальнейшее введение ртиГЬ в штамм ГМ83 рХХ7 вызывает уменьшение значения 8МЕ при сверхэкспрессии МиГЬ примерно в 3 раза.

Краткий обзор и заключение: Сверхэкспрессия МиГЬ уменьшает мутабильность в штаммепродуценте О-С8Е примерно в 3 раза и повышает жизнеспособность клеток в 10³ раз.

C) Определение частоты спонтанных мутаций в штамме Е.со11 ГМ83рХХ7 путем введения геноврепортеров

a) Экспрессия О-С8Е

b) Экпрессия и подавление О-С8Е

Поскольку активность О-С8Е контролировать нельзя, в плазмиду рХХ7 были введены генырепортеры.

Мутагенез анализировали в двух разных системах. В первой системе был использован ген устойчивости к хлорамфениколу, контролируемый слабым промотором. Спонтанные мутации, такие как точковые мутации, делеции и инсерции, которые дезактивируют экспрессию гена ст, уменьшают устойчивость к хлорамфениколу. Отсутствие МиГЬ должно быть выражено в виде уменьшения отношения числа спонтанных мутаций, сообщающих устойчивость к хлорамфениколу, к общему числу жизнеспособных клеток в культуре. Во второй системе использовали кластер, содержащий молчащий ген !е!А, контролируемый промотором Р_В бактериофага λ, и репрессор λ с1, препятствующий экспрессии !е!А. Спонтанные мутации, такие как точковые мутации, делеции и инсерции, которые инактивируют с1 или удаляют сайт связывания с1, вызывают дерепрессию Р_В и, таким образом, запускают экспрессию !е!А. Экспрессия МиГЬ должна быть выражена в виде уменьшения отношения числа спонтанных мутаций, сообщающих устойчивость к тетрациклину, к общему числу жизнеспособных клеток в культуре.

а) Экспрессия О-С8Е

Бактериальный штамм ГМ83 трансформировали плазмидами рХХ7ст, рХХ7ст рТгсН ίδ2/1;κΖ. рХХ7ст ртиГЬ, рХХ7!е!, рХХ7!е! рТгсН|52/1;·^ и рХХ7!е! рти1Ь. Полученные единичные колонии очищали и клетки инокулировали в среде ЬВ, содержащей 50 мкг/мл канамицина и при необходимости 100 мкг/мл ампициллина, в течение ночи при 30°С.

мкл ночных культур указанных бактерий инокулировали в 10 мл среды ВМС, содержащей 50 мкг/мл канамицина и при необходимости 100 мкг/мл ампициллина, при 30°С. Во время фазы экспоненциального роста добавляли ГРТО в конечной концентрации 1 мМ для усиления экспрессии МиГЬ из Р_1асплазмиды ртиГЬ, и добавляли триптофан в конечной концентрации 100 мкг/мл для индукции экспрессии О-С8Е из промотора Р_!гр плазмиды рХХ7. Через один час после индукции температуру инокуляции повышали с 30 до 37°С и выдерживали клетки в течение ночи при 37°С.

И наконец, культуры разводили и культивировали на агаровых пластинках со средой ЕВ, содержащей разные антибиотики (указанные в табл. 7), и инкубировали в течение четырех дней при 30°С.

- 23 009058

Таблица 7. Использованные антибиотики

Штамм	Антибиотики
ДМ 83 рХХ7 ДМ83 рХХ7 рТгсА	50 мкг/мл канамицина 50 мкг/мл канамицина 100 мкг/мл ампициллина	50 мкг/мл канамицина 30 мкг/мл хлорамфеникола 50 мкг/мл канамицина 30 мкг/мл хлорамфеникола	50 мкг/мл канамицина 12,5 мкг/мл тетрациклина 50 мкг/мл канамицина 12,5 мкг/мл тетрациклина
		100 мкг/мл ампициллина	100 мкг/мл ампициллина
Л483 рХХ7 ршиРЬ	50 мкг/мл канамицина 100 мкг/мл ампициллина	50 мкг/мл канамицина 30 мкг/мл хлорамфеникола 100 мкг/мл ампициллина	50 мкг/мл канамицина 12,5 мкг/мл тетрациклина 100 мкг/мл ампициллина
ДМ8 3 рХХ7ст	50 мкг/мл канамицина	50 мкг/мл канамицина 30 мкг/мл хлорамфеникола
ДМ8 3 рХХ7ст рТгсА	50 мкг/мл канамицина 100 мкг/мл ампициллина	50 мкг/мл канамицина 30 мкг/мл хлорамфеникола 100 мкг/мл ампициллина
ДМ8 3 рХХ7ст ртиРЬ	50 мкг/мл канамицина 100 мкг/мл ампициллина	50 мкг/мл канамицина 30 мкг/мл хлорамфеникола 100 мкг/мл ампициллина
ДМ8 3 рХХ7СеР	50 мкг/мл канамицина		50 мкг/мл канамицина 12,5 мкг/мл тетрациклина
ДМ83 рХХ7ЬеЪ рТгсА	50 мкг/мл канамицина 100 мкг/мл ампициллина		50 мкг/мл канамицина 12,5 мкг/мл тетрациклина 100 мкг/мл ампициллина
ДМ8 3 рХХ7РеЪ	50 мкг/мл		50 мкг/мл

- 24 009058

ртиЪЬ

канамицина 100 мкг/мл ампициллина

канамицина 12,5 мкг/мл тетрациклина 100 мкг/мл ампициллина

Значения частоты спонтанных мутаций в гене-репортере устойчивости к хлорамфениколу для штаммов 1М83 рХХ7ст, 1М83 рХХ7ст рТгс и 1М83 рХХст ртиГО показаны на фиг. 10. Для двух штаммов 1М83 рХХ7ст и 1М83 рХХ7 рТгс значения мутабильности были равны 0,28 или 0,35 (Δ1,25). Экспрессия Ми1Ь уменьшает значение мутабильности до 0,49 (А1,75). Из вышеизложенного следует, что экспрессия Ми1Ь подавляет конверсию устойчивости к хлорамфениколу в чувствительность к хлорамфениколу и, таким образом, противодействует закреплению спонтанной мутации в хромосоме.

Значения частоты спонтанных мутаций в молчащем гене-репортере 1е1А для штаммов .1М83 рХХ71е1, 1М83 рХХ71е! рТгс и 1М83 рХХ71е! рти1Ь показаны на фиг. 11. Для двух штаммов 1М83 рХХ71е! и 1М83 рХХ71е! рТгс значения мутабильности были равны 0,43 или 0,39 (Δ1,1). Экспрессия Ми1Ь уменьшает значение мутабильности до 0,25 (Δ1,72). Из вышеизложенного следует, что экспрессия Ми1Ь подавляет конверсию чувствительности к тетрациклину в устойчивость к тетрациклину и, таким образом, противодействует закреплению спонтанных мутаций в хромосоме.

Ь) Экспрессия и подавление О-С8Е

Бактериальный штамм дикого типа .1М83 трансформировали плазмидами рХХ7ст, рХХ7ст рТгсН182/1ас2, рХХ7ст рти1Ь, рХХ71е! и рХХ71е! рТгсН182/1ас2 и рХХ71е! рти1Ь. Полученные единичные колонии очищали и клетки инокулировали в среде ЬВ, содержащей 50 мкг/мл канамицина и при необходимости 100 мкг/мл ампициллина, в течение ночи при 30°С.

мкл ночных культур указанных бактерий инокулировали в 10 мл среды ВОМ, содержащей 50 мкг/мл канамицина и при необходимости 100 мкг/мл ампициллина, при 30°С. Во время фазы экспоненциального роста добавляли ГОТО в конечной концентрации 1 мМ для усиления экспрессии Ми1Ь из промотора Р_1гс плазмиды ргаи1Ь. Культуры делили пополам и добавляли триптофан в конечной концентрации 100 мкг/мл для индукции экспрессии О-С8Е из промотора Р_1гр плазмиды рХХ7. Через один час после индукции температуру инокуляции повышали с 30 до 37° С и выдерживали клетки в течение ночи при 37°С.

И наконец, культуры разводили и культивировали на агаровых пластинках со средом 1.В, содержащей разные антибиотики (см. табл. 7), и инкубировали в течение ночи при 37°С.

Мутабильность модифицированного штамма-продуцента 1М83 рХХст в условиях ферментации показана на фиг. 12. При отсуствии О-С8Е измеренная частота устойчивости к хлорамфениколу изменялась в пределах от 50 до 55 для штаммов 1М83 рХХ7ст, 1М83 рХХ7ст рТгс и 1М83 рХХ7ст ртиГО. Индукция О-С8О уменьшает указанные значения для штаммов 1М83 рХХ71е! и 1М83 рХХ71е! рТгс в 3 раза. Но для штамма 1М83 рХХ7 рти1Ь устойчивость к хлорамфениколу сохраняется при экспрессии О-С8Е.

Экспрессия Ми1Ь подавляет конверсию устойчивости к хлорамфениколу в чувствительность к хлорамфениколу. Ми1Ь противодействует закреплению спонтанных мутаций в хромосоме.

На фиг. 13 показано значительное увеличение мутабильности в модифицированном штаммепродуценте 1М83 рХХ7 в условиях ферментации. Но для штамма .1М8 3 рХХ7 рти1Ь, экспрессирующего кодированный плазмидой белок Ми1Ь, устойчивость к тетрациклину остается постоянной при экспрессии О-С8Е. Экспрессия Ми1Ь подавляет конверсию устойчивости к тетрациклину в чувствительность к тетрациклину и противодействует закреплению спонтанных мутаций в хромосоме.

Заключение и краткий обзор: полученные результаты показывают, что сверхэкспрессия Ми1Ь уменьшает мутабильность в штамме, ферментирующем О-С8Е, во время продуцирования О-С8Е примерно в 3 раза. Кроме того, установлено, что сверхэкспрессия Ми1Ь повышает жизнеспособность клеток в 10³ раз.

Индукция О-С8Е повышает частоту спонтанных мутаций в испытанных штаммах-продуцентах примерно в 2-3 раза.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ уменьшения частоты спонтанных мутаций в клетке или организме путем введения в указанную клетку или организм по меньшей мере двух мутаций, объединенное действие которых вызывает усиление по меньшей мере двух механизмов репарации клеточной ДНК.
2. Способ получения клетки или организма с уменьшенной частотой спонтанных мутаций путем введения по меньшей мере в одну клетку организма по меньшей мере двух мутаций, объединенное действие которых вызывает усиление по меньшей мере двух механизмов репарации клеточной ДНК, и реге

- 25 009058 нерации организма из указанной клетки, если данный организм является многоклеточным организмом.
3. Способ по п.1 или 2, в котором клетка является прокариотической клеткой.
4. Способ по п.3, в котором прокариотическая клетка является клеткой архебактерии или эубактерии.
5. Способ по п.4, в котором клетка эубактерии является клеткой грамположительной или грамотрицательной бактерии.
6. Способ по п.1 или 2, в котором клетка является эукариотической клеткой.
7. Способ по п.6, в котором эукариотическая клетка является грибной клеткой, животной клеткой или растительной клеткой.
8. Способ по любому из пп.1, 2 или 5-7, в котором организм является грибом, животным или растением.
9. Способ по любому из пп.1-8, в котором объединенное действие по меньшей мере двух мутаций приводит к усилению способности по меньшей мере двух механизмов репарации клеточной ДНК исправлять спонтанно возникающие мутации.
10. Способ по п.9, в котором усилена способность системы репарации ошибочно спаренных оснований, системы пострепликативной репарации и/или системы 808-репарации исправлять спонтанно возникающие мутации.
11. Способ по любому из пп.1-10, в котором по меньшей мере две мутации выбраны из мутации, приводящей к повышению экспрессии белка ΜιιΐΓ или гомологичного ему белка, мутации, приводящей к повышению экспрессии белка Μι.ιΐ8 или гомологичного ему белка, аллеля-антимутатора гена, кодирующего ДНК-полимеразу IV или гомологичный ей белок, и аллеля-антимутатора гена, кодирующего субъединицу ДНК-полимеразы III или гомологичного ей белка.
12. Способ по п.11, в котором повышение экспрессии ΜπίΕ, Μπΐ8 или гомологичного им белка достигается путем введения в клетку вектора, содержащего ген ти1Ь, ген, кодирующий гомологичный белок ΜπίΕ, ген ти!8 или ген, кодирующий гомологичный белок Μπΐ8, под функциональным контролем одной или нескольких регуляторных единиц, обеспечивающих сверхэкспрессию ΜπίΕ, Μι.ιΐ8 или гомологичного им белка.
13. Способ по п.12, в котором вектор является многокопийной плазмидой.
14. Способ по п.11 или 12, в котором регуляторная единица является индуцибельным или конститутивным промотором.
15. Способ по п.11, в котором повышение экспрессии ΜπίΕ, Μι.ιΐ8 или гомологичного им белка достигается путем введения в хромосому (хромосомы) клетки-хозяина одной или нескольких дополнительных копий соответствующего гена ти! под функциональным контролем одной или нескольких регуляторных единиц и/или путем введения одной или нескольких мутаций в указанные регуляторные единицы, контролирующие экспрессию нативного белка Μπΐ, так, чтобы продуцирование соответствующего белка Μπΐ увеличивалось по сравнению с соответствующей клеткой дикого типа.
16. Способ по п.11, в котором аллель-антимутатор гена, кодирующего ДНК-полимеразу IV, представляет собой 6ίηΒ10.
17. Способ по п.11, в котором аллель-антимутатор гена, кодирующего субъединицу ДНКполимеразы III, представляет собой 6иаЕ911.
18. Способ по любому из пп.1-17, в котором объединенное действие 6ίηΒ10 и άηаΕ911 уменьшает частоту спонтанных мутаций по сравнению с клеткой или организмом дикого типа по меньшей мере в 10 раз.
19. Способ по любому из пп.1-18, в котором объединенное действие 6ίηΒ10, 6иаЕ911 и сверхэкспрессированного белка ти!Ь уменьшает частоту спонтанных мутаций по сравнению с клеткой или организмом дикого типа по меньшей мере в 50 раз.
20. Способ по любому из пп.1-19, в котором объединенное действие по меньшей мере двух мутаций повышает жизнеспособность клетки.
21. Клетка с уменьшенной частотой спонтанных мутаций и/или повышенной жизнеспособностью, полученная способом по любому из пп.1-20, которая содержит по меньшей мере две мутации, объединенное действие которых вызывает усиление по меньшей мере двух механизмов репарации клеточной ДНК.
22. Клетка по п.21, которая является бактериальной, грибной, растительной или животной клеткой.
23. Организм с уменьшенной частотой спонтанных мутаций, полученный способом по любому из пп.1-20, где клетки этого организма содержат по меньшей мере две мутации, объединенное действие которых вызывает усиление по меньшей мере двух механизмов репарации клеточной ДНК.
24. Штамм Е.сой Μ616556ίηΒ10, содержащий плазмиду рти1й (Ό8Μ 17016).
25. Штамм Е.сой Μ616556ίηΒ10 тиШТе!, содержащий плазмиду рти1й (Ό8Μ 17017).
26. Штамм Е.сой Μ61655 6иаЕ хассст, содержащий плазмиду рти!Ь (Ό8Μ 17018).
27. Штамм Е.сой Μ61655 6иаЕ хае::ст тиШТе!, содержащий плазмиду рти1й (Ό8Μ 17019).
28. Штамм Е.сой Μ616556ίηΒ10 6иаЕ /ае::ст (Ό8Μ 17015).
29. Штамм Е.сой Μ616556ίηΒ10 6иаЕ /ае::ст тиШТе! (Ό8Μ 17014).

- 26 009058
30. Штамм Е.со11 М6165561пВ10 бпаЕ хае::ст. содержащий плазмиду рти!Ь (И8М 17020).
31. Штамм Е.со11 М616556шВ10 бпаЕ хае::ст ти!Ь::!е!, содержащий плазмиду рти!Ь (И8М 17021).
32. Способ создания экспрессирующей системы для белка, аминокислотная последовательность которого стабилизирована в отношении спонтанно возникающих мутаций, который включает в себя

a) введение последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей данный белок, в геном клеткихозяина, содержащей по меньшей мере две мутации, объединенное действие которых усиливает способность по меньшей мере двух механизмов репарации ДНК исправлять спонтанно возникающие мутации под функциональным контролем одной или нескольких регуляторных единиц, обеспечивающих индуцибельную или конститутивную экспрессию белка; или

b) введение последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей данный белок, в вектор под функциональным контролем одной или нескольких регуляторных единиц, обеспечивающих индуцибельную или конститутивную экспрессию белка, и перенос указанного вектора в клетку-хозяина, содержащую по меньшей мере две мутации, объединенное действие которых усиливает способность по меньшей мере двух механизмов репарации клеточной ДНК исправлять спонтанно возникающие мутации; и

c) культивирование и/или поддержание клетки-хозяина в соответствующей среде.
33. Способ продуцирования белка, аминокислотная последовательность которого стабилизирована в отношении спонтанно возникающих мутаций, который включает в себя

a) введение последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей данный белок, в геном клеткихозяина, содержащей по меньшей мере две мутации, объединенное действие которых усиливает способность по меньшей мере двух механизмов репарации ДНК исправлять спонтанно возникающие мутации под функциональным контролем одной или нескольких регуляторных единиц, обеспечивающих индуцибельную или конститутивную экспрессию белка; или

b) введение последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей данный белок, в вектор под функциональным контролем одной или нескольких регуляторных единиц, обеспечивающих индуцибельную или конститутивную экспрессию белка, и перенос указанного вектора в клетку-хозяина, содержащую по меньшей мере две мутации, объединенное действие которых усиливает способность по меньшей мере двух механизмов репарации клеточной ДНК исправлять спонтанно возникающие мутации;

c) культивирование клетки-хозяина в соответствующей среде в условиях, обеспечивающих экспрессию данного белка; и

ά) выделение экспрессированного белка.
34. Способ по п.33, в котором белок выделяют из среды.
35. Способ по п.33, в котором белок экстрагируют из клетки-хозяина.
36. Способ по любому из пп.32-35, в котором белок является терапевтически пригодным белком, в частности, цитокином или фактором роста.
37. Способ по любому из пп.32-36, в котором вектор является плазмидой, бактериофагом или космидой.
38. Способ по любому из пп.32-37, в котором регуляторная единица является промотором, сайтом связывания рибосомы, энхансером, сайленсером и/или 3'-концевым терминатором транскрипции.
39. Способ по любому из пп.32-38, в котором последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая белок, функционально связана с лидерной последовательностью, направляющей перенос экспрессированного белка в клеточную органеллу, клеточный компартмент, внеклеточное пространство или среду.
40. Способ получения продукта ферментации путем культивирования в среде клетки, продуцирующей продукт ферментации, и/или по меньшей мере одного фермента, участвующего в образовании продукта ферментации, в котором геном клетки стабилизирован в отношении спонтанно возникающих изменений последовательности по меньшей мере двумя мутациями, объединенное действие которых усиливает способность по меньшей мере двух механизмов репарации клеточной ДНК исправлять спонтанно возникающие мутации.
41. Способ по п.40, в котором продукт ферментации является нуклеиновой кислотой, нуклеозидом, нуклеотидом, аминокислотой, белком, кислотой, углеводом, витамином, антибиотиком или алкалоидом.
42. Способ по любому из пп.32-41, в котором усилена способность системы репарации ошибочно спаренных оснований, функции исправления ошибок и/или системы 808-репарации исправлять спонтанно возникающие мутации.
43. Способ по любому из пп.32-42, в котором по меньшей мере две мутации выбраны из мутации, приводящей к повышению экспрессии белка Ми!Ь или гомологичного белка, мутации, приводящей к повышению экспрессии белка Ми!8 или гомологичного белка, аллеля-антимутатора гена, кодирующего ДНК-полимеразу IV или гомологичный ей белок, или аллеля-антимутатора гена, кодирующего субъединицу ДНК-полимеразы III или гомологичного ей белка.
44. Способ по п.43, в котором повышение экспрессии МиШ, Ми!8 или гомологичного им белка происходит благодаря присутствию в клетке вектора, который содержит ген ти!Ь, ген, кодирующий гомологичный белок МиШ, ген ти!8 или ген, кодирующий гомологичный белок Ми!8, под функциональным контролем одной или нескольких регуляторных единиц, обеспечивающих сверхэкспрессию Ми!Ь, Ми!8 или гомологичного им белка.

- 27 009058
45. Способ по п.43, в котором повышение экспрессии Ми!Ь, Ми!8 или гомологичного им белка достигается путем введения в хромосому (хромосомы) клетки-хозяина одной или нескольких дополнительных копий соответствующего гена ти! под функциональным контролем одной или нескольких регуляторных единиц и/или введения одной или нескольких мутаций в указанные регуляторные единицы, контролирующие экспрессию нативного белка Ми! так, чтобы продуцирование соответствующего белка Ми! увеличивалось по сравнению с соответствующей клеткой дикого типа.
46. Способ по п.43, в котором аллель-антимутатор гена, кодирующего ДНК-полимеразу IV, представляет собой б1иВ10.
47. Способ по п.43, в котором аллель-антимутатор гена, кодирующего субъединицу ДНКполимеразы III, представляет собой биаЕ911.
48. Способ по любому из пп.32-47, в котором объединенное действие б1иВ10 и биаЕ911 уменьшает частоту спонтанных мутаций по сравнению с клеткой дикого типа по меньшей мере в 10 раз.
49. Способ по любому из пп.32-48, в котором объединенное действие б1иВ10, биаЕ911 и сверхэкспрессированного белка ти!Ь уменьшает частоту спонтанных мутаций по сравнению с клеткой дикого типа по меньшей мере в 50 раз.
50. Способ по любому из пп.32-49, в котором объединенное действие по меньшей мере двух мутаций повышает жизнеспособность клетки.
51. Способ по любому из пп.32-50, в котором клетка является прокариотической или эукариотической клеткой.
52. Способ по п.51, в котором клетка является клеткой грамположительной или грамотрицательной бактерии.
53. Способ по п.51, в котором клетка является грибной клеткой, животной клеткой или растительной клеткой.
54. Способ по любому из пп.32-53, в котором клетка является клеткой по любому из пп.21, 22 или 24-31 или полученной способом по любому из пп.1-20.
55. Способ по любому из пп.32-54, в котором клетку культивируют в жидкой среде.
56. Способ по п.55, в котором клетку культивируют в непрерывной культуре или периодической культуре.
57. Способ по любому из пп.32-56, в котором клетка является иммобилизованной.
58. Способ по любому из пп.32-54, в котором клетку культивируют на твердой или полутвердой среде.
59. Способ по любому из пп.40-58, в котором продукт ферментации выделяют из клетки.
60. Способ по любому из пп.40-58, в котором продукт ферментации выделяют из среды.
61. Белок, полученный способом по любому из пп.32-60.
62. Продукт ферментации, полученный способом по любому из пп.40-60.