JP2007523657A - 細胞の自然突然変異率の低減 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、細胞または生物の自然突然変異の頻度を低下させる方法、ならびにそのような細胞および生物を産生する方法と、自然突然変異の頻度が低下している細胞および/または生物と、自然突然変異の頻度が低下している細胞を用いることによって、タンパク質の発現系を産生する方法、タンパク質を産生する方法、および発酵産物を産生する方法とに関する。
変異は、生体システムの特徴であり、自然選択の材料を提供する。細菌などの生物では絶えず自然突然変異が起きている。変異の発生率は、生物、例えば特定の遺伝子のサイズ、および塩基対置換による不活性化に対する遺伝子の感受性によって大きく異なる。大腸菌(Escherichia coli)では、1ゲノム複製あたり、1ゲノムあたりの変異の値がμg=0.0025であり、ゲノムサイズ4.6×106塩基対の中での1複製あたり、1塩基対あたりの変異率がμb=5.4×10−10である。G−C→A−Tなど、詳細が明らかにされている単一の経路の発生率でさえ、単一遺伝子内の異なった部位では、2000倍を越える相違を有することがあり、これは、いまなお大部分が謎である、局所的DNA配列およびDNA構造の影響によるものと考えられている。変異の種類、およびそれらを生成する過程は、両方とも多様であり、部分的にしか発見されていない。
したがって、本発明の根底にある技術的課題は、細胞または生物によって、タンパク質などの発酵産物を産生する方法および手段を提供し、その際、自然発生した突然変異、中でも発酵工程の定常期中に発生する変異に対して、産生を行う細胞または生物が保護および/または安定化され、かつ発酵産物、詳細にはタンパク質の形成速度および組成の両方が長期的に保障および保護されるようにすることである。
a) 少なくとも2つの変異を含有するタンパク質をコードする核酸配列を、上記タンパク質の誘導性または構成的発現を可能にする1つまたは複数の調節ユニットの機能的制御下に、宿主細胞のゲノムに挿入する工程であって、上記少なくとも2つの変異の複合作用によって、自然発生した突然変異を修復する少なくとも2つの細胞性DNA修復機構の能力の強化に導かれる工程、または
b) 上記タンパク質をコードする核酸配列を、上記タンパク質の誘導性または構成的発現を可能にする1つまたは複数の調節ユニットの機能的制御下にベクターに挿入し、さらに、少なくとも2つの変異を含有するベクターを宿主細胞内に移入する工程であって、上記少なくとも2つの変異の複合作用によって、自然発生した突然変異を修復する少なくとも2つの細胞性DNA修復機構の能力の強化に導かれる工程と、
c) 適当な培地中で上記宿主細胞を培養および/または維持する工程と
を含む。
a) 少なくとも2つの変異を含有するタンパク質をコードする核酸配列を、上記タンパク質の誘導性または構成的発現を可能にする1つまたは複数の調節ユニットの機能的制御下に、宿主細胞のゲノムに挿入する工程であって、上記少なくとも2つの変異の複合作用によって、自然発生した突然変異を修復する少なくとも2つの細胞性DNA修復機構の能力の強化に導かれる工程、または
b) 上記タンパク質をコードする核酸配列を、上記タンパク質の誘導性または構成的発現を可能にする1つまたは複数の調節ユニットの機能的制御下にベクターに挿入し、さらに、少なくとも2つの変異を含有するベクターを宿主細胞内に移入する工程であって、上記少なくとも2つの変異の複合作用によって、自然発生した突然変異を修復する少なくとも2つの細胞性DNA修復機構の能力の強化に導かれる工程と、
c) 適当な培地中で、タンパク質の発現を可能にする条件下に宿主細胞を培養する工程と、
d) 発現された上記タンパク質を単離する工程と
を含む。
プラスミドpmutLを含有する大腸菌MG1655 dinB10(DSM17016)、
プラスミドpmutLを含有する大腸菌MG1655 dinB10 mutL::tet(DSM17017)、
プラスミドpmutLを含有する大腸菌MG1655 dnaE zae::cm(DSM17018)、
プラスミドpmutLを含有する大腸菌MG1655 dnaE zae::cm mutL::tet(DSM17019)、
大腸菌MG1655 dinB10 dnaE zae::cm(DSM17015)、
大腸菌MG1655 dinB10 dnaE zae::cm mutL::tet(DSM17014)、
プラスミドpmutLを含有する大腸菌MG1655 dinB10 dnaE zae::cm(DSM17020)、および
プラスミドpmutLを含有する大腸菌MG1655 dinB10 dnaE zae::cm mutL::tet(DSM17021)
からなる群から選択される。
(様々な大腸菌株のリファンピシン耐性に対する自然突然変異の頻度(SMF)の測定)
通常、細菌である大腸菌(Escherichia coli)の細胞は、抗生物質リファンピシンに対して感受性であって、すなわちそれらは、この抗生物質を含有する培地で増殖できない。しかし、リファンピシンに対する耐性を与える変異は、大腸菌ゲノムで低頻度で自然に発生する。したがって、リファンピシンを含有する培地上に、多数の細胞(108)をプレーティングした場合、ほとんどの細胞は抗生物質によって殺されるであろうが、いくつかのコロニーが成長するであろう。これは、リファンピシンに対する耐性を与える変異が、細胞ゲノム中で自然に発生するために可能である。それらの変異は、その次に、元の変異体の子孫によって引き継がれる。この変異は、リファンピシンが存在する環境においてのみ有益であり、おそらく、他のほとんどの条件下においては、それは、その変種に何の利点も与えないことに留意するのが重要である。リファンピシンは、主として、結核およびライ病、および場合によっては他の疾患を治療するのに使用される抗生物質である。耐性は、膜透過性の変化、またはmRNAポリメラーゼをコードするrpoB遺伝子における変異によるものである。これらの機構は両方とも、染色体突然変異を介して起動する。しかし、大腸菌の染色体には、リファンピシンに対する細菌の耐性を与え得るいくつかの標的遺伝子が存在する。
(実験の概要)
(1.MutLおよびMutSの過剰発現プラスミドの構築)
a) pTrcHis2/lacZへのmutLのクローニング
このプラスミドは、大腸菌におけるMutLの高レベルで、かつ「制御された」発現を実現するために構築した。
このプラスミドは、大腸菌におけるMutSの高レベルで、かつ「制御された」発現を実現するために構築した。
a) MutLの検出
ES568(mutL13;Mut−) pmutLの終夜培養物20μlを0.4%グルコースおよびアンピシリン(100μg/m)を含有するLB10mlに播種し、ODが約0.5に達するまで培養した。グルコースを除去するために、細胞を遠心分離し、必要な抗生物質を含有するLB5mlに懸濁した。最終濃度1mMのIPTGを添加することによって、PlacからのpmutLの発現を誘導した。この培養物を37℃で16時間インキュベートし、その後、遠心分離し、SDS−PAGE分析用に調製した。ウェスタンブロット分析は、AP結合抗His−tac抗体を用いて行った(データは示されていない)。
構築されたプラスミドpmutSで、菌株Top10の野生型細胞を形質転換し、得られた形質転換体を精製した。これらの細菌の終夜培養物20μlを、アンピシリン(100μg/ml)および0.4%グルコースを含有するLB10mlに播種し、ODが約0.5に達するまで培養した。グルコースを除去するために、細胞を遠心分離し、必要な抗生物質を含有するLB5mlに懸濁した。最終濃度1mMのIPTGを添加することによって、PlacからのpmutSの発現を誘導した。この培養物を37℃で16時間インキュベートし、その後、遠心分離し、SDS−PAGE分析用に調製した。ウェスタンブロット分析は、AP結合抗His−tac抗体を用いて行った(データは示されていない)。
菌株ES568(mutL13;Mut−)、MG1655 dnaQ::kn(Mut−)、および野生型株MG1655(Mut+)を、プラスミドpmutLまたは親プラスミドpTrcHis2/lacZで形質転換した。アンピシリン100μg/mlを含有するLB寒天プレート上で、得られた単一コロニーを精製し、その後、アンピシリン100μg/mlを含有するLBに播種し、37℃で終夜培養した。
(1.菌株の構築)
a) 大腸菌株MG1655およびMG1655dinB10の細菌細胞を感染させるために、大腸菌株ES1484(mutL218::Tn10)からP1vir溶解物を調製した。
大腸菌株ES1484(mutL218::tet)の終夜培養物のアリコートを、CaCl2(5mM)を含有する37℃のLBに播種した。指数関数的増殖期に、(野生型株MG1655の)P1virを添加した。感染した培養物を37℃で約4h、細胞溶解が観察されるまでインキュベートした。CHCl3を添加し、溶解物を遠心分離し、CHCl3を含有する新しいチューブに上清を移して、4℃で保存した。
宿主株MG1655およびMG1655 dinB10の終夜培養物のアリコートをLBに播種し、指数関数的増殖期に達するまで37℃で培養した。細胞を遠心分離し、CaCl2(cE=5mM)を含有するMgSO4(cE=10mM)に再懸濁し、調製されたP1vir溶解物を添加し、細胞混合物をRTで30分間インキュベートした。(ファージ感染を停止させるために)クエン酸ナトリウムを添加し、栄養源としてSOCを添加した。細胞を37℃で1hインキュベートした後、テトラサイクリン(12.5μg/ml)を含有する寒天プレート上にアリコートをプレーティングした。得られた単一コロニーを精製し、試験し、単離された株を保存した。
細菌株MG1655、MG1655 dinB10、MG1655 dnaE911 zae::cm、MG1655 dinB10 dnaE911 zae::cm、MG1655 mutL::tet、MG1655 dinB10 mutL::tet、MG1655 dinB10 dnaE911 zae::cm mutL::tet、およびMG1655 dinB10 dnaE911 zae::cm mutL::tetを、プラスミドpTrcHis2AまたはpmutLで形質転換した。得られた単一コロニーを精製し、100μg/mlアンピシリンを含有するLBに播種し、30℃で終夜培養した。
前述の結果を確認するために、dinB10(ポリメラーゼIVの欠失)および/またはdnaE911(ポリメラーゼIIIのαサブユニットのコード配列内のアレル)の抗変異原効果をmutS−バックグランドで試験した。
大腸菌株MG1655、MG1655 dinB10、MG1655 dnaE911 zae::cm、およびMG1655 dinB10 dnaE911 zae::cmの細菌細胞を感染させるために、P1vir溶解物を大腸菌株ES1481(mutL215::Tn10)から調製した。得られた単一コロニーを精製し、試験し、その菌株を保存した。
これらの細菌の終夜培養物10μlを、12:5μg/mlテトラサイクリンを含有する30℃のLB10mlに播種した。指数関数的増殖期(8hの増殖の後)に、温度を37℃に変化させ、細胞を37℃で終夜インキュベートした。
(dapA変異の復帰変異)
特定の標的遺伝子における点変異およびフレームシフト変異の復帰変異を研究するために、大腸菌において栄養要求変異株表現型を有する系(dapA−株)を用いた。
(1.プラスミドの構築)
a) dapAのクローニング
(pTrcHis2/lacZへのdapA(dapA15)、dapA+1(dapA15+1)、dapA+2(dapA15+2)のクローニング)
大腸菌株MG1655(wt)またはAT997(dapA15)から調製されたゲノムDNAを使用し、プライマー5(配列番号5)、6(配列番号6)、7(配列番号7)、および8(配列番号8)(表4を参照)によって、DapAタンパク質をコードする732bpのDNA断片を増幅した。これらのPCR断片を消化し、BamHI−XhoI断片として、プラスミドpTrcHis2/lacZにクローニングして、プラスミドpdapAIF、pdapA+1、およびpdapA+2を産生させた。プラスミドpdapAIFの物理構造を図4Aに示す。PCR条件(温度(℃)/時間(分))は以下の通り、すなわち(98/10)(96/0.75;55/0.50;72/2)35(72/10);Herculaseであった。
大腸菌株AT997から調製されたゲノムDNAを使用して、プライマー9(配列番号9)および10(配列番号10)(表4も参照)によって、DapAタンパク質をコードする732bpのDNA断片を増幅した。このPCR断片を消化し、HindIII−EcoRI断片として、プラスミドpSU19およびpSU40にクローニングして、プラスミドpSU19dapA15およびpSU40dapA15を産生させた。プラスミドpSU40dapAの物理構造を図4Bに示す。
a) pSU40へのmutLのサブクローニング
プラスミドpmutLをSpHI−XmnI消化し、3629bpの断片をゲル電気泳動によって単離した。プラスミドpSU40をSphI−HincII消化し、2680bpの断片をゲル電気泳動によって単離した。精製された2つの断片を粘着端−平滑端連結して、プラスミドpSU40mutLを産生させた。プラスミドpSU40mutLを産生するストラテジーを図5に示す。
(プラスミドpmutLにおける、スペクトマイシン耐性遺伝子によるアンピシリン耐性遺伝子の置換)
プラスミドpIC156から調製されたDNAをFspI−XmnI消化し、ゲル電気泳動を用いて1304bpの断片を単離し、プラスミドpmutLから調製されたDNAをScaI−XmnI消化し、ゲル電気泳動を用いて5443bpの断片を単離した。精製された2つの断片を平滑端−平滑端連結して、プラスミドmutLspecを産生させた。
a) DapA/DapA15の検出
菌株dapA::knを、pdapAIF、pdapA+1、pdapA+2、pdapA15IF、pdapA15+1、およびpdapA15+2で形質転換し、観察された形質転換体を精製した。
野生型株Top10をプラスミドpmutLspecで形質転換し、得られた形質転換体を精製した。これらの細菌の終夜培養物20μlを、スペクトマイシン(75μg/ml)を含有するLB10mlに播種し、ODが約0.5に達するまで培養した。この培養物を5mlアリコートに分割し、プロモーターPlacからのMutLの発現を誘導するために、最終濃度1mMのIPTGを1回、添加した。この培養物を37℃で4時間インキュベートし、その後、遠心分離し、SDS−PAGE分析用に調製した。MutLの発現を証明するために、AP結合抗His−tac抗体を用いてウェスタンブロット分析を行った(データは示されていない)。
大腸菌株MG1655、MG1655 dinB10、MG1655 dnaE911 zae::cm、MG1655 dinB10 dnaE911 zae::cm、MG1655 mutL::tet、MG1655 dinB10 mutL::tet、MG1655 dnaE911 zae::cm mutL::tet、MG1655 dinB10 dnaE911 zae::cm mutL::tetの細菌細胞を感染させるために、P1vir溶解物を大腸菌株dapA::knから調製した。得られた単一コロニーを精製し、試験し、単離された株を保存した。
a) 点突然変異の復帰変異:
細菌株AT997(dapA15)およびMG1655 dinB10 dapA::knを、プラスミドpTrcHis2/lacZおよびpSU19dapA15、またはプラスミドpmutLおよびpSU19dapA15で形質転換した。得られた単一コロニーを精製し、100μg/mlアンピシリン、30μg/mlクロラムフェニコール、および50μg/ml DAPを含有するLBに播種して、37℃で終夜培養した。
細菌株AT997(dapA15;DapA−)を、プラスミドpSU40およびpdapAIF、プラスミドpSU40mutLおよびpdapAIF、プラスミドpSU40およびpdapA+1、プラスミドpSU40mutLおよびpdapA+1、プラスミドpSU40およびpdapA+2、またはプラスミドpSU40mutLおよびpdapA+2で形質転換した。得られた単一コロニーを精製し、100μg/mlアンピシリン、50μg/mlカナマイシン、および50μg/ml DAPを含有するLBに播種して、37℃で終夜培養した。
(「発酵状態」中におけるMutLの発現)
トリプトファンによって制御されたG−CSF発現ベクターを保持する産生株JM83 pXX7の変異性を、A)細胞をリファンピシリン上にプレーティングすることによる自然突然変異の発生率の計算、B)細胞をホスホマイシン上にプレーティングすることによる自然突然変異の発生率の計算、およびC)産生プラスミドpXX7(G−CSFをコードする)へのレポータ遺伝子の導入によって分析した。
(1.クローニング)
a) pXX7へのクロラムフェニコールカセットのクローニング:
プラスミドpSUI9から調製されたDNAを使用して、プライマー11(配列番号11)および12(配列番号12)(表6)によって、クロラムフェニコール耐性をコードするDNA断片を増幅した。これらのPCR断片を消化し、BbvcI−AhdI断片として、プラスミドpXX7にクローニングして、プラスミドpXX7cmを産生させた。プラスミドpXX7cmを産生するストラテジーを図7Aに示す。選択過程を単純化するために、「シャイン−ダルガルノ」配列の−10領域のみをクローニングした。
プラスミドpGBG1の選択カートリッジを単離し、MslI−SmaI断片として、プラスミドpXX7にクローニングして、プラスミドpXX7tetを産生させた(平滑端−平滑端連結)。プラスミドpXX7tetを産生するストラテジーを図7Bに示す。
A) 細胞をリファンピシリン上にプレーティングすることによる大腸菌の自然突然変異の頻度(SMF)の測定
細菌株JM83 pXX7を、プラスミドpTrcHis2/lacZ(対照プラスミド)およびpmutLで形質転換した。得られた単一コロニーを精製し、その細胞を、50μg/mlカナマイシン、そして、必要に応じて100μg/mlアンピシリンを含有するLBに播種し、30℃で終夜培養した。これらの細菌の終夜培養物3mlを、50μg/mlカナマイシン、そして、必要に応じて100μg/mlアンピシリンを含有する30℃のRMG100mlに播種した。指数関数的増殖期に、プラスミドpmutLのPlacプロモーターからのMutLの発現を強化するために、最終濃度1mMのIPTGを添加し、さらに、プラスミドpXX7からのG−CSFの発現を誘導するために、最終濃度100μg/mlのトリプトファンを添加した。誘導の1時間後に、播種温度を30℃から37℃に変化させ、その後、細胞を終夜、37℃に維持した。
a) 100μg/mlアンピシリン、および必要に応じて50μg/mlカナマイシン、
b) 100μg/mlアンピシリン、ならびに、必要に応じて50μg/mlカナマイシンおよび100μg/mlリファンピシン
を含有する、A) LBAプレート、B) RMGプレート、およびC) M9プレート上にプレーティングし、30℃で3日間インキュベートした。
細菌株JM83 pXX7を、プラスミドpTrcHis2AおよびpmutLで形質転換した。得られた単一コロニーを精製し、それぞれの株(JM83 pXX7、JM83 pXX7 pTrcA、およびJM83 pXX7 pmutL)につき20の独立かつ特有の細胞を、50μg/mlカナマイシン、そして、必要に応じて100μg/mlアンピシリンを含有するLBに播種し、30℃で終夜培養した。
a) 100μg/mlアンピシリン、および必要に応じて50μg/mlカナマイシン、
b) 100μg/mlアンピシリン、ならびに、必要に応じて50μg/mlカナマイシンおよび30μg/mlホスホマイシン
を含有するLB寒天プレート上にプレーティングし、30℃で3日間インキュベートした。
a) G−CSFの発現
b) G−CSFの発現および抑制
G−CSF活性をモニターすることができなかったので、プラスミドpXX7にレポータ遺伝子を導入した。
細菌株JM83をプラスミドpXX7cm、pXX7cm pTrcHis2/lacZ、pXX7cm pmutL、pXX7tet、pXX7tet pTrcHis2/lacZ、およびpXX7tet pmutLで形質転換した。得られた単一コロニーを精製し、50μg/mlカナマイシン、そして、必要に応じて100μg/mlアンピシリンを含有するLBに細胞を播種し、30℃で終夜培養した。
野生型細菌株JM83を、プラスミドpXX7cm、pXX7cm pTrcHis2/lacZ、pXX7cm pmutL、pXX7tet、pXX7tet pTrcHis2/lacZ、およびpXX7tet pmutLで形質転換した。得られた単一コロニーを精製し、その細胞を、50μg/mlカナマイシン、そして、必要に応じて100μg/mlアンピシリンを含有するLBに播種し、30℃で終夜培養した。
Claims (62)
- 少なくとも2つの変異を細胞または生物に導入することによって、前記細胞または生物における自然突然変異の頻度を低下させる方法であって、その複合作用が少なくとも2つの細胞性DNA修復機構の強化をもたらす、方法。
- 少なくとも2つの変異を生物の少なくとも1つの細胞に導入することによって、自然突然変異の頻度が低下している細胞または生物を産生し、前記生物が多細胞生物である場合には、それから前記生物を再生する方法であって、その複合作用が少なくとも2つの細胞性DNA修復機構の強化をもたらす、方法。
- 前記細胞が原核細胞である、請求項1または2に記載の方法。
- 前記原核細胞が古細菌または真正細菌の細胞である、請求項3に記載の方法。
- 前記真正細菌の細胞がグラム陽性細菌またはグラム陰性細菌の細胞である、請求項4に記載の方法。
- 前記細胞が真核細胞である、請求項1または2に記載の方法。
- 前記真核細胞が、真菌細胞、動物細胞、または植物細胞である、請求項6に記載の方法。
- 前記生物が、真菌、動物、または植物である、請求項1、2、または5から7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも2つの変異の複合作用が、自然発生した突然変異を修復する少なくとも2つの細胞性DNA修復機構の能力の強化をもたらす、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
- 自然発生した突然変異を修復するミスマッチ修復系、複製後修復系、および/またはSOS修復系の能力が強化される、請求項9に記載の方法。
- 前記少なくとも2つの変異が、MutLタンパク質またはその相同タンパク質の発現の上方制御に導く変異、MutSタンパク質またはその相同タンパク質の発現の上方制御に導く変異、DNAポリメラーゼIVまたはその相同タンパク質をコードする遺伝子の抗変異原アレル、およびDNAポリメラーゼIIIのサブユニットまたはその相同タンパク質をコードする遺伝子の抗変異原アレルから選択される、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
- MutL、MutS、またはそれらの相同タンパク質の発現の上方制御が、ベクターを細胞内に導入することによって実現され、前記ベクターが、MutL、MutS、またはそれらの相同タンパク質の過剰発現を可能にする1つまたは複数の調節ユニットの機能的制御下に、mutL遺伝子、MutLの相同タンパク質をコードする遺伝子、mutS遺伝子、またはMutSの相同タンパク質をコードする遺伝子を含む、請求項11に記載の方法。
- 前記ベクターが多コピープラスミドである、請求項12に記載の方法。
- 前記調節ユニットが誘導性または構成的プロモーターである、請求項11または12に記載の方法。
- 1コピーまたは複数コピーのそれぞれのmut遺伝子を1つまたは複数の調節ユニットの機能的制御下に宿主細胞の染色体に導入すること、および/または対応する野生型細胞と比較して、それぞれのMutタンパク質の産生が増強されるように、1つまたは複数の変異を、天然のMutタンパク質の発現を制御する調節ユニットに導入することによって、MutL、MutS、またはそれらの相同タンパク質の発現の上方制御が実現される、請求項11に記載の方法。
- DNAポリメラーゼIVをコードする遺伝子の抗変異原アレルがdinB10である、請求項11に記載の方法。
- DNAポリメラーゼIIIのサブユニットをコードする遺伝子の抗変異原アレルがdnaE911である、請求項11に記載の方法。
- dinB10およびdnaE911の複合作用によって、自然突然変異の頻度が、野生型細胞または野生型生物と比較して少なくとも10分の1に低下する、請求項1から17のいずれか一項に記載の方法。
- dinB10、dnaE911、および過剰発現したmutLの複合作用によって、自然突然変異の頻度が、野生型細胞または野生型生物と比較して少なくとも50分の1に低下する、請求項1から18のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも2つの変異の複合作用によって、細胞生存率の増強に導かれる、請求項1から19のいずれか一項に記載の方法。
- 自然突然変異の頻度の低下および/または細胞生存率の増強を有し、請求項1から20のいずれか一項に記載の方法で取得可能な細胞であって、前記細胞が少なくとも2つの変異を含み、その複合作用が少なくとも2つの細胞性DNA修復機構の強化をもたらす、細胞。
- 前記細胞が、細菌、真菌、植物、または動物細胞である、請求項21に記載の細胞。
- 自然突然変異の頻度が低下しており、請求項1から20のいずれか一項に記載の方法によって取得可能な生物であって、前記生物の細胞が少なくとも2つの変異を含み、その複合作用が少なくとも2つの細胞性DNA修復機構の強化をもたらす、生物。
- プラスミドpmutLを含有する大腸菌MG1655 dinB10(DSM17016)。
- プラスミドpmutLを含有する大腸菌MG1655 dinB10 mutL::tet(DSM17017)。
- プラスミドpmutLを含有する大腸菌MG1655 dnaE zae::cm(DSM17018)。
- プラスミドpmutLを含有する大腸菌MG1655 dnaE zae::cm mutL::tet(DSM17019)。
- 大腸菌MG1655 dinB10 dnaE zae::cm(DSM17015)。
- 大腸菌MG1655 dinB10 dnaE zae::cm mutL::tet(DSM17014)。
- プラスミドpmutLを含有する大腸菌MG1655 dinB10 dnaE zae::cm(DSM17020)。
- プラスミドpmutLを含有する大腸菌MG1655 dinB10 dnaE zae::cm mutL::tet(DSM17021)。
- タンパク質の発現系を産生する方法であって、前記タンパク質のアミノ酸配列が自然発生した突然変異に対して安定化されており、
a) 少なくとも2つの変異を含有するタンパク質をコードする核酸配列を、前記タンパク質の誘導性または構成的発現を可能にする1つまたは複数の調節ユニットの機能的制御下に、宿主細胞のゲノムに挿入する工程であって、その複合作用が自然発生した突然変異を修復する少なくとも2つの細胞性DNA修復機構の能力の強化をもたらす工程、または
b) 前記タンパク質をコードする核酸配列を、前記タンパク質の誘導性または構成的発現を可能にする1つまたは複数の調節ユニットの機能的制御下にベクターに挿入し、さらに、少なくとも2つの変異を含有するベクターを宿主細胞内に移入する工程であって、その複合作用が自然発生した突然変異を修復する少なくとも2つの細胞性DNA修復機構の能力の強化をもたらす工程と、
c) 適当な培地中で前記宿主細胞を培養および/または維持する工程と
を含む方法。 - タンパク質を産生する方法であって、前記タンパク質のアミノ酸配列が自然発生した突然変異に対して安定化されており、
a) 少なくとも2つの変異を含有するタンパク質をコードする核酸配列を、前記タンパク質の誘導性または構成的発現を可能にする1つまたは複数の調節ユニットの機能的制御下に、宿主細胞のゲノムに挿入する工程であって、その複合作用が自然発生した突然変異を修復する少なくとも2つの細胞性DNA修復機構の能力の強化をもたらす工程、または
b) 前記タンパク質をコードする核酸配列を、前記タンパク質の誘導性または構成的発現を可能にする1つまたは複数の調節ユニットの機能的制御下にベクターに挿入し、さらに、少なくとも2つの変異を含有するベクターを宿主細胞内に移入する工程であって、その複合作用が自然発生した突然変異を修復する少なくとも2つの細胞性DNA修復機構の能力の強化をもたらす工程と、
c) 適当な培地中で、前記タンパク質の発現を可能にする条件下に前記宿主細胞を培養する工程と、
d) 発現された前記タンパク質を単離する工程と
を含む方法。 - 前記タンパク質が培地から単離される、請求項33に記載の方法。
- 前記タンパク質が宿主細胞から抽出される、請求項33に記載の方法。
- 前記タンパク質が、治療に使用できるタンパク質、詳細にはサイトカインまたは成長因子である、請求項32から35のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ベクターが、プラスミド、バクテリオファージ、またはコスミドである、請求項32から36のいずれか一項に記載の方法。
- 前記調節ユニットが、プロモーター、リボソーム結合部位、エンハンサー、サイレンサー、および/または3’転写ターミネーターである、請求項32から37のいずれか一項に記載の方法。
- 前記タンパク質をコードする核酸配列が、細胞小器官、細胞内区画、細胞外間隙、または培地中への、発現されたタンパク質の輸送を指示するリーダー配列に機能的に連結されている、請求項32から38のいずれか一項に記載の方法。
- 発酵産物、および/または発酵産物の形成に関与する少なくとも1つの酵素を産生する細胞を培地中で培養することによって、発酵産物を産生する方法であって、少なくとも2つの変異によって前記細胞のゲノムが自然発生の配列変化に対して安定化されており、その複合作用が自然発生した突然変異を修復する少なくとも2つの細胞性DNA修復機構の能力の強化をもたらす、方法。
- 前記発酵産物が、核酸、ヌクレオシド、ヌクレオチド、アミノ酸、タンパク質、酸、糖質、ビタミン、抗生物質、またはアルカロイドである、請求項40に記載の方法。
- 自然発生した突然変異を修復するミスマッチ修復系、プルーフリーディング機構、および/またはSOS修復系の能力が強化される、請求項32から41のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも2つの変異が、MutLタンパク質またはその相同タンパク質の発現の上方制御に導く変異、MutSタンパク質またはその相同タンパク質の発現の上方制御に導く変異、DNAポリメラーゼIVまたはその相同タンパク質をコードする遺伝子の抗変異原アレル、およびDNAポリメラーゼIIIのサブユニットまたはその相同タンパク質をコードする遺伝子の抗変異原アレルから選択される、請求項32から42のいずれか一項に記載の方法。
- MutL、MutS、またはそれらの相同タンパク質の発現の上方制御が、細胞内のベクターの存在によるものであり、前記ベクターが、mutL遺伝子、MutLの相同タンパク質をコードする遺伝子、mutS遺伝子、またはMutSの相同タンパク質をコードする遺伝子を、MutL、MutS、またはそれらの相同タンパク質の過剰発現を可能にする1つまたは複数の調節ユニットの機能的制御下に含む、請求項43に記載の方法。
- それぞれのmut遺伝子を1コピーまたは複数コピー追加して、1つまたは複数の調節ユニットの機能的制御下に宿主細胞の染色体に導入すること、および/またはそれぞれのMutタンパク質の産生が、対応する野生型細胞と比較して増大するように、天然のMutタンパク質の発現を制御する調節ユニットに1つまたは複数の変異を導入することによって、MutL、MutS、またはそれらの相同タンパク質の発現の上方制御が実現される、請求項43に記載の方法。
- DNAポリメラーゼIVをコードする遺伝子の抗変異原アレルがdinB10である、請求項43に記載の方法。
- DNAポリメラーゼIIIのサブユニットをコードする遺伝子の抗変異原アレルがdnaE911である、請求項43に記載の方法。
- dinB10およびdnaE911の複合作用によって、自然突然変異の頻度が、野生型細胞と比較して少なくとも10分の1に低下する、請求項32から47のいずれか一項に記載の方法。
- dinB10、dnaE911、および過剰発現したmutLの複合作用によって、自然突然変異の頻度が、野生型細胞と比較して少なくとも50分の1に低下する、請求項32から48のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも2つの変異の複合作用によって、細胞生存率の増強に導かれる、請求項32から49のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞が原核細胞または真核細胞である、請求項32から50のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞がグラム陽性細菌またはグラム陰性細菌の細胞である、請求項51に記載の方法。
- 前記細胞が、真菌細胞、動物細胞、または植物細胞である、請求項51に記載の方法。
- 前記細胞が、請求項21、22、または24から31のいずれか一項に記載の細胞であるか、あるいは請求項1から20のいずれか一項に記載の方法で取得可能である、請求項32から53のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞が液体培地中で培養される、請求項32から54のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞が連続培養またはバッチ培養で培養される、請求項55に記載の方法。
- 前記細胞が固定される、請求項32から56のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞が固体または半固体の培地上で培養される、請求項32から54のいずれか一項に記載の方法。
- 前記発酵産物が前記細胞から単離される、請求項40から58のいずれか一項に記載の方法。
- 前記発酵産物が培地から単離される、請求項40から58のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項32から60のいずれか一項に記載の方法で取得可能なタンパク質。
- 請求項40から60のいずれか一項に記載の方法で取得可能な発酵産物。
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