CN110616161B

CN110616161B - 一种利用Y家族聚合酶Rev1调节酿酒酵母氧胁迫的方法

Info

Publication number: CN110616161B
Application number: CN201910911697.0A
Authority: CN
Inventors: 吴静; 姚瑞; 刘立明; 陈修来; 刘佳; 罗秋玲
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2019-09-25
Filing date: 2019-09-25
Publication date: 2021-07-27
Anticipated expiration: 2039-09-25
Also published as: CN110616161A

Abstract

本发明公开了一种利用Y家族聚合酶Rev1调节酿酒酵母氧胁迫的方法，属于生物工程技术领域。通过同源重组的方法敲除基因REV1，构建敲除菌株rev1Δ，使得酵母菌株抗氧化胁迫能力降低，具体表现为胁迫条件下敲除菌株生物量降低9％，存活率降低34.8％，基因突变频率降低63.8％，丙酮酸产量降低30.8％。利用pY26质粒过表达基因REV1，构建过表达菌株rev1Δ/REV1，使得菌株抗氧化胁迫能力增强，具体表现为生物量提高8.3％，存活率提高11.5％，基因突变频率提高186.2％，丙酮酸产量提高57.7％。上述结果表明Rev1可以提高酵母菌株在氧胁迫条件下的生存能力和发酵性能。

Description

一种利用Y家族聚合酶Rev1调节酿酒酵母氧胁迫的方法

技术领域

本发明涉及一种利用Y家族聚合酶Rev1调节酿酒酵母氧胁迫的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

微生物在生长和代谢过程中容易受到各种外源和内源环境的攻击，外源环境主要包括电离辐射、紫外辐射以及各种化学试剂，内源环境主要包括细胞在代谢过程中产生的一些次级代谢产物。大部分这些因素都会造成细胞内活性氧的堆积，对胞内的DNA造成氧化损伤，阻碍细胞的生长和代谢。在工业应用中，酿酒酵母不仅可以用来生产酒精，还可以用来生产有机酸、蛋白质等。在生命科学领域，酿酒酵母和人类高度同源，通过对酿酒酵母基因进行分析，能够提高人类疾病的诊断和治疗水平。

提高菌株的氧胁迫抗性可以提高菌株对恶劣环境以及有毒产品的耐受能力，对微生物发酵生产化学品有一定的前景。降低菌株的氧胁迫抗性可以降低菌株的环境耐受能力，可以应用于菌株的诱变育种，耐受能力低的菌株在胁迫环境下可以产生更多的突变，有助于扩大突变库，筛选目的菌株。目前国内外主要通过外源添加辅助底物、诱变育种、基因工程、适应性进化等策略提高菌株的氧胁迫抗性。对酿酒酵母进行耐氧机制的研究可从根本上解决这一问题。

Y家族DNA聚合酶是一类特殊的DNA聚合酶，能够以损伤的DNA为模板，在损伤位点对面插入正确或错误的核苷酸，从而跨越损伤位点，使细胞免于因复制停滞造成的细胞周期延迟和细胞死亡。在酿酒酵母中，Y家族DNA聚合酶包括Polη和Rev1，分别由RAD30和REV1基因编码。其中Polη主要在紫外线诱导的DNA损伤中起作用，也能够修复氧胁迫造成的DNA损伤。Rev1是一种脱氧胞苷转移酶，不仅具有核苷酸转移酶的催化活性，也具有非催化活性，其非催化活性在于能够与其他Y家族DNA聚合酶或者辅助蛋白相互作用，参与各种类型的跨损伤合成。

丙酮酸在能量代谢过程中具有重要的作用，同时也是合成多种工业化合物的前体物质，广泛应用于化学、制药、食品、农业等领域。目前丙酮酸的合成主要为微生物发酵法，酵母是重要的发酵宿主。然而在发酵过程中丙酮酸浓度过高对酵母有毒害作用，过高的酸浓度会导致胞内ROS水平升高，造成DNA和蛋白质氧化损伤。

综上所述，提供一种调节酿酒酵母氧胁迫且能够调节丙酮酸产量的方法，对于其工业应用有重要价值。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种酿酒酵母工程菌，是在不表达REV1基因，或过表达REV1基因；所述不表达REV1基因是指敲除或沉默REV1基因。

在本发明的一种实施方式中，所述REV1基因的核苷酸序列如NCBI上的gene ID:854527的核苷酸序列所示。

在本发明的一种实施方式中，所述酿酒酵母是Saccharomyces cerevisiaeBY4741(https://www.yeastgenome.org/strain/S000203456)，基因型为MATa his3Δ1leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0。

在本发明的一种实施方式中，所述不表达REV1基因包括：将标记基因同基因REV1的左同源臂、右同源臂连接起来，构建敲除框，将敲除框导入酿酒酵母感受态细胞中，通过同源臂重组将基因REV1替换成标记基因。

在本发明的一种实施方式中，所述不表达REV1基因具体是：将标记基因HIS3同基因REV1的左同源臂、右同源臂连接起来，构建敲除框，将测序正确的敲除框导入酿酒酵母感受态细胞中，通过同源臂重组将基因REV1替换成HIS3，利用重组后的菌株含有HIS3基因而能合成组氨酸这一特征筛选缺失REV1基因的突变菌株，经基因组PCR和测序验证正确的菌株即为不表达REV1基因的菌株Rev1Δ。

在本发明的一种实施方式中，所述过表达具体是将REV1基因连接到质粒PY26上，由强启动子启动转录翻译，得到重组质粒PY26-REV1，然后将重组质粒转化到酵母中，利用重组质粒上的URA3基因来筛选阳性转化子，最后提取质粒验证得到过表达菌株Rev1Δ/REV1。

本发明的第二个目的是提供一种提高酵母发酵生产丙酮酸能力的方法，所述方法是在酿酒酵母中过表达基因REV1。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵的条件是28-32℃，200-220rpm下发酵40-60h。

本发明的第三个目的是提供一种改变酿酒酵母DNA突变频率的方法，所述方法是不表达以降低酿酒酵母DNA突变频率，或过表达基因REV1以提高酿酒酵母DNA突变频率；所述不表达REV1基因是指敲除或沉默REV1基因。

本发明的第四个目的是提供一种改变酿酒酵母氧胁迫抗性的方法，是不表达REV1基因以降低菌株氧胁迫抗性，或者过表达REV1基因以提高菌株的氧胁迫抗性；所述不表达REV1基因是指敲除或沉默REV1基因。

本发明的第五个目的是提供上述酿酒酵母在食品、化工或制备药物方面的应用。

本发明的有益效果：

本发明通过过量表达本源的Y家族聚合酶Rev1来增强酿酒酵母的氧胁迫抗性。本发明鉴定了一种调控酿酒酵母氧胁迫的Y家族DNA聚合酶Rev1的功能，具体如下：

(1)当酿酒酵母过表达REV1基因时，在浓度为2mM的H₂O₂条件下，过表达菌株Rev1Δ/REV1突变频率较出发菌株BY4741提高186％，培养Rev1Δ/REV1 24h后，菌株的OD₆₀₀值从3.20上升至3.45；当H₂O₂浓度为2000μM时，Rev1Δ/REV1菌株存活率从69.4％提高至75.5％；Rev1Δ/REV1发酵48h后，丙酮酸产量相对于出发菌株提高了57.7％；

(2)当酿酒酵母不表达REV1基因时，在浓度为2mM的H₂O₂条件下，敲除菌株Rev1Δ突变频率较出发菌株BY4741降低63％，培养Rev1Δ/REV124h后，菌株的OD₆₀₀值从3.20下降至2.90；当H₂O₂浓度为2000μM时，Rev1Δ/REV1菌株存活率从69.4％下降至28.5％；Rev1Δ/REV1发酵48h后，丙酮酸产量相对于出发菌株降低30.8％。

本发明有效解决了调节酿酒酵母氧胁迫抗性同时调节丙酮酸产量的问题，能够使得酿酒酵母菌株在氧胁迫条件下生存能力有所提高，同时对其发酵生产丙酮酸的能力有所提高。

生物材料

酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae BY4741(https://www.yeastgenome.org/ strain/S000203456)，基因型为MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0。

附图说明

图1：基因缺失菌株的构建；A是目的基因左右臂及标记基因的扩增和融合；B是敲除基因的验证，其中，M1：分子量为2000的Maker；L：REV1基因的左臂；M：组氨酸基因；R：REV1基因的右臂；LM：REV1基因的左臂和组氨酸基因融合后的基因；MR：REV1基因的右臂和组氨酸基因融合后的基因；M2：分子量为10000的Maker；LMR：REV1基因的左、右臂和组氨酸基因融合后的基因；1：基因敲除的阴性对照；-：空白；2：阳性转化子。

图2：各菌株在正常条件和2mM H₂O₂条件下的平板生长实验。

图3：各菌株在正常条件和2mM H₂O₂条件下的的生长曲线；A：正常条件下各菌株的生长曲线；B：2mM H₂O₂条件下各菌株的生长曲线。

图4：各菌株在不同浓度H₂O₂下的存活率。

图5：各菌株在正常条件和2mM H₂O₂条件下的DNA突变频率的测定。

图6：各菌株发酵生产丙酮酸的产量。

具体实施方式

(一)培养基

YNB培养基(g/L)：葡萄糖20，无氨基酸酵母氮源6.7(pH 6.0)，补充添加相应的氨基酸。

发酵培养基(g/L)：葡萄糖60，尿素2，磷酸二氢钾5，七水硫酸镁0.8，硫酸钾4，醋酸钠3，盐酸-硫胺素1.6×10^-5，生物素4×10^-5，盐酸-维生素B6 4×10^-4，烟碱酸8×10^-3；所用维生素过滤除菌。

(二)HPLC测定丙酮酸产量

HPLC测定方法：色谱柱为氨基色谱柱(4.6mm×250mm,5μm)；柱温30℃；流动相：乙腈/0.02mol/L磷酸氢二钾；流速1mL/min；波长210nm。

实施例1：缺失突变菌株的构建

以野生型酿酒酵母基因组为模板，分别以P1/P2、P3/P4、P5/P6为引物，扩增出待敲除基因REV1的左臂(L)、组氨酸基因(M)和右臂(R)，经融合PCR构建敲除框REV1-LMR(图1)。将测序正确的敲除框用化学转化法导入出发菌株Saccharomyces cerevisiae BY4741，利用组氨酸标记基因来筛选阳性转化子，并提取基因组PCR测序验证。

表1引物序列表

实施例2：过表达菌株的构建

以Saccharomyces cerevisiae BY4741基因组为模板，以P7/P8为引物扩增目的基因REV1，将扩增产物与质粒PY26用相同的限制性内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ消化，通过T4连接酶将基因REV1连接到PY26，由强启动子GPD1启动转录翻译，利用重组质粒上的URA3基因来筛选阳性转化子，最后提取质粒验证得到过表达菌株Rev1Δ/REV1。

实施例3：各菌株生长性能的测定

(1)平板生长实验：将待测菌株的单菌落接种于20mL的YNB(0.67％YeastNitrogen Base without Amino Acids,2％Glucose)液体培养基中过夜活化，再转接到YNB培养基中培养至对数期，测定菌体浓度并将菌悬液调节至OD₆₀₀＝1.0，以此为初始浓度，进行5次10倍梯度稀释，依次将3μL菌液点种在相应的固体YNB培养基上，30℃培养2-3天，观察菌体的生长情况并拍照(图2)。

(2)生长曲线测性：将待测菌株的单菌落接种于20mL的YNB(0.67％YeastNitrogen Base without Amino Acids,2％Glucose)液体培养基中过夜活化，再转接到相应的YNB液体培养基中，控制起始OD₆₀₀＝0.1，30℃200rpm摇床培养，每隔2小时取样测定OD值，绘制生长曲线(图3)。

平板生长实验和生长曲线分析H₂O₂对菌株BY4741，Rev1Δ，Rev1Δ/REV1生长的影响。正常条件下，敲除或过表达REV1并不影响菌株的生长；在浓度为2mM的H₂O₂条件下，培养24h后，敲除REV1，菌株的OD₆₀₀值从3.20下降至2.90；而过表达REV1，菌株的OD₆₀₀值从3.20上升至3.45。以上结果表明，基因REV1能够调节细胞对氧环境的耐受能力。

实施例4：各菌株突变频率的测定

将菌株BY4741，Rev1Δ，Rev1Δ/REV1单菌落接种于YNB液体培养基过夜培养，各取1mL菌液离心，用无菌水清洗两次后将各菌株稀释到10^-4，然后用不同浓度H₂O₂于30℃处理30min，离心后弃去上清，用无菌水清洗两遍后，用200μL无菌水重悬，涂布于相应的营养缺陷平板上30℃培养2-3天，对形成的菌落计数并计算存活率。如图4所示，Rev1Δ菌株存活率在各H₂O₂浓度下较BY4741都有所降低，而Rev1Δ/REV1菌株存活率在各H₂O₂浓度下较BY4741都有所提高。当H₂O₂浓度为2000μM时，BY4741菌株存活率为69.4％，Rev1Δ菌株存活率为28.5％，Rev1Δ/REV1菌株存活率为75.5％。表明基因REV1有利于酿酒酵母在H₂O₂条件下存活。

实施例5：各菌株DNA突变频率的测定

本实验采用测定CAN1基因座的突变频率来表征细胞的DNA突变频率。具体方法是取对数期培养的酵母细胞分别涂布刀豆氨酸平板(60mg/L)和YPD平板，于30℃培养36h后统计两个平板的菌落数。突变频率即为刀豆氨酸平板上的菌落数除以YPD平板上的菌落数。

结果如图5所示：(1)在正常条件下，出发菌株BY4741、过表达菌株Rev1Δ/REV1以及敲除菌株Rev1Δ突变频率无明显差异；(2)在2mM H₂O₂条件下，敲除菌株Rev1Δ突变频率较出发菌株BY4741降低63％，而过表达菌株Rev1Δ/REV1突变频率较出发菌株BY4741提高186％。结果表明Y家族聚合酶Rev1对于酵母提高突变频率有重要作用。其抗氧化胁迫作用可能是通过提高菌株的突变频率来适应氧化胁迫环境。

实施例6：各菌株发酵生产丙酮酸产量的测定

将出发菌株BY4741、敲除菌株Rev1Δ和过表达菌株Rev1Δ/REV1划线于YNB平板上在30℃培养箱中活化培养，将活化菌株单菌落接至50mL YNB培养基中，培养24h，以1％的接种比例分别接种至发酵培养基中进行发酵培养，30℃，200rpm，发酵培养48h后分别取样采用高效液相色谱法测量其丙酮酸产量。结果如图6所示，敲除REV1使得丙酮酸产量相对于出发菌株降低30.8％，而过表达REV1使得丙酮酸产量相对于出发菌株提高57.7％。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种利用Y家族聚合酶Rev1调节酿酒酵母氧胁迫的方法

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tgccgcgttc acagattc 18

<210> 2

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tagggctttc tgctctgtca tcgctggata tgcctagaaa tg 42

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atttctaggc atatccagcg atgacagagc agaaagccct 40

<210> 4

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

aatgtttttt tttttttaat ctacataaga acacctttgg tgg 43

<210> 5

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ccaaaggtgt tcttatgtag attaaaaaaa aaaaaacatt tcagc 45

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

actatcgctc atttggctct t 21

<210> 7

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ccggaattca tgggtgaaca tggtggt 27

<210> 8

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ccgctcgagt caaacttcaa agtccatgtc aag 33

Claims

1.一种提高酵母发酵生产丙酮酸能力的方法，其特征在于，所述方法是在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）BY4741中过表达基因REV1；所述酿酒酵母BY4741的基因型为MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0；所述REV1基因的核苷酸序列如NCBI上的geneID: 854527的核苷酸序列所示。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵的条件是28-32℃，200-220 rpm下发酵40-60 h。