CN115838645B - 一种高产乳清酸的酵母菌株及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种能过量合成胞外乳清酸的酵母菌株及其构建方法、发酵工艺与在医药、美容、畜牧业、食品、保健品或化工领域中的应用。所述酵母菌株包括第一种和第二种基因修饰，其中，所述第一种基因是乳清酸核苷‑5'‑磷酸脱羧酶编码基因URA3，通过修饰第一种基因使乳清酸核苷‑5'‑磷酸脱羧酶活性下降或表达被抑制；第二种基因包括嘧啶合成途径其它基因、组氨酸合成途径相关基因和/或嘌呤合成途径相关基因，第二种基因修饰使得嘧啶合成途径其它基因编码酶蛋白的活性提高或者过表达，或者组氨酸合成途径和/或嘌呤合成途径相关酶蛋白的活性下降或表达被抑制。所述酵母的乳清酸产量大幅上升，其中，所述乳清酸产量上升，是相对于未经基因修饰和经过第一种基因修饰的酵母的乳清酸产量而言。
Description
技术领域
本发明属于基因工程和微生物发酵技术领域，具体涉及一种能过量合成乳清酸的酵母菌株及其构建方法、发酵工艺与在医药、美容、畜牧业、食品、保健品或化工领域中的应用。
背景技术
乳清酸(Orotate,orotic Acid)，化学名称尿嘧啶-6-羧酸，分子式C5H5N2O4，分子量156.10。作为生物活体嘧啶基核酸生物合成过程中的有效前体，是一种重要的嘧啶衍生物，在生物和药物化学中发挥独特的作用。乳清酸是一种营养药，又名维生素B13，乳清酸盐类，例如乳清酸钙、乳清酸镁和乳清酸锂，都是很好的营养品。乳清酸在医药、食品、保健品、化妆品和饲料行业等领域应用非常广泛，现年需求量在500吨以上。
目前乳清酸以化学生产为主，随着中国对环保要求的日益严格，化学合成乳清酸的成本也相应的提高，环保和低成本的生物制造乳清酸的方式就显得非常重要了。目前报道的生物法主要是微生物发酵法，微生物发酵法生产条件温和、工艺简单、能利用廉价的碳源，副产物少、环境污染小，可实现持续生产等等，是有潜力的、值得大力开发的工艺。
通过对自然界微生物菌种进行基因工程改造，结合诱变筛选等措施来提高乳清酸产量。这些菌种包括谷氨酸棒杆菌、大肠杆菌等；遗憾的是，迄今为止还没有酵母生产乳清酸的报道。
而作为最重要、拥有最高商业产值的工业微生物，酿酒酵母应用历史悠久，工业化应用技术成熟、抗逆性强、为食品安全性GRAS微生物；同时作为最早实现全基因组测序的微生物菌种，又是分子生物学和遗传学研究的最重要模式生物之一，通过基因工程手段的改造实现以酿酒酵母为菌种的乳清酸发酵法生产，有其特殊的优势，将为微生物发酵生产乳清酸开辟新的途径，推动高值医药和生化产品的绿色清洁生产，具有重要的经济价值和社会意义。
发明内容
本发明的目的是克服上述现有技术存在的不足，提供一种容易培养、适合大规模发酵生产并易于实现产业化的、经过遗传改造而能过量合成乳清酸的酵母菌株，构建此菌株的重组方法及应用。具体地，
本发明提供一种酵母菌株，此酵母菌株经过了第一种、第二种基因修饰。其中，所述第一种基因是URA3，它编码的酶蛋白为乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶(orotidine-5'-phosphate decarboxylase)，所述酶蛋白催化从头合成嘧啶途径的第6个酶催化反应，将乳清酸核苷-5'-磷酸转化为尿苷一磷酸(uridine monophosphate，简称为UMP)；通过修饰第一种基因使其活性下降或表达被抑制，使得乳清酸核苷-5'-磷酸不能转变为尿苷一磷酸(uridine monophosphate，简称为UMP)，从而有可能积累作为从头合成嘧啶途径第4个酶催化反应产物的乳清酸。但，仅仅此步催化中断还不足以使得酵母细胞积累足量的乳清酸；
所述第二种基因包括嘧啶合成途径其它基因、组氨酸合成途径相关基因和/或嘌呤合成途径相关基因，所述第二种基因修饰使得嘧啶合成途径其它基因编码酶蛋白的活性提高或者过表达，或者组氨酸合成途径和/或嘌呤合成途径相关酶蛋白的活性下降或表达被抑制，所述酵母菌株的乳清酸产量上升，其中，所述乳清酸产量上升，是相对于未经基因修饰的，和/或只经过第一种基因修饰的酵母的乳清酸产量而言。
所述嘧啶合成途径其它基因是指除乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶编码基因URA3之外的其他嘧啶合成途径中的基因。
优选的，所述第二种基因，包括而不限于如下基因：
1)嘧啶合成途径其它基因，包括乳清酸合成基因，例如二氢乳清酸脱氢酶编码基因URA1和/或URA2，分别编码二氢乳清酸脱氢酶(Dihydroorotate dehydrogenase)和氨基甲酰磷酸合成酶/天冬氨酸转氨甲酰酶(carbamoyl-phosphate synthetase/aspartatetranscarbamylase)，此两种酶催化从头合成嘧啶途径的第4步酶催化反应和第1步/第2步酶催化反应；
2)组氨酸合成途径相关基因，例如HIS1和/或HIS3，分别编码六聚体酶蛋白ATP磷酸核糖基转移酶(ATP phosphoribosyltransferase)和咪唑甘油磷酸脱水酶(Imidazoleglycerol-phosphate dehydratase)，催化组氨酸生物合成途径的第1步和第6步酶催化反应；
3)嘌呤合成途径相关基因，例如磷酸二酯酶编码基因PDE1或PDE2，编码环磷酸腺苷(cAMP)磷酸二酯酶，此酶催化cAMP降解，使酵母细胞内cAMP浓度下降从而影响从头合成嘌呤途径。
对第二种基因的修饰，使得所修饰基因编码的酶蛋白的活性提高或者过表达，或者酶蛋白的活性下降或表达被抑制。优选的，第二种基因修饰使得URA2、URA1基因编码的酶蛋白的活性提高或者过表达，或者使得HIS1、HIS3、PDE1和/或PDE2编码的酶蛋白的活性下降或表达被抑制。
优选的，所述第二种基因包括二氢乳清酸脱氢酶编码基因URA1、ATP磷酸核糖基转移酶编码基因HIS1和/或磷酸二酯酶编码基因中的任意一种或多种，更优选的，所述磷酸二酯酶编码基因包括PDE1或PDE2，进一步优选的，所述磷酸二酯酶编码基因包括PDE1。
优选的，上述使得酶蛋白的活性提高或者过表达的基因修饰方式包括点突变、连接强启动子、连接增强子、提高拷贝数；使得酶蛋白的活性下降或表达被抑制的基因修饰方式包括点突变、缺失、插入、反义polynucleotides、siRNA、microRNA、CRISPR，更优选缺失和点突变。
优选的所述酵母菌株的基因修饰选自下列组中的一组：
(1)第一种基因修饰使得Ura3的活性或表达被完全抑制，和，第二种基因修饰使得Ura1的活性提高或者过表达活性；
(2)第一种和第二种基因修饰使得Ura3和His1的活性或表达被抑制；
(3)第一种和第二种基因修饰使得Ura3和Pde1的活性或表达被抑制；
(4)第一种和第二种基因修饰使得Ura3和Pde2的活性或表达被抑制；
(5)第一种和第二种基因修饰使得Ura3和His1的活性或表达被抑制，以及Ura1的活性提高或者过表达活性；
(6)第一种和第二种基因修饰使得Ura3和Pde1的活性或表达被抑制，以及Ura1的活性提高或者过表达活性；
(7)第一种和第二种基因修饰使得Ura3和Pde2的活性或表达被抑制，以及Ura1的活性提高或者过表达活性；
(8)第一种和第二种基因修饰使得Ura3、His1和Pde1的活性或表达被抑制；
(9)第一种和第二种基因修饰使得Ura3、His1和Pde2的活性或表达被抑制；
(10)第一种和第二种基因修饰使得Ura3、His1和Pde1的活性或表达被抑制，以及Ura1的活性提高或者过表达活性；
(11)第一种和第二种基因修饰使得Ura3、His1和Pde2的活性或表达被抑制，以及Ura1的活性提高或者过表达活性。
优选地，所述抑制包括完全或部分抑制。更优选地，第一种基因修饰使得第一基因，例如Ura3的活性或表达被完全抑制，第二种基因修饰使得第二基因，例如His1、Pde1、或Pde2的活性或表达被完全或部分抑制。
上述基因及酶蛋白的序列，都可以在SGD数据库(Saccharomyces GenomeDatabase，简称SGD，https://www.yeastgenome.org/)，或GenBank数据库中找到，例如：
URA3及Ura3：https://www.yeastgenome.org/locus/S000000747，
URA2及Ura2：https://www.yeastgenome.org/locus/S000003666，
URA1及Ura1：https://www.yeastgenome.org/locus/S000001699，
HIS1及His1:https://www.yeastgenome.org/locus/S000000857，
HIS3及His3:https://www.yeastgenome.org/locus/S000005728，
PDE1及Pde1：https://www.yeastgenome.org/locus/S000003217，
PDE1及Pde2：https://www.yeastgenome.org/locus/S000005887。
本发明所描述的酵母菌株，较未经第一种基因修饰的酵母菌株，或未经第二种基因修饰的酵母菌株有更高的胞外乳清酸水平。例如，本文描述的酵母菌株的胞外乳清酸水平高达10.65g/L。
本发明所描述的酵母菌株，为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德酵母(Saccharomyces pastorianus),树干毕赤酵母(Pichia stipitis),SaccharomycesBayanus和休哈塔假丝酵母(Candida shehatae)、产朊假丝酵母(Candida utilis)中的任意一种，优选酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。优选的，所述酵母菌株是单倍体、二倍体、多倍体或非整倍体等等。
本发明的一个目的是提供一种上述酵母菌株的构建方法，所述构建方法包括：
(1)对第一种基因进行修饰，使得第一基因编码酶的活性下降或表达被抑制；
(2)对第二种基因进行修饰，使得第二种基因编码酶的活性提高或者过表达，或者，第二基因编码酶的活性下降或表达被抑制。
所述第一种基因和第二种基因如上所限定。
对第一种基因URA3的修饰，使得从头合成嘧啶途径发生缺陷，乳清酸作为中间代谢产物有了被大量积累的可能；
对第二种基因URA1的修饰，使得二氢乳清酸更多地转化为乳清酸；对第二种基因HIS1的修饰，切断了组氨酸合成途径，减少了对共同中间代谢产物PRPP的消耗，使得PRPP更多流向嘧啶和/或嘌呤代谢途径；对第二种基因PDE1或PDE2的修饰，减少了对环磷酸腺苷cAMP的降解，调控了嘌呤代谢途径；
第二种基因包括任一种基因修饰，或任意两两组合基因修饰，或三种基因组合修饰，都调控组氨酸合成途径、嘧啶合成途径和嘌呤合成途径三者之间代谢流的平衡，从而影响着乳清酸的产量。
所述构建方法使得酵母菌株胞外乳清酸水平大幅提高。
优选的，所述第一种基因修饰和第二种基因修饰的步骤不分前后，可以先对第一种基因进行修饰，然后对第二种基因进行修饰，也可以先对第二种基因进行修饰，然后对第一种基因进行修饰。第一和第二只是为了对基因进行描述，并不必然代表步骤的顺序，有特定定义的情形除外。
优选的，所述第二种基因是多个基因修饰时，所述第二种基因修饰的步骤不分先后，可以任意组合，例如：
可以先对二氢乳清酸脱氢酶编码基因进行修饰，然后对ATP磷酸核糖基转移酶的编码基因进行修饰；
也可以先对ATP磷酸核糖基转移酶编码基因进行修饰，然后对二氢乳清酸脱氢酶编码基因进行修饰；或者，
又如，先对ATP磷酸核糖基转移酶编码基因进行修饰，然后对磷酸二酯酶编码基因进行修饰，再对二氢乳清酸脱氢酶编码基因进行修饰，等等，以此类推，在此不再进行穷举。
优选的，所述使得酶蛋白的活性下降或表达被抑制的基因修饰方式包括点突变、缺失、插入、反义polynucleotides、siRNA、microRNA、CRISPR；使得酶蛋白的活性提高或者过表达的基因修饰方式包括点突变、连接强启动子、连接增强子、提高拷贝数。
在一个具体的实施方式中，所述构建方法包括基于同源重组双交换的对染色体直接进行序列修饰和基因编辑的方法。
其中应用的一个具体方式是：重复利用URA3基因选择标记，在URA3选择标记基因两侧加上酿酒酵母自身序列为同源臂；在第一轮筛选中使用没有添加尿嘧啶的选择性基本培养基进行筛选，得到同时整合了目的片段和URA3选择标记基因序列的转化子；第二轮使用5’-FOA平板对前述转化子进行反选，得到仅仅整合了目的片段而相应URA3选择标记基因序列删除的菌株。
另一个应用的具体方式是使用CRISPR Cas9系统进行基因修饰，涉及如下操作步骤和生物材料：
1、构建CRISPR Cas9表达载体，导入待修饰的酵母菌株；
2、构建guide序列表达载体；
3、合成携带整合左、右同源臂和待修饰基因片段的DNA序列(简称donor片段)；
4、制备导入了Cas9表达载体的酵母菌株感受态细胞；
5、guide序列表达载体和donor片段共转化酵母菌株感受态细胞；
6、筛选和鉴定目的转化子，同时丢失掉导入的Cas9表达载体和guide序列表达载体，得到染色体序列发生了如期修饰变化的重组菌株。
虽然本发明所应用的策略针对S.cerevisiae菌株的基因和多肽，但是相同的策略同样适用于其它可发酵的酵母，优选能够进行工业发酵的酵母菌株。除了S.cerevisiae菌株外，合适的菌株还包括巴斯德酵母(Saccharomyces pastorianus)、树干毕赤酵母(Pichia stipitis)、Saccharomyces Bayanus和休哈塔假丝酵母(Candida shehatae)、产朊假丝酵母(Candida utilis)。在这些菌株中通路或者基因名称或许稍有不同，但是可以应用同样的策略和技术来修饰相应的通路和同源基因。此处描述的基因工程酵母菌株是本领域的研究人员所熟知的，可以参见Jin et al.,2008,MoI.Biol.Cell,19:284-296。
本发明的一个目的是提供一种使用上述的酵母菌株生产乳清酸的发酵方法。
进一步，所述发酵方法包括发酵培养基组分，如碳源、氮源、微量元素。还包括温度、转速、碳源的补给方式。
优选的，所述发酵方法中，发酵用培养基的葡萄糖浓度为20-150g/L，酵母提取物10-30g/L，蛋白胨10-40g/L，尿素0-10g/L，铵盐0-10g/L。
优选的，所述发酵方法中，分批发酵或流加发酵；更优选的，所述分批发酵中，利用高糖培养基进行发酵。
更优选的，所述流加发酵中，流加补充葡萄糖，和/或酵母提取物，和/或蛋白胨，和/或尿素，和/或铵盐。进一步优选的，流加发酵中流加补充葡萄糖，更优选的，当葡萄糖浓度降至1～5g/L时流加补充葡萄糖，使葡萄糖浓度维持在0.1～5g/L。
在一个具体的实施方式中，所述发酵方法包括：
1、高糖培养基分批发酵：葡萄糖浓度为100-150g/L，酵母提取物20-30g/L，蛋白胨10-20g/L，尿素5-10g/L，铵盐2-5g/L；控制起始OD600＝0.1～1.0，30℃、220～800rpm下发酵72～168h；
2、流加发酵：起始培养基组成为：酵母膏10～30g/L，蛋白胨5～20g/L，尿素0～10g/L，铵盐2-5g/L,葡萄糖20g/L，自然pH值；当葡萄糖浓度降至1～5g/L时流加补充葡萄糖，使葡萄糖浓度维持在0.1～5g/L；控制起始OD600＝0.1～1.0，30℃、220～800rpm下发酵72～168h。
本发明的一个目的是提供一种利用上述的酵母菌株发酵生产的发酵液。
优选的，所述发酵液包括上述酵母菌株发酵分泌产生的乳清酸。更优选的，所述发酵液还包括上述任一的酵母菌株。
本发明的一个目的是提供上述任一的酵母菌株或者发酵液在生产乳清酸中的用途。
本发明的一个目的是提供一种利用上述任一所述的酵母菌株或者上述的发酵液生产乳清酸的方法，所述方法包括用分批发酵或流加发酵步骤对酵母菌株进行发酵。
本发明的一个目的是提供上述任一的酵母菌株或者发酵液在医药、美容、畜牧业、食品、保健品或化工等领域的应用。
本发明的一个目的是提供上述任一的酵母菌株或者发酵液在制备医药、美容、畜牧业、食品、保健品或化工等领域的产品中的应用。
优选的，所述应用为作为畜牧业的饲料或饲料添加剂。
相应的，本发明还提供包含上述任一的酵母菌株或者发酵液的医药、美容、畜牧业、食品、保健品或化工等领域的产品，例如药物，美容产品、饲料，食品、保健品等等。
本发明还提供一种制备医药、美容、畜牧业、食品、保健品或化工领域的产品的方法，所述方法包括利用上述任一的酵母菌株或者所述的发酵液制备上述产品。
本发明还提供一种饲料或者饲料添加剂，所述饲料或者饲料添加剂包含上述任一所述的酵母菌株或者所述的发酵液。
优选的，上述应用、方法、产品、饲料或者饲料添加剂包括将所述酵母或者发酵液进一步加工成任何其他剂型。
更优选的，所述剂型包括可食用的剂型。
进一步优选的，所述剂型为粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊、或液体形式。
若非特殊说明，本文涉及的所有专业术语、技术概念都是本领域技术人员所熟知的。尽管有多种类似或等效的方法可以用来构建和测定本发明中涉及的酵母菌株，下文中将描述一种合适的方法和材料。这些材料、方法和例子只是作为举证，它不在任何程度上限制本发明。本文中提到的所有文献、专利和其他参考资料均尊重其完整性。
本发明的优点和益处
本发明所得重组酵母菌株具有低营养需求、容易培养、适合大规模发酵生产并易于实现产业化的性能；
通过基因工程手段进行相关基因修饰，使所得重组酵母菌株能稳定、持续、高效生产胞外乳清酸；
在优化的方案中，通过调整碳源浓度、优化碳/氮比、流加等措施，使代谢流更有效地流向目的产物，得到优化的、高产胞外乳清酸的发酵工艺，乳清酸浓度可达到10.65g/L。当发酵结束、静置一段时间后，摇瓶或发酵罐底部甚至能看到颗粒物析出。
本发明具有工艺操作简单、产物容易分离提取、原料成本低、安全环保、可工业化生产的优点，为微生物发酵生产乳清酸开辟了新的途径，将推动高值医药和生化产品的绿色清洁生产，能广泛应用于医药、美容、畜牧业、食品、保健品或化工领域，具有重要的经济价值和社会意义。
附图说明
图1为质粒YCplac33-Cas9示意图。
图2为质粒pRS42H-gURA1示意图。
图3为6527bp PCR片段切胶回收琼脂糖凝胶电泳图谱。泳道1为6528bp片段，泳道M为DL15000 DNA ladder。
图4为URA1基因过表达整合菌株的PCR鉴定产物琼脂糖凝胶电泳图谱。从左到右3个泳道样品分别是：转化子、DNA ladder(从上到下7个条带顺次为4500、3000、2000、1200、800、500、200bp)、宿主对照。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明所述技术方案作进一步的说明。可以理解的是，在此描述的特定实施方式通过举例的方式来表示，其并不作为对本发明的限制。若非特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。在不偏离于本发明范围的情况下，本发明的主要特征可以用于各种实施方式。本领域的技术人员将会意识到或能够确认，仅仅使用常规实验，许多等同物都能应用于本文所描述的特定步骤中。这些等同物被认为处在本发明的范围之内，并且被权利要求所覆盖。
实施例中所涉及的几种培养基如下：
1)酵母菌株平板活化及种子液培养用培养基YPD或YPDA
YPD：酵母提取物(Yeast extracts)10g/L，蛋白胨(Peptone)20g/L，葡萄糖(Glucose)20g/L，自然pH值；固体培养时另加琼脂粉15g/L。
YPDA：上述基础上添加腺嘌呤(Adenine)0.05g/L。
2)使用尿嘧啶(URA3)营养缺陷型选择标记时的转化筛选培养基CMG-URA
使用缺省了尿嘧啶的基本培养基CMG平板简称CMG-URA平板进行筛选。组分如下：氨基酸碱基混合物，0.83g/L；不含氨基酸的酵母氮源Yeast Nitrogen Base，简称YNB，6.7g/L；葡萄糖，20g/L；琼脂粉，15g/L。其中的氨基酸碱基混合物见表1。
表1.氨基酸碱基混合物成分
| 腺嘌呤50mg/L | 亮氨酸100mg/L | 精氨酸20mg/L | 赖氨酸30mg/L |
| 天冬氨酸100mg/L | 甲硫氨酸20mg/L | 谷氨酸100mg/L | 苯丙氨酸50mg/L |
| 组氨酸100mg/L | 丝氨酸150mg/L | 异亮氨酸30mg/L | 苏氨酸150mg/L |
| 色氨酸l00mg/L | 酪氨酸30mg/L | 尿嘧啶50mg/L | 缬氨酸150mg/L |
注：省却特定的氨基酸成分，即可做成选择培养基。调pH值5.6，葡萄糖110℃灭菌15min，其它成分121℃灭菌21min，使用前混合。
3)5’-FOA平板(5’-乳清酸平板)
制备方法如下：
a、制备100ml 5’-FOA溶液，包括：
YNB w/o AA：1.4g dropout powder：0.17g 5’-FOA：0.2g
尿嘧啶：20mg 腺嘌呤：10mg 亮氨酸：40mg
组氨酸：30mg 色氨酸：20mg 葡萄糖：4g
用磁力搅拌器于45℃下不停搅拌，使其各个组分全部溶解，之后过滤除菌；
b、制备100ml琼脂粉Agar溶液，使其最终浓度达到3.0％，121℃灭菌15min后，将其冷却至45℃；
c、将100ml 5’-FOA与100ml Agar溶液混匀，防止出现气泡，倒入无菌培养皿中，冷却成型。
4)大肠杆菌培养用LB培养基
酵母提取物(Yeast extracts)5g/L，蛋白胨(Peptone)10g/L，氯化钠(NaCl)10g/L，调pH值至7.0；固体培养时另加琼脂粉15g/L。需要时添加抗生素，氨苄青霉素的添加终浓度100μg/mL。
实施例中涉及的生物材料，如：活性干酵母TH-AADY、菌株W303-1A(ATCC208352)、YPH499(ATCC204679)、YNN216，质粒YCplac33(＝ATCC 87586)、pRS42H-gRNA，可从安琪酵母股份有限公司、美国ATCC、Invitrogen或BioVector NTCC Inc.公司买到。
实施例1：工业生产用酵母菌株乳清酸生产评价
酿酒酵母既能以二倍体也能以单倍体形式存在于自然界中，一般情况下都能以营养体状态进行出芽繁殖。选用市场销售的耐高温活性干酵母TH-AADY(安琪酵母股份有限公司生产，http://bio.angelyeast.com/)进行了生长和生产乳清酸评价，操作如下：
1、种子活化：按产品说明书要求进行复水活化；
2、发酵及检测
发酵培养基：酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，自然pH值；100mL摇瓶，装液量20mL，控制起始OD600＝0.1，30℃、220rpm下发酵120h；发酵过程中定期取样进行检测：
OD600测定：将发酵液样品适当稀释后测定OD600，检测生长情况；
乳清酸浓度测定：1)将发酵样品在13000rpm、1min条件下离心，取上清进行适当稀释，用孔径0.22μm滤膜过滤，滤液用于色谱检测：检测波长280nm，Diamonsil C18色谱柱(迪马)，流动相使用2％H3PO4溶液和甲醇(色谱级)分别作为水相和有机相，以85％的水相等度洗脱，流速为0.5mL/min，柱温40℃，检测时长30min；2)乳清酸标准样品的配置及标准曲线的测定：先将乳清酸标准品用0.22μm滤膜过滤并高压灭菌后的去离子水配置成浓度为0.256g/L的标准溶液，再用同法制备的去离子水对其进行稀释，得到终浓度分别为0.004、0.008、0.016、0.032、0.064和0.128g/L的标准样品，用0.22μm滤膜过滤标准样品后进行HPLC分析，以峰面积对乳清酸浓度做标准曲线；3)利用标准曲线由外标定量法计算出发酵液样品中乳清酸的浓度。
发酵结果：发酵120h的OD600最大值为19.0，发酵液上清液中没有检测到乳清酸。
实施例2：URA3基因缺陷型菌株构建和乳清酸生产评价
首先以实施例1中的工业用酵母为出发材料进行单倍体分离和URA3缺陷型菌株构建；然后和收集的其它URA3缺陷型酵母菌株一起进行乳清酸生产评价。
一、URA3基因缺陷型单倍体菌株构建
以实施例1中的工业用酵母为出发材料，进行如下步骤操作：
1、形成酵母子囊孢子：取适量新活化酵母细胞均匀地涂布在醋酸钾产子囊孢子培养基上，30度培养2-3天，刮取适量涂层酵母细胞，溶解到装有50ul无菌水的离心管中，加入蜗牛酶、37度消化子囊壁10-30min；
2、拆分子囊孢子得到单倍体细胞：向上述离心管缓缓加入无菌水，倒置数分钟，取数十微升液体滴加到YPD平板边缘，倾斜使形成条形状，干燥后在显微操作仪上进行子囊孢子拆分，置于YPD平板培养2-3天，然后转接YPD液体培养基培养，收集菌液里的细胞提取染色体，用PCR方法检验菌株交配型和倍性，PCR验证使用的引物序列为：
P1：5'agtcacatcaagatcgtttatgg 3'(SEQ ID No：1)；
P2：5'gcacggaa tatgggactacttcg 3'(SEQ ID No：2)；
P3：5'actccacttcaagtaagagtttg 3'(SEQ ID No：3)。
a型酵母细胞的PCR产物大小为544bp，α型酵母细胞的PCR产物大小为404bp，二倍体酵母细胞的PCR产物则为两条带，大小分别为404bp和544bp；
3、失活URA3基因：
1)PCR方法扩增含有失活URA3基因序列的片段：以前述单倍体细胞提取染色体为模板，共使用4条引物：
P4：5'AGACGATGATAACAAACCGAA 3'(SEQ ID No：4)；
P5：5'AATGCCTTTAAATTTTGGGACCTAATGCTT3'(SEQ ID No：5)；
P6：5'TCCCAAAATTTAAAGGCATTATCCGCCAAG 3'(SEQ ID No：6)；
P7：5’TAGAAATCATTACGACCGAGA 3’(SEQ ID No：7)；
其中P4\P5引物对扩增URA3基因起始密码子上游412bp处序列到ORF中第165位碱基的DNA序列片段，加上重叠延申10bp，全长587bp；而P6\P7引物对扩增URA3基因ORF中第230位碱基起始的679bp序列片段，加上重叠延申10bp，全长689bp；然后以这两个PCR产物片段为模板，使用P4\P7引物对进行交叉重叠延申得到含有缺失了ORF中第166–229位碱基共64bp序列的片段，全长1256bp；
2)转化和筛选：制备前述单倍体菌株的感受态细胞，醋酸锂法转化1256bp片段到此细胞中，涂布5’-FOA平板筛选，生长菌落即失活了URA3基因的单倍体菌株。重复上述步骤可稳定获得URA3缺陷单倍体菌株，分别记为Angel#1～Angel#3。
二、URA3基因缺陷酵母菌株乳清酸生产评价
一起进行评价的菌株：
1)上述URA3缺陷单倍体菌株Angel#1～Angel#3；
2)URA3缺陷单倍体酵母菌株W303-1A(ATCC208352)和YPH499(ATCC204679)，购自美国ATCC(https://www.atcc.org)；
3)URA3缺陷的二倍体菌株YNN216，来自BioVector NTCC Inc.(http://www.biovector.net)。
挑取YPDA固体培养基平板上生长的新鲜菌落，接入装有5mL YPDA培养基的试管中，30℃、220rpm过夜培养，必要时进行二次扩大培养；液体培养物用作摇瓶发酵的种子液。
同实施例1进行乳清酸发酵评价，发酵120h结果见表2：
表2、URA3基因缺陷菌株最大乳清酸发酵浓度(g/L)
ND表示检测不到。
表2结果显示：URA3基因缺陷不意味着一定能积累乳清酸；即使积累浓度也很低。
实施例3：构建URA3基因缺陷和URA1基因过表达的酵母菌株
采用实施例2的方法构建URA3基因缺陷菌株，例如选取Angel#1，或选择已经失活了URA3基因的、公众能获得的酵母菌株(如W303-1A)作为出发菌株；然后进一步过表达URA1基因。
采用CRISPR Cas9系统进行酵母菌株的URA1基因过表达修饰，整体操作流程参见说明书里的说明。以菌株W303-1A为宿主为例，主要步骤如下：
1、将Cas9表达质粒YCplac33-Cas9(见图1)转化URA3基因缺陷酵母菌株W303-1A的感受态细胞，获得菌株W303-1A(YCplac33-Cas9)；
2、以质粒pRS42H-gRNA为出发材料构建guide表达质粒pRS42H-gURA1(见图2)：设计选用酿酒酵母染色体ChrⅨ上的20bp DNA序列5‘ACTATCAACACGTCGAGGGA 3’(SEQ ID No:8)作为guide序列进行相应表达质粒构建，将质粒pRS42H-gRNA中的8bp NotI酶切特异性识别碱基序列5'GCGGCCGC 3'(SEQ ID No:9)替换为20bp guide序列即得质粒pRS42H-gURA1，经测序证明序列无误。具体操作是：以Not I酶切的质粒pRS42H-gRNA线性片段为模板，使用引物对P8\P9扩增得到6528bp的PCR片段，其切胶回收片段的琼脂糖凝胶电泳图谱见图3；引物序列为：P8：5’TTTACAGGCAAGCACCCATT GTTTTAGAGCTAGAAATAGC 3’(SEQ ID No:10)；P9：5’AATGGGTGCTTGCCTGTAAA GATCATTTATCTTTCACTGC 3’(SEQ ID No:11)。6528bp片段使用诺唯赞公司的无缝重组试剂盒按说明书进行首尾连接，然后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，用LB+Amp100平板进行筛选，挑取生长菌落，接种LB+Amp100液体培养基过夜培养，提取质粒，对质粒提取物进行酶切鉴定和测序，证明得到重组质粒pRS42H-gURA1。
3、合成供体DNA片段
用交叉重叠延申PCR方法合成URA1基因整合过表达用供体DNA片段，全长2440bp。各元件片段信息和相应合成引物对序列如下：
1)左同源臂片段H1：对应染色体IX上第338187-338410位共224bp序列
P10：5’TTTACTCTCCCCTAACGATG 3’(SEQ ID No:12)，
P11：5’GCTCCCGTTAAATGGGTGCTTGCCTGTA 3’(SEQ ID No:13)；
2)启动子片段Ptpi：酿酒酵母TPI1基因起始密码子上游启动子区689bp
P12：5’AGCACCCATTTAACGGGAGCGTAATGGT 3’(SEQ ID No:14)，
P13：5’TGGCTGTCA TTTTTAGTTTATGTATGTG 3’(SEQ ID No:15)；
3)过表达基因URA1序列：945bp ORF序列
P14：5’TAAACTAAAAATGACAGCCAGTTTAACT 3’(SEQ ID No:16)，
P15：5’AGAAATTCGCTTAAATGCTGTTCAACTT 3’(SEQ ID No:17)；
4)终止子片段Tadh1：329bp ADH1基因终止子区序列
P16：5’CAGCATTTAA GCGAATTTCTATGATTTA 3’(SEQ ID No:18)，
P17：5’ACGTACCCTTATCCGTGTGGAAGAACGA 3’(SEQ ID No:19)；
5)右同源臂片段H2：对应染色体IX上第338414-338666位253bp序列
P18：5’CCACACGGATAAGGGTACGTAAACTAAA 3’(SEQ ID No:20)，
P19：5’TTCGTATCTTCATTCCGACA 3’(SEQ ID No:21)。
一轮PCR分别扩增5个元件，均以原养型酿酒酵母染色体或URA3基因缺陷酵母菌株(如W303-1A)的染色体为模板，使用全式金公司生产的Fast Pfu聚合酶，50℃退火1min，72℃延伸0.5-3.0min(视产物长度调整)，32个循环。所得产物顺次命名为PCR1～PCR5。
二轮PCR进行交叉重叠延申：
1)PCR12：以PCR1和PCR2为模板，以P10和P13为引物对，所得片段预计923bp；
2)PCR45：以PCR4和PCR5为模板，以P16和P19为引物对，所得片段预计592bp。
三轮PCR交叉重叠延申：
以PCR3和PCR45为模板，以P14和P19为引物对，得产物PCR345，预计1537bp。
四轮PCR交叉重叠延申：以PCR12和PCR345为模板，以P10和P19为引物对，得产物PCR12345，预计2440bp。
各轮交叉重叠延申PCR中，两个模板以摩尔比1:1等量混匀后使用，延申时间视产物长度调整。
4、共转化：将pRS42H-gURA1质粒和供体DNA片段一起共转化菌株yeast(YCplac33-Cas9)感受态细胞，涂布(CMG-URA+潮霉素)筛选平板进行筛选，潮霉素终浓度300μg/mL；
5、获得过表达URA1基因的目的菌株W303-1A(URA1)：使用鉴定引物对(P20：5’
TCTTAGTAATCCCGATGGAA 3’(SEQ ID No:22)，P21：5’AATAATCACTTGGGTGCAAT 3’(SEQ ID No:23))，对平板生长菌落进行PCR鉴定、PCR产物测序、丢失质粒和5’-FOA平板反选等操作，获得菌株W303-1A(URA1)。鉴定引物对扩增的PCR产物大小，目的整合菌株为2672bp，宿主对照菌株为712bp；PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果(见图4)证明了整合成功。
实施例4：构建URA3基因缺陷和HIS1基因缺陷的酵母菌株
采用实施例2的方法构建URA3基因缺陷菌株，例如选取Angel#1，或选择已经失活了URA3基因的、公众能获得的酵母菌株(如W303-1A)作为出发菌株；然后进一步失活HIS1基因，得到W303-1A(his1)。
同实施例3，采用CRISPR/Cas9系统对URA3基因缺陷菌株进行HIS1基因失活修饰。以菌株W303-1A为宿主为例，主要步骤如下：
1、制备菌株W303-1A(YCplac33-Cas9)感受态细胞；
2、以质粒pRS42H-gRNA为出发材料，构建和扩增guide表达质粒pRS42H-gHIS1:设计选用酿酒酵母染色体Chr V上的20bp DNA序列5’AAATACTTTGC CGATTTGGA 3’(SEQ IDNo:24)作为guide序列进行相应表达质粒载体构建，且测序证明质粒序列无误。20bp序列对应HIS1基因ORF第394-413位碱基序列。
使用的引物对序列为：
P22：5'AAATACTTTGCCGATTTGGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGC 3’(SEQ ID No:25)
P23：5'TCCAAATCGGCAAAGTATTTGATCATTTATCTTTCACTGC 3’(SEQ ID No:26)
扩增得到的PCR片段大小为6528bp；后续操作同实施例3的相应操作。
3、合成供体DNA片段
以原养型酿酒酵母染色体或W303-1A染色体为模板，使用引物对P24/P25合成PCR1片段，产物大小为78bp，包含对应HIS1基因ORF第343-410位的序列：
P24：5’CTTTGGTCTCACCAAAACACCATTGTTACCAGTTTCGT 3’(SEQ ID No:27)
P25：5’TCAACAGTAGAAATCGGCAAAGTATTTTTC 3’(SEQ ID No:28)。
使用引物对P26/P27合成PCR2片段，产物大小为100bp，包含对应HIS1基因ORF第419-508位的序列：
P26 5’TTGCCGATTTCTACTGTTGAAAAAATGACC 3’(SEQ ID No:29)，
P27 5’GAAAGGTCTCTCTCTAAAACTCCAAATCGGCAAAGTATTTCACGGAACCACTGACA AA 3’(SEQ ID No:30)。
以PCR1和PCR2片段为模板，使用引物对P24/P27进行交叉重叠延申PCR，产物大小为158bp。
4、共转化：将pRS42H-gHIS1质粒和供体DNA片段一起共转化菌株W303-1A(YCplac33-Cas9)感受态细胞，涂布(CMG-URA+潮霉素)筛选平板进行筛选；
5、获得HIS1基因缺陷的目的菌株W303-1A(his1)：使用鉴定引物对(P28：5’TGACCAAGTTCGTAAATCTA 3’SEQ ID No:31)，P29：5’CCATCTCCACAATAGGCATA 3’(SEQ ID No:32))，对平板生长菌落进一步进行PCR鉴定、PCR产物测序、丢失质粒和5’-FOA平板反选等操作；鉴定引物对扩增的PCR产物，对目的菌株预计1132bp，非目的菌株为1140bp。
测序证明HIS1基因ORF第411-418位共8bp碱基序列被缺失，造成了移码突变。
实施例5：构建URA3基因缺陷和PDE1基因缺陷的酵母菌株
采用实施例2的方法构建URA3基因缺陷菌株，例如选取Angel#1，或选择已经失活了URA3基因的、公众能获得的酵母菌株(如W303-1A)作为出发菌株；然后进一步失活PDE1基因，得到W303-1A(pde1)。
同实施例3或实施例4，采用CRISPR/Cas9系统对URA3基因缺陷菌株进行PDE1基因失活修饰。以菌株W303-1A为宿主为例，主要步骤如下：
1、制备菌株W303-1A(YCplac33-Cas9)感受态细胞；
2、以质粒pRS42H-gRNA为出发材料，构建和扩增guide表达质粒pRS42H-gPDE1:设计选用酿酒酵母染色体Chr VII上的20bp DNA序列5’GTGCAGGAAT GTACCAGCTA 3’(SEQ IDNo:33)作为guide序列进行相应表达质粒载体构建，且测序证明质粒序列无误。20bp序列对应PDE1基因ORF第122-141位碱基序列。
使用的引物对序列为：
P30：5'GTGCAGGAATGTACCAGCTAGTTTTAGAGCTAGAAATAGC 3’(SEQ ID No:34)
P31：5'TAGCTGGTACATTCCTGCACGATCATTTATCTTTCACTGC 3’(SEQ ID No:35)
扩增得到的PCR片段大小为6528bp；后续操作同实施例3的相应操作。
3、合成供体DNA片段
以原养型酿酒酵母染色体或W303-1A染色体为模板，使用引物对P32/P33合成PCR1片段，产物大小为111bp，包含对应PDE1基因ORF第36到第136位序列：
P32：5’TGGAGGACCCACCGAATACG 3’(SEQ ID No:36)
P33：5’CCAACATCTCGGTACATTCCTGCACCACC 3’(SEQ ID No:37)。
使用引物对P34/P35合成PCR2片段，产物大小为168bp，包含对应PDE1基因ORF第145到第302位序列：
P34 5’GGAATGTACCGAGATGTTGGTCCAAGGGC 3’(SEQ ID No:38)，
P35 5’TGCCTCTTTAATGATTGTAGCAAG 3’(SEQ ID No:39)。
以PCR1和PCR2片段为模板，使用引物对P32/P35进行交叉重叠延申PCR，产物大小为259bp。
4、共转化：将pRS42H-gPDE1质粒和供体DNA片段一起共转化菌株W303-1A(YCplac33-Cas9)感受态细胞，涂布(CMG-URA+潮霉素)筛选平板进行筛选；
5、获得PDE1基因缺陷的目的菌株W303-1A(pde1)：使用鉴定引物对(P36：5’CAAACCCTTTCCATTTTCGAG 3’(SEQ ID No:40)，P37：5’ACTTTTGAACTTCC TTCGGAT 3’(SEQ IDNo:41))，对平板生长菌落进一步进行PCR鉴定、PCR产物测序、丢失质粒和5’-FOA平板反选等操作；鉴定引物对扩增的PCR产物，对目的菌株预计718bp，宿主对照菌株为726bp。
测序证明PDE1基因ORF第137-144位共8bp碱基序列被缺失，造成了移码突变,得到菌株W303-1A(pde1)。
实施例6：双基因修饰菌株发酵评价
对双基因同时修饰酵母菌株进行了发酵评价。以W303-1A(URA1)、W303-1A(pde1)和W303-1A(his1)为例进行了发酵评价。发酵培养基为：酵母提取物15g/L，蛋白胨30g/L，葡萄糖100g/L，自然pH值；100mL摇瓶，装液量20mL，控制起始OD600＝0.5，30℃、220rpm下发酵120h。按实施例1方法进行了发酵液乳清酸浓度检测，发酵120h内的最大乳清酸浓度分别为0.0502、0.0194和0.0253g/L。相对于W303-1A菌，上述双基因修饰菌株胞外乳清酸产量都有显著性的差异。
实施例7：构建URA3基因缺陷基础上URA1、HIS1和PDE1三基因两两组合修饰酵母菌株
一、三个基因同时修饰酵母菌株构建
分三步构建得到三个基因同时被修饰的酵母菌株：
1、采用实施例2的方法构建URA3基因缺陷菌株，或选择已经失活了URA3基因的、公众能获得的酵母菌株(如W303-1A)作为出发菌株；
2、采用实施例3或实施例4或实施例5里方法构建第二个基因修饰酵母菌株；
3、采用实施例3或实施例4或实施例5里方法构建第三个基因修饰酵母菌株。
具体地，以URA3基因缺陷菌株W303-1A为例：
按实施例3方法构建得到W303-1A(URA1)，按实施例4的方法进一步失活HIS1基因，得到W303-1A(his1URA1)；或按实施例5的方法进一步失活PDE1基因，得到W303-1A(pde1URA1)；
按实施例4方法构建得到W303-1A(his1)，按实施例3的方法进一步过表达URA1基因，得到W303-1A(his1URA1)；或按实施例5的方法进一步失活PDE1基因，得到W303-1A(his1pde1)；
按实施例5方法构建得到W303-1A(pde1)，按实施例3的方法进一步过表达URA1基因，得到W303-1A(pde1URA1)；或按实施例4的方法进一步失活HIS1基因，得到W303-1A(his1pde1)；
不论何种方式，基因修饰不分先后，构建得到三类菌株：W303-1A(his1URA1)、W303-1A(pde1URA1)和W303-1A(his1 pde1)。
二、三个基因同时修饰酵母菌株发酵评价
对三个基因同时修饰酵母菌株进行了发酵评价。以W303-1A(his1URA1)、W303-1A(pde1URA1)和W303-1A(his1 pde1)为例进行了发酵评价。发酵培养基为：酵母提取物15g/L，蛋白胨30g/L，葡萄糖100g/L，自然pH值；100mL摇瓶，装液量20mL，控制起始OD600＝0.5，30℃、220rpm下发酵120h。按实施例1方法进行了发酵液乳清酸浓度检测，发酵120h内的最大乳清酸浓度分别为2.91、3.23和2.57g/L，相对于第二种基因单个基因的修饰，双基因修饰能显著性的提高胞外乳清酸的产量。
实施例8：构建URA3基因缺陷基础上其他三个基因同时修饰的酵母菌株
一、四个基因同时修饰酵母菌株构建
下面分四个步骤构建得到同时修饰四个基因的菌株。URA3基因缺陷修饰以外，上述URA1、HIS1和PDE1三个基因可以不分先后的被修饰：
1、采用实施例2的方法构建URA3基因缺陷菌株，或选择已经失活了URA3基因的、公众能获得的酵母菌株(如W303-1A)作为出发菌株；
2、采用实施例3或实施例4或实施例5里方法构建第二个基因修饰酵母菌株；
3、采用实施例3或实施例4或实施例5里方法构建第三个基因修饰酵母菌株；
4、采用实施例3或实施例4或实施例5里方法构建第四个基因修饰酵母菌株，得到菌株W303-1A(his1 pde1URA1)。
二、四个基因同时修饰酵母菌株发酵评价
对四个基因同时修饰酵母菌株W303-1A(his1 pde1URA1)进行了发酵评价：
1、摇瓶发酵：完全同实施例6里的操作；
2、发酵罐发酵
1)分批发酵：发酵培养基为：酵母膏25g/L，蛋白胨10g/L，尿素10g/L，葡萄糖150g/L，自然pH值；5L发酵罐，装液量3L，控制起始OD600＝0.5，30℃、200～800rpm下发酵120h。
2)流加发酵：发酵培养基为：酵母膏25g/L，蛋白胨10g/L，尿素10g/L，葡萄糖20g/L，自然pH值；当葡萄糖浓度降至1～5g/L时开始流加补充50％(w/v)葡萄糖，使葡萄糖浓度维持在1～5g/L；5L发酵罐，装液量3L，控制起始OD600＝0.5，30℃、200～800rpm下发酵120h。
按实施例1方法进行了发酵液乳清酸浓度检测。发酵120h内的最大乳清酸浓度分别达到了3.75g/L(摇瓶)、4.61g/L(发酵罐分批发酵)、10.15g/L(发酵罐流加发酵)。当发酵结束、静置一段时间后，摇瓶或发酵罐底部能看到颗粒物析出。
可见，第二种基因进行三个基因的修饰后，进一步限制性提高了胞外乳清酸的产量，优化发酵工艺后，可以使得胞外乳清酸产量大幅度提高。
实施例9：构建URA3基因缺陷基础上其他三个基因同时修饰酵母菌株的二倍体菌株
一、二倍体菌株构建
在单倍体细胞中表达显性基因HO进行酵母交配型的改变，然后相反交配型酵母进行交配获得二倍体，是构建酵母二倍体的常用方法。具体操作步骤概述如下：
1.将含有显性基因HO的质粒转入实施例8中菌株感受态细胞，涂布CMG-URA平板进行筛选；2.PCR验证筛选平板生长转化子的交配型；3.将验证正确的二倍体菌株涂于5’-FOA平板，得到转入质粒弹出后的菌株；4.平板划线纯化，再次PCR方法检验菌株交配型。
PCR验证使用的引物序列和判断方法完全同实施例2，即使用引物P1～P3，a型和α型酵母细胞的PCR产物大小分别为544bp、404bp，二倍体酵母细胞的PCR产物则为两条带，大小分别为404bp和544bp。构建的二倍体命名为WD。
二、二倍体WD菌株发酵评价
同实施例8进行了发酵罐发酵。菌株WD在发酵120h内的最大乳清酸浓度分别达到了4.91g/L(发酵罐分批发酵)、10.65g/L(发酵罐流加发酵)。当发酵结束、静置一段时间后，摇瓶或发酵罐底部能看到颗粒物析出。
以上结果说明，无论是单倍体还是多倍体，在进行基因工程修饰后，均可显著性的提高胞外乳清酸产量。
实施例10：富含乳清酸发酵液制备固态粉剂
实施例6到实施例9中任一发酵生产的富含乳清酸的酵母发酵液，使用喷雾干燥机进行脱水干燥制粉，进风温度160-180度、出口温度75-95度。所得粉剂进行密封包装、低温或室温储存。
实施例11：富含乳清酸酵母粉剂提高产蛋量
选用品种和日龄相同，健康状况和生产性能相近且处于产蛋后期的蛋鸡5000羽，分成2组:A组为对照组，饲喂基础日粮；B组为试验组，在基础日粮中添加富含乳清酸酵母制剂，添加量由0.015％逐步增加至0.075％，预试期7天，正试期30天。在正试期结束时，A对照组产蛋率较试验前期降低了2.98％，而B组产蛋率较试验前期仅降低了0.93％，且平均蛋重较A组高0.96g/枚。证明酵母粉剂能有效维持产蛋后期产蛋率及提高蛋重。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
Claims (18)
1.一种酵母菌株，其特征在于，所述酵母菌株包括第一种和第二种基因修饰，其中，所述第一种基因是乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶编码基因URA3，通过修饰第一种基因使乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶Ura3活性下降或表达被抑制，所述第二种基因包括二氢乳清酸脱氢酶编码基因URA1、ATP磷酸核糖基转移酶的编码基因HIS1和/或磷酸二酯酶的编码基因PDE1，所述第二种基因修饰使得二氢乳清酸脱氢酶Ura1的活性提高或者过表达,或者所述第二种基因修饰使得ATP磷酸核糖基转移酶His1或磷酸二酯酶Pde1的活性下降或表达被抑制，所述酵母菌株的乳清酸产量上升，其中，所述乳清酸产量上升，是相对于未经基因修饰的，和/或只经过第一种基因修饰的酵母的乳清酸产量而言。
2.根据权利要求1所述的酵母菌株，其特征在于，所述使得酶蛋白的活性下降或表达被抑制的基因修饰方式为点突变、缺失、插入、反义polynucleotides、siRNA、microRNA、CRISPR；使得酶蛋白的活性提高或者过表达的基因修饰方式为点突变、连接强启动子、连接增强子、提高拷贝数。
3.根据权利要求1所述的酵母菌株，其特征在于，所述酵母菌株的基因修饰选自下列组中的一组：
（1）第一种基因修饰使得Ura3的活性或表达被完全抑制，和，第二种基因修饰使得Ura1的活性提高或者过表达活性；
（2）第一种和第二种基因修饰使得Ura3和His1的活性或表达被抑制；
（3）第一种和第二种基因修饰使得Ura3和Pde1的活性或表达被抑制；
（5）第一种和第二种基因修饰使得Ura3和His1的活性或表达被抑制，以及Ura1的活性提高或者过表达活性；
（6）第一种和第二种基因修饰使得Ura3和Pde1的活性或表达被抑制，以及Ura1的活性提高或者过表达活性；
（8）第一种和第二种基因修饰使得Ura3、His1和Pde1的活性或表达被抑制；
（10）第一种和第二种基因修饰使得Ura3、His1和Pde1的活性或表达被抑制，以及Ura1的活性提高或者过表达活性。
4.根据权利要求3所述的酵母菌株，其特征在于，所述抑制为完全或部分抑制。
5.根据权利要求4所述的酵母菌株，其特征在于，第一种基因修饰使得Ura3的活性或表达被完全抑制，第二种基因修饰使得第二基因His1或Pde1的活性或表达被完全或部分抑制。
6.根据权利要求1-5任一所述的酵母菌株，其特征在于，所述酵母菌株为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、巴斯德酵母（Saccharomyces pastorianus）, 树干毕赤酵母（Pichia stipitis）, Saccharomyces Bayanus和休哈塔假丝酵母（Candida shehatae）、产朊假丝酵母（Candida utilis）中的任意一种。
7.根据权利要求6所述的酵母菌株，其特征在于，所述酵母菌株为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。
8.一种权利要求1-7任一所述的酵母菌株的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括：
（1）对第一种基因进行修饰，使得第一种基因编码酶的活性下降或表达被抑制；
（2）对第二种基因进行修饰，使得第二种基因编码酶的活性提高或者过表达，或者，第二种基因编码酶的活性下降或表达被抑制。
9.一种利用权利要求1-7任一所述的酵母菌株发酵生产的发酵液，其特征在于，所述发酵液包括权利要求1-7任一所述的酵母菌株和所述酵母菌株发酵分泌产生的乳清酸。
10.一种利用权利要求1-7任一所述的酵母菌株生产乳清酸的方法，其特征在于，所述方法包括用分批发酵或流加发酵步骤对酵母菌株进行发酵。
11.一种制备医药、美容、畜牧业、食品、保健品或化工领域的产品的方法，其特征在于，所述方法包括利用权利要求1-7任一所述的酵母菌株或者权利要求9所述的发酵液制备上述产品。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述方法包括将所述酵母或者发酵液进一步加工成任何其他剂型。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述剂型为可食用的剂型。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述剂型为粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊、或液体形式。
15.一种饲料或者饲料添加剂，其特征在于，所述饲料或者饲料添加剂包含权利要求1-7任一所述的酵母菌株或者权利要求9所述的发酵液。
16.根据权利要求15所述的饲料或者饲料添加剂，其特征在于，所述酵母菌株或者发酵液进一步加工成任何其他剂型。
17.根据权利要求16所述的饲料或者饲料添加剂，其特征在于，所述剂型为可食用的剂型。
18.根据权利要求17所述的饲料或者饲料添加剂，其特征在于，所述剂型为粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊、或液体形式。
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