CN1237208A

CN1237208A - 用于产朊假丝酵母转化的方法和材料

Info

Publication number: CN1237208A
Application number: CN 97199610
Authority: CN
Inventors: L·罗德里古茨密挪卡尔; F·P·萨威斯艾斯比挪萨; M·E·科萨雷茨马丁尼斯; T·里威罗巴易萨; L·比萨比图罗; E·帕菲雷仪斯; J·M·德加多伯阿达
Original assignee: Centro de Ingenieria Genetica y Biotecnologia CIGB
Current assignee: Centro de Ingenieria Genetica y Biotecnologia CIGB
Priority date: 1996-10-03
Filing date: 1997-10-03
Publication date: 1999-12-01
Also published as: CU22722A1; WO1998014600A1; AU744698B2; JP2001501475A; BR9713313A; CA2268004A1; EP0956356A1; AU4548597A; RU2235127C2

Abstract

本发明提供了一种用于在酵母菌产朊假丝酵母中表达外源蛋白质的转化系统,该系统的建立是基于得到了该菌的营养缺陷型突变株以及从基因组文库中分离出能互补所述营养缺陷型突变的不同的基因。此转化系统用从产朊假丝酵母NRRLY－1084菌株得到的新的营养缺陷型突变株作为宿主,该突变株主要在尿嘧啶和组氨酸途径中有缺陷,并用包含作为选择性标记的上述酵母菌的URA和HIS基因的质粒来转化。

Description

用于产朊假丝酵母转化的方法和材料

技术内容

本发明涉及基因工程和生物技术领域，特别是涉及用于酵母菌产朊假丝酵母(Candida utilis)的遗传转化的一种宿主载体系统的建立，该系统允许异源蛋白质在该酵母菌中表达和分泌，其还可用于多种目的。

现有技术

基因工程和生物技术已经使许多用于医学、营养学或工业目的之目标蛋白质的生产获得了未曾预料到的进展，据报道获得了很好的效益。

基于对大肠杆菌遗传学的了解、它的易操作性和它们的高密度培养系统，大肠杆菌已经被许多生物技术公司作为用于这些目的的最常用的微生物。

但是，期望的该微生物产生的目标蛋白质的产量受到多种因素的影响。首先，当试图将所获产物作为人用药品或食物时，大肠杆菌细胞壁上的热原和毒性化合物限制了其的应用。另外，在大肠杆菌中过度表达的蛋白质通常是以一种不能被分泌的不溶解的形式存在。另一方面，转录、翻译和翻译后修饰的机理不同于真核系统，导致重组蛋白质在特定的方面不同于天然来源的蛋白质。

在真核系统如酵母菌中表达异源蛋白质的可行性相对于原核表达系统有一些优势。其中涉及生长至高细胞密度的能力以及调整它们以适合于连续系统培养的可能性。而且，与大肠杆菌相比酵母菌可将相当大的量的蛋白质分泌到培养基中，而且用于培养酵母菌的培养基比培养细菌所用的培养基更经济(Lemoine,Y.,1988.酵母菌中的异源表达(Heterologous espression in yeast)第八届国际生物技术研讨会(8thInternational Biotechnology Syposium,)Paris,July 17-22)而且，这些系统能够进行其它的转录后修饰，如细菌系统不具备的糖基化作用(Fiers,W.,1988.微生物中外源基因的最大工程化表达(EngineeringMaximal Expression of Heterologous Gene in Microorganism.)第八届国际生物技术研讨会(8th International Biotechnology Symposium,)Paris,7月17-22)。另外，这些系统一般优选使用与更高等的真核系统所用的相同密码子(Kigsman,S.M.等人，1990.酿酒酵母中的异源基因表达(Heterologous Gene Expression in Saccharomyces cerevisiae)生物技术与基因工程回顾(Biotechnology & Genetic Engineering Reviews),3,G.E.Russell编)。

所有这些导致了新的真核转化系统的发展和普及，并且尤其令人感兴趣的是在酵母菌中，最先被描述是酵母属(Saccharomyces)的一些种，特别强调的是在酿酒酵母中。但是，酵母属中的蛋白质表达面临一些问题，即用它们的同源启动子得到的表达水平以及分泌到培养基的蛋白质的过度糖基化现象。这就是过去几年加强寻找非常规的酵母菌以用于表达异源蛋白质的主要原因。

随着在其它非酵母属酵母菌中转化系统的发展，象多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)，巴斯德毕氏酵母(Pichia pastoris)和克鲁维酵母属的酵母菌(Sudbery,E,1994.酵母菌(Yeast)10:1707-1726)已经在这些系统的发展和了解方面有了很快的进展，并且用这些系统表达的用于疫苗、诊断和工业目的的外源蛋白质的种类也不断增长。

而且，已经报道了假丝酵母属中的几种转化和表达系统，包括热带假丝酵母，博伊丁假丝酵母(Candida boidiini),Candida glabrata，近平滑假丝酵母，Candida maltosa和白假丝酵母，这些菌种都有明显的医学方面的用途，因为其中的很多种有可能是人类疾病的病因。

因为假丝酵母属中产朊假丝酵母具有特别的特征，对它有着特殊的兴趣。首先，产朊假丝酵母可利用种类繁多的廉价碳源如木糖、蔗糖和麦芽糖等。另一有趣的特点是在连续的培养体系中它可有效地产生大量的细胞。而且，产朊假丝酵母和酿酒酵母以及乳酸克鲁维酵母作为安全的食物材料的来源已经被FDA(食品及药物管理局)认可。此外，产朊假丝酵母已经被用于L-谷氨酰胺、etil乙酸盐和转化酶以及其它产品的工业生产中。

一种用于产朊假丝酵母的转化系统的初步系统已经被Ho,I.等人，1984，(生物技术与生物工程研讨会(Biotechnology and BioengineeringSvmp.)14:295-301)描述。这篇报道是不完全的，因为抗药性标记的存在和转化过程的直接证据还未公开。最近，Kondo,K.等人，1995，(细菌学杂志(J.Bacteriol.)177:7171-7177)报道了一种涉及产朊假丝酵母的转化系统的新策略。他们通过使用包含一个核糖体蛋白L41的突变体的标记基因得到了放线菌酮抗性(CYH)的转化子，该基因可赋予抗药性并且以核糖体DNA(rDNA)片段作为质粒整合的多拷贝靶点，因为为了筛选CHY抗性转化子，标记需要以多拷贝的形式存在。

已经做了许多用产朊假丝酵母作为宿主来表达异源蛋白质的尝试，然而，利用营养缺陷型突变株进行产朊假丝酵母的转化的步骤至今还没有建立。

如果注意到产朊假丝酵母在工业上的应用和它的遗传的新颖性，产朊假丝酵母因其作为异源蛋白表达系统用于商业应用可以被视为一种具有吸引力的微生物。

发明内容

本发明的目的是提供用于酵母菌产朊假丝酵母转化的方法和材料，以用来在此酵母菌中有效地表达外源蛋白质，这是基于得到了该菌种的营养缺陷型突变株，并且从基因组文库中分离了与该营养缺陷型互补的不同的基因。

这里所述的转化方法提供了将DNA片段或序列插入产朊假丝酵母宿主细胞的方法并且容许将产朊假丝酵母作为基因表达和蛋白质制备的宿主系统。

而且，利用本发明中的所述方法也可以鉴定和筛选转化的酵母菌细胞。提供了新的产朊假丝酵母菌株、载体和亚克隆。新的酵母菌菌株被用作导入重组DNA片段的宿主细胞。

本发明还涉及DNA在宿主细胞中稳定的转化和保持，其中标记可以同源性地整合到酵母菌的基因组中。

具体而言，本发明由用于酵母菌产朊假丝酵母的转化系统组成，该系统用从所述酵母菌的菌株NRRL Y-1084中分离出的新的营养缺陷型突变株作为宿主。这些突变株缺失了尿嘧啶生物合成途径中的乳清酸核苷5′-磷酸脱羧酶或组氨酸生物合成途径中的咪唑甘油磷酸脱水酶，并且是用现有技术中(Sherman,F.等人，1986.实验室操作：酵母菌遗传学手册(Laboratory course:Manual for methods in yeast genetics.)ColdSpring Harbor Laboratory Press,NY)的以紫外线(UV)和亚硝基胍(NTG)为诱变剂的传统诱变方法得到的。这些突变株具有高度的稳定性(回复突变率约为10^-8)而且可用本发明所述步骤有效地进行转化。另外，编码乳清酸核苷5′-磷酸脱羧酶的URA3基因和编码咪唑甘油磷酸脱水酶的HIS3基因可以作为产朊假丝酵母突变株的选择性标记被分离出来，这两个基因是从pUC19中的产朊假丝酵母的基因文库中分离出的，并分别在大肠杆菌MC1066中用pyrF和hisb463突变的互补实验来进行鉴定。相类似，酿酒酵母菌株SEY2202的ura3突变也被用来鉴定来自产朊假丝酵母的这种基因。测定了这些基因的全部序列并且推导出的氨基酸序列与其它酵母菌和真菌的相同基因具有高度相似性。

该转化系统中应用的一些载体是包含URA3基因的质粒pURA5和包含URA3基因的pUREC3，它们可以通过同源重组整合到产朊假丝酵母突变体宿主的同源位点上。

本发明也提供了基于前面所述的一系列质粒，它们可用于从产朊假丝酵母分离的突变株的转化以获得异源蛋白质。

本发明的转化系统用从产朊假丝酵母的菌株NRRL Y-1084得到的新的营养缺陷型突变株作为宿主，这些营养缺陷型突变株主要是在尿嘧啶和组氨酸合成途径中有缺陷，根据它们的特征从中筛选出突变株CUT-35(ura^-)和突变株TMN-3(his^-)。

实施例：实施例1：产朊假丝酵母的诱变

建立一种微生物的转化系统通常需要三个要素：

1)一种用于选择转化子的标记，它可以是一种营养缺陷型的或一种显性标记，

2)一种用于筛选的突变株或适合的宿主，以及

3)一种以有效的形式将核外DNA可复制地导入宿主的方法。

为了满足第二要素，需要对产朊假丝酵母进行传统诱变。将选出的酵母菌株(NRRL Y-1084)的培养物接种到100ml YPG培养基(酵母提取物1％，蛋白胨2％，葡萄糖2％)中，30℃振荡培养10-20小时。取50ml培养物3000转/分离心5分钟。然后将细胞用0.1M(pH5.5)无菌的柠檬酸缓冲液洗两次并重悬浮于50ml同样的缓冲液中。然后，取10ml该悬浮液与终浓度为50mg/ml的NTG溶液共同培养。悬浮液30℃静置培养30分钟。

将悬浮液用蒸馏水洗两遍以去除NTG。将细胞悬浮于50ml的YPG培养基中然后再转移至装有100ml YPG的锥形瓶中，突变细胞的培养物于30℃培养48小时。制霉菌素富集培养

将大约5ml经48小时YPG培养的培养物接种到100ml基础培养基中，用于抗生素富集培养的基础培养基(YNB，酵母氮基质)其中不能补充在所寻找的缺陷型的生物合成途径所产生的该代谢物。例如，为了分离尿嘧啶的营养缺陷型突变株，培养基中不加尿嘧啶。

持续培养一直到培养物的光密度(OD)达到最初OD值的20-30％。当培养物达到所需OD值时，用25单位/毫升的制霉菌素溶液处理细胞悬液。将含抗生素的溶液在30℃无搅拌培养30分钟。将细胞悬液用蒸馏水洗两遍以去除培养基中的制霉菌素，然后将细胞重悬浮于合适体积中以使每个平板得到150-200个菌落。筛选和选择

将含有根据实施例1诱变过的菌落的平板上的菌落接种于含有尿嘧啶和不含尿嘧啶的YNB培养基上。在无尿嘧啶的培养基上不能生长的菌落被用于进一步的分析。

特别是为了鉴定ura3和ura5突变株的存在，在5-氟乳清酸(5FOA)存在下培养细胞。抗性菌落作为ura3和ura5样突变株被挑选出来。实施例2:ura3突变株的分离

制霉菌素富集培养后将培养物用蒸馏水洗两遍并直接涂布于含0.75μg/ml的5-FOA(5-氟乳清酸，Fluka)和40μg/ml的尿嘧啶的平板上。平板培养四天后分析长出的菌落以检测ura^-表型。在经过制霉菌素富集培养后的4×10⁴个活细胞中有79个菌落表现出对5-FOA的抗性。这些菌落可能是ura3、ura5或仅是5-FOA抗性株。为了证实尿嘧啶营养缺陷型的存在，将假定的突变株涂在YPG培养基上30℃培养48小时后再涂布于含尿嘧啶和无尿嘧啶的YNB培养基上。共有67个菌落在无尿嘧啶的YNB培养基上不能生长，表现出ura^-表型。

测定所有这些突变株的回复突变率，特别突出的是回复突变率数量级为10^-8的一组23个突变株，表明它们确实稳定，可作为转化系统的宿主。

用Yoshimoto等人，1978(酶学方法(Methods Enzymol)51:74-79)的方法测定所有尿嘧啶营养缺陷型突变株的乳清酸核苷-5′-单磷酸脱羧酶(ODCase)的活性，并确定其生长条件，结果见表1。表1更为明显的ura3突变株的特征概述名称回复突变率乳清酸核苷-5’-单磷酸脱羧酶活性生长CUT35 ＜5×10^-7 - +++CUT43 ＜1×10^-7 - +++CUT61 ＜1×10^-8 - +++CUT65 ＜1×10^-8 - ++CUT70 ＜1×10⁴ - +CUT88 ＜7×10^-7 - +++CUT93 1×10^-8 - +++CUT166 6×10^-8 - +++实施例3：不同于ura3^-表型的其它突变株的分离

为了得到不同于尿嘧啶缺陷型的多种营养缺陷型突变株，将按照制霉菌素富集培养获得的细胞悬液涂布于YPG培养基上30℃培养50小时。然后将YPG平板上的菌落再复制于含有YNB培养基的平板上30℃培养48小时。在YNB平板上不能生长的菌落被用于进一步分析。

筛选大约2411个菌落，结果2％的菌落表现为营养缺陷型突变株。这些突变株用Holiday和Finchan检测加以验证。结果90％为his^-突变株，2％表现出lys^-表型，1％表现出leu^-表型，1％表现出met^-表型，1％表现出ade^-表型，而5％未表现单一的营养缺陷型(Naa)。

挑选回复突变率在10^-7～10^-8之间的突变株做进一步分析(表2)。表2

名称表型回复突变率

TMN3 his^- 1×10^-8

TMN31 his^- 1×10^-8

TMN64 his^- 1×10^-8

TMN9 his^- 4×10^-7

TMN12 his^- 5×10^-7

TMN13 his^- 2.5×10^-7

TMN62 his^- 8×10^-7

TMN74 his^- 2×10^-7

TMN78 his^- 2×10^-7

TMN45 lys^- 8×10^-6

TMN71 his^- 2×10^-6

TMN82 Naa 2×10^-6

实施例4：产朊假丝酵母基因组文库的构建

用Sau3A酶部分酶解从产朊假丝酵母NRRL Y-1084中提取的染色体DNA，用低熔点(LGT)琼脂糖凝胶电泳分离出大小在6-9kb的片段。这些片段被连接到预先用BamHⅠ酶解并用碱性磷酸酶处理过的pUC19载体上。连接体被转化进大肠杆菌MC 1066(F’,D Lac x74,hsr,hsm,rpsl,galU,galK,trip C 9030F,leuB,pyrF∷tn5)菌株。从基因组文库得到大约95％的重组子。实施例5：产朊假丝酵母中URA3基因的分离

作为产朊假丝酵母ura3宿主转化的标记，分离且表征了产朊假丝酵母中的URA3基因。通过可互补大肠杆菌pyrF突变的能力，包含产朊假丝酵母URA3基因的DNA片段被从产朊假丝酵母pUC19基因组文库中分离出来，其考虑到获自酿酒酵母的URA3基因与大肠杆菌的pyrF突变互补，使用大肠杆菌的恰巧的启动子活性。将此文库涂布于缺乏尿嘧啶的培养基上后，分离出12个单独的pyrF⁺的克隆。通过用HindⅢ和EcoRⅠ限制性酶解将DNA插入pUC-19中，其中插入的两个克隆(pURA-2和pURA-5)具有相同的2.6kb的产朊假丝酵母基因组片段。来自这两个质粒的DNA可以高频地将大肠杆菌MC1066转化为Ura⁺表型。其中的一个产朊假丝酵母URA3基因-pUC19重组质粒(pURA-5)的图谱见图1。该质粒被用于进一步的互补实验和序列分析。实施例6：产朊假丝酵母URA3基因的分界和序列分析

用几种限制性酶酶切质粒pURA5。将EcoR1酶切片段(1.9kb),HincⅡ酶切片段(1.3kb),SacⅠ酶切片段(1.1kb)亚克隆至pBluescript SK(+)，分别得到质粒pUREc-3,pURHinc-1,pURSac-4。质粒pURSac-4的片段不能与大肠杆菌的pyrF突变相互补(图2)。

用Sanger等人(1977，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.SciUSA)74:5463-5467)的方法可将含有产朊假丝酵母URA3基因的1.9kb的EcoRⅠ酶切片段(pUREc-3，图3)双链序列全部测定。

最后，应用M13mp/pUC系列的通用寡聚核苷酸和衍生自该序列的内在寡聚核苷酸。EcoRⅠ酶切片段的全部1179个碱基的序列见图4(SEQ.ID.NO.1、2)。此片段包含一个800碱基的开放读框(266个密码子)。产朊假丝酵母URA3基因编码一个理论分子量为29436道尔顿的蛋白质。ATG起始密码子旁侧的核苷酸序列(GAAAATG)与Cigan yDonehue.1987(基因(Gene)59:1-18)报道的酵母菌中的(A/YAA/YAATG)具有很好的一致性。3′-非翻译区包含一个推定的多聚腺苷酸位点(TATAAAA，共有序列AATAAAA)，该序列存在于大多数的真核生物基因3′末端(Guo,Z y Sherman,E.,1995.分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)15:5983-5990)。实施例7：酿酒酵母的互补分析

为了证明克隆片段与产朊假丝酵母URA3基因一致而不是一个有抑制子活性的DNA片段，将pURA5质粒的2.8kb的KpbⅠ/XbaⅠ片段克隆到pBR332衍生载体(pBSARTR-3)中。pBSARTR-3载体具有均来自酿酒酵母一个自主复制序列(ARS1)和一个TRP1基因选择性标记。因此，得到质粒pUT64(图5)并将其用于按照Ito.等人，1983(细菌学杂志(J.Bacteriol.)153:163-168)先前报道的醋酸锂方法转化酿酒酵母菌株SEY2202(ura3-52-,leu2-112,his3)。

转化后48小时得到转化子。用原位杂交和Southern印迹实验验证复制型质粒的存在。

所获得的转化频率(2-5×10²转化子/毫克)与文献报道的其他酵母菌的营养缺陷型标记的转化频率一致。因而，证明了产朊假丝酵母的URA3基因能与酿酒酵母的URA3突变互补。实施例8：用醋酸锂方法以质粒pURA5和pUCURA3转化产朊假丝酵母NRRL Y-1084CTU35

以已经从产朊假丝酵母分离出的URA3基因作为选择性标记，用Ito.等人,1983(细菌学杂志(J.Bacteriol.)153:163-168)报道的醋酸锂方法转化酿酒酵母CUT35的ura3突变株(保藏号待定)。设计将用于转化系统的载体(pURA5和pUCURA3)用同源重组的方法直接整合到产朊假丝酵母突变株的同源基因座上。通过将产朊假丝酵母URA3基因的1.8kb的EcoRⅠ片段克隆到pUC19载体的相应位点得到了质粒pUCURA3(图6)。在转化步骤之前，两种质粒均在位于结构基因5′末端的位点被XhoⅠ酶解。质粒的线性化有利于基因组位点的同源整合。

转化步骤依据Ito等人先前所述的用于酿酒酵母的方法进行，用碱性金属阳离子接触酵母。不同之处是对于醋酸锂转化步骤，所用醋酸锂浓度在此是50mM而不是100mM。

转化子的筛选在无尿嘧啶的YNB基础培养基上进行。由于是同源整合的机制，转化子的分裂稳定性很高。转化频率与报道的用整合型载体的酿酒酵母和其它非常规酵母菌的转化频率一致(表3)。实施例9：用电穿孔法以质粒pURA5和pUCURA3转化产朊假丝酵母CUT35

根据Kondo,K.等A,1995,(细菌学杂志(J.Bacteriol.)177:7171-7177)报道的电穿孔方法用已分离的产朊假丝酵母的URA3基因作为选择性标记转化产朊假丝酵母CUT35的ura3突变株。将用于转化系统的载体(pURA5和pUCURA3)设计用同源重组的方法直接整合到产朊假丝酵母突变株的同源基因座上。

所采用步骤是基于用电场处理完整的酵母菌细胞。应用如下条件：0.7kV(3.5kV/cm)的脉冲电压，800Ω的电阻和25μF的电容。

转化步骤之前，两种质粒均在位于结构基因5′端的位点被XhoⅠ酶解，以利于基因座的同源整合。

转化子的筛选在无尿嘧啶的YNB基础培养基上进行。

用pURA5和pUCURA3进行转化的频率均依赖于质粒的浓度。两种方法(醋酸锂法与电穿孔法)的比较见表3。

表3载体 DNA浓度(μg) 转化频率(转化率/μg)

LiAc 电穿孔pUCURA-3 0.1 - 70-90

0.5 - 640

3.0 22 -pURA-5 0.1 - 40-50

0.5 - 670

3.0 21 -

由于是同源整合的机制，转化子的分裂稳定性很高。转化频率与报道的用整合型质粒的酿酒酵母和其它非常规酵母菌的转化频率一致。

图7中列出了产朊假丝酵母基因组的可能的整合情况的略图和一些转化子的Southern印迹结果。实施例10：产朊假丝酵母HIS3基因的分离

从前面实施例4所述的文库中分离产朊假丝酵母的HIS3基因并进行表征。根据包含产朊假丝酵母HIS3基因的DNA片段能与大肠杆菌KC8的his463突变型(hsd,hisB463,leuB6,pyrF∷ Tn5 Km^r,trp(9830(lact YA),stm,galU,gal)互补的能力，可将它从产朊假丝酵母基因组文库中分离出来，其考虑到获自酿酒酵母的URA3基因与大肠杆菌的hisb463突变互补，使用大肠杆菌的恰巧的启动子活性。

为了分离HIS3基因，将10⁵的细胞涂布在补充了尿嘧啶、色氨酸、亮氨酸的基础培养基上。从能在这种培养基上生长的并因而能与大肠杆菌KC8突变菌株的hisb463突变互补的菌落中提取质粒DNA。用分离出的质粒DNA再转化大肠杆菌KC8突变株。所有能够补充突变菌株所需组氨酸的质粒被命名为pHCU。为了证实his⁺克隆包含产朊假丝酵母的HIS3基因并且不是具有抑制子活性的DNA片段，将两个获自His⁺转化子的质粒(pHCU37、pHCU40)进行PCR反应。应用来自于真菌和酵母菌的五个IGPDasas序列的两个高度保守区的两段简并性寡聚核苷酸。图8中列出了简并的寡聚核苷酸的序列和其编码的氨基酸序列。

扩增了与获自产朊假丝酵母的HIS3基因的编码序列相应的一个大约500bp的PCR条带。用Southern印迹可显示出这一大约500bp的PCR片段能与产朊假丝酵母基因组DNA杂交，将此片段克隆到T-载体(pMOSBLUE,Amershan)上，推导出的此序列翻译的氨基酸序列与其他酵母菌和真菌中的His3p高度一致。质粒pHCU37(图9)被用于产朊假丝酵母的HIS3基因的全序列测定。实施例11：产朊假丝酵母的HIS3基因的序列测定

用Sanger等人(1977)的方法对产朊假丝酵母的HIS3基因进行全部双链序列测定。应用通用的M13mp/pUC系列的寡聚核苷酸。获自PCR片段的引物被用于起始全基因的序列测定。测定了pHCU37的全部1190bp的序列。获自产朊假丝酵母的HIS3全序列见图10(SEQ.ID.NO.5,6)。

该片段包含了一个210个密码子的开放读框。产朊假丝酵母的HIS3基因编码一个理论分子量为24518道尔顿的蛋白质。实施例12：编码产朊假丝酵母的转化酶的INV1基因的分离

为了分离编码产朊假丝酵母中转化酶的INV1基因，利用此酶在不同物种之间高度保守的本区域的有利事实，与来自酵母的呋喃果糖苷酶的序列加以比较。根据产朊假丝酵母中所用的密码子设计用于该PCR中的两个简并的寡核苷酸。图11显示了多肽序列以及简并性寡核苷酸。

将PCR产生的417bp条带亚克隆至T-载体(pMOBLue，Amersham)。将该条带完全测序，该DNA片段的翻译证实存在共有区域以及文献中报道的转化酶高度同源区。这证明所分离的片段属于INV1基因，其编码产朊酵母中的此酶。用此片段作为探针从产朊假丝酵母分离INV1基因。

在检索产朊假丝酵母文库之后，分离到6个具有INV1基因的克隆。根据大小选择其中的两个用于测序(pCI-6和pCI-12)，利用前述PCR步骤的寡核苷酸。这些寡核苷酸用于从属于质粒pCI-6的两条链开始完整的序列。实施例13：产朊假丝酵母INV1基因的测序

用Sanger等(1977)的方法将含有编码产朊假丝酵母的INV1基因的克隆pCI-6的全部2607bp进行测序，采用属于M13mp/pUC系列的通用寡核苷酸及衍生自该序列的内部寡核苷酸。全部2607bp序列示于图12(SEQ.ID.NO.5,6)。该片段含有1602bp(534密码子)的开放读框。产朊假丝酵母的INV1基因编码理论分子量60703Da的蛋白质。

鉴于产朊假丝酵母中的转化酶是一种周质酶，其N-端应有一个信号肽。分析至该基因序列的5’端，发现两个ATG密码子(ATG₁和ATG₂，图12)，其产生编码仅与其N端不同的蛋白质之开放读框的空间。利用vonHeiine氏规则(1986，核酸研究，14:4683-4690)以推测从两个ATG产生的成熟蛋白质的肽酶信号之限制性位点，发现两种情况的限制性位点分别位于残基S39和S40之间(对于ATG₁)和残基S26和S27之间(对于ATG₂)。这产生长度分别为39和26个氨基酸的信号肽。考虑到酵母中所用信号肽的平均大小(估计约20个残基)，可以推断INV1基因的起始密码子为第二个ATG。

根据N-X-T/S通用规则，在成熟蛋白质序列位置40、88、141、187、245、277、344、348、365、373、379和399的天冬氨酸是11个可能的N-糖基化位点。

5’-非翻译区显示两个可能的TATA盒(共有序列TATAA)，位于-81至-14区域和-212至-208区域，也发现多个可能的抑制子Mig1单位(共有序列SYGGRG)的位点。

附图简述

图1．通过大肠杆菌MC1066 pyrF酿酒酵母SEY 2202 ura3突变互补，从产朊假丝酵母基因组文库中得到的质粒pURA5。

图2．产朊假丝酵母URA3基因的限制性酶切图谱、测序策略和互补分析。

图3．质粒pURA5的1.9kb的EcoRⅠ片段克隆到pBLUESCRIPTSK(+)得到的质粒pUREC3。

图4．由URA3基因的DNA序列推导出的氨基酸序列和编码此序列的DNA的DNA序列。

图5．由酿酒酵母ura3突变株的互补实验得到的质粒pUT64。

图6．用于产朊假丝酵母转化实验的质粒pUCURA3。

图7.(A)通过同源重组整合到URA3基因座的载体DNA的预计的排列。

(B)一些转化子的基因组DNA的DNA印迹杂交。

图8．用于分离HIS3基因的引物之DNA序列以及推导出的其编码氨基酸序列。

图9．通过大肠杆菌KC8 his463突变的互补实验从产朊假丝酵母基因组文库中得到的质粒pHCU37。

图10．由HIS3基因的DNA序列推导出的氨基酸序列和编码此序列的DNA序列。

图11．用于分离产朊假丝酵母INVI基因的PCR中的寡核苷酸之氨基酸序列和相应的DNA序列。

图12．相应于含有产朊假丝酵母INVI基因的片段之DNA序列。

序列表(1)一般信息

(ⅰ)申请人：

(A)姓名：CENTRO DE INGENIERIA GENETICA YBIOTECNOLOGIA

(B)街道：AVE.31 ENTRE 18 Y 190,CUBANACAN,PLAYA

(C)城市：CIYDAD DE LA HABANA

(E)国家：古巴

(F)邮政编码(ZIP):12100

(G)电话：537216013

(H)传真：537336008

(ⅱ)发明名称：用于产朊假丝酵母转化的材料和方法

(ⅲ)序列数目：6

(ⅳ)计算机可读信息：

(A)介质类型：软盘

(B)计算机：IBM PC兼容机

(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

(D)软件：PatentIn Release#1.0,Version#1.30(EPO)

(ⅵ)在先申请数据：

(A)申请号：82/96

(B)递交日：1996年10月3日(2)SEQ ID NO:1的信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：1179个碱基对

(B)类型：核酸

(C)线性：单链

(D)拓扑类型：线性

(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)

(ⅲ)假设：非

(ⅳ)反义：非

(ⅵ)初始来源：

(A)生物：产朊假丝酵母

(B)菌株：NRRL Y-1084

(ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：mat-peptide

(B)位置：1..1179

(D)其它信息：/产物=“酶乳清酸核苷-5-磷酸脱羧酶”

/基因=“URA3”(ⅹⅰ) SEQ ID NO:1的序列描述：CAAATAGCTC TCTACTTGCT TCTGCTCAAC AAGCTGCTGG AACTGCTGCT GCTCTTTTGG 60GTTCAATTGG TCCATCCTTG CTACTTTTCC GCCTAGTTTC GATTCCGATT CTGATAGAGA 120AGCCCAGCTA TGAATGGAAG AAATTTTTCA CTTTTGTATG TCCTTTTTTT CACGCTTCGT 180TGCTTCGGAC AAAAAAATAG TGGAGGCACT CGGTGGAGGG AAGCTATCCT CGAGATGAAA 240AATTTCAAGC TCATCTCATC GTCCAAGTGG GACAGCAAGC TGAGGCTTCT GAAGAGGTTG 300AGGAAAATGG TCACCACGTT ATCGTACACA GAGAGGGCAT CGCACCCTTC GCCACTTGCT 360AAGCGTCTGT TTTCGCTTAT GGAGTCCAAG AAGACGAACC TGTGTGCCAG TGTCGATGTT 420CGTACCACAG AGGAGTTGCT CAAGCTCGTT GATACGCTTG GTCCTTATAT CTGTCTGTTG 480AAGACGCATA TTGATATCAT TGATGACTTC TCTATGGAGT CTACTGTGGC TCCACTGTTG 540GAGCTTTCAA AAGAGCACAA TTTCCTCATC TTTGAGGACC GTAAGTTTGC TGATATCGGC 600AACACCGTCA AGGCACAGTA CGCCGGTGGT GCGTTCAAGA TTGCACAATG GGCAGACATC 660ACCAACGCCC ACGGTGTCAC CGGTCGAGGT ATCGTCAAGG GGTTGAAGGA GGCTGCACAG 720GAAACCACGG ATGAGCCAAG AGGGCTGTTG ATGCTTGCTG AGCTAAGCTC CAAGGGCTCC 780TTCGCTCACG GGACATATAC CGAGGAGACC GTGGAGATTG CCAAAACTGA TAAGGACTTT 840TGTATTGGAT TCATCGCACA GAGAGACATG GGTGGCAGAG AAGATGGGTT CGACTGGATC 900ATCATGACAC CAGGCGTGGG ACTCGACGAT AAGGGCGACT CCCTGGGCCA ACAGTACAGA 960ACTGTCGATG AGGTTGTCAG TGGTGGCTGT GACATCATCA TCGTTGGTAG AGGCTTGTTT 1020GGAAAGGGAA GAGATCCAAC AGTGGAAGGT GAGCGTTATA GAAAAGCAGG CTGGGATGCT 1080TATCTCAAGA GATACTCAGC TCAATAAACG TTGAGCTCTG GCTTGTATAG GTTCACTTGT 1140ATAAAATGTT CATTACTGTT TTCGGAAGTT GTAGATTGC 1179(2)SEQ ID NO:2的信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：266个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑类型：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白质

(ⅲ)假设：非

(ⅳ)反义：非

(ⅵ)初始来源：

(A)生物：产朊假丝酵母

(B)菌株：NRRL Y-1084

(ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：蛋白质

(B)位置：1..266

(ⅹⅰ)SEQ ID NO:2的序列描述：Met Val Thr Thr Leu Ser Tyr Thr Glu Arg Ala Ser His Pro Ser Pro1 5 10 15Leu Ala Lys Arg Leu Phe Ser Leu Met Glu Ser Lys Lys Thr Asn Leu

20 25 30Cys Ala Ser Val Asp Val Arg Thr Thr Glu Glu Leu Leu Lys Leu Val

35 40 45Asp Thr Leu Gly Pro Tyr Ile Cys Leu Leu Lys Thr His Ile Asp Ile

50 55 60Ile Asp Asp Phe Ser Met Glu Ser Thr Val Ala Pro Leu Leu Glu Leu65 70 75 80Ser Lys Glu His Asn Phe Leu Ile Phe Glu Asp Arg Lys Phe Ala Asp

85 90 95Ile Gly Asn Thr Val Lys Ala Gln Tyr Ala Gly Gly Ala Phe Lys Ile

100 105 110Ala Gln Trp Ala Asp Ile Thr Asn Ala His Gly Val Thr Gly Arg Gly

115 120 125Ile Val Lys Gly Leu Lys Glu Ala Ala Gln Glu Thr Thr Asp Glu Pro

130 135 140Arg Gly Leu Leu Met Leu Ala Glu Leu Ser Ser Lys Gly Ser Phe Ala145 150 155 160His Gly Thr Tyr Thr Glu Glu Thr Val Glu Ile Ala Lys Thr Asp Lys

165 170 175Asp Phe Cys Ile Gly Phe Ile Ala Gln Arg Asp Met Gly Gly Arg Glu

180 185 190Asp Gly Phe Asp Trp Ile Ile Met Thr Pro Gly Val Gly Leu Asp Asp

195 200 205Lys Gly Asp Ser Leu Gly Gln Gln Tyr Arg Thr Val Asp Glu Val Val

210 215 220Ser Gly Gly Cys Asp Ile Ile Ile Val Gly Arg Gly Leu Phe Gly Lys225 230 235 240Gly Arg Asp Pro Thr Val Glu Gly Glu Arg Tyr Arg Lys Ala Gly Trp

245 250 255Asp Ala Tyr Leu Lys Arg Tyr Ser Ala Gln

260 265(2)SEQ ID NO:3的信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：1190个碱基对

(B)类型：核酸

(C)线性：单链

(D)拓扑类型：线性

(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)

(ⅲ)假设：非

(ⅳ)反义：非

(ⅵ)初始来源：

(A)生物：产朊假丝酵母

(B)菌株：NRRL Y-1084

(ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：mat-peptide

(B)位置：1..1190

(D)其它信息：/产物=“酶咪唑甘油磷酸脱水酶”

/基因=“HIS3”

(ⅹⅰ)SEQ ID NO:3的序列描述：ACCTCCCAAT CGCACAGGCA ACGATACAAA TTCAACGAGT ATTAACCATC TTGTGTGCTA 60AAAAGAGTCG AAGAACAACA GTGCGCCAAA AAAAAAACTC CGGACCGCAC ACGACTCATC 120GCTCTCGGAA TATCCCTCGG AATGCGCCAC TTCCGGGTGC GTGGCCATCG GAAGAGCGAA 180GAGTCATCAC CATCGTACTT TAACGACTTA CTATTCTCAT TGAGTATTGA GAAGAAGGAT 240AGAGAAATGG CTGAACGAAC GGTGAAACCC CAGAGAAGAG CTCTTGTGAA TCGTACAACA 300AACGAAACGA AGATCCAGAT TTCCTTGAGT TTGGATGGTG GATACGTAAC GGTTCCGGAG 360TCAATCTTCA AGGATAAGAA GTACGACGAT GCTACTCAAG TCACCTCTTC TCAGGTGATT 420TCAATCAACA CGGGCGTTGG ATTCCTGGAC CACATGATCC ATGCTCTTGC GAAGCATGGT 480GGGTGGAGTT TGATTGTGGA GTGTATTGGT GATTTGCACA TTGACGACCA CCACACCACC 540GAGGACGTTG GTATTGCGCT GGGAGACGCC GTCAAGGAGG CCTTGGCATA TAGAGGTGTC 600AAGAGATTTG GTAGCGGGTT TGCTCCATTG GACGAGGCTC TGAGCAGAGC CGTTGTTGAT 660CTGAGTAACC GTCCGTTTGC CGTTGTTGAG CTGGGACTCA AGAGGGAAAA GATCGGTGAC 720TTGTCATGTG AGATGATTCC TCACTTCTTG GAGAGTTTTG CCCAAGCAGC TCATATCACG 780ATGCATGTTG ACTGTTTGAG AGGCTTCAAC GACCATCACA GAGCTGAATC CGCATTCAAG 840GCCCTGGCAG TCGCCATTAA GGAATCCATC TCCAGTAACG GCACCAATGA TGTTCCCTCA 900ACAAAGGGTG TTTTGTTCTA GATAGCAGTC TTTCTGTCTC TCTATTTATT CGATAAATAA 960GAACTATGTA TATCTTTCTC TTTTAATTGT ATATGTACAT GCACAGCTGA CTTCATCAAC 1020GGAAGATGTT ATTGAGTGCA GCCATTGTCT GACTGTCGTT ATCCTTCTTT GCGGATTTAC 1080CAAGGACTCT ACGACCACTG GTGGCTTTGA TATGATTTCC TGCCAGTACT TGTAAGAGGT 1140GCAACGTCAA TGGAAACGGC ACCGTTAGCC TTGATGGTTG CACGGGTAGG 1190(2)SEQ ID NO:4的信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：210个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑类型：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白质

(ⅲ)假设：非

(ⅳ)反义：非

(ⅵ)初始来源：

(A)生物：产朊假丝酵母

(B)菌株：NRRL Y-1084

(ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：蛋白质

(B)位置：1..210(ⅹⅰ)SEQ ID NO:4的序列描述：Met Ala Glu Arg Thr Val Lys Pro Gln Arg Arg Ala Leu Val Asn Arg1 5 10 15Thr Thr Asn Glu Thr Lys Ile Gln Ile Ser Leu Ser Leu Asp Gly Gly

20 25 30Tyr Val Thr Val Pro Glu Ser Ile Phe Lys Asp Lys Lys Tyr Asp Asp

35 40 45Ala Thr Gln Val Thr Ser Ser Gln Val Ile Ser Ile Asn Thr Gly Val

50 55 60Gly Phe Leu Asp His Met Ile His Ala Leu Ala Lys His Gly Gly Trp65 70 75 80Ser Leu Ile Val Glu Cys Ile Gly Asp Leu His Ile Asp Asp His His

85 90 95Thr Thr Glu Asp Val Gly Ile Ala Leu Gly Asp Ala Val Lys Glu Ala

100 105 110Leu Ala Tyr Arg Giy Val Lys Arg Phe Gly Ser Gly Phe Ala Pro Leu

115 120 125Asp Glu Ala Leu Ser Arg Ala Val Val Asp Leu Ser Asn Arg Pro Phe

130 135 140Ala Val Val Glu Leu Gly Leu Lys Arg Glu Lys Ile Gly Asp Leu Ser145 150 155 160Cys Glu Met Ile Pro His Phe Leu Glu Ser Phe Ala Gln Ala Ala His

165 170 175Ile Thr Met His Val Asp Cys Leu Arg Gly Phe Asn Asp His His Arg

180 185 190Ala Glu Ser Ala Phe Lys Ala Leu Ala Val Ala Ile Lys Glu Ser Ile

195 200 205Ser Ser

210(2)SEQ ID NO:5的信言息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：2607个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑类型：线性

(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)

(ⅲ)假设：非

(ⅳ)反义：非

(ⅵ)初始来源：

(A)生物：产朊假丝酵母

(B)菌株：NRRL Y-1084

(ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：mat-peptide

(B)位置：1..2607

(D)其它信息：/产物=“酶转化酶(β-果糖呋喃糖苷酶)

/基因=“INV1”

(ⅹⅰ)SEQ ID NO:5的序列描述：ATCGGCACAG AAGCGACACT GATGTCCTCC GTCTAAAACT CATCGTTTAA TAACTTCTGC 60ATTGGCAGCT CCGGAGCACA CTCAATTGGG ACTAAAAGAA GTAACATTTG TACTACAATG 120AGTCGTATAG AGTCATGTAT AAGAAGAACA GCAAGAAAAG AAAATATTGG TGCAGAATTC 180AACAGCTTCT GAGATCGTAA GAACAGCCAA TCATTTACCG GAATTCATTA TGATACCTAT 240AGAAAGACAC AAATTGTTGG GTAAAACAAC AGAACATACC TGTATAGGGG TTTATACGAG 300AATTTTCTTA GACGTCTCCC CCAGTGTCCG CCAAAGCAAC TTACATGTGG AGTTTGAATT 360TGGATGCGCC TTTTCCTTTA AACGGTCACC TGAGGTCTGA ATCTCAATGC AAATATCATT 420ACACCAATAA TAAAGGTGCA TATAACCCCA TAACCTGTAC ATAAAGAACG GCACATGATC 480CAATTTATCG ACGTTATGCC TTGTCAGACC ATCGTCGTGA ACTTTTCTAA ACCGGATAAA 540CTCTCGCACG GATTATAACG TGCGTCTGTG ATATGCACTC CGGAAAAAAC CCCCGTGGAG 600AAGTGAAGCG GCCACCTGTG GAGCAGAAAT TTCGATCGAC GTTTCAAGTT CAAATGGTTT 660CCTGTTGTCA AAGGGCTTGA GATTTACCAC TTGAGCATTT GTGCTCAGAA TTCGGAGAGC 720ATTCCCATGA GTGGTGTCCA AAAACACTAT AAAAGCAGCA CAGGGATGTC GTTGACAAAA 780GATGCCTCAG AGGACCAAGA AGACATCAAG AGTCTCACGA TGAACACTAG TTTAGTTGAT 840TCCAGCATTT ACAGACCATT AGTCCATCTA ACGCCACCAG TGGGGTGGAT GAACGACCCT 900AATGGTCTCT TCTACGATTC ATCTGAATCT ACTTACCATG TGTACTACCA ATACAACCCA 960AACGATACGA TTTGGGGATT GCCTCTATAT TGGGGACATG CCACCTCTGA TGATTTGTTA 1020ACGTGGGACC ACCATGCGCC TGCAATTGGA CCTGAGAATG ATGATGAGGG TATTTACTCT 1080GGATCTATAG TCATAGACTA CGATAATACC TCAGGGTTCT TTGACGATTC AACAAGACCA 1140GAACAGAGAA TCGTTGCCAT TTATACCAAT AACTTACCAG ATGTCGAGAC GCAAGACATT 1200GCCTATTCCA CGGACGGTGG TTATACTTTC GAAAAGTATG AAAACAACCC AGTTATAGAC 1260GTCAATTCGA CCCAATTTAG GGATCCGAAG GTGATTTGGT ATGAGGAAAC TGAACAATGG 1320GTCATGACTG TGGCAAAGAG TCAAGAGTAC AAGATCCAGA TTTACACCTC TGACAATTTG 1380AAAGACTGGA GTTTGGCCTC GAATTTCTCA ACCAAGGGTT ATGTTGGTTA TCAGTATGAA 1440TGTCCAGGTC TATTCGAAGC CACTATTGAA AACCCAAAGA GTGGTGACCC AGAGAAGAAA 1500TGGGTTATGG TCTTAGCAAT CAATCCAGGC TCACCTCTTG GTGGTTCCAT AAATGAATAC 1560TTTGTTGGTG ATTTCAACGG TACTGAATTC ATTCCAGATG ATGACGCTAC AAGATTTATG 1620GATACTGGTA AGGACTTCTA TGCCTTCCAA GCGTTCTTCA ATGCACCGGA GAATCGGTCA 1680ATTGGAGTTG CCTGGTCATC GAACTGGCAG TATTCCAACC AGGTTCCGGA TCCTGATGGA 1740TATAGAAGCT CCATGTCATC AATCAGAGAG TACACTCTGA GATATGTCAG TACGAATCCA 1800GAATCTGAAC AGTTGATCCT TTGTCAAAAA CCATTCTTTG TGAACGAGAC AGACTTGAAG 1860GTGGTTGAAG AGTACAAGGT TTCAAACAGT TCTTTGACCG TGGACCACAC GTTTGGAAGT 1920AGCTTTGCAA ACTCCAACAC CACTGGACTG TTGGATTTCA ACATGACTTT CACGGTTAAC 1980GGTACAACTG ACGTTACGCA GAAGGACTCC GTCACCTTTG AGCTCAGAAT CAAATCTAAC 2040CAAAGCGACG AGGCAATTGC GCTTGGTTAC GATTACAACA ACGAGCAATT CTACATCAAC 2100AGAGCCACAG AGAGCTACTT CCAGAGAACC AACCAGTTCT TCCAGGAGAG ATGGTCCACG 2160TACGTTCAGC CTCTCACAAT CACCGAATCT GGTGATAAAC AGTACCAGCT CTACGGATTG 2220GTTGATAACA ACATCCTTGA GTTGTACTTC AACGACGGGG CATTCACATC CACAAACACC 2280TTCTTCTTGG AGAAGGGCAA GCCATCAAAC GTCGATATCG TGGCAAGCTC CTCCAAGGAG 2340GCTTACCACC GTGGACCAGC TGACTGAGAC GTCTCACTGT TTGACGAATA CGCACGTGAA 2400AGCTATATAA GGGATCACGT GGTCTAGCCA CCCCAGTCTA AAAGCTTCAG CAAACCGCCA 2460CTATATAAAC AGACAGGTTT GTCACTTTTC AACAAAACAA ATATCTTCTT CTTTTACCCT 2520TCAGAGTAGT TTGTACGAGT GCTTTTTTCA ATTATATATA CAACAACGTG AGCTGCCTTT 2580GGATATGCAA TCAACAGCGC TCTCTTT 2607(2)SEQ ID NO:6的信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：533个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑类型：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白质

(ⅲ)假设：非

(ⅳ)反义：非

(ⅵ)初始来源：

(A)生物：产朊假丝酵母

(B)菌株：NRRL Y-1084

(ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：蛋白质

(B)位置：1..533

(ⅹⅰ)SEQ ID NO:6的序列描述：Met Ser Leu Thr Lys Asp Ala Ser Glu Asp Gln Glu Asp Ile Lys Ser1 5 10 15Leu Thr Met Asn Thr Ser Leu Val Asp Ser Ser Ile Tyr Arg Pro Leu

20 25 30Val His Leu Thr Pro Pro Val Gly Trp Met Asn Asp Pro Asn Gly Leu

35 40 45Phe Tyr Asp Ser Ser Glu Ser Thr Tyr His Val Tyr Tyr Gln Tyr Asn

50 55 60Pro Asn Asp Thr Ile Trp Gly Leu Pro Leu Tyr Trp Gly His Ala Thr65 70 75 80Ser Asp Asp Leu Leu Thr Trp Asp His His Ala Pro Ala Ile Gly Pro

85 90 95Glu Asn Asp Asp Glu Gly Ile Tyr Ser Gly Ser Ile Val Ile Asp Tyr

100 105 110Asp Asn Thr Ser Gly Phe Phe Asp Asp Ser Thr Arg Pro Glu Gln Arg

115 120 125Ile Val Ala Ile Tyr Thr Asn Asn Leu Pro Asp Val Glu Thr Gln Asp

130 135 140Ile Ala Tyr Ser Thr Asp Gly Gly Tyr Thr Phe Glu Lys Tyr Glu Asn145 150 155 160Asn Pro Val Ile Asp Val Asn Ser Thr Gln Phe Arg Asp Pro Lys Val

165 170 175Ile Trp Tyr Glu Glu Thr Glu Gln Trp Val Met Thr Val Ala Lys Ser

180 185 190Gln Glu Tyr Lys Ile Gln Ile Tyr Thr Ser Asp Asn Leu Lys Asp Trp

195 200 205Ser Leu Ala Ser Asn Phe Ser Thr Lys Gly Tyr Val Gly Tyr Gln Tyr

210 215 220Glu Cys Pro Gly Leu Phe Glu Ala Thr Ile Glu Asn Pro Lys Ser Gly225 230 235 240Asp Pro Glu Lys Lys Trp Val Met Val Leu Ala Ile Asn Pro Gly Ser

245 250 255Pro Leu Gly Gly Ser Ile Asn Glu Tyr Phe Val Gly Asp Phe Asn Gly

260 265 270Thr Glu Phe Ile Pro Asp Asp Asp Ala Thr Arg Phe Met Asp Thr Gly

275 280 285Lys Asp Phe Tyr Ala Phe Gln Ala Phe Phe Asn Ala Pro Glu Asn Arg

290 295 300Ser Ile Gly Val Ala Trp Ser Ser Asn Trp Gln Tyr Ser Asn Gln Val305 310 315 320Pro Asp Pro Asp Gly Tyr Arg Ser Ser Met Ser Ser Ile Arg Glu Tyr

325 330 335Thr Leu Arg Tyr Val Ser Thr Asn Pro Glu Ser Glu Gln Leu Ile Leu

340 345 350Cys Gln Lys Pro Phe Phe Val Asn Glu Thr Asp Leu Lys Val Val Glu

355 360 365Glu Tyr Lys Val Ser Asn Ser Ser Leu Thr Val Asp His Thr Phe Gly

370 375 380Ser Ser Phe Ala Asn Ser Asn Thr Thr Gly Leu Leu Asp Phe Asn Met385 390 395 400Thr Phe Thr Val Asn Gly Thr Thr Asp Val Thr Gln Lys Asp Ser Val

405 410 415Thr Phe Glu Leu Arg Ile Lys Ser Asn Gln Ser Asp Glu Ala Ile Ala

420 425 430Leu Gly Tyr Asp Tyr Asn Asn Glu Gln Phe Tyr Ile Asn Arg Ala Thr

435 440 445Glu Ser Tyr Phe Gln Arg Thr Asn Gln Phe Phe Gln Glu Arg Trp Ser

450 455 460Thr Tyr Val Gln Pro Leu Thr Ile Thr Glu Ser Gly Asp Lys Gln Tyr465 470 475 480Gln Leu Tyr Gly Leu Val Asp Asn Asn Ile Leu Glu Leu Tyr Phe Asn

485 490 495Asp Gly Ala Phe Thr Ser Thr Asn Thr Phe Phe Leu Glu Lys Gly Lys

500 505 510Pro Ser Asn Val Asp Ile Val Ala Ser Ser Ser Lys Glu Ala Tyr His

515 520 525Arg Gly Pro Ala Asp

530

Claims

1．一种用于产朊假丝酵母的转化系统，其中所用的宿主酵母细胞能被重组DNA转化，并且该宿主细胞至少有一种生物合成途径的缺陷。

2．一种权利要求1的用于产朊假丝酵母的转化系统，其中宿主酵母细胞至少在一种氨基酸的生物合成途径中有缺陷。

3．一种权利要求2的用于产朊假丝酵母的转化系统，其中所述宿主酵母细胞在尿嘧啶生物合成途径中有缺陷。

4．一种权利要求3的转化系统，其中所述宿主酵母细胞的乳清酸核苷5′-磷酸脱羧酶的酶活性有缺陷。

5．一种权利要求4的转化系统，其中所述宿主酵母细胞是产朊假丝酵母NRRL Y-1084CUT35(保藏号待定)。

6．一种权利要求2的用于产朊假丝酵母的转化系统，其中所用的宿主酵母细胞至少在组氨酸生物合成途径中有缺陷。

7．一种权利要求6的转化系统，其中该宿主酵母细胞的咪唑甘油磷酸脱水酶的酶活性有缺陷。

8．一种权利要求7的转化系统，其中所述宿主酵母细胞是产朊假丝酵母Y-1084TMN3。

9．一种权利要求1的转化系统，其中的重组DNA包含一种能互补宿主的生物合成途径缺陷的功能基因。

10．一种权利要求9的转化系统，其中所述功能基因是产朊假丝酵母的URA3基因。

11．一种权利要求10的转化系统，其中所述重组DNA是质粒pURA5和pUCURA3。

12．一种权利要求9的转化系统，其中所述功能基因是产朊假丝酵母的HIS3基因。

13．一种权利要求12的转化系统，其中的重组DNA是质粒pHCU37和pHCU40。

14．一种能用重组DNA转化的产朊假丝酵母宿主细胞，其中所述宿主至少有一种生物合成途径的缺陷。

15．一种权利要求14的酵母宿主细胞，其中所述宿主细胞至少有一种氨基酸生物合成途径的缺陷。

16．一种权利要求15的酵母宿主细胞，其中所述宿主细胞至少在尿嘧啶生物合成途径有缺陷。

17．一种权利要求16的酵母宿主细胞，其中所述宿主细胞的乳清酸核苷5′-磷酸脱羧酶的酶活性有缺陷。

18．一种权利要求17的酵母宿主细胞，其中所述宿主细胞是产朊假丝酵母NRRL Y-1084CUT35(保藏号待定)。

19．一种权利要求15的酵母宿主细胞，其中所述宿主细胞在组氨酸生物合成途径有缺陷。

20．一种权利要求19的酵母宿主细胞，其中所述宿主细胞的咪唑甘油磷酸脱水酶的酶活性有缺陷。

21．一种权利要求20的酵母宿主细胞，其中它是产朊假丝酵母(NRRL Y-1084)菌株TMN3。

22．一种能转化产朊假丝酵母的酵母宿主细胞的重组DNA材料，其中所述重组DNA材料包含一种能互补宿主的生物合成途径缺陷的功能基因。

23．一种权利要求22的重组DNA材料，其中的功能基因是产朊假丝酵母的URA3基因。

24．一种权利要求23的重组DNA材料，其中重组DNA材料是质粒pURA5以及pUCURA3。

25．一种权利要求22的重组DNA材料，其中的功能基因是产朊假丝酵母的HIS3基因。

26．一种权利要求25的重组DNA材料，其中的重组DNA材料是质粒pHCU37和pHCU40。

27．一种用于产朊假丝酵母转化的方法，其包括：

(a)用碱金属盐处理产朊假丝酵母宿主菌株；

(b)在适于转化的条件下用重组DNA材料接触步骤(a)的细胞产物；

(c)在合适的条件下进行酵母菌宿主菌株的电穿孔；

(d)在选择性的条件下将步骤(c)中的细胞产物接种于培养基。

28．如权利要求27的方法，其中步骤(a)中所用的碱金属盐是浓度为50mM的醋酸锂。

29．如权利要求27的方法，其中，适于步骤(b)的转化的条件包括：

-用70％聚乙二醇(PEG)与经醋酸锂和重组DNA处理过的等体积细胞悬液混合；

-在30℃温育60分钟；

-将混合物在42℃处理5分钟进行热休克刺激；

-冰上冷却5分钟。

30．如权利要求27的方法，其中适于步骤(c)的酵母宿主菌株的电穿孔条件为：

-电场3.5kV/cm；

-电阻800Ω，且

-电容25μF。

31．如权利要求27的用于产朊假丝酵母转化的方法，其中它利用了能由重组DNA材料转化的酵母宿主细胞，所述宿主在至少一种生物合成途径中有缺陷。

32．如权利要求31的方法，其中它利用了在至少一种氨基酸生物合成途径中有缺陷的酵母宿主细胞。

33．如权利要求32的方法，其中它利用了在尿嘧啶生物合成途径中有缺陷的酵母宿主细胞。

34．如权利要求33的方法，其中所述酵母宿主细胞在乳清酸核苷-5-磷酸脱羧酶活性中有缺陷。

35．如权利要求34的方法，其中所述宿主酵母细胞是产朊假丝酵母NRRL Y-1084CUT35(保藏号待定)。

36．如权利要求32的方法，其中它利用了至少在组氨酸生物合成途径中有缺陷的酵母宿主细胞。

37．如权利要求36的方法，其中所述酵母宿主细胞在咪唑甘油磷酸脱水酶活性中有缺陷。

38．如权利要求37的方法，其中所述宿主酵母细胞是产朊假丝酵母NRRL Y-1084 TMN3。

39．如权利要求31的方法，其中所述重组DNA材料包含一种能互补宿主的生物合成途径缺陷的功能基因。

40．如权利要求39的方法，其中所述功能基因是产朊假丝酵母的URA3基因。

41．如权利要求40的方法，其中所述重组DNA材料是质粒pURA5以及质粒pUCURA3。

42．如权利要求39的方法，其中的功能基因是产朊假丝酵母的HIS3基因。

43．如权利要求42的方法，其中所述重组DNA材料是质粒pHCU37和质粒pHCU40。

44．一种编码产朊假丝酵母URA3基因的DNA序列(Seq.Id.No.1)。

45．一种编码产朊假丝酵母HIS3基因的DNA序列(Seq.Id.No.3)。

46．一种编码产朊假丝酵母INV1基因的DNA序列(Seq.Id.No.5)。