CN1223663A

CN1223663A - 转录因子

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Publication number: CN1223663A
Application number: CN97196014A
Authority: CN
Inventors: T·克里斯坦森
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 1996-07-05
Filing date: 1997-07-07
Publication date: 1999-07-21
Anticipated expiration: 2017-07-07
Also published as: WO1998001470A1; ATE373493T1; CN100432099C; JP4198753B2; DE69738158T2; EP0909273A1; DE69734449D1; EP1616580B1; US20030148500A1; EP1616580A3; US6555657B2; DK1616580T3; ES2294644T3; AU3336597A; US6316220B1; US8710205B2; DK0909273T3; US20020151073A1; DE69738158D1; JP2000514292A

Abstract

调节α淀粉酶启动子启动的在丝状真菌,特别是曲霉属中的表达的转录因子,编码所说的因子的DNA序列,其向真菌宿主生物体中的转化及在其中的表达,以及所说的因子在这样的宿主中增加由所说的宿主产生的感兴趣多肽的表达的应用。

Description

转录因子

发明的领域

本发明涉及见于丝状真菌特别是曲霉属真菌中的转录因子，编码所说的因子的DNA序列，其向真菌宿主生物体中的转化和在其中的表达，以及所说的因子在这类宿主中为增加由所说的宿主产生的有用多肽的表达中的应用。

发明的背景

转录因子是已知参予转录起始的蛋白质。已在许多不同的生物中对其进行了广泛研究，并也已描述了真菌中的转录因子。Dhawale和Lane(NAR(1993)21,5537-5546)最近整理了有包括丝状真菌在内的真菌中的转录因子的资料。

转录因子中有许多都是调节蛋白质，它们与启动子DNA结合并且作为刺激细胞的反应，激活或抑制转录过程。

在对可利用的碳源的反应中，α淀粉酶基因在米曲霉中的表达受到调节。当生物体在淀粉或麦芽糖基质上生长时，基因得以最大水平地表达(Lachmund等人(1993)当代微生物学26,47-51；Tada等人，(1991)Mol.Gen.Genet.229,301-306)。如Lachmund等人(引文同上)所显示，α淀粉酶基因的表达在转录水平上受到调节，这一结果强有力地提示转录因子参予调节作用，但迄今尚未鉴定出这种因子的基因。

已通过缺失分析研究了α淀粉酶基因的启动子(Tada等人，(1991)农业生物化学，55,1939-1941；Tsuchiya等人(1992)生物科学生物技术·生物化学，56,1849-1853；Nagata等人(1993)Mol.Gen.Genet.237,251-260)。这些文章的作者提出，启动子的特异性序列是麦芽糖诱导作用的主要原因。Nagata等人(引文同上)使用该序列作为凝胶移位实验中的探针，观察构巢曲霉(A.nidulans)核提取物中的任何蛋白质是否能够与启动子序列结合。发现了三种这样的蛋白质，但未能证明这些蛋白质参予表达。没有用其他手段纯化或鉴定出这些蛋白质。对它们的基因同样也是不清楚的。

发明的概要

本发明涉及调节α淀粉酶启动子在丝状真菌中表达的转录因子。

因此，本发明的第一个方面涉及含有编码本发明转录因子的DNA序列的DNA构建物，其DNA序列包括a)克隆到存在于大肠杆菌ToC1058,DMS10666中的质粒pToC320内的DNA序列的转录因子编码部分；或b)a)中限定的DNA序列的类似物，该类似物

ⅰ)与a)中限定的DNA序列至少有60％同源性，或者

ⅱ)与a)中限定的DNA序列的同样核苷酸探针杂交，或者

ⅲ)编码与由含有a)中限定的DNA序列的DNA序列编码的转录因子至少有50％同源性的转录因子，或者

ⅳ)编码与抗a)中限定的DNA序列编码的纯化的转录因子的抗体有免疫学反应性的转录因子，或者

ⅴ)弥补ToC879中的突变，即能够使ToC879在环糊精基质上生长，并且当用所说的DNA序列转化时产生脂酶。

已从丝状真菌米曲霉(Aspergillus oryzae)的菌株中得到了编码转录因子的全长度基因组DNA序列，并已克隆到存在于大肠杆菌ToC1058,DSM10666中的质粒pToC320中。

据信包含于pToC320,DSM10666中的所说的转录因子编码DNA序列具有如SEQ ID No:1和SEQ ID No:2中给出的同样序列。因此，每当提到克隆到DSM10666中的质粒pToC320内的DNA序列的转录因子编码部分时，也都是指SEQ ID No:1和SEQ ID No:2中给出的DNA序列的转录因子编码部分。

因此，术语“克隆到存在于DSM10666中的质粒pToC320内的DNA序列的转录因子编码部分”和“SEQ ID No:1和SEQ ID No:2中给出的DNA序列的转录因子编码部分”是可以互换的。

本发明的再一个方面提供包含本发明DNA构建物的表达载体，含有所说的DNA构建物或所说的表达载体的细胞，以及生产表现有转录因子活性的肽的方法，该方法包括在得以产生转录因子的条件下培养所说的细胞。

本发明的这样一种转录因子典型地是来源于丝状真菌。

术语“丝状真菌”可包括藻状菌纲(Phycomycetes)、接合菌纲(Zygomycetes)、子囊菌纲(Ascomyectes)、担子菌纲(Basidiomyeetes)和包括丝孢菌纲在内的不完全真菌，如曲霉属、青霉属、木霉属、镰孢属(Fusarium)和腐质霉属(Humicola)。

本发明还涉及生产丝状真菌宿主细胞的方法，其包括将编码任何一个这样的因子的DNA片段导入丝状真菌中，其中α淀粉酶启动子或共调节的启动子以一种使所说的因子将在所说的真菌中表达的方式调节有用多肽的表达。

本发明的再一个方面涉及生产其表达受α淀粉酶启动子或共调节启动子调节的有用多肽的方法，该方法包括在适于产生所说的因子和所说有用多肽的条件下培养如上描述的丝状真菌宿主细胞，并回收所说的有用多肽。

最后本发明涉及所说的因子用于调节有用的多肽在丝状真菌中表达的用途。

本文中，调节作用是指改变使本发明的因子具有活性的条件。例如改变不同的pH、底物等环境因素，从而所产生的效果是改善对有用蛋白质的表达的调节。

此外，调节作用还包括出现于转录因子有活性的真菌生长期的过程。依据环境的不同，提前和/或延迟使因子保持活性的这个阶段，可提高表达水平并进而提高产率。

再者，可使用本领域已知的标准方法，鉴定参予转录因子结合的特异性DNA序列，因而有可能将这样的序列插入到正常情况下不受因子调节的其他启动子中，并使那些启动子处于所说的因子的调节之下。

附图简要说明

图1显示质粒pMT1657的结构，实施例1中描述了该质粒的构建；

图2显示质粒pToC316的结构，实施例1中描述了该质粒的构建；

图3显示质粒pToC320的结构，实施例1中描述了该质粒的构建；

图4显示质粒pToC342和pToC359的结构，实施例3中描述了这些质粒的构建；

图5显示质粒pToC298的结构，实施例4中描述了该质粒的构建；

图6显示与培养在含有2％葡萄糖(-□-)或10％葡萄糖(-◇-)的YP培养基中的并在实施例4中描述的ToC1075相比较，由培养在含有2％葡萄糖(-■-)或10％葡萄糖(-◆-)的YP培养基中的米曲霉IFO4177的p960转化体产生脂酶的实验结果；

图7显示与培养在含有2％葡萄糖(-□-)或10％葡萄糖(-◇-)的YP培养基的并在实施例4中描述的ToC1075相比较，培养在含有2％葡萄糖(-■-)或10％葡萄糖(-◆-)的YP培养基中的ToC1139的脂酶生产量。

图8显示用下列限制性酶消化的黑曲霉DNA的放射自显影谱，泳道2,XbaⅠ；泳道3,XmaⅠ；泳道4,SalⅠ；泳道5,HindⅢ，泳道6,EcoRⅠ；泳道7,BglⅡ；泳道8,BamHⅠ；泳道1和9含有³²P标记的BstEⅡ消化的IDNA。实施例5中描述了该实验。

发明的详细描述

本发明的第一个方面涉及含有DNA序列的DNA构建物，所说DNA序列编码调节α淀粉酶启动子的转录因子，该DNA序列包括a)克隆到存在于大肠杆菌Toc1058,DMS10666中的质粒pToC320内的DNA序列的转录因子编码部分；或b)a)中限定的DNA序列的类似物，该类似物

ⅰ)与a)中限定的DNA序列至少有60％同源性，或者

ⅱ)与a)中限定的DNA序列的同样核苷酸探针杂交，或者

如本文限定的，克隆到存在于大肠杆菌ToC1058中的质粒pToC320内的DNA序列的转录因子编码部分的类似DNA序列，是指编码调节α淀粉酶启动子的转录因子的任何DNA序列，所说的转录因子具有上文(ⅰ)-(ⅴ)所列出的一种或多种性质。

可以从产生转录因子的丝状真菌米曲霉，或另一种或相关生物体的菌株中分离类似的DNA序列，因此其可以是克隆到存在于DSM10666中的pToC320内的DNA序列的转录因子编码部分的等位变异体或种变异体。

或者，也可以基于作为SEQ ID No:1和SEQ ID No:2的转录因子编码部分给出的DNA序列，例如其亚序列，和/或通过导入并不产生由DNA序列编码的转录因子的另一个氨基酸序列，但相当于产生转录因子的宿主生物体的密码子选择的核苷酸取代，或者通过导入可产生不同的氨基酸序列的核苷酸取代来构建类似序列。

当进行核苷酸取代时，氨基酸残基的改变最好是次要性质的改变，即不会显著地影响蛋白质的折叠或活性的保守氨基酸取代，并且有一般为一个至大约30个氨基酸残基的小的缺失，或小的氨基或羧基末端延伸。

保守取代的例子是在碱性氨基酸(例如精氨酸、赖氨酸、组氨酸)、酸性氨基酸(例如谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(例如谷氨酸胺和天冬酰胺)、疏水氨基酸(例如亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸)、芳族氨基酸(例如苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸)和小氨基酸(例如甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、蛋氨酸)内的取代。有关核苷酸取代的一般性描述可参见Ford，等人，(1991)，蛋白质的表达和纯化2,95-107。

本领域技术人员很清楚的是，可以在对于分子的功能很关键的并且仍可产生活性转录因子的区域之外进行这些取代。可以按照本领域已知的方法，例如位点特异性诱变或丙氨酸扫描诱变(例如参见Cunningham和Wells,(1989)，科学244,1081-1085)鉴定那些对于由本发明的DNA构建物编码的转录因子的活性必不可少的，并且因而最好不被取代的氨基酸残基。在后一种技术中，在分子的每个残基处引入突变，并试验所得突变分子的生物学活性(即调节α淀粉酶启动子的转录因子)，以鉴定那些对分子的活性至关重要的氨基酸残基。

上文(1)中所提到的同源性被确定为表明一个序列从另一序列衍生的两个序列间的同一性程度。可以借助本领域已知的计算机程序例如GCG程序包中提供的GAP(Needleman,S.B．和Wunsch,C.D.,(1970)，分子生物学杂志48,443-453)来适当地确定同源性。使用有下列用于DNA序列比较的设定的GAP:5.0的GAP创制补偿和0.3的GAP延伸补偿，DNA序列的编码区与SEQ ID No:1和SEQ ID No:2中所示DNA序列的转录因子编码部分一般表现有至少60％，较好至少70％，更好至少80％，最好至少90％的同一性程度。

上文(ⅱ)中提到的杂交是指在下文材料和方法部分中详细描述的在某些特定条件下与编码转录因子的DNA序列的同样探针杂交的类似DNA序列。待使用的寡核苷酸探针是相当于SEQ ID No:1或SEQ ID No:2中所示DNA序列的转录因子编码部分的DNA序列或其片段。

上文(ⅲ)中所提到的同源性被确定为两个序列间的同一性程度，借以表明第一个序列衍生于第二个序列。可借助本领域已知的计算机程序，例如GCG程序包中提供的GAP(Weedleman,S.B．和Wunsch,C.D.，文献出处同上)适当地确定同源性。使用有下列用来进行转录因子序列比较的设定的GAP:3.0的GAP创制补偿和0.1的GAP延伸补偿，由类似DNA序列编码的转录因子与由含有SEQ ID No:2中所示DNA序列的转录因子编码部分的DNA构建物编码的转录因子，例如与氨基酸序列SEQ IDNo:3表现有至少50％，较好有至少60％，更好有至少70％，特别是有至少80％，最好有90％的同一性程度。

可按照下文材料和方法部分中所述的方法确定性质(ⅳ)中所提到的免疫学反应性。

下文实施例1中描述了有关性质(ⅴ)的弥补方法。

可使用例如Sambrook等人，(1989)分子克隆，实验室手册，冷泉港实验室，冷泉港，纽约所述的标准方法，从米曲霉菌株IFO4177中分离编码本发明的转录因子的DNA序列。

WO93/11249和WO94/14953中公开了分离RNA和DNA的一般方法(这些文献列为本文参考文献)。下文实施例1中给出了补偿方法的详细描述。

另外，也可以按照已知的方法，使用基于本文公开的DNA序列制备的合成寡核苷酸探针，从适当的来源，例如下文提到的任何一种生物中方便地分离编码本发明的转录因子的DNA。例如，可以基于如SEQ ID No:1所给出的核苷酸序列的转录因子编码部分或其适当的亚序列，或基于氨基酸序列SEQ ID No:3制备适当的寡核苷酸探针。

本发明特别涉及调节丝状真菌中α淀粉酶启动子的表达的转录因子，实施例2中所指出的因子甚至可调节其他基因的表达。

本文中所使用的术语“丝状真菌”倾向于包括藻状菌纲、接合菌纲、子囊菌纲、担子菌纲、和包括丝孢菌纲在内的不完全真菌如曲霉属、青霉属、木霉属、镰孢属和腐质霉属。

本文中所使用的术语“α淀粉酶启动子”是指直接接在α淀粉酶基因上游的碱基序列，RNA聚合酶识别α-淀粉酶基因并与之结合，以促进编码α淀粉酶基因的转录。

如所指出的，已知转录因子来自许多生物体，因此可望从曲霉属、木霉属、青霉属、镰孢属和腐质霉属等其他真菌中发现对于上述这些属的任何真菌中的淀粉酶启动子调节下的多肽的表达具有提高效果的相似或相应因子。

比较编码用来调节α淀粉酶启动子的转录因子的DNA序列后显示，其与调节念珠菌中葡糖苷酶表达的转录因子(CASUCI)及Kelly和Kwon-Chung(1992)细菌学杂志174,222-232中所公开的酿酒酵母的MAL63有某种程度的同源性。

目前可预期从其他微生物中，可以得到编码与本发明的转录因子同源的转录因子的DNA序列，即类似DNA序列。例如，可按类似方法筛选另一种微生物，例如曲霉属、酵母属、欧氏杆菌属、镰孢属或木霉属菌株的cDNA文库，以得到DNA序列。

发明人已按照国际公认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约的规定，将已失活的含有编码本发明转录因子的基因的米曲霉菌株的分离物保藏在DSM(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH,Mascheroder Weg 1b,D-38124 Braunschweig,DEUTSCHLAND)。保藏日期：1996年5月6日(06.05.96)保藏人的参考号：ToC879=NN049238DSM命名：米曲霉DSM No.10671

可以使用已保藏的米曲霉菌株DSM NO.10671从米曲霉的任何菌株中以及按下述方法弥补后带有这样的基因的任何其他真菌菌株中分离根据本发明的转录因子。

已将含有编码本发明的转录因子的全长度基因组DNA序列的表达质粒pToC320转化到大肠杆菌菌株中，并且发明人已按照国际公认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条件的规定，将所得到的菌株ToC1058保藏在DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH.,Mascheroder Web 1b,D-38124 Braunschweig,DEUTSCHLAND)。保藏日期：1996年6日(06.05.96)保藏人的参数号：ToC1058=NN049237DSM命名：大肠杆菌DSM NO.10666

根据本发明，优选来源于米曲霉、黑曲霉、泡盛曲霉(A.awamori)等，特别是米曲霉IFO4177的这种类型的因子。

已发现本发明的转录因子不仅参予调节α淀粉酶启动子，而且还参予调节米曲霉的葡糖淀粉酶启动子。

特别是，本发明包括具有如SEQ ID No:3中所示氨基酸序列的，包括其一个或多个片段或片段组合的任何因子。

截短形式的转录因子也可能是有活性的。术语“截短形式”是指对转录因子的修饰，其中N末端，C末端或一个或多个内部片段已被删除。

本发明的再一个方面涉及编码其中任何一种因子的DNA序列

在这个方面，本发明特别包括编码SEQ ID No:3中所示氨基酸序列的一个或多个片段的任何DNA序列。

更具体地说，本发明涉及包括如SEQ ID No:1和SEQ ID No:2中所示DNA序列的一个或多个片段或片段组合的DNA序列。

根据另一个方面，本发明涉及生产丝状真菌宿主细胞的方法，其包括将上文提到的任何一个DNA片段导入丝状真菌内，其中α淀粉酶启动子或另一个被共调节的启动子以某种方式调节有用多肽的表达，从而所说的因子将在所说的真菌中被表达。

可借助任何已知的将DNA导入丝状真菌中的标准方法，例如使用如下文所述的表达载体和宿主细胞导入所说的DNA片段。

因此，本发明还提供包括本发明的DNA构建物的重组表达载体。

本发明的表达载体可以是能方便地经受重组DNA处理的表达载体，并且载体的选择常常依赖于将向其中导入该载体的宿主细胞。

因此，载体可以是自动复制载体，即作为染色体外整体存在的载体，其复制不依赖于染色体的复制，例如可以是质粒。另外，载体可以在被导入宿主细胞时整合到宿主细胞基因组中并与已被导入的染色体一起复制。

在表达载体中，编码转录因子的DNA序列还应含有正常情况下与转录因子相联系的表达信号，或者应被可操作地连接到适当的启动子和终止子序列上。启动子可以是在选择的宿主细胞中显示有转录活性的任何DNA序列，并且其可衍生于与宿主细胞同源或异源的基因。用于将编码转录因子的DNA序列分别与启动子和终止子连接，并将它们插入适当的载体中的方法是本领域技术人员已知的(参见Sambrook，等人，文献同上)。

用于丝状真菌宿主细胞中的适当的启动子例如可以是构巢曲霉ADH3启动子(McKnight，等人(1985)The EMBO J.4,2093-2099)或tpiA启动子。其他有用的启动子的例子是那些衍生于编码米曲霉α淀粉酶、黑曲霉中性α淀粉酶、黑曲霉酸稳定的α淀粉酶、黑曲霉、泡盛曲霉或米曲霉葡糖淀粉酶(gluA)、米曲霉碱性蛋白酶(alp)、米曲霉硝酸盐还原酶(niaD)、黑曲霉丙糖磷酸异构酶(tpi)、构巢曲霉乙酰胺酶等基因的启动子，或者编码氨基酸生物合成基因如argB的曲霉启动子。

在另一个方面，本发明提供含有本发明的DNA构建物和/或本发明的重组表达载体的宿主细胞。

本发明的宿主细胞较好是真核细胞，特别是例如酵母或丝状真菌细胞等真菌细胞。具体地说，细胞可以属于木霉属，较好是Trichodermaharzianum或Trichoderma reesei，或曲霉属，最好是米曲霉或黑曲霉。可以使用包括原生质体形成和原生质体转化，然后按已知方式再生细胞壁的方法转化真菌细胞。EP238023(Novo Nordisk A/S)中描述了曲霉作为宿主微生物的使用方法(其内容列为本文参考资料)。宿主细胞还可以是酵母细胞，例如酵母属的菌株，特别是酿酒酵母、克鲁弗酵母(S.Kluyveri)或葡萄糖酵母(S.uvarum)，裂殖酵母属的菌株，例如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)，汉逊氏酵母属、毕赤酵母属、Yarrowiasp.例如Yarrowia Lipolytica或克鲁维酵母(Kluyveromyces sp.)，例如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)。

可用其他方法删除或失活宿主细胞的内源性amyR基因。然后用异源性启动子导入amyR控制将导致α淀粉酶启动子的全新调节流程。例如，如果将amyR融合到米曲霉niaD启动子上，α淀粉酶启动子将成为可由硝酸盐诱导的。如果使用palC调节的启动子代替niaD启动子，则α淀粉酶启动子的活性将受pH的调节。

本发明还包括生产感兴趣的多肽的方法，因而在适于产生所说的因子和感兴趣的多肽的条件下培养上述宿主细胞，并回收所说的感兴趣的多肽。

用于培养被转化的宿主细胞的培养基可以是适于所研究的宿主细胞生长的任何常规培养基。被表达的感兴趣的多肽可被分泌到培养基中，并可用已知方法从中回收之，这些已知方法包括经离心或过滤从培养基中分离细胞，借助盐析法(例如使用硫酸铵)沉淀培养基中的蛋白质成分，然后进行层析，例如离子交换层析、亲合层析等。

根据本发明，可使用上述方法生产有用的多肽，即药用多肽，特别是例如生长激素、胰岛素、凝血因子等药用多肽。

也可使用本发明的方法生产工业酶，例如蛋白酶、脂酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶、氯化还原酶、糖酶、碳酰水解酶、纤维素酶、酯酶等。

根据本发明的另一个方面，可使用所说的转录因子提高感兴趣的多肽在丝状真菌，例如曲霉属、木霉属、青霉属、镰孢属、腐质霉属等的菌株，特别是米曲霉、黑曲霉、泡盛曲霉，并且最好是米曲霉中的表达。

因此可使用本发明的转录因子提高药用多肽例如生长激素、胰岛素、凝血因子等的表达。

另外，可使用本发明的转录因子提高蛋白酶、脂酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶、氧化还原酶、糖酶、碳酰水解酶、纤维素酶、酯酶等工业酶的表达。

还可使用转录因子鉴定其与之结合的α淀粉酶启动子中的序列。例如，可为此而制造适于在大肠杆菌中生产的，与AmyR的DNA结合区例如锌指形成的GST融合蛋白质。可使用市售的药盒，例如“GST基因融合药盒”(“The GST Gene Fusion Kit”)(Pharmacia)方便地制得这样的融合蛋白质。然后可在常规体外技术如凝胶移位检测法或DNA足迹分析法(Kulmburg,Lutfiyya,L.L.，和Johnston,M.,(1996)分子和细胞生物学16,4790-4797)中使用纯化的GST融合蛋白质。鉴定AmyR结合位点将有可能将这些序列插入到正常情况下不受AmyR调节的其他启动子中。材料和方法杂交：

可按下述方法限定确定核苷酸探针与本发明的“类似”DNA序列间杂交的适当杂交条件。待使用的寡核苷酸探针是相当于SEQ ID No:1中所示DNA序列的转录因子编码部分的DNA序列，即SEQ ID No:1中的核苷酸1691…2676+2743…3193+3278…3653，或其片段，如SEQ IDNo:1中的核苷酸1770-1800。杂交条件

决定核苷酸探针和同源DNA或RNA序列间杂交的适当条件包括将含有DNA片段或待杂交的RNA的滤膜在5xSSC(标准柠檬酸盐缓冲液)中预浸渍10分钟，并使滤膜在5xSSC(Sambrook，等人，文献同上)、5XDenhardt氏溶液(Sambrook等人，文献同上)、0.5％ SDS和100μg/ml变性的并超声处理的鲑精DNA(Sambook，等人，文献同上)的溶液中预杂交，然后于大约65℃在含有随机引导的(Feinberg,A.P．和Vogelstein,B.(1993)分析生物化学，132,6-13)、³²P-dATP标记的(比活性＞1×10⁹cpm/μg)针的同样溶液中杂交12小时。然后，在不高于50℃，较好不高于60℃，更好不高于65℃，最好不高于70℃，特别是不高于75℃的温度下，在2XSSC、0.5％SDS中将滤膜洗两次(30分钟)。

使用Phospho Image检测器检测在这些条件下与核苷酸探针杂交的分子。免疫学交叉反应性

可以使用纯化的转录因子制备用于确定免疫学交叉反应性的抗体。更具体地说，可以按照N.Axelsen等人在“定量免疫电泳手册”(BlackwellScientific Publications,1973，第23章)或A.Johnstone和R.Thorpe在“免疫化学实践”(Blockwell Scientific Publications,1982，特别是第27-37页)中所述的方法，经免疫兔(或啮齿动物)产生抗本发明转录因子的抗血清。例如通过盐析((NH₄)₂SO₄)、透析及离子交换层析(例如使用DEAE-Sephadex柱)从抗血清中制得纯化的免疫球蛋白。可以使用Outcherlony双向扩散法(O.Ouchterlony，实验免疫学手册(D.M.Weir编辑)，Blackwell Scientific Publications,1967,pp.655-706)、交叉免疫电泳法(N.Axelsen等人，文献同上，第3和4章)，或火箭免疫电泳(N.Axelsen等人，上述文献第2章)鉴定蛋白质的免疫化学特征。

实施例实施例1：从米曲霉克隆amyR转录因子

补偿不能表达两种均处于TAKA淀粉酶启动子控制下的不同蛋白质的米曲霉突变菌株以克隆amyR。经诱变含有处于TAKA启动子控制下的编码脂酶(HLL)的cDNA和一个从其自身启动子转录的TAKA淀粉酶基因拷贝的菌株SRe440，制得突变的米曲霉菌株ToC879。

根据其淀粉酶阴性(淀粉酶^-)表型以及进而显示为脂酶阴性(脂酶^-)来鉴定和分离突变株。

菌株ToC879含有两表达盒的完整拷贝。淀粉酶-表型使ToC879不能在含有1％环糊精作为唯一碳源的平皿上生长，而亲本菌株SRe440将会在这样的平皿上生长。

ToC879已被保藏在DSM，保藏号为DSM NO.10671。

用米曲霉粘粒文库和携带来自吸水链霉菌(Streptomyceshygroscopicus)的bar基因(其赋予抗glufosinate抗性)的自动复制pHelp1基质粒(D.Gems,I.L.Johnstone，和A.J.Clutterbuck(1991)基因98,61-67)共转化ToC879，以分离amyR。在含有作为唯一碳源的环糊精的平皿上选择并根据同时逆转成脂酶⁺表型来筛选转化体。

从能够在环糊精上生长的菌落中拯救转化DNA。亚克隆后得以分离出能够弥补ToC879的两种表型的4.3kb DNA片段。隐藏在该片段中的基因被定名为amyR。pHelp1衍生质粒pMT1657的构建

连接(并且其后转化到大肠杆菌DH5a中)下列四个片段以制备质粒pMT1612：ⅰ)用SphⅠ/XbaⅠ切割的大肠杆菌载体pToC65(参见EP531372),ⅱ)用SphⅠ/BamHⅠ切割的PCR片段(含有构巢曲霉amdS启动子)，ⅲ)含有bar基因的pBP1T(B.Staubinger等人(1992)真菌遗传学通讯39,82-83)中的0.5kb BamHⅠ/XhoⅠ片段，以及ⅳ)含有黑曲霉葡糖淀粉酶转录终止子的pIC AMG/Term(EP申请NO.87103806.3)中的0.7kb XhoⅠ/XbaⅠ片段。

使用作为底物DNA的质粒pMSX-6B1(M.E.Katz等人，(1990)Mol.Gen.Genet.220,373-376)和作为引物的两个寡核苷酸4650(SEQID No:4)和4561(SEQ ID No:5)制得含有amdS启动子的PCR片段。4650:CTTGCATGCCGCCAGGACCGAGCAAG, SEQ ID NO:44651:CTTGGATCCTCTGTGTTAGCTTATAG. SEQ ID NO:5pMSX-6B1含有称为I666的amdS启动子上游突变。

用HindⅢ切割pMT1612，去磷酸化并连接到得自含有AMA1序列的pHelp1的5.5kb HindⅢ片段上。所得到的质粒pMT1657是在曲霉菌中自我复制并可根据glufosinate抗性的增加选择的。图1中图解显示了pMT1657，其中PamdS代表上述片段ⅱ)的amdS启动子，bar代表上述片段ⅲ),Tamg代表上述片段ⅳ)。粘粒文库的构建

基本上按照“SuperCos1粘粒载体药盒”(Stratagene CloningSystems,La Jalla CA,USA)的供应商提供的说明书构建米曲霉的粘粒文库。

从按标准方法(Christensen,T.，等人(1988)，生物技术6,1419-1422)制得的原生质体制备米曲霉IFO4177的基因组DNA。

分离后，在Labofuge T(Heto)中以2500rpm离心5分钟沉淀原生质体；然后按Supercos1粘粒载体药盒的使用手册所述，将沉淀物悬浮于10mM NaCl、20mM Tris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA、100μg/ml蛋白酶K和0.5％SDS中；按药盒说明书完成DNA制备。

使用CHEF-凝胶装置(Bio-Rad Laboratories,Hercules CA,USA)，以电泳法分析基因组DNA的大小。1％琼脂糖凝胶以200瓦电流，10-50秒脉冲电泳20小时。用溴化乙锭染凝胶并进行照相。DNA大小为50-100kb。使用Sau3A部分消化DNA。按上述方法用同一类型的CHEF凝胶进行电泳分析，确定被消化的DNA大小为20-50kb。按照手册中所述制备CsCl梯度分带的SuperCos1载体。同样按手册中所述方法进行连接和包装。

滴定文库之后，将得自一次连接并包装的所有包装混合物转化到宿主细胞XL1-Blue MR中，并铺敷在50μg/ml氨苄青霉素LB平皿上。得到大约3800个菌落。得自10个菌落的粘粒制备物显示，它们均具有预期大小的插入片段。挑取个别菌落，接种于含100μl LB(100μg/ml氨苄青霉素)的微量滴定板的各孔内，并于37℃保温过夜。向各孔内加入100μl50％甘油并将整个文库置于-80℃下冷冻保存。共贮存3822个菌落。

这个量代表米曲霉基因组的大约4.4倍。挑取菌落后刮去平皿中培养物，合并刮除物并将总文库分4个集合体作为冷冻的甘油原液贮存。4个集合体定名为ToC901-ToC904。

使用配合到微量滴定皿的一半中的8针6排多针装置将文库中的个别冷冻的菌落接种到LB平板(100μg/ml氨苄青霉素)上。制作含有来自文库中所有克隆的菌落的平板。

将平板于37℃保温过夜。将切成平皿大小的灭菌的Whatman 540滤膜放在已经过37℃保温2小时以上的菌落上。将滤膜转移到含有200μg/ml氯霉素的LB平板上并于37℃保温过夜。

第二天用0.5M NaOH将滤膜洗两次(每次5分钟)，再在0.5MTris-HCl(pH7.4)中洗两次(每次5分钟)，然后在2XSSC中洗两次(每次5分钟)。用乙醇浸湿滤膜并风干。amyR克隆的选择

从ToC901-904制备粘粒DNA，并与pMT1657共转化导入ToC879中。转化方法如EP申请NO.87103806.3中所述。根据在含有1M蔗糖(用于渗透灭菌)和10mM(NH₄)₂SO₄的基本培养基平板(Cove D.J.(1966)BBA113,51-56)中对1mg/ml glufosinate的抗性选择出大约8700个转化体。

在同一类型平板上再一次分离随机选择的转化体。将得自这些10个转化体的分生孢子接种于含有1mg/ml glufosinate的基本培养基中，并于30℃培养到可收集到足够用来制备DNA的菌丝体。按T.Christensen等人(文献同上)所述的方法制备DNA。

将未切割的DNA加于0.7％琼脂糖凝胶上并进行电泳分离，然后进行Southern印迹分析。印迹与³²P标记的SuperCos1特异性DAN片段杂交。10个转化体中，每个都显示出一条比线性染色体DNA有更高迁移率的带。每条带也都与pHelp1特异性探针杂交，表明粘粒文库的共转化频率接近于100％，并且粘粒都已整合到了自动复制载体pHelp1中。

如所预期的pHelp1转化体那样，这些转化体是不稳定的。得自glufosinate抗性菌落的10％以下的分生孢子产生了glufosinate抗性子代。

以8份集合体收集所有转化体的分生孢子，并铺板在含有1mg/mlglufosinate、10mM(NH₄)₂SO₄和1％β环糊精(Kleptose得自RoquetteFreres＇,62136 Lestem,France)的基本培养基平板(Cove D.J.，文献同上)上。

从其中一个集合体中得到4个菌落，并从一个其他集合体中得到1个菌落。在同种类型平板上再一次分离第一个集合体中的两个菌落。

将得自再次分离的菌落中的分生孢子铺板在以葡萄糖或环糊精作为碳源的基本平板上和含glufosinate的平板上。glufosinate抗性和在环糊精上生长的能力都是不稳定的表型，并有同样程度的不稳定性。这表明赋予在环糊精上生长能力的基因在物理上是与转化体中的pMT1657连接的。

从再分离平板中切出菌落并使用抗HLL脂酶抗体以火箭免疫电泳法(RIE)分析之。转化体与抗体产生清楚的反应，而生长于麦芽糖基质上的ToC879菌落则不发生反应。因此可以认为，这些转化体已恢复了淀粉酶(即在环糊精基质上生长)和脂酶(即抗体结合)的表达。负责这一表型的基因被称为amyR。amyR基因的分离

为了从ToC879的淀粉酶⁺、脂酶⁺转化体中拯救amyR基因，成功地使用了两种不同的方法。

从生长于以环糊精为碳源的基本培养基中的菌丝体制备DNA。

在第一种方法中，使用Stratagene公司的GigapackⅡ药盒将DNA包装到λ-菌体头部中，以试图拯救出总DNA中的原粘粒。在药盒供应商规定的条件下使包装反应混合物与XLI-Blue MR大肠杆菌一起保温。将大肠杆菌细胞铺板在含50μg/ml氨苄青霉素的LB平板上。平板上出现两个菌落；它们所含有的粘粒是同样的并定名为ToC1012。

在第二种方法中，尝试使用总DNA转化感受态大肠杆菌DH5a细胞。分离菌落并根据限制性酶消化表明含有6种不同的质粒。用EcoRⅠ消化各种质粒并对其进行Southern分析。使用pMT1657混合物的32P标记的探针和SuperCos1鉴定不是这些载体的一部分的DNA片段。大小约0.7和1.2kb的两个EcoRⅠ片段不与其中的任何探针杂交。分离1.2kb片段，用32P标记，并在与含有产生原转化体的粘粒部分的滤膜进行杂交实验中使用它们作为探针。在含有大约1000个克隆的集合体(ToC904)中，有6个粘粒没有发生杂交。

限制酶消化结果显示，这类克隆中有些是完全相同的，致使分离出四种不同的粘粒。

所有粘粒都至少含有一部分的TAKA淀粉酶基因。经与pMT1623(携带在米曲霉tpi启动子控制下的bar基因的基于pUC的质粒)一起共转化，将四种粘粒和粘粒ToC1012转化到ToC879中。根据抗glufosinate抗性，从每次共转化分离到14个转化体并试验其在环糊精上生长的能力。

ToC1012的8个转化体和其他粘粒之一(41B12)的3个转化体能够生长。其他粘粒的转化体都没有生长。并不是ToC1012和41B12的所有转化体都能生长可能是反映了每次实验中共转化频率的不同。以RIE法分析生长于环糊精上的转化体菌落，并显示它们都产生了脂酶。

为了再克隆粘粒中的amyR，将用BglⅡ、HindⅢ或PstⅠ消化的41B12得到的DNA片段克隆到pUC19中。将亚克隆转化到ToC879中并按上述方法根据在环糊精中生长和产生脂酶的能力分析转化体。如图2中所示，一个称为pToC316的质粒含有约9kb的HindⅢ片段，该片段被鉴定为含有amyR的片段。

进一步再克隆后，产生了一个含有4.3kb HindⅢ/SacⅠ片段的称pToC320的质粒(如图3中所示)，然后使用进一步再克隆和引物行走方法在ABI DNA序列仪上进行序列测定。

SEQ ID No:1中显示了包含amyR基因的3980bpDNA序列。SEQID No:3中显示了推测的氨基酸序列，并揭示在氨基酸28-54之间有一个Gal4型锌指序列。已知这样的序列与DNA结合(Reece,R.J.，和Ptashne,M.(1993)科学261,909-910)。

因为amyR是从也含有淀粉酶特异性DNA片段的粘粒中分离的，所以amyR酶切图谱接近于IFO4177中的三个淀粉酶基因之一。粘粒的基因图谱显示α淀粉酶基因和amyR相隔5-6kb。基因组DNA的Southern分析显示，IFO4177中只存在一个amyR拷贝，并进一步证实其酶切图接近于淀粉酶基因之一。amyR cDNA的分析

使用Wahleithner,J.A.，等人(1996)当代遗传学29,395-403)的方法，从在有利于产生α淀粉酶的条件下生长于含麦芽糖培养基中的米曲霉培养物制备mRNA。以标准方法制得双链cDNA，并用来以下列引物进行PCR反应：oligodT引物：TTTTGTAAGCT31 SEQ ID NO.923087:CCCCAAGCTTCGCCGTCTGCGCTGCTGCCG SEQ ID NO.620865:CGGAATTCATCAACCTCATCAACGTCTTC SEQ ID NO.720866:CGGAATTCATCGGCGAGATAGTATCCTAT SEQ ID NO.8

用引物20866和23087进行PCR反应产生一个约1.1kb的片段。用EcoRⅠ和HindⅢ消化该片段；将这些限制位点掺入引物中，并克隆到用同样的酶切割的pUC19载体内。

测定所得质粒中插入片段的序列，可见基因的该部分中有一个内含子。SEQ ID No:2中指示出了该内含子。

用OligodT引物和引物20866进行的另一个PCR反应并没有产生不同的片段。使用该反应的一个等份作为用OligodT引物和引物20865进行的新反应的开始点，结果产生了一个约1.1kb的片段。用EcoRⅠ和HindⅢ消化该片段并克隆到pUC19中。

测序结果显示该片段含有amyR的3′部分并定位了另一个内含子。该内含子也在SEQ ID No:2中指明。测定三个独立质粒的3′末端序列并定位两个polyA加入位点，其中一个在bp no.3827处，另一个在bpno.3927处。实施例2：amyR^-菌株中葡糖淀粉酶合成的定量

米曲霉产生由glaA基因编码的葡糖淀粉酶，所说的基因则受如α淀粉酶同样的物质的调节(Y.Hata等人(1992)当代遗传学22,85-91)。为了弄清楚是否amyR也参予调节glaA，检测菌株ToC879中和由之直接衍生ToC879的amyR wt菌株SRe440中，在诱导条件下葡糖淀粉酶的合成。

将得自各菌株的分生孢子接种于10ml YPM(含有2％麦芽糖的YP培养基)中并于30℃培养4天。收集上清液并与当被葡糖淀粉酶酶解时变成黄色的酶底物对位硝基苯-α-D-葡糖吡喃糖苷一起保温，以分析上清液中的葡糖淀粉酶含量。在所使用的方法中，将0.5ml发酵液与1ml含有1mg/ml底物的0.1M乙酸钠(pH=4.3)混合。将样品于室温下保温3小时并加入1.5ml 0.1M Na₂B₄O₇。在分光光度计中检测所产生的黄颜色的400nm吸光率。将上清液首先与硼酸盐混合，然后再与底物溶液混合以制成对照样品。检测结果是：

反应-对照(OD单位)

SRe440 0.655

ToC879 0.000

取自ToC879的样品中的OD读数为零这一结果清楚地表明，米曲霉的葡糖淀粉酶的合成需要有amyR转录因子的表达。实施例3：amyR的过表达

构建含有融合到米曲霉tpi基因启动子上的amyR的编码区和3′非编码序列的质粒pToC342。tpi基因编码丙糖磷酸异构酶——一种参予初级代谢的组成性表达的酶。按照Mcknight,G.L.等人(1986细胞46,143-147)的方法，经与构巢曲霉cDNA克隆交叉杂交分离米曲霉tpi基因。经序列测定来鉴定结构基因。所使用的启动子是直接接在编码区上游的约700bp片段。pToC342能够弥补ToC879中的突变。进一步向pToC342中加入米曲霉pyrG基因，并将所得到的质粒pToC359转化到JaL250-1996年9月19日提交的专利申请DK1024/96中描述的JaL228的pyrG突变体中。发现含有多拷贝pToC359的菌株可增加葡糖淀粉酶的合成水平。pToC342和pToC359的构建

以pToC320作为模板并使用下列引物进行PCR反应：8753 GTTTCGAGTATGTGGATTCC8997 CGGAATTCGGATCCGAGCATGTCTCATTCTC

用EcoRⅠ/ApaⅠ切割所得到的片段以产生一个约180bp的片段，然后将该片段克隆到已用EcoRⅠ/ApaⅠ消化的pToC320中。测定所得质粒pToC336的碱基序列以证实PCR片段是完整的。将含amyR的编码区和3′非翻译序列的pToC336的2.6kb BamHⅠ/SalⅠ片段，以及含有tpi启动子的约700bp EcoRⅠ/BamHⅠ片段克隆到EcoRⅠ/SacⅠ消化的pUC19中。在体外导入tpi启动子的下游BamHⅠ位点，而EcoRⅠ位点则是来自原有tpi克隆的内源性位点。用HindⅢ切割所得到的称为pToC342的质粒，去磷酸化并连接到含有米曲霉pyrG基因的1.8kb HindⅢ片段上，得到称为pToC359的质粒。pToC342和pToC359的结构示于图4中。其中Ptpi代表tpi启动子，TamyR代表amyR的3′非编码区。以前曾在WO95/35385中描述了pyrG基因的克隆方法。在米曲霉中的表达

JaL250是根据对5-氟乳清酸的抗性选择的JaL228的pyrG突变体。1996年9月19日提交的专利申请DK1024/96中已描述了JaL228。按照标准方法用pToC359转化JaL250并根据尿嘧啶核苷需求的下降选择转化体。再通过分生孢子再次分离转化体并在YP+2％麦芽糖培养基中30℃培养4天。根据裂解对位硝基苯-α-D-葡糖吡喃糖苷的能力测定分泌的葡糖淀粉酶。转化体在发酵液中具有5-31单位/ml的葡糖淀粉酶生成能力，而JaL228只有2-3单位/ml。最好的转化体称为ToC1200。Southern分析显示，pToC359的多个拷贝已被整合到ToC1200的基因组中。因为有α淀粉酶启动子，所以可优选使用ToC1200作为表达质粒的宿主菌株。实施例4：TAKA启动子的碳分解代谢物抑制作用

TAKA淀粉酶启动子受到碳分解代谢物的抑制。在曲霉中，碳分解代谢物抑制作用至少部分地是通过相应于酿酒酵母MIG1的转录阻遏物CreA介导的。已知在CreA控制下的启动子中的DNA结合位点是富含GC的，并且看来相同于酿酒酵母中的MIG1位点。TAKA淀粉酶启动子含有几个潜在的CreA结合位点。为了确定该启动子是否参予碳分解代谢物抑制作用，突变三个这样的位点，但结果只对碳代谢物抑制作用提供了部分缓解。相反，在含有偶联到报道基因上的经过修饰的启动子的菌株中导入组成性表达的amyR的拷贝，则完全解除报道分子的抑制。CreA位点缺失的TAKA淀粉酶启动子的构建

经与已知的CreA和MIG1位点进行序列比较，认定三个位点为TAKA淀粉酶启动子中的潜在CreA结合位点。所得位点具有下示序列：

位点Ⅰ CCCCGGTATTG

位点Ⅱ CCCCGGAGTCA

位点Ⅲ ATATGGCGGGT

将划下线的碱基都改变成A＇s，因为已知这种改变可破坏MIG1结合位点。使用位点特异性诱变方法完成这种取代。构建含有经修饰的启动子和来自黑曲霉葡糖淀粉酶基因的3′非转录序列的表达载体pToC297。除了启动子有所改变外，pToC297完全相同于WO91/17243中所述的pToC68。两质粒在启动子和终止子之间都具有单一BamHⅠ位点。CreA-TAKA淀粉酶启动子调节的脂酶的表达

将含有编码Humicola lanuginosa脂酶的cDNA的约950bp BamHⅠ片段克隆到pToC297中(以前在EP305216中已描述了H.lanuginosa脂酶的克隆和表达)。经与构巢曲霉amdS基因共转化，将所得到的质粒pToC298转化到米曲霉IFO4177中。图5中显示了该质粒的结构，其中Ptaka-creA代表CreA结合位点有缺陷的TAKA淀酚酶启动子。通过分生孢子重新两次分离转化体，选择一个产生脂酶的这样的转化体ToC1075，用于进一步地估价。于30℃，在含有2％或10％葡萄糖的10mlYP培养基中培养含有融合到野生型TAKA启动子上的脂酶基因的ToC1075和IFO4177的p960转化体(参见EP305216)。每天取样品分析发酵液中的脂酶生成。使用抗纯化的脂酶的多克隆抗体，以火箭免疫电泳法检测脂酶含量。米曲霉IFO4177的发酵废液不与抗体反应。还使用Lilly公司的Tes-tape每天检测发酵液的葡萄糖含量。

第一天检测到所有培养物中的葡萄糖，但在第二天申只能在原来含有10％培养物中检测到葡萄糖。图6显示酯酶的产生量，表明在葡萄糖耗尽之前，野生型启动子一直受到抑制。因此，当葡萄糖逐渐耗尽时脂酶开始聚积。图6还显示，经修饰的启动子并没有象在10％葡萄糖发酵中于葡萄糖存在下产生低水平脂酶那样受到严格的调节。因此，在ToC1075可见有部分地葡萄糖脱阻抑。

pToC342对ToC1075中脂酶的碳代谢物抑制作用的缓解

经与含bar质粒pMT1623共转化，用pToC342转化ToC1075。用Southern印迹分析法鉴定含有pToC342的多个拷贝并保留有脂酶表达盒的菌株；其中一个就是这样的菌株。将ToC1075和ToC1139于30℃培养在10ml含有2％或10％葡萄糖的YP培养基中，每天测定样品中的脂酶和葡萄糖。根据对位硝基丁酸苯酯的裂解检测脂酶。用Lilly公司的Tes-tape检测葡萄糖含量。图7中所示的结果表明，如前所述，ToC1075提供了对葡萄糖抑制作用的部分缓解，而ToC1139的酯酶生产量则不取决于葡萄糖的存在。实施例5：黑曲霉中amyR基因的Southern分析

如在米曲霉中一样，黑曲霉中α-淀粉酶和葡糖淀粉酶的合成也是受碳源调节的。因此，黑曲霉也可能含有amyR基因。通过寻找米曲霉amyR基因和黑曲霉染色体DNA之间的交叉杂交来试验这一推测。

用常规方法从黑曲霉中制备DNA。用BamHⅠ、BglⅡ、EcoRⅠ、HindⅢ、SalⅠ、XmaⅠ或XbaⅠ切割DNA，并在琼脂糖凝胶上电泳分离所得到的DNA片段。然后将DNA转印迹到硝酸纤维素膜上，并与含有米曲霉amyR结构基因一部分的³²P标记的探针杂交。基于pToC320以PCR方法制备探针，探针起始于SEQ ID No:1中所示序列的bpno.1683并终止于bp.no.2615。在10x Denhardt′s溶液(5XSSC、10mM EDTA、1％SDS、0.15mg/ml polyA、0.05mg/ml酵母tRNA)中，于50℃杂交过夜。杂交后，于逐渐严格的条件下洗膜，并用PhosphoImager分析膜上的放射活性。图8显示在2XSSC、0.1％SDS中于58℃洗膜后得到的结果。用几种限制酶消化后可见到单一带。因此，可以基于该交叉杂交的结果克隆黑曲霉amyR基因。说明书中列出的参考文献描述部分：Dhawale和Lane(1993)NAR21 5537-5546Lachmund等人(1993)当代微生物学2647-51Tada等人(1991)Mol.Gen.Genet.229301-306Tada等人(1991)农业生物化学551939-1941Tsuchiya等人(1992)生物科学·生物技术·生物化学561849-1853,Nagata等人(1993)Mol.Gen.Genet.237251-260Ford等人，(1992)，蛋白质的表达和纯化2,95-107Cunningham和Wells,(1989)科学2441081-1085Needleman,S.B．和Wunsch,C.D.,(1970)分子生物学杂志48443-453Sambrook,J.，等人(1989)，分子克隆：实验室手册，冷泉港实验室；冷泉港，纽约。WO93/11249WO94/14953Kelly和Kwon-Chung(1992)细菌学杂志，174222-232McKnight等人(1985)The EMBO J.42093-2099EP238023Kulmburg,P.，等人(1992)分子和细胞生物学121932-1939Lutfiyya,L.L.，和Johnston,M.(1996)分子和细胞生物学16 4790-4797实施例部分：Feinberg,A.P．和Vogelstein,B.(1983)分析生物化学，132:6-13N.Axelsen等人，定量免疫电泳手册，Blackwell Scientific Publications,1973，第23章A.Johnstone和Thorpe，免疫化学实践，Blackwell ScientificPublications,1982,pp.27-31O.Ouchterlony，实验免疫学手册(D.M.Weir，编辑)，BlackwellScientific Publications,1967,pp.655-706D.Gems,I.L.Johnstone,和A.J.Clutterbuck,(1991)基因9861-67EP531372B.Staubinger等人(1992)真菌遗传学通讯3982-83M.E.Katz等人(1990)Mol.Gen.Genet.220 373-376Christensen,T.，等人(1988)生物技术61419-1422Cove D.J.,BBA(1966)11351-56Reece,R.J.，和Ptashne,M.(1993)科学261909-910Wahleithner,J.A.，等人(1996)当代遗传学29395-403Hata,Y.，等人(1992)当代遗传学2285-91McKnight,G.L.，等人(1986，细胞46143-147)DK1024/96WO95/35385WO91/17243EP305216 序列表(1)一般信息：(ⅰ)申请人：

(A)名称：Novo Nordisk A/S

(B)街道：Novo Alle

(C)城市：Bagsvaerd

(E)国家：丹麦

(F)邮编(ZIP):DK-2880

(G)电话：+45 4442 2668

(H)传真：+45 4442 6080(ⅱ)发明名称：转录因子(ⅲ)序列数目：9(ⅳ)计算机可读形式：

(A)介体类型：软盘

(B)计算机：IBM PC可兼容

(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

(D)软件：PetentIn Release#1.0，版本#1.30(EPO)(2)SEQ ID NO:1的信息：(ⅰ)序列特征：

(A)长度：3980碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)(ⅲ)假设：无(ⅳ)反义：无(ⅵ)最初来源：(A)生物体：米曲霉(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:1:TCTAGACCGG CCATGTCGTG GTCCGCCAAG TTGATTCCGG ACCGTGTTGT AGTTGCTTCT 60TTTAAGAAAC GGCACCCCTC TGCCGTCTCC GAACCGGAAT TGTAGCTAGA TGTATATGTC 120TTGACGAACC AGGTGTCCAC GGGCAAATCC CTCACAATTG ATGGCCCGTC CCGTTCCCAT 180CGATTTGTGC TACCTGCCGT GCAAGGCAAA ACATCCCCGT CAAACGTCCG AGGGGCATTG 240CCTGCAATCT CTCGACCATG AGAGGGGAAG CAAGTCACGC TAGTTGCAAG GGTATAGGTC 300CTACGCAGCA ATGAGGTGGC TTCACCCGTA CGGAGTGGGG ACAGCATGAT CAAGCCTTTT 360GGGAACGTGA CGAAAGAGTA CCGGTTAAGC CGACGATGGG AGATGAATCT CTGCCGAGCA 420AAGGACGAGA CCGGAAAAGA GTGTGTTGAT TCTTGGGAGC AGTTACAGTA CTTCCGTGTC 480CGGAAATTGG AAACGTTCCT GACCAATGCT GGCGATCATC TGATATCCCT ACGCTGATTG 540GTCCATCCCC CGATAAATGC CCGACACGAC GCTTGAGCCC TGAAAAGGTA GTATTTCTCG 600AGAGATCCAT TCACCAGAGT CAATACTGGC AAATACATCG TTCCCCACCT CATATTCCAA 660GGTGCCTAAA CCCCTCCGGT GTGCCGGTGA GGGTTTTCCA CGCCATCTCT AGTGGTGCCA 720TGACGGGAGC ATCCGATGGC TTCCAGTATT GGGTGGTTGG GATGGACAAC AAGCTCCAAA 780TAAGGGGAAT TTGCCTTTGG TCCAGGAATG AAGTCCCCGT GGGGACCAGC GGCTCAGCCC 840AGGCTAAGAG TGGAATATCG TCATAGACCT TCGGCTCATG GGAGGTTCGG AGGTGTTACG 900ATCCTCTTCA ATGCCATTCA TTCTCTGTTT TGACCTCGGC TTCCCGAGAG TGGTGCCTCC 960CTTACATCCC CACATGCTGG ATGCAAGCCT GTGGTACGCT GTTTCTTTCA GAAGTAGCAG 1020GCTAGGTTCA CGATGAGCTG CCTTTCAAAC CTGGAATAAC CATTACGTGA GACTGTTCTA 1080CTTCTTGAAT TGATCCCTGA CTAGAGTCTG CTCTAATATG CTGTGTGGCA CGGCCGGTCC 1140CCTCGGGGTT GCTAAGGCTG ATTTATGCAC TCCGTACAGT ATAACCCAGG GTGGCTATAG 1200ATTCCCTGCA TCTTCCACGC TCCCTCACAA CCTGATTCCA CCATTCTTAA GCGGCCGTTA 1260GCCTCGATGG GGTATAATGG AGTTAACTAT AAACACGACT CTACAACGAA TCCCGATGTG 1320AGTTTGGAAC GAGTTGTTAC CGATGGGTCC TCCCATTTGT TAGGAGTGAC GCTAGGGGAC 1380CTTTAGGGCA CAGACTAAAC CAAGACAAAG ATGGAGTAGA CTCCAGGTAG ATTAATTCCA 1440ATCTTCTTGC CAAAGTAACG CGGGGTTTTT TGCACCTGCA GCCTCTTTTT TTTCTTTTTT 1500CTTTTTTTTC TTTTTTTATT GTTCCCCAGA TTTCTTTTCT TTTTCTTCAA TCCTGACGTT 1560CTCAACCGTG ATGGCGACAC AGCCCGCTTC GCTATCCCTC GCTTTTACGT CGGCCATTCT 1620TCTAGTTGCT CTCGCGGGAT GCCATGATTT CTAAAGGCTC CACATCGGCG AGATAGTATC 1680CTATCCGAGC ATGTCTCATT CTCCAACCGA CATTCCCTCA ACATCCGAAA AGGAAATGGA 1740GTCAACCCCA GAAAAGCCGC CTAAACAGGC CTGCGACAAT TGCCGTCGAC GCAAAATCAA 1800GTGTTCTAGA GAGCTTCCAT GCGACAAGTG CCAGCGTCTT CTTCTCTCCT GTTCCTACAG 1860CGACGTGCTC CGTCGCAAGG GCCCCAAGTT CCGCACGCTC TACCCTCTCG CTCCCATCCA 1920TCCACTCGCC TCACGACCAC GTCCTCTCAC CAAGGAATGG CTGCCCCCAA ACCCAGGGGC 1980TTGCCATTTG GCGTCCCCGA CGTCTCCGCC GTCCACCGTA GCTGACGCCC AGTATCTACA 2040TCCAGACTTC TCGGAGTCGT TCACTCGACT ACCACCCCCA GATCTCGTCT CCTCTCCCGA 2100CTCGACAAAC TCGCTATTCG ACTCGTCCAC TATCGGCGCA CTCCCCGCGC CACGCCGTCT 2160GTCGACGCCA AACCTTCTAG CCCATGTCAA TGTCTTCCTC AAGTACCTGT TCCCGATCAT 2220GCCCGTCGTG AGACAGGACC AGCTGCAGCA GGACTGCCAC CAGCCGGAGC GCTTGTCTCC 2280CCAACGCTAC GCTTTCATTG CCGCTCTATG CGCGGCCACG CACATCCAAC TGAAGCTGGA 2340CGGTGCAGCA CCGGGTCCCC AGGCGGCTTC CGCGCGAGCC AGCCTCGACG GACATCCTAT 2400GTTGTCGGGA GAAGAACTCC TGGCTGAAGC CGTGCGCGCA AGAAAGGAAT ACAACGTGGT 2460CGACGAAATT AACATGGAAA ACCTCCTAAC CTCCTTCTTT CTCTTCGCCG CCTACGGAAA 2520CCTAGACAGA CAGGATCAGG CCTGGTTCTA CCTATGTCAG ACCACGTCCA TGGTCTTCAC 2580ACTAGGCCTA CAACGGGAAT CCACATACTC GAAACTAAGC GTCGAGGAAG CAGAAGAGAA 2640AAGGAGAGTA TTCTGGCTCT TATTCGTCAC AGAAAGGTAA GAAAAGAAAA AACTCTACTT 2700TCCCAATCAC CACCACGTAC CAAAAATAAC ACGAAAAACC AGAGGCTACG CATTACAACA 2760AGCAAAACCA GTCATGCTCC GCAACTCCAT CCACAAACCA CAGGTCCTGT GCTCAGACGA 2820CCCAATCCTA GCCTACGGGT TCATCAACCT CATCAACGTC TTCGAAAAGC TCAGCCCAAA 2880TCTCTACGAC TGGGTCTCCG CCGGCGGCAG CAGCGCAGAC GGCGACCCCC CGCCTACTTC 2940TTCTATCCAA TCCAGTCTCG CCAAGCAAAT CTCCCTCGAG GGCGTCTCCG AGATCCAGAA 3000AGTAGACATC CTCATCACTC AGCAATGGCT ACAAACCATG ATGTGGAAAC TCTCCATGAC 3060CCACGTCACA CAGCCCGGCT CTCGCGATGA CGCCGTTCTC CCCTTCCACC TGCCCGTGCT 3120AGTCGGCAAG GCCGTCATGG GCGTCATCGC CGCGGCATCC CAAGGTGCTG TTGACGCTCA 3180TGGTATCGGA ATGGTAAGAA AGCGACCTTA CCTCATCACA CCCTCCCTCA TCAGTCACTC 3240CCCATCATCT ATACCCGCAA TCTAACAAAA ACCGCAGGAA CAAAAACTCT ACGACCTCGG 3300CACCTCCGTA GCCGACGTCT CCCGCTCCCT AAGCACAAAA GCCGCCCACC ACCTCGCCGA 3360ATCGACCATC GACCCCCGAG AACTCCTCTG GGGCATTCTC ACAACCCTAT CCCGAATCCG 3420CGGTTCCCAA TCATACCTCT TCCCAGCGCT CGTCGAGCAA AGTCGAGGCA TCATCAGTTT 3480CGACTGTTCG CTTTCCATCA GTGACTTTCT GCCTTCGTTT GGTGGGCCGC CGGCTATTAT 3540GTGGCGGACG GGTGAATCTG GGTTTGATTT ATTGGGGATC GCGGATGATT TGCAAGAGAG 3600GGAGAATGAG GGTGGGGAGG GGATTGTGGT GGCTGGGGAG GAGATTTCGT TTTGAGGGGG 3660CTCTTTTCTT TTTCCTTTGT GGTGTGTTGT GTTGGGTGGT TCTGGGGGGG CGGGGGTGTA 3720TATACGCTTG ACGATGTGCA TTGGGATTGG GGTTCCTACT GGTATATAAT ATGGATTGTT 3780TTGTATATAG TCCGCTGGAG ACGGTGCAAT GATGTGGGGA TCAATCACTT CTTAGGACTC 3840GGAGCACAGG GTGTCGGTTC TCGGGTTATT CTGAGTATGA GATTATATAG AATCAGTTAA 3900TGATCATTAT TGTACATACC TTAAAGAAAG ATATGCTTGG CACCCCGATA TGACAATAGA 3960AAACTGGTCT TCATTCTAGA 3980(2)SEQ ID NO:2的信息：(ⅰ)序列特征：

(A)长度：3980碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)(ⅲ)假设：无(ⅳ)反义：无(ⅵ)最初来源：

(A)生物体：米曲霉 (ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：外显子

(B)定位：1691..2676(ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：内含子

(B)定位：2677..2742(ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：外显子

(B)定位：2743..3193(ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：内含子

(B)定位：3194..3277(ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：外显子

(B)定位：3278..3653(ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：CDS

(B)定位：join(1691..2676,2743..3193,3278..3653)(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:2:TCTAGACCGG CCATGTCGTG GTCCGCCAAG TTGATTCCGG ACCGTGTTGT AGTTGCTTCT 60TTTAAGAAAC GGCACCCCTC TGCCGTCTCC GAACCGGAAT TGTAGCTAGA TGTATATGTC 120TTGACGAACC AGGTGTCCAC GGGCAAATCC CTCACAATTG ATGGCCCGTC CCGTTCCCAT 180CGATTTGTGC TACCTGCCGT GCAAGGCAAA ACATCCCCGT CAAACGTCCG AGGGGCATTG 240CCTGCAATCT CTCGACCATG AGAGGGGAAG CAAGTCACGC TAGTTGCAAG GGTATAGGTC 300CTACGCAGCA ATGAGGTGGC TTCACCCGTA CGGAGTGGGG ACAGCATGAT CAAGCCTTTT 360GGGAACGTGA CGAAAGAGTA CCGGTTAAGC CGACGATGGG AGATGAATCT CTGCCGAGCA 420AAGGACGAGA CCGGAAAAGA GTGTGTTGAT TCTTGGGAGC AGTTACAGTA CTTCCGTGTC 480CGGAAATTGG AAACGTTCCT GACCAATGCT GGCGATCATC TGATATCCCT ACGCTGATTG 540GTCCATCCCC CGATAAATGC CCGACACGAC GCTTGAGCCC TGAAAAGGTA GTATTTCTCG 600AGAGATCCAT TCACCAGAGT CAATACTGGC AAATACATCG TTCCCCACCT CATATTCCAA 660GGTGCCTAAA CCCCTCCGGT GTGCCGGTGA GGGTTTTCCA CGCCATCTCT AGTGGTGCCA 720TGACGGGAGC ATCCGATGGC TTCCAGTATT GGGTGGTTGG GATGGACAAC AAGCTCCAAA 780TAAGGGGAAT TTGCCTTTGG TCCAGGAATG AAGTCCCCGT GGGGACCAGC GGCTCAGCCC 840AGGCTAAGAG TGGAATATCG TCATAGACCT TCGGCTCATG GGAGGTTCGG AGGTGTTACG 900ATCCTCTTCA ATGCCATTCA TTCTCTGTTT TGACCTCGGC TTCCCGAGAG TGGTGCCTCC 960CTTACATCCC CACATGCTGG ATGCAAGCCT GTGGTACGCT GTTTCTTTCA GAAGTAGCAG 1020GCTAGGTTCA CGATGAGCTG CCTTTCAAAC CTGGAATAAC CATTACGTGA GACTGTTCTA 1080CTTCTTGAAT TGATCCCTGA CTAGAGTCTG CTCTAATATG CTGTGTGGCA CGGCCGGTCC 1140CCTCGGGGTT GCTAAGGCTG ATTTATGCAC TCCGTACAGT ATAACCCAGG GTGGCTATAG 1200ATTCCCTGCA TCTTCCACGC TCCCTCACAA CCTGATTCCA CCATTCTTAA GCGGCCGTTA 1260GCCTCGATGG GGTATAATGG AGTTAACTAT AAACACGACT CTACAACGAA TCCCGATGTG 1320AGTTTGGAAC GAGTTGTTAC CGATGGGTCC TCCCATTTGT TAGGAGTGAC GCTAGGGGAC 1380CTTTAGGGCA CAGACTAAAC CAAGACAAAG ATGGAGTAGA CTCCAGGTAG ATTAATTCCA 1440ATCTTCTTGC CAAAGTAACG CGGGGTTTTT TGCACCTGCA GCCTCTTTTT TTTCTTTTTT 1500CTTTTTTTTC TTTTTTTATT GTTCCCCAGA TTTCTTTTCT TTTTCTTCAA TCCTGACGTT 1560CTCAACCGTG ATGGCGACAC AGCCCGCTTC GCTATCCCTC GCTTTTACGT CGGCCATTCT 1620TCTAGTTGCT CTCGCGGGAT GCCATGATTT CTAAAGGCTC CACATCGGCG AGATAGTATC 1680CTATCCGAGC ATG TCT CAT TCT CCA ACC GAC ATT CCC TCA ACA TCC GAA 1729

Met Ser His Ser Pro Thr Asp Ile Pro Ser Thr Ser Glu

1 5 10AAG GAA ATG GAG TCA ACC CCA GAA AAG CCG CCT AAA CAG GCC TGC GAC 1777Lys Glu Met Glu Ser Thr Pro Glu Lys Pro Pro Lys Gln Ala Cys Asp

15 20 25AAT TGC CGT CGA CGC AAA ATC AAG TGT TCT AGA GAG CTT CCA TGC GAC 1825Asn cys Arg Arg Arg Lys Ile Lys Cys Ser Arg Glu Leu Pro Cys Asp30 35 40 45AAG TGC CAG CGT CTT CTT CTC TCC TGT TCC TAC AGC GAC GTG CTC CGT 1873Lys Cys Gln Arg Leu Leu Leu Ser Cys Ser Tyr Ser Asp Val Leu Arg

50 55 60CGC AAG GGC CCC AAG TTC CGC ACG CTC TAC CCT CTC GCT CCC ATC CAT 1921Arg Lys Gly Pro Lys Phe Arg Thr leu Tyr Pro Leu Ala Pro Ile His

65 70 75CCA CTC GCC TCA CGA CCA CGT CCT CTC ACC AAG GAA TGG CTG CCC CCA 1969Pro leu Ala Ser Arg Pro Arg pro Leu Thr Lys Glu Trp Leu Pro Pro

80 85 90AAC CCA GGG GCT TGC CAT TTG GCG TCC CCG ACG TCT CCG CCG TCC ACC 2017Asn Pro Gly Ala Cys His Leu Ala Ser Pro Thr Ser Pro Pro Ser Thr

95 100 105GTA GCG GAC GCC CAG TAT CTA CAT CCA GAC TTC TCG GAG TCG TTC ACT 2065Val Ala Asp Ala Gln Tyr Leu His Pro Asp Phe Ser Glu Ser Phe Thr110 115 120 125CGA CTA CCA CCC CCA GAT CTC GTC TCC TCT CCC GAC TCG ACA AAC TCG 2113Arg Leu Pro Pro Pro Asp Leu Val Ser Ser Pro Asp Ser Thr Asn Ser

130 135 140CTA TTC GAC TCG TCC ACT ATC GGC GCA CTC CCC GCG CCA CGC CGT CTG 2161Leu Phe Asp Ser Ser Thr Ile Gly Ala Leu Pro Ala Pro Arg Arg Leu

145 150 155TCG ACG CCA AAC CTT CTA GCC CAT GTC AAT GTC TTC CTC AAG TAC CTG 2209Ser Thr Pro Asn Leu Leu Ala His Val Asn Val Phe Leu Lys Tyr Leu

160 165 170TTC CCG ATC ATG CCC GTC GTG AGA CAG GAC CAG CTG CAG CAG GAC TGC 2257Phe Pro Ile Met Pro Val Val Arg Gln Asp Gln Leu Gln Gln Asp Cys

175 180 185CAC CAG CCG GAG CGC TTG TCT CCC CAA CGC TAC GCT TTC ATT GCC GCT 2305His Gln Pro Glu Arg Leu Ser Pro Gln Arg Tyr Ala Phe Ile Ala Ala190 195 200 205CTA TGC GCG GCC ACG CAC ATC CAA CTG AAG CTG GAC GGT GCA GCA CCG 2353Leu Cys Ala Ala Thr His Ile Gln Leu Lys Leu Asp Gly Ala Ala Pro

210 215 220GGT CCC GAG GCG GCT TCC GCG CGA GCC AGC CTC GAC GGA CAT CCT ATG 2401Gly Pro Glu Ala Ala Ser Ala Arg Ala Ser Leu Asp Gly His Pro Met

225 230 235TTG TCG GGA GAA GAA CTC CTG GCr GAA GCC GTG CGC GCA AGA AAG GAA 2449Leu Ser Gly Glu Glu Leu Leu Ala Glu Ala Val Arg Ala Arg Lys Glu

240 245 250TAC AAC GTG GTC GAC GAA ATT AAC ATG GAA AAC CTC CTA ACC TCC TTC 2497Tyr Asn Val Val Asp Glu Ile Asn Met Glu Asn Leu Leu Thr Ser Phe

255 260 265TIT CTC TTC GCC GCC TAC GGA AAC CTA GAC AGA CAG GAT CAG GCC TGG 2545Phe Leu Phe Ala Ala Tyr Gly Asn Leu Asp Arg Gln Asp Gln Ala Trp270 275 280 285TTC TAC CTA TGT CAG ACC ACG TCC ATG GTC TTC ACA CTA GGC CTA CAA 2593Phe Tyr Leu Cys Gln Thr Thr Ser Met Val Phe Thr Leu Gly Leu Gln

290 295 300CGG GAA TCC ACA TAC TCG AAA CTA AGC GTC GAG GAA GCA GAA GAG AAA 2641Arg Glu Ser Thr Tyr Ser Lys Leu Ser Val Glu Glu Ala Glu Glu Lys

305 310 315AGG AGA GTA TTC TGGCTC TTA TTC GTC ACA GAA AG GTAAGAAAAG 2686Arg Arg Val Phe Trp Leu Leu Phe Val Thr Glu Arg

320 325AAAAAACTCT ACTTCCCAA TCACCACCAC GTACCAAAAA TAACACGAAA AACCAG A 2743GGC TAC GCA TTA CAA CAA GCA AAA CCA GTC ATG CTC CGC AAC TCC ATC 2791Gly Tyr Ala Leu Gln Gln Ala Lys Pro Val Met Leu Arg Asn Ser Ile330 335 340 345CAC AAA CCA CAG GTC CTG TG C TCA GAC GAC CCA ATC CTA GCC TAC GGG 2839His Lys Pro Gln Val Leu Cys Ser Asp Asp Pro Ile Leu Ala Tyr Gly

350 355 360TTC ATC AAC CTC ATC AAC GTC TTC GAA AAG CTC AGC CCA AAT CTC TAC 2887Phe Ile Asn Leu Ile Asn Val Phe Glu Lys Leu Ser Pro Asn Leu Tyr

365 370 375GAC TGG GTC TCC GCC GGC GGC AGC AGC GCA GAC GGC GAC CCC CCG CCT 2935Asp Trp Val Ser Ala Gly Gly Ser Ser Ala Asp Gly Asp Pro pro Pro

380 385 390ACT TCT TCT ATC CAA TCC AGT CTC GCC AAG CAA ATC TCC CTC GAG GGC 2983Thr Ser Ser Ile Gln Ser Ser Leu Ala Lys Gln Ile Ser Leu Glu Gly

395 400 405GTC TCC GAG ATC CAG AAA GTA GAC ATC CTC ATC ACT CAG CAA TGG CTA 3031Val Ser Glu Ile Gln Lys Val Asp Ile Leu Ile Thr Gln Gln Trp Leu410 415 420 425CAA ACC ATG ATG TGG AAA CTC TCC ATG ACC CAC GTC ACA CAG CCC GGC 3079Gln Thr Met Met Trp Lys Leu Ser Met Thr His Val Thr Gln Pro Gly

430 435 440TCT CGC GAT GAC GCC GTT CTC CCC TTC CAC CTG CCC GTG CTA GTC GGC 3127Ser Arg Asp Asp Ala Val Leu Pro Phe His Leu Pro Val Leu Val Gly

445 450 455AAG GCC GTC ATG GGC GTC ATC GCC GCG GCA TCC CAA GGT GCT GTT GAC 3175Lys Ala Val Met Gly Val Ile Ala Ala Ala Ser Gln Gly Ala Val Asp

460 465 470GCT CAT GGT ATC GGA ATG GTAAGAAAGC GACCTTACCT CATCACACCC 3223Ala His Gly Ile Gly Met

475TCCCTCATCA GTCACTCCCC ATCATCTATA CCCGCAATCT AACAAAAACC GCAG GAA 3280

Glu

480CAA AAA CTC TAC GAC CTC GGC ACC TCC GTA GCC GAC GTC TCC CGC TCC 3328Gln Lys Leu Tyr Asp Leu Gly Thr Ser Val Ala Asp Val Ser Arg Ser

485 490 495CTA AGC ACA AAA GCC GCC CAC CAC CTC GCC GAA TCG ACC ATC GAC CCC 3376Leu Ser Thr Lys Ala Ala His His Leu Ala Glu Ser Thr Ile Asp pro

500 505 510CGA GAA CTC CTC TGG GGC ATT CTC ACA ACC CTA TCC CGA ATC CGC GGT 3424Arg Glu Leu Leu Trp Gly Ile Leu Thr Leu Ser Arg Ile Arg Gly

515 520 525TCC CAA TCA TAC CTC TTC CCA GCG CTC GTC GAG CAA AGT CGA GGC ATC 3472Ser Gln Ser Tyr Leu Phe Pro Ala Leu Val Glu Gln Ser Arg Gly Ile

530 535 540ATC AGT TTC GAC TGT TCG CTT TCC ATC AGT GAC TTT CTG CCT TCG TTT 3520Ile Ser Phe Asp Cys Ser Leu Ser Ile Ser Asp Phe Leu Pro Ser Phe545 550 555 560GGT GGG CCG CCG GCT ATT ATG TGG CCG ACG GGT GAA TCT GGG TTT GAT 3568Gly Gly Pro Pro Ala Ile Met Trp Arg Thr Gly Glu Ser Gly Phe Asp

565 570 575TTA TTG GGG ATC GCG GAT GAT TTG CAA GAG AGG GAG AAT GAG GGT GGG 3616Leu Leu Gly Ile Ala Asp Asg Leu Gln Glu Arg Glu Asn Glu Gly Gly

580 585 590GAG GGG ATT GTG GTG GCT GGG GAG GAG ATT TCG TTT TGAGGGGGCT 3662Glu Gly Ile Val Val Ala Gly Glu Glu Ile Ser Phe

595 600CTTTTCTTTT TCCTTTGTGG TGTGTTGTGT TGGGTGGTTC TGGGGGGGCG GGGGTGTATA 3722TACGCTTGAC GATGTGCATT GGGATTGGGG TTCCTACTGG TATATAATAT GGATTGTTTT 3782GTATATAGTC CGCTGGAGAC GGTGCAATGA TGTGGGGATC AATCACTTCT TAGGACTCGG 3842AGCACAGGGT GTCGGTTCTC GGGTTATTCT GAGTATGAGA TTATATAGAA TCAGTTAATG 3902ATCATTATTG TACATACCTT AAAGAAAGAT ATGCTTGGCA CCCCGATATG ACAATAGAAA 3962ACTGGTCTTC ATTCTAGA 3980(2)SEQ ID NO:3的信息：(ⅰ)序列特征：

(A)长度：604氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：蛋白质(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:3:Met Ser His Ser Pro Thr Asp Ile Pro Ser Thr Ser Glu Lys Glu Met1 5 10 15Glu Ser Thr Pro Glu Lys Pro Pro Lys Gln Ala Cys Asp Asn Cys Arg

20 25 30Arg Arg Lys Ile Lys Cys Ser Arg Glu Leu Pro Cys Asp Lys Cys Gln

35 40 45Arg Leu Leu Leu Ser Cys Ser Tyr Ser Asp Val Leu Arg Arg Lys Gly

50 55 60Pro Lys Phe Arg Thr Leu Tyr Pro Leu Ala Pro Ile His Pro Leu Ala65 70 75 80Ser Arg Pro Arg Pro Leu Thr Lys Glu Trp Leu Pro Pro Asn Pro Gly

85 90 95Ala Cys His Leu Ala Ser Pro Thr Ser Pro Pro Ser Thr Val Ala Asp

100 105 110Ala Gln Tyr Leu His Pro Asp Phe Ser Glu Ser Phe Thr Arg Leu Pro

115 120 125Pro Pro Asp Leu Val Ser Ser Pro Asp Ser Thr Asn Ser Leu Phe Asp

130 135 140Ser Ser Thr Ile Gly Ala Leu Pro Ala Pro Arg Arg Leu Ser Thr Pro145 150 155 160Asn Leu Leu Ala His Val Asn Val Phe Leu Lys Tyr Leu Phe Pro Ile

165 170 175Met Pro Val Val Arg Gln Asp Gln Leu Gln Gln Asp Cys His Gln Pro

180 185 190Glu Arg Leu Ser Pro Gln Arg Tyr Ala Phe Ile Ala Ala Leu Cys Ala

195 200 205Ala Thr His Ile Gln Leu Lys Leu Asp Gly Ala Ala Pro Gly Pro Glu

210 215 220Ala Ala Ser Ala Arg Ala Ser Leu Asp Gly His Pro Met Leu Ser Gly225 230 235 240Glu Glu Leu Leu Ala Glu Ala Val Arg Ala Arg Lys Glu Tyr Asn Val

245 250 255Val Asp Glu Ile Asn Met Glu Asn Leu Leu Thr Ser Phe Phe Leu Phe

260 265 270Ala Ala Tyr Gly Asn Leu Asp Arg Gln Asp Gln Ala Trp Phe Tyr Leu

275 280 285Cys Gln Thr Thr Ser Met Val Phe Thr Leu Gly Leu Gln Arg Glu Ser

290 295 300Thr Tyr Ser Lys Leu Ser Val Glu Glu Ala Glu Glu Lys Arg Arg Val305 310 315 320Phe Trp Leu Leu Phe Val Thr Glu Arg Gly Tyr Ala Leu Gln Gln Ala

325 330 335Lys Pro Val Met Leu Arg Asn Ser Ile His Lys Pro Gln Val Leu Cys

340 345 350Ser Asp Asp Pro Ile Leu Ala Tyr Gly Phe Ile Asn Leu Ile Asn Val

355 360 365Phe Glu Lys Leu Ser Pro Asn Leu Tyr Asp Trp Val Ser Ala Gly Gly

370 375 380Ser Ser Ala Asp Gly Asp Pro Pro Pro Thr Ser Ser Ile Gln Ser Ser385 390 395 400Leu Ala Lys Gln Ile Ser Leu Glu Gly Val Ser Glu Ile Gln Lys Val

405 410 415Asp Ile Leu Ile Thr Gln Gln Trp Leu Gln Thr Met Met Trp Lys Leu

420 425 430Ser Met Thr His Val Thr Gln Pro Gly Ser Arg Asp Asp Ala Val Leu

435 440 445Pro Phe His Leu Pro Val Leu Val Gly Lys Ala Val Met Gly Val Ile

450 455 460Ala Ala Ala Ser Gln Gly Ala Val Asp Ala His Gly Ile Gly Met Glu465 470 475 480Gln Lys Leu Tyr Asp Leu Gly Thr Ser Val Ala Asp Val Ser Arg Ser

485 490 495Leu Ser Thr Lys Ala Ala His His Leu Ala Glu Ser Thr Ile Asp Pro

500 505 510Arg Glu Leu Leu Trp Gly Ile Leu Thr Thr Leu Ser Arg Ile Arg Gly

515 520 525Ser Gln Ser Tyr Leu Phe Pro Ala Leu Val Glu Gln Ser Arg Gly Ile

530 535 540Ile Ser Phe Asp Cys Ser Leu Ser Ile Ser Asp Phe Leu Pro Ser Phe545 550 555 560Gly Gly Pro Pro Ala Ile Met Trp Arg Thr Gly Glu Ser Gly Phe Asp

565 570 575Leu Leu Gly Ile Ala Asp Asp Leu Gln Glu Arg Glu Asn Glu Gly Gly

580 585 590Glu Gly Ile Val Val Ala Gly Glu Glu Ile Ser Phe

595 600(2)SEQ ID NO:4的信息：(ⅰ)序列特征：

(A)长度：26碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：引物4650(ⅲ)假设：有(ⅲ)反义：无(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:4:CTTGCATGCC GCCAGGACCG AGCAAG 26(2)SEQ ID NO:5的信息：(ⅰ)序列特征：

(A)长度：26碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：引物4651(ⅲ)假设：有(ⅲ)反义：无(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:5:CTTGGATCCT CTGTGTTAGC TTATAG 26(2)SEQ ID NO:6的信息：(ⅰ)序列特征：

(A)长度：30碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：引物(ⅲ)假设：有 (ⅲ)反义：无(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:6:CCCCAAGCTT CGCCGTCTGC GCTGCTGCCG 30(2)SEQ ID NO:7的信息：(ⅰ)序列特征：

(A)长度：29碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：引物(ⅲ)假设：有(ⅲ)反义：无(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:7:CGGAATTCAT CAACCTCATC AACGTCTTC 29(2)SEQ ID NO:8的信息：(ⅰ)序列特征：

(a)长度：29碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：引物 (ⅲ)假设：有(ⅲ)反义：无(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:8:CGGAATTCAT CGGCGAGATA GTATCCTAT 29(2)SEQ ID NO:9的信息：(ⅰ)序列特征：

(A)长度：41碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：引物(ⅲ)假设：有(ⅲ)反义：无(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:9:TTTTGTAAGC TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT T 41

Claims

1．调节丝状真菌中α淀粉酶启动子表达的转录因子。

2．权利要求1的因子，其来源于曲霉属、木霉属、青霉属、镰孢属、腐质霉属的真菌。

3．权利要求2的因子，其来源于米曲霉、黑曲霉、泡盛曲霉，特别是米曲霉IFO4177。

4．权利要求3的因子，其具有包括SEQ ID NO.3所示氨基酸序列的一个或多个片段的氨基酸序列。

5．具有编码权利要求1至4中任何一项的因子的DNA序列的DNA构建物。

6．权利要求5的DNA序列，其具有包括如SEQ ID No:1所示DNA序列的一个片段或片段组合的DNA序列。

7．包括编码在调节丝状真菌中α淀粉酶启动子表达中表现活性的转录因子的DNA序列的DNA构建物，所说的DNA序列包括：

a)克隆到存在于大肠杆菌Toc1058,DSM10666中的质粒pToC320中的DNA序列的转录因子编码部分；或

b)a)中限定的DNA序列的类似物，该类似物

ⅰ)与a)中限定的DNA序列至少有60％同源性，或者

ⅱ)与a)中限定的DNA序列的同样核苷酸探针杂交，或者

ⅲ)编码与含有由a)中限定的DNA序列的DNA序列编码的转录因子至少有50％同源性的转录因子，或者

ⅴ)弥补ToC879中的突变，即，使ToC879能够在环糊精基质上生长，并且当用所说的DNA序列转化时产生脂酶。

8．根据权利要求5至7中任何一项的DNA构建物，其中所说的DNA序列可从丝状真菌中得到。

9．根据权利要求8的DNA构建物，其中所说的丝状真菌属于藻状菌、接合菌、子囊菌、担子菌和不全真菌，包括如曲霉属、青霉属、木霉属、镰孢属和腐质霉属的丝孢菌，特别是曲霉种的，更具体是米曲霉的菌株。

10．根据权利要求9的DNA构建物，其中所说的DNA序列分离自米曲霉菌株的DNA文库或者是基于所说DNA文库产生的。

11．根据权利要求5至8的DNA构建物，其中所说的DNA序列是可从酵母菌株，特别是酵母属的菌株得到的。

12．根据权利要求7的DNA构建物，其中DNA序列分离自大肠杆菌DSM10666。

13．含有根据权利要求5至12中任何一项的DNA构建物的重组表达载体。

14．包含根据权利要求5至12中任何一项的DNA构建物，或根据权利要求13的重组表达载体的细胞。

15．根据权利要求14的细胞，其为真核细胞，特别是真菌细胞，如酵母细胞或丝状真菌细胞。

16．根据权利要求15的细胞，其为曲霉种的菌株，特别是黑曲霉或米曲霉的菌株。

17．根据权利要求15的细胞，其为木霉种，特别是T.reesei的菌株。

18．根据权利要求15的细胞，其为酵母属，特别是酿酒酵母的菌株。

19．生产感兴趣的多肽的方法，包括在适于产生所说的因子或所说的感兴趣的多肽的条件下培养权利要求14至18中任何一项的细胞，并回收所说的感兴趣的多肽。

20．权利要求19的方法，其中所说的真菌是曲霉属、木霉属、青霉属、镰孢属或腐质霉属的真菌。

21．权利要求20的方法，其中所说的细胞是米曲霉、黑曲霉或泡盛曲霉种的。

22．权利要求19、20或21的方法，其中感兴趣的多肽是药用多肽。

23．权利要求22的方法，其中所说的药用多肽是生长激素、胰岛素或凝血因子。

24．权利要求19、20或21的方法，其中所说的多肽是工业酶。

25．权利要求24的方法，其中所说的工业酶是碳酰水解酶、糖酶、蛋白酶、脂酶、淀粉酶、纤维素酶、氧化还原酶、葡糖淀粉酶或酯酶。

26．权利要求1至4中任何一项的因子用于提高丝状真菌中感兴趣的多肽的表达。

27．权利要求26的应用，其中所说的因子是权利要求4的因子。

28．权利要求27的应用，其中所说的真菌是曲霉属、青霉属、木霉属、镰孢属和腐质霉属的真菌，特别是曲霉种，尤其是米曲霉的菌株。

29．权利要求28的应用，其中所说的真菌是米曲霉、黑曲霉、泡盛曲霉、T.reesei或T.harzianum的真菌。

30．权利要求26至29中任何一项的应用，其中所说的感兴趣的多肽是药用多肽。

31．权利要求30的应用，其中所说的药用多肽是生长激素、胰岛素或凝血因子。

32．权利要求26至29中任何一项的应用，其中所说的多肽是工业酶。

33．权利要求32的应用，其中所说的工业酶是碳酰水解酶、糖酶、蛋白酶、脂酶、淀粉酶、纤维素酶、氧化还原酶、葡糖淀粉酶或酯酶。