ES2294644T3 - Factor de transcripcion de la alfa-amilasa. - Google Patents
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Abstract
Factor de transcripción capaz de regular la transcripción dirigida por un promotor de alfa-amilasa de un hongo filamentoso de una manera específica para la secuencia, que comprende una secuencia de aminoácidos tiene una identidad de al menos un 90% con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 3.
Description
Factor de transcripción de la
\alpha-amilasa.
\global\parskip0.900000\baselineskip
La presente invención se refiere a un factor de
transcripción encontrado en hongos filamentosos, especialmente en
Aspergillii, a las secuencias de ADN que codifican para
dicho factor, a su transformación y expresión en organismos
fúngicos huéspedes, y al uso de dicho factor en tales huéspedes para
aumentar la expresión de un polipéptido de interés que es producido
por dicho huésped.
Los factores de la transcripción son proteínas
conocidas implicadas en la iniciación de la transcripción. Estos
han sido estudiados intensivamente en muchos organismos diferentes
y también han sido descritos en hongos. Dhawale y Lane (NAR (1993)
21 5537-5546) han recopilado recientemente los
factores de transcripción de hongos, incluidos los hongos
filamentosos.
Muchos de los factores de transcripción son
proteínas reguladoras; se enlazan con el ADN del promotor y bien
activan o reprimen la transcripción como una respuesta a los
estímulos a la célula.
La expresión del gen de la
\alpha-amilasa en A. oryzae está regulada
en respuesta a la fuente de carbono disponible. El gen es expresado
al máximo cuando el organismo se cultiva en almidón o maltosa
(Lachmund et al. (1993) Current Microbiology 26
47-51; Tada et al. (1991) Mol. Gen. Genet.
229 301-306).
La expresión de la
\alpha-amilasa es regulada en el nivel
transcripcional como está mostrado por Lachmund et al.
(supra), que sugiere rotundamente que los factores de
transcripción están implicados en la regulación, pero hasta ahora
no se ha identificado ningún gen para este tipo de factor.
El promotor del gen de la
\alpha-amilasa ha sido estudiado por el análisis
de deleción (Tada et al. (1991) Agric. Biol. Chem. 55
1939-1941; Tsuchiya et al. (1992) BioSci.
Biotech. Biochem. 56 1849-1853; Nagata et al.
(1993) Mol. Gen. Genet. 237 251-260). Los autores
de estos documentos proponen que una secuencia específica del
promotor es responsable de la inducción de maltosa. Nagata et
al. (supra) usaron esta secuencia como una sonda en un
experimento de retardo en geles para ver si alguna proteína de los
extractos nucleares de A. nidulans habían sido capaces de
enlazarse con la secuencia promotora. Tres proteínas de este tipo
fueron encontradas, pero no se mostró ninguna involucración de estas
proteínas en la expresión. Ninguna proteína ha sido purificada o
identificada por otros medios. Sus genes asimismo siguen siendo
desconocidos.
La presente invención se refiere a un factor de
transcripción que regula la expresión del promotor de
\alpha-amilasa en hongos filamentosos. Un factor
de transcripción capaz de regular la transcripción dirigida por un
promotor de alfa-amilasa de un hongo filamentoso en
una forma específica para la secuencia, que comprende una secuencia
de aminoácidos que tiene al menos una identidad del 90% con la
secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 3.
La secuencia de ADN genómico de longitud total
que codifica un factor de transcripción ha sido derivado de una
cepa del hongo filamentoso Aspergillus oryzae y ha sido
clonado en el plásmido pToC320 presente en E. coli ToC1058,
DSM 10666.
Se cree que dicha secuencia de ADN que codifica
el factor de transcripción albergada en pToC320, DSM 10666, tiene
la misma secuencia que se presenta en la SEC ID NO: 1 y SEC ID NO:
2. Por consiguiente, siempre que se hace referencia al factor de
transcripción que codifica parte de la secuencia de ADN clonada en
el plásmido pToC320 presente en DSM 10666 tal referencia está
también destinada a incluir el factor de transcripción que codifica
parte de la secuencia de ADN presentada en la SEC ID NO: 1 y SEC ID
NO: 2.
Por consiguiente, los términos "el factor de
transcripción que codifica parte de la secuencia de ADN clonada en
el plásmido pToC320 presente en DSM 10666" y "el factor de
transcripción que codifica parte de la secuencia de ADN presentada
en la SEC ID NO: 1 y SEC ID NO: 2" pueden ser usados de forma
intercambiable.
En otros aspectos la invención proporciona un
vector de expresión que alberga el constructo de ADN de la
invención, una célula comprendiendo dicho constructo de ADN o dicho
vector de expresión y un método para producir un péptido que
presente actividad del factor de transcripción, dicho método
comprendiendo el cultivo de dicha célula bajo condiciones que
permiten la producción del factor de transcripción.
Este factor de transcripción de la invención
normalmente se origina a partir de un hongo filamentoso.
El término "hongo filamentoso" se destina a
incluir los grupos Phycomycetes, Zygomycetes, Ascomycetes,
Basidiomycetes y hongos imperfectos, incluyendo los Hyphomycetes
tales como los géneros Aspergillus, Penicillium, Trichoderma,
Fusarium y Humicola.
\global\parskip1.000000\baselineskip
La invención también se refiere a un método para
producir una célula huésped filamentosa fúngica que comprende la
introducción de un fragmento de ADN que codifica para cualquier
factor de este tipo en un hongo filamentoso donde un promotor de
\alpha-amilasa o un promotor corregulado regula la
expresión de un polipéptido de interés de un modo en el cual dicho
factor será expresado en dicho hongo.
En otro aspecto la invención se refiere a un
método para producir un polipéptido de interés, cuya expresión está
regulada por un promotor de \alpha-amilasa o un
promotor corregulado, comprendiendo el crecimiento de una célula
huésped fúngica filamentosa según el modo descrito anteriormente
bajo las condiciones propicias para la producción de dicho factor y
dicho polipéptido de interés, y la recuperación de dicho
polipéptido de interés.
Finalmente la invención se refiere al uso de
dicho factor para regular la expresión de un polipéptido de interés
en un hongo filamentoso.
En este contexto, regulación significa cambiar
las condiciones bajo las cuales el factor de la invención está
activo. Esto podría significar diferentes regímenes de pH,
sustrato, etc., por los cuales el efecto resultante es una
regulación mejorada de la expresión de la proteína de interés.
Además, la regulación también comprende eventos
que ocurren en la fase de crecimiento del hongo durante los cuales
el factor de transcripción está activo. Dependiendo de las
circunstancias, tanto un avance y/o una posposición de la fase en
la que el factor está activo puede incrementar la expresión y por
lo tanto el rendimiento.
Además, utilizando procedimientos estándares
conocidos en la técnica, se pueden identificar las secuencias de
ADN específicas implicadas en la unión de un factor de
transcripción, de ese modo permitiendo insertar secuencias de este
tipo en otros promotores normalmente no regulados por el factor y
permitiendo que estos promotores estén bajo la regulación de dicho
factor.
En las figuras
Fig. 1 muestra la estructura del plásmido
pMT1657, cuya construcción está descrita en el ejemplo 1;
Fig. 2 muestra la estructura del plásmido
pToC316, cuya construcción está descrita en el ejemplo 1;
Fig. 3 muestra la estructura del plásmido
pToC320, cuya construcción está descrita en el ejemplo 1;
Fig. 4 muestra la estructura de los plásmidos
pToC342 y pToC359, cuya construcción está descrita en el ejemplo
3;
Fig. 5 muestra la estructura del plásmido
pToC298, cuya construcción está descrita en el ejemplo 4;
Fig. 6 muestra los resultados de la producción
de lipasa por un transformante p960 de IFO4177 de A. oryzae
cultivado en medios YP conteniendo el 2% de glucosa
(\cuadradonegrotachado) o el 10% de glucosa
(\rombonegrotachado), en comparación con ToC1075 culti-
vado en medios YP conteniendo el 2% de glucosa (- -) o el 10% de glucosa (\romboblancotachado) y que están descritos en el ejemplo 4;
vado en medios YP conteniendo el 2% de glucosa (- -) o el 10% de glucosa (\romboblancotachado) y que están descritos en el ejemplo 4;
Fig. 7 muestra los resultados de la producción
de lipasa por ToC1139 cultivado en medios YP conteniendo el 2% de
glucosa (\cuadradonegrotachado) o el 10% de glucosa
(\rombonegrotachado), en comparación con ToC1075 cultivado en
medios YP conteniendo el 2% de glucosa (- -) o el 10% de
glucosa (\romboblancotachado) y que están descritos en el ejemplo
4; y
Fig. 8 muestra los resultados de la
autorradiografía de ADN de A. niger digerido con las enzimas
de restricción siguientes: vía 2, XbaI; vía 3, XmaI;
vía 4, SalI; vía 5, HindIII; vía 6, EcoRI; vía
7, BglII; vía 8, BamHI; vías 1 y 9 contienen 1 ADN
marcado con 32P digerido con BstEII. El experimento está
descrito en el ejemplo 5.
En un primer aspecto la invención se refiere a
un constructo de ADN que comprende una secuencia de ADN que
codifica un factor de transcripción que regula un promotor de la
\alpha-amilasa. Un factor de transcripción capaz
de regular la transcripción dirigido por un promotor de la
alfa-amilasa de un hongo filamentoso en un modo
específico para la secuencia, que comprende una secuencia de
aminoácidos que tiene al menos una identidad del 90% con la
secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 3.
Cuando se realizan sustituciones de nucleótidos,
los cambios de residuos de aminoácidos son preferiblemente de una
naturaleza inferior, es decir sustituciones de residuos de
aminoácidos conservadoras que no afectan significativamente en el
plegamiento o en la actividad de la proteína, pequeñas delecciones,
normalmente de uno hasta aproximadamente 30 residuos aminoácidos;
pequeñas extensiones amino o carboxilo terminales.
Ejemplos de sustituciones conservadoras están
incluidas en el grupo de aminoácidos básicos (tales como la
arginina, la lisina, la histidina), aminoácidos acídicos (tales
como el ácido glutámico y el ácido aspártico), aminoácidos polares
(tales como la glutamina y la asparagina), aminoácidos hidrofóbicos
(tales como la leucina, la isoleucina, la valina), aminoácidos
aromáticos (tales como la fenilalanina, el triptófano, la tirosina)
y aminoácidos pequeños (tales como la glicina, la alanina, la
serina, la treonina, la metionina). Para una descripción general de
la sustitución de nucleótidos, ver p. ej. Vado, et al.,
(1991), Protein Expression and Purification 2,
95-107.
Será evidente para los expertos en la técnica
que las sustituciones de este tipo pueden ser realizadas fuera de
las regiones fundamentales para el funcionamiento de la molécula y
además suponen un factor de transcripción activo. Los residuos
aminoácidos esenciales para la actividad del factor de
transcripción codificado por un constructo de ADN de la invención, y
en consecuencia preferiblemente no sometido a la sustitución, puede
ser identificado según los procedimientos conocidos en la técnica,
tales como la mutagénesis sitio dirigida o mutagénesis de barrido
de alanina (ver p. ej. Cunningham y Wells, (1989), Science 244
1081-1085). En la última técnica, las mutaciones
son introducidas en cada residuo de la molécula, y las moléculas
mutantes resultantes son evaluadas por su actividad biológica (es
decir el factor de transcripción que regula un promotor de la
\alpha-amilasa) para identificar los residuos
aminoácidos que son fundamentales para la actividad de la
molécula.
La homología a la que se hace referencia en (i)
arriba está determinada como el grado de identidad entre las dos
secuencias que indican una derivación de una secuencia a partir de
la otra. La homología puede de manera adecuada ser determinada
mediante programas informáticos conocidos en la técnica tales como
GAP proporcionado en el paquete informático GCG (Needleman, S.B. y
Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology 48
443-453). Usando GAP con los ajustes siguientes
para la comparación de las secuencias de ADN: penalización por la
creación de espacios de 5.0 y penalización por la extensión de
espacios de 0.3, la región de codificación de la secuencia de ADN
muestra algo de identidad preferiblemente de al menos un 60%, más
preferiblemente al menos un 70%, más preferiblemente al menos un
80%, más preferiblemente al menos un 90%, más preferiblemente al
menos un 95% con el factor de transcripción que codifica parte de
la secuencia de ADN mostrada en la SEC ID NO: 1 y SEC ID
NO: 2.
NO: 2.
La hibridación a la que se hace referencia en
(ii) arriba se destina a indicar que la secuencia de ADN análoga
hibrida a la misma sonda que la secuencia de ADN que codifica el
factor de transcripción bajo unas condiciones específicas
determinadas, lo que se describe con detalle en la sección
materiales y métodos más adelante. La sonda de oligonucleótidos que
se debe usar es la secuencia de ADN correspondiente al factor de
transcripción que codifica parte de la secuencia de ADN mostrada en
SEC ID NO: 1 o SEC ID NO: 2 o un fragmento de la misma.
La homología a la que se hace referencia en
(iii) arriba está determinada como el grado de identidad entre las
dos secuencias indicando una derivación de la primera secuencia a
partir de la segunda. La homología puede de manera adecuada ser
determinada mediante programas informáticos conocidos en la técnica
tales como GAP proporcionado en el paquete informático GCG
(Needleman, S.B. y Wunsch, C.D., supra). Usando GAP con los
ajustes siguientes para la comparación de la secuencia del factor
de transcripción: penalización por la creación de espacios de 3.0 y
penalización por la extensión de espacios de 0.1, el factor de
transcripción codificado por una secuencia de ADN análoga muestra
cierto grado de identidad preferiblemente de al menos un 50%, más
preferiblemente al menos un 60% más preferiblemente al menos un
70%, incluso más preferiblemente al menos un 80% especialmente al
menos un 90% con el factor de transcripción codificado por un
constructo de ADN que comprende el factor de transcripción que
codifica parte de la secuencia de ADN mostrada en la SEC ID NO: 2,
p. ej. con la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 3.
En relación con la propiedad (iv) la reactividad
inmunológica puede ser determinada por el método descrito en la
sección materiales y métodos más adelante.
En relación con la propiedad (v) el método de
complementación está descrito en el Ejemplo 1 de la presente.
La secuencia de ADN que codifica un factor de
transcripción de la invención puede ser aislada de la cepa IFO 4177
de Aspergillus oryzae usando métodos estándares p. ej. como
se describe por Sambrook, et Al., (1989) Molecular Cloning:
A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Lab.; Cold Spring Harbor,
NY.
Los métodos generales de aislamiento del ARN y
del ADN están también descritos en WO 93/11249 y WO 94/14953, cuyo
contenido está incorporado en la presente por referencia. Una
descripción más detallada del método de complementación está
provisto en el ejemplo 1 en la presente.
De forma alternativa, el ADN que codifica un
factor de transcripción de la invención, de acuerdo con los
procedimientos bien conocidos, puede ser convenientemente aislado
de una fuente adecuada, tal como cualquiera de los organismos
mencionados más abajo, usando sondas de oligonucleótidos sintéticas
preparadas en base a una secuencia de ADN descrita en la presente.
Por ejemplo, una sonda de oligonucleótidos adecuada puede ser
preparada basándose en el factor de transcripción que codifica
parte de las secuencias de nucleótidos presentadas como la SEC ID
NO: 1 o cualquier subsecuencia adecuada de la misma, o basándose en
la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 3.
La invención se refiere específicamente a un
factor de transcripción que regula la expresión del promotor de la
\alpha-amilasa en un hongo filamentoso, dicho
factor según se indica en el ejemplo 2 puede incluso regular la
expresión de otros genes.
En este contexto la expresión "hongo
filamentoso" se destina a incluir los grupos Phycomycetes,
Zygomycetes, Ascomycetes, Basidiomycetes y hongos imperfectos,
incluyendo Hyphomycetes tales como los géneros Aspergillus,
Penicillium, Trichoderma, Fusarium y Humicola.
En este contexto la expresión "promotor de la
\alpha-amilasa" significa una secuencia de
bases dirigidas inmediatamente hacia arriba de un gen de la
\alpha-amilasa cuya
ARN-polimerasa reconoce y se enlaza para promover la
transcripción del gen que codifica para la
\alpha-amilasa.
Como se ha indicado, se conocen los factores de
transcripción de muchos organismos y se prevé en consecuencia que
factores similares o correspondientes puedan ser encontrados
originándose a partir de otros hongos de los géneros
Aspergillus, Trichoderma, Penicillium, Fusarium, Humicola,
etc., y teniendo un efecto de aumento en la expresión de un
polipéptido que está bajo la regulación de los promotores de la
amilasa en cualquier hongo que pertenezca a cualquiera de estos
géneros.
Una comparación de la secuencia de ADN que
codifica para el factor de transcripción que regula el promotor de
\alpha-amilasa ha mostrado cierto grado de
homología a un factor de transcripción (CASUCI) que regula la
expresión de la glucosidasa en Candida y a MAL63 de
Saccharomyces cerevisiae como se describe en Kelly y
Kwon-Chung, (1992) J. Bacteriol. 174
222-232.
Está actualmente contemplado que una secuencia
de ADN que codifica un factor de transcripción homólogo al factor
de transcripción de la invención, es decir, una secuencia de ADN
análoga, puede ser obtenida de otros microorganismos. Por ejemplo,
la secuencia de ADN puede ser derivada por una selección similar de
una genoteca de ADNc de otro microorganismo, tal como una cepa de
Aspergillus, Saccharomyces, Erwinia, Fusarium o
Trichoderma.
Un aislamiento de una cepa de A. oryzae
donde el gen que codifica para un factor de transcripción de la
invención ha sido inactivado y ha sido depositado por los
inventores según el tratado de Budapest en el Reconocimiento
Internacional del depósito de microorganismos para los fines del
procedimiento en materia de patentes en el DSM, Deutsche Sammlung
von Mikroorganismen und Zellkulturen Gmbh, Mascheroder Weg 1b,
D-38124 Braunschweig, DEUTSCHLAND.
- Fecha de depósito:
- 6 de mayo 1996 (06.05.96)
- Ref. del depositante:
- ToC879 = NN049238
- Designación de DSM:
- DSM No.10671 de Aspergillus oryzae
La cepa DSM No.10671 de Aspergillus
oryzae depositada puede ser utilizada para aislar un factor de
transcripción según la invención de cualquier cepa de
Aspergillus oryzae y otra cepa fúngica cualquiera que tenga
tal gen por complementación como se describe más adelante.
El plásmido de expresión pToC320 que comprende
la secuencia de ADN genómico de longitud total que codifica el
factor de transcripción de la invención ha sido transformado en una
cepa de E. coli dando como resultado la cepa ToC1058, que ha
sido depositada por los inventores según el tratado de Budapest en
el Reconocimiento Internacional del depósito de microorganismos
para los fines del procedimiento en materia de patentes en el DSMZ,
Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH., Masc
heroder Weg 1 b, D-38124 Braunschweig,
DEUTSCHLAND.
- Fecha de depósito:
- 6 de mayo 1996 (06.05.96)
- Ref. del depositante:
- ToC1058 = NN049237
- Designación de DSM:
- DSM No.10666 de E. coli
Según la invención, los factores de este tipo
originados a partir de las especies A. oryzae, A. Niger, A.
awamori, etc., especialmente IFO4177 de A. oryzae son
preferidos.
Se ha hallado que el factor de transcripción de
la invención no sólo interviene en la regulación del promotor de la
\alpha-amilasa, sino que también interviene en la
regulación del promotor de la glucoamilasa de A. oryzae.
Especialmente, la invención comprende cualquier
factor con una secuencia de aminoácidos comprendiendo uno o más
fragmentos o combinaciones de fragmentos de la secuencia de
aminoácidos representada como la SEC ID NO: 3.
Las formas truncadas del factor de transcripción
pueden también ser activas. Por formas truncadas se entiende
modificaciones del factor de transcripción donde el fragmento
N-terminal, C-terminal o uno o más
fragmentos internos han sido deleccionados.
Otro aspecto de la invención se refiere a una
secuencia de ADN que codifica para cualquiera de estos
factores.
En este aspecto la invención especialmente
comprende cualquier secuencia de ADN que codifica para uno o más
fragmentos de la secuencia de aminoácidos representada como SEC ID
NO: 3.
Más específicamente la invención se refiere a
una secuencia de ADN comprendiendo uno o más fragmentos o una
combinación de fragmentos de la secuencia de ADN representada como
SEC ID NO: 1 y SEC ID NO: 2.
Según otro aspecto, la invención se refiere a un
método para producir una célula huésped filamentosa fúngica que
comprende la introducción de cualquiera de los fragmentos de ADN
anteriormente mencionados en un hongo filamentoso donde el promotor
de la \alpha-amilasa u otro promotor corregulado
regula la expresión de un polipéptido de interés en un modo por el
cual dicho factor será expresado en dicho hongo.
La introducción de dicho fragmento de ADN puede
ser realizada mediante cualquier método estándar bien conocido para
la introducción del ADN en un hongo filamentoso, así como mediante
el uso de un vector de expresión y células huéspedes según se
describe más abajo.
En consecuencia, la invención también
proporciona un vector de expresión recombinante que comprende el
constructo de ADN de la invención.
El vector de expresión de la invención puede ser
cualquier vector de expresión que esté convenientemente sometido a
procedimientos de ADN recombinante, y la elección del vector
dependerá frecuentemente de la célula huésped en la que deba ser
introducido.
Así, el vector puede ser un vector de
replicación autónoma, es decir un vector que exista como una
entidad extracromosómica, cuya replicación sea independiente de la
replicación cromosómica, p. ej. un plásmido. De forma alternativa,
el vector puede ser uno que, al introducirse en una célula huésped,
se integre en el genoma de la célula huésped y se replique con
el(los) cromosoma(s) en el(los) que se haya
integrado.
En el vector de expresión, la secuencia de ADN
que codifica el factor de transcripción debería contener también la
señal de expresión normalmente asociada con el factor de
transcripción o bien debería ser operativamente conectada a una
secuencia del promotor y terminador adecuada. El promotor puede ser
cualquier secuencia de ADN que muestre actividad transcripcional en
la célula huésped de elección y puede ser derivado de genes que son
bien homólogos o bien heterólogos a la célula huésped. Los
procedimientos usados para enlazar las secuencias de ADN que
codifican para el factor de transcripción, el promotor y el
terminador, respectivamente, y para insertarlas en los vectores
adecuados son bien conocidos por los expertos en la técnica (ver,
Sambrook, et al., supra).
Ejemplos de promotores adecuados para el uso en
células huéspedes filamentosas fúngicas son, por ejemplo, el
promotor ADH3 de A. nidulans (McKnight, et al. (1985)
el EMBO J. 4 2093-2099) o el promotor de tpiA.
Ejemplos de otros promotores útiles son aquellos derivados del gen
que codifica la \alpha-amilasa de Aspergillus
oryzae, la \alpha-amilasa neutra de
Aspergillus niger, la \alpha-amilasa
estable en ácido de Aspergillus niger, la glucoamilasa
(gluA) de Aspergillus niger, Aspergillus awamori, o
Aspergillus oryzae, la proteasa alcalina (alp) de
A. oryzae, la nitrato reductasa (niaD) de A.
oryzae, la triosa fosfato isomerasa (tpi) de
Aspergillus oryzae, la acetamidasa de Aspergillus
nidulans, o un promotor de Aspergillus que codifica para
un gen biosintético aminoácido tal como argB.
En otro aspecto adicional la invención
proporciona una célula huésped que comprende el constructo de ADN
de la invención y/o el vector de expresión recombinante de la
invención.
Preferiblemente, la célula huésped de la
invención es una célula eucariótica, en particular una célula
fúngica tal como una levadura o célula fúngica filamentosa. En
particular, la célula puede pertenecer a unas especies de
Trichoderma, preferiblemente Trichoderma harzianum o
Trichoderma reesei, o unas especies de Aspergillus,
más preferiblemente Aspergillus oryzae o Aspergillus
niger. Las células fúngicas pueden ser transformadas por un
proceso que implica la formación de protoplastos y la transformación
de los protoplastos seguida por la regeneración de la pared celular
en cierto modo conocido per se. El uso de Aspergillus
como un microorganismo huésped está descrito en EP 238 023 (Novo
Nordisk NS), el contenido estando incorporado en la presente por
referencia. La célula huésped puede ser también una célula de
levadura, p. ej. una cepa de Saccharomyces, en particular
Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces kluyveri o
Saccharomyces uvarum, una cepa de Schizosaccharomyces
sp., tal como Schizosaccharomyces pombe, una cepa de
Hansenula, Sp. Pichia, Sp. Yarrowia sp., tal como Yarrowia
lipolytica, o Kluyveromyces, sp. tal como
Kluyveromyces lactis.
El gen endógeno amyR de la célula huésped
puede ser deleccionado o inactivado por otros medios. La
introducción del control amyR por un promotor heterólogo
llevará después a un esquema completamente nuevo de regulación del
promotor de la \alpha-amilasa. Si, por ejemplo,
amyR se fusiona con el promotor niaD de A.
oryzae, el promotor de la \alpha-amilasa se
volverá inducible por nitrato. Si, en vez del promotor niaD,
se usa un promotor regulado por palC, la actividad del
promotor de la \alpha-amilasa será regulada por el
pH.
La invención también comprende un método para
producir un polipéptido de interés, por el cual una célula huésped
según el modo descrito anteriormente se cultiva bajo las
condiciones propicias para la producción de dicho factor y dicho
polipéptido de interés, y dicho polipéptido de interés es
recuperado.
El medio usado para cultivar las células
huéspedes transformadas puede ser cualquier medio convencional
adecuado para hacer crecer las células huéspedes en cuestión. El
polipéptido de interés expresado puede ser segregado
convenientemente en el medio de cultivo y puede ser recuperado del
mismo por procedimientos bien conocidos que incluyen la separación
de las células del medio por centrifugado o filtración, la
precipitación de componentes proteínicos del medio mediante una sal
tal como sulfato de amonio, seguido de procedimientos
cromatográficos tales como la cromatografía de intercambio iónico,
cromatografía de afinidad, o similar.
Según la invención el método puede ser usado
para producir un polipéptido de interés que sea un polipéptido
medicinal, especialmente aquellos polipéptidos medicinales como la
hormona del crecimiento, la insulina, el factor de coagulación de
la sangre, y similares.
El método de la invención puede también ser
usado para la producción de enzimas industriales, tales como
proteasas, lipasas, amilasas, glucoamilasas, óxido reductasas,
carbohidrasas, carbonil hidrolasas, celulasas, esterasas, etc.
Según otro aspecto de la invención dicho factor
de transcripción puede ser usado para aumentar la expresión de un
polipéptido de interés en un hongo filamentoso, tal como un hongo
del género Aspergillus, Trichoderma, Penicillium, Fusarium,
Humicola, etc., especialmente de las especies A. oryzae, A.
niger, A. awamori, etc y específicamente A. oryzae.
El factor de transcripción de la invención puede
ser usado por lo tanto para aumentar la expresión de un polipéptido
medicinal, tal como la hormona del crecimiento, la insulina,-
factor de coagulación de la sangre, etc.
Además, la expresión de enzimas industriales,
tales como proteasas, lipasas, amilasas, glucoamilasas, óxido
reductasas, carbohidrasas, carbonil hidrolasas, celulasas,
esterasas, etc., pueden ser mejoradas por el uso del factor de
transcripción de la invención.
El factor de transcripción puede también ser
usado para identificar las secuencias en el promotor de la
\alpha-amilasa al cual se enlaza. Por ejemplo,
esto podría obtenerse haciendo una proteína de fusión a GST con el
dominio de unión del ADN de amyR, tal como el dedo de zinc,
para la producción en E. coli. Tales proteínas de fusión
pueden ser convenientemente realizadas usando equipos
comercialmente disponibles, por ejemplo, "el kit de fusión de
genes GST" de Pharmacia. La proteína de fusión GST purificada
puede ser usada después en técnicas convencionales in vitro
tales como los ensayos de retardo en geles o el análisis de huella
de ADN (Kulmburg, P., et al. (1992) Molecular and Cellular
Biology 12 1932-1939; Lutfiyya, L.L., y Johnston, M.
(1996) Molecular and Cellular Biology 16
4790-4797). La identificación del centro de unión
de AmyR permitirá insertar estas secuencias en otros
promotores normalmente no regulados por AmyR.
Las condiciones de hibridación adecuadas para
determinar la hibridación entre una sonda de nucleótidos y una
secuencia de ADN "análoga" de la invención pueden ser
definidas como se describe abajo. La sonda de oligonucleótidos que
se debe usar es la secuencia de ADN correspondiente al factor de
transcripción que codifica parte de la secuencia de ADN mostrada en
la SEC ID NO: 1, es decir los nucleótidos 1691..2676 + 2743..3193 +
3278..3653 en la SEC ID NO: 1, o un fragmento de la misma, p. ej.
los nucleótidos 1770-1800 en la SEC ID NO: 1.
Las condiciones adecuadas para determinar la
hibridación entre una sonda de nucleótidos y una secuencia de ADN o
ARN homóloga implica la puesta en remojo previa del filtro que
contiene los fragmentos de ADN o ARN para hibridarse en 5x SSC
(tampón citrato de solución salina estándar) durante 10 min, y la
prehibridación del filtro en una solución de 5x SSC (Sambrook, et
al., supra); 5x Solución de Denhardt (Sambrook, et
al., supra); 0,5% de SDS y 100 \mug/ml de ADN de
esperma de salmón desnaturalizado y sometido a un baño de
ultrasonidos (Sambrook, et al., supra), seguido de la
hibridación en la misma solución que contiene una sonda cebada de
forma aleatoria (Feinberg, A. P. y Vogelstein, B. (1983) Anal.
Biochem. 132 6-13); marcada con
32P-dATP (actividad específica > 1 X 10^{9}
cpm/pg) durante 12 horas a aprox. 65ºC. El filtro es lavado a
continuación dos veces durante 30 minutos en 2x SSC; 0,5% de SDS
preferiblemente a no más de 50ºC, más preferiblemente a no más de
55ºC, más preferiblemente a no más de 60ºC, más preferiblemente a no
más de 65ºC, incluso más preferiblemente a no más de 70ºC,
especialmente a no más de 75ºC.
Las moléculas en las que se hibrida la sonda de
nucleótidos bajo estas condiciones son detectadas usando un
detector Phospho Image.
Los anticuerpos que deben ser usados para
determinar la reacción inmunológica cruzada pueden ser preparados
usando un factor de transcripción purificado. Más específicamente,
el antisuero contra el factor de transcripción de la invención
puede ser aumentado mediante la inmunización de conejos (o
roedores) según el procedimiento descrito por N. Axelsen et
al. en: A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis,
Blackwell Scientific Publications, 1973, Capítulo 23, o A.
Johnstone y R. Thorpe, Immunochemistry in Practice, Blackwell
Scientific Publications, 1982 (más específicamente págs.
27-31). Inmunoglobulinas purificadas pueden ser
obtenidas de los antisueros, por ejemplo por precipitación de sal
((NH_{4})_{2}SO_{4}), seguida de diálisis y
cromatografía de intercambio iónico, p. ej. en
DEAE-Sephadex. La caracterización inmunoquímica de
las proteínas puede hacerse bien por análisis de difusión doble de
Ouchterlony (O. Ouchterlony en: Handbook of Experimental Immunology
(D.M. Weir, ed.), Blackwell Scientific Publications, 1967, pp.
655-706), por inmunoelectroforesis cruzada (N.
Axelsen et Al., supra, capítulos 3 y 4), o por
inmunoelectroforesis en cohete (N. Axelsen et Al., op cit.,
Capítulo 2).
Ejemplo
1
Clonación del factor de transcripción de
amyR de amyR de A. oryzae fue clonado por
complementación de una cepa mutante de A. oryzae incapaz de
expresar dos proteínas diferentes ambas bajo el control del promotor
de TAKA-amilasa. La cepa mutante ToC879 de A.
oryzae fue obtenida por mutagénesis de una cepa, SRe440,
conteniendo una lipasa (HLL) que codifica el ADNc bajo el control
del promotor TAKA y una copia del gen de la
TAKA-amilasa transcrito de su propio promotor.
El mutante fue identificado y aislado por su
fenotipo amilasa negativo (amilasa^{-}) y posteriormente mostró
que era también lipasa negativo (lipasa^{-}).
La cepa ToC879 contiene copias intactas de ambos
cassettes de expresión. El fenotipo amilasa^{-} provoca que
ToC879 sea incapaz de crecer en placas conteniendo el 1% de
ciclodextrina como la fuente de carbono única, mientras que la cepa
progenitora SRe440 crecerá en este tipo placas.
ToC879 ha sido depositado en DSM bajo el nombre
DSM No.10671.
amyR fue aislado mediante la
cotransformación de ToC879 con una genoteca cósmida de A.
oryzae y un plásmido basado en pHelp1 de replicación autónoma
(D. Gems, I. L. Johnstone, y A. J. Clutterbuck (1991) Gene 98
61-67) que lleva el gen bar de Streptomyces
hygroscopicus que confiere resistencia al glufosinato. Los
transformantes fueron sometidos a selección en placas que contenían
ciclodextrina como única fuente de carbono y fueron seleccionados
por su reversión concurrente al fenotipo lipasa^{+}.
El ADN transformante fue rescatado de las
colonias que fueron capaces de crecer en ciclodextrina. La
subclonación resultó en el aislamiento de un fragmento de ADN de
4,3 kb capaz de complementar ambos fenotipos de ToC879. El gen
albergado en este fragmento fue denominado amyR.
Un plásmido, pMT1612, fue obtenido por ligación
(y transformación posterior en DH5a de E. coli) de los
cuatro fragmentos siguientes:
i) el vector pToC65 de E. coli (descrito
en EP 531 372) cortado con SphI/XbaI,
ii) un fragmento de la PCR (conteniendo el
promotor amdS de A. nidulans) cortado con
SphI/BamHI,
iii) un fragmento BamHI/XhoI de 0,5 kb de
pBP1T (B. Staubinger et al., (1992) Fungal Genetics
Newsletter 39 82-83) conteniendo el gen bar,
y
iv) un fragmento xhoI/XbaI de 0,7 kb de
plC AMG/Term (solicitud EP nº. 87103806.3) conteniendo el
terminador de la transcripción de glucoamilasa de A.
niger.
El fragmento de la PCR conteniendo el promotor
amdS fue obtenido usando el plásmido
pMSX-6B1 (M. E. Katz et Al., (1990) Mol. Gen.
Genet. 220 373-376) como sustrato de ADN y los dos
oligonucleótidos 4650 (SEC ID NO: 4) y 4561 (SEC ID NO: 5) como
cebadores.
pMSX-6B1 contiene
un promotor amdS después de la mutación llamado
1666.
pMT1612 fue cortado con HindIII,
desfosforilado y ligado a un fragmento HindIII de 5,5 kb de
pHelp1 conteniendo la secuencia AMA1. El plásmido resultante,
pMT1657 es autorreplicativo en Aspergilli y puede ser
seleccionado por su resistencia al glufosinato incrementada.
pMT1657 está representado en la Fig. 1, donde PamdS representa el
promotor amdS del fragmento ii) anterior, bar representa el
fragmento iii) anterior, y Tamg representa el fragmento iv)
anterior.
Una genoteca de cósmidos de Aspergillus
oryzae fue construida esencialmente según las instrucciones del
proveedor del "kit del vector cósmido SuperCos1 " (Stratagene
Cloning Systems, La Jolla CA, EEUU).
ADN genómico de IFO4177 de A. oryzae fue
obtenido a partir de protoplastos obtenidos por procedimientos
estándares (Christensen, T., et. al. (1988) Biotechnology 6
1419-1422).
Después del aislamiento, los protoplastos fueron
comprimidos por centrifugación a 2500 rpm durante 5 minutos en un
Labofuge T (Neto); el granulado fue luego suspendido en 10 mM de
NaCl; 20 mM de tris-HCl (pH 8.0); 1 mM de EDTA; 100
pg/ml de proteinasa K y 0,5% SDS como se indica en el manual del kit
del vector cósmido Supercos 1; el resto de la preparación de ADN
fue realizado según las instrucciones del kit.
El tamaño del ADN genómico fue analizado por
electroforesis usando el aparato CHEF-gel
(Bio-Rad Laboratories, Hercules CA, EEUU). Un 1% de
gel de agarosa fue ejecutado durante 20 horas a 200 voltios con un
impulso de 10-50 segundos. El gel fue coloreado con
bromuro de etidio y fotografiado. El ADN fue de un tamaño de
50->100 kb. El ADN fue parcialmente digerido usando
Sau3A. El tamaño del ADN digerido fue 20-50
kb determinado por el mismo tipo de análisis
CHEF-gel que antes. El vector SuperCos1 agrupado del
gradiente de CsCl fue preparado según el manual. La ligación y
empaquetamiento fueron asimismo realizados como se describe en el
manual.
Después de la titulación de la genoteca, toda la
mezcla de empaquetammiento de una ligación y el empaquetamiento
fueron transferidos a las células huéspedes,
XL1-Blue MR, y colocados en placas de LB con 50
\mug/ml de ampicilina. Aproximadamente 3800 colonias fueron
obtenidas. Las preparaciones de cósmidos de 10 colonias mostraron
que todas tenían insertos del tamaño previsto. Las colonias fueron
seleccionadas individualmente e inoculadas en los pocillos de las
placas de microtitulación con 100 \mul de LB (100 \mug/ml
ampicilina) y se incubaron a 37ºC durante toda la noche. 100 \mul
del 50% de glicerol fueron añadidos a cada pocillo, y la genoteca
entera fue congelada a -80ºC. Un total de 3822 colonias fueron
almacenadas.
Esto representa el genoma de A. oryzae
aproximadamente 4,4 veces. Después de seleccionar las colonias las
placas fueron descartadas, el descarte fue agrupado y la genoteca
total fue también almacenada en cuatro agrupaciones como una
concentración de glicerol congelada. Las cuatro agrupaciones fueron
denominadas ToC901-ToC904.
Las colonias individuales congeladas en la
genoteca fueron inoculadas en placas de LB (100 \mug/ml
ampicilina) usando un dispositivo multiaguja de 6 filas de 8 agujas
que se ajustan en la mitad de un plato de microtitulación. Se
hicieron placas que contenían colonias de todos los clones en la
genoteca.
Las placas fueron incubadas a 37ºC durante toda
la noche. Los filtros Whatman 540 esterilizados cortados al tamaño
de una placa de Petri fueron colocados en las colonias que fueron
incubadas durante dos más horas a 37ºC. Los filtros fueron
transferidos a placas LB que contenían 200 \mug/ml de
cloranfenicol y las placas fueron incubadas durante toda la noche a
37ºC.
Al día siguiente los filtros fueron lavados dos
veces en 0,5 M de NaOH durante 5 minutos, luego dos veces en 0,5 M
de Tris-HCl (pH 7.4) durante 5 minutos y luego dos
veces en 2x SSC durante 5 minutos. Los filtros fueron humedecidos
con etanol y secados al aire.
ADN cósmido fue obtenido a partir de
ToC901-904 e introducido en ToC879 por
cotransformación con pMT1657. El procedimiento de transformación
está descrito en la solicitud de EP nº. 87103806.3. Aproximadamente
8700 transformantes fueron seleccionados por resistencia a 1 mg/ml
de glufosinato en placas mínimas (Cove D.J. (1966) BBA 113
51-56) conteniendo 1 M de sacarosa para la
estabilización osmótica y 10 mM de
(NH_{4})_{2}SO_{4}.
Diez transformantes elegidos de forma aleatoria
fueron reaislados una vez en el mismo tipo de placas. Las
conidiosporas de estos 10 transformantes fueron inoculadas en un
medio mínimo que contenía 1 mg/ml de glufosinato y se dejaron
crecer a 30ºC hasta que se pudieron cosechar los micelios
suficientes para la preparación del ADN. El ADN fue preparado como
se describe en T. Christensen et al. (supra).
El ADN no cortado fue aplicado a un 0,7% de gel
de agarosa, y se realizó la electroforesis, seguida del análisis de
Southern blot. La mancha fue hibridada con un fragmento de ADN
específico de SuperCos1 marcado con 32P.
Cada uno de los diez transformantes mostraron
una banda con una movilidad más alta que el ADN cromosómico lineal.
Cada una de las bandas también hibridaron a una sonda específica de
pHelp1, indicando que la frecuencia de cotransformación de la
genoteca de cósmidos fue próxima al 100% y que los cósmidos se
habían integrado en el vector de replicación autónoma pHelp1.
Los transformantes fueron inestables como se
esperaba para los transformantes de pHelp1. Menos del 10% de las
conidiosporas de una colonia resistente al glufosinato dió lugar a
una progenie resistente al glufosinato.
Las conidiosporas de todos los transformantes
fueron recogidas en 8 agrupaciones y colocadas en placas mínimas
(Cove D.J., supra) conteniendo 1 mg/ml de glufosinato; 10 mM
(NH_{4})_{2}SO_{4} y 1% de
b-ciclodextrina (Kleptose de Roquette Fréres',
62136 Lestem, Francia).
Cuatro colonias fueron obtenidas de una de las
agrupaciones y una de una de las otras agrupaciones. Dos de las
colonias de la primera agrupación fueron reaisladas una vez en el
mismo tipo de placas.
Las conidiosporas de las colonias reaisladas
fueron colocadas en placas mínimas bien con glucosa o con
ciclodextrina como fuente de carbono y en placas conteniendo
glufosinato. La resistencia al glufosinato y la capacidad de crecer
en ciclodextrina fueron ambos fenotipos inestables con el mismo
grado de inestabilidad. Esto indicó que el gen que confiere la
capacidad de crecer en ciclodextrina fue físicamente enlazado a
pMT1657 en los transformantes.
Las colonias de las placas de reaislamiento
fueron recortadas y fueron analizadas por electroforesis
inmunológica en cohete (RIE) usando un anticuerpo dirigido contra
la HLL lipasa. Los transformantes produjeron una reacción clara con
el anticuerpo, mientras que las colonias ToC879 que crecieron en
maltosa no produjeron ninguna reacción. Esto condujo a la
conclusión de que la expresión de la amilasa (es decir, el
crecimiento en ciclodextrina) y la lipasa (es decir, unión de
anticuerpos) han sido restaurados en estos transformantes. El gen
responsable de este fenotipo fue denominado amyR.
\vskip1.000000\baselineskip
Para rescatar el gen amyR de los
transformantes amilasa^{+}, lipasa^{+} de ToC879, dos enfoques
diferentes fueron usados con éxito.
El ADN fue obtenido a partir del micelio crecido
en un medio mínimo con ciclodextrina como fuente de carbono.
En el primer enfoque el ADN fue envasado en
\lambda-cabezas usando el kit Gigapack® II de
Stratagene en un intento de extraer el cósmido original del ADN
total. La reacción de empaquetamiento fue incubada con
XL1-Blue MR de E. coli bajo las condiciones
especificadas por el proveedor del kit. Las células de E.
coli fueron colocadas en placas de LB con 50 \mug/ml de
ampicilina. Dos colonias aparecieron en las placas; los cósmidos
que contenían fueron idénticos y denominados ToC1012.
En el segundo enfoque el ADN total fue usado en
un intento de transformar las células DH5a competentes de E.
coli. Dieciséis colonias fueron aisladas e indicaron que
contenían seis plásmidos diferentes por la digestión de enzimas de
restricción. Cada uno de los plásmidos fue digeridos con
EcoRI y sometidos al análisis de Southern. Una sonda marcada
con ^{32}P de una mezcla de pMT1657 y SuperCos1 fue usada para
identificar fragmentos de ADN que no formaban parte de ninguno de
estos vectores. Dos fragmentos EcoRI, aproximadamente de 0,7
y 1,2 kb de tamaño, no hibridaron ninguna de estas sondas. El
fragmento de 1,2 kb fue aislado, marcado con ^{32}P y usado como
sonda en un experimento de hibridación con los filtros que contenían
la parte de la genoteca de cósmidos que dio lugar a los
transformantes originales. Se hibridaron seis cósmidos de la
agrupación (ToC904), que contenían aproximadamente 1000 clones.
La digestión de la enzima de restricción indicó
que algunos de ellos eran idénticos, dando como resultado el
aislamiento de cuatro cósmidos diferentes. Todos los cósmidos
contenían también al menos partes del gen de la
TAKA-amilasa. Los cuatro cósmidos y el cósmido
ToC1012 fueron transformados en ToC879 por cotransformación con
pMT1623, un plásmido basado en pUC que llevaba el gen bar
bajo el control del promotor tpi de A. oryzae. Quince
transformantes de cada cotransformación fueron aislados por su
resistencia al glufosinato y evaluados por su capacidad para crecer
en ciclodextrina.
Ocho transformantes de ToC1012 y tres
transformantes de uno de los otros cósmidos; 41B12; fueron capaces
de crecer. Ninguno de los transformantes de los otros cósmidos
creció. El hecho de que no todos los transformantes de ToC1012 y
41B12 fueran capaces de crecer puede ser una reflexión sobre la
frecuencia de cotransformación en cada experimento. Las colonias
del crecimiento de los transformantes en ciclodextrina fueron
analizadas por RIE, y mostraron que todas producían lipasa.
Los fragmentos de ADN obtenidos mediante la
digestión de 41B12 con BgIII, HindIII o PstI
fueron clonados en pUC19 para subclonar amyR del cósmido.
Los subclones fueron transformados en ToC879 y los transformantes
fueron analizados por la capacidad para crecer en ciclodextrina y
producir lipasa según se ha descrito anteriormente. Como se ha
representado en la Fig. 2, se ha indicado que un plásmido llamado
pToC316 contenía un fragmento de casi 9 kb de HindIII que
fue identificado como conteniendo amyR.
Además la subclonación resultó en un plásmido
llamado pToC320 conteniendo un fragmento de HindIII/SacI de
4,3 kb, que está mostrado en la Fig. 3 y que fue posteriormente
secuenciado en un secuenciador ABI de ADN usando una subclonación
adicional y un paseo con cebador.
Una secuencia de ADN de 3980 bp que incluía el
gen amyR está mostrada en la SEC ID NO: 1. La secuencia de
aminoácidos deducida está mostrada en la SEC ID NO: 3 y revela una
secuencia de dedos de zinc de tipo Gal 4 entre los aminoácidos
28-54. Tales secuencias son conocidas por enlazarse
con el ADN (Reece, R.J., and Ptashne, M. (1993) Science 261
909-910).
amyR está trazado cerca de uno de los
tres genes de la amilasa en IFO4177, puesto que fue aislado de un
cósmido que también contenía los fragmentos de ADN específicos para
la amilasa. El trazado del cósmido indicó que el gen de la
\alpha-amilasa y amyR son de
5-6 kb cada uno. El análisis de Southern del ADN
genómico indicó que sólo una copia de amyR está presente en
IFO4177, y confirmó que estaba trazado cerca de uno de los genes de
la amilasa.
Se obtuvo el ARNm por el método de Wahleithner,
J. A., et al. (1996, Curr. Genet. 29
395-403) a partir de un cultivo de A. oryzae
crecido en un medio que contenía maltosa bajo las condiciones
favorables para la producción de \alpha-amilasa.
El ADNc bicatenario fue obtenido por los procedimientos estándares
y se utilizó para reacciones PCR con los cebadores siguientes:
Una reacción PCR con los cebadores 20866 y 23087
resultó en un fragmento de aproximadamente 1,1 kb. El fragmento fue
digerido con EcoRI y HindIII; estos sitios de
restricción fueron incorporados en los cebadores, y clonados en un
vector pUC19 cortado con las mismas enzimas.
El inserto en el plásmido resultante fue
secuenciado, el resultado situó un intrón en esta parte del gen. El
intrón está indicado en la SEC ID NO: 2.
Otra reacción PCR con el cebador oligodT y el
cebador 20866 no resultó en un fragmento diferente. Una parte
alícuota de esta reacción fue usada como el punto de partida para
una reacción nueva con el cebador oligodT y el cebador 20865, que
resultó en un fragmento de aproximadamente 1,1 kb. Este fragmento
fue digerido con EcoRI y HindIII y clonado en
pUC19.
La secuenciación indicó que el fragmento
contenía la parte 3' de amyR y otro intrón fue localizado.
Esto está también indicado en la SEC ID NO: 2. Tres plásmidos
independientes fueron ordenados en el extremo 3' y dos sitios de
adición de poliA fueron localizados, uno en el bp nº. 3827 y otro en
el bp nº. 3927.
Ejemplo
2
El A. oryzae produce una glucoamilasa,
codificada por el gen glaA, que está regulado por las mismas
sustancias que la \alpha-amilasa (Y. Hata et
al. (1992) Curr. Genet. 22 85-91). Para
comprobar si amyR está también implicado en la regulación de
glaA se midió la síntesis de la glucoamilasa bajo condiciones
de inducción en la cepa ToC879 de amyR y en la cepa SRe440
de amyR wt, de la cual derivó directamente ToC879.
Las conidiosporas de cada cepa fueron inoculadas
en 10 ml de YPM (YP conteniendo el 2% de maltosa) y crecieron
durante cuatro días a 30ºC. Los sobrenadantes fueron recogidos y
analizados por su contenido en glucoamilasa por incubación con
p-nitrofenilo
a-D-glucopiranosido, un sustrato que
se vuelve amarillo cuando es dividido por la glucoamilasa. En el
procedimiento utilizado, se mezclaron 0,5 ml de caldo de
fermentación con 1 ml de acetato de Na 0,1 M pH = 4.3; conteniendo
1 mg/ml del sustrato. Las muestras fueron incubadas durante 3 horas
a la temperatura ambiente y se añadió 1,5 ml de
Na_{2}B_{4}O_{7} 0,1 M. El color amarillo fue medido en un
espectrofotómetro a 400 nm. Las muestras de control fueron hechas
mezclando los sobrenadantes primero con el borato y luego con la
solución de sustrato. Los resultados fueron:
La ausencia de lectura de la OD en la muestra
tomada de ToC879 indica claramente que la síntesis de la
glucoamilasa de A. oryzae requiere la expresión del factor
de transcripción de AmyR.
Ejemplo
3
Un plásmido, pToC342, conteniendo la región de
codificación y secuencias no codificantes en 3' de AmyR
fusionadas al promotor para el gen tpi de A. oryzae
fue construido. El gen tpi codifica para la triosafosfato
isomerasa, una enzima expresada constitutivamente implicada en el
metabolismo primario. El gen tpi de A. oryzae fue
aislado por hibridación cruzada con un clon de ADNc de A.
nidulans según el procedimiento de McKnight, G.L., et
Al, (1986, Cell 46 143-147). La secuenciación
condujo a la identificación del gen estructural. El promotor usado
fue un fragmento de aproximadamente 700 bp dirigido inmediatamente
hacia arriba de la región de codificación. pToC342 fue capaz de
complementar la mutación en ToC879. A pToC342 se le añadió
adicionalmente el gen pyrG de A. oryzae y el plásmido
resultante, pToC359, fue transformado en JaL250, un pyrG
mutante de JaL228 descrito en la solicitud de patente DK1024/96
depositada el 19-09-1996. Se
encontró que las cepas que contenían copias múltiples de pToC359
sintetizaban niveles de glucoamilasa incrementados.
Una reacción PCR fue hecha con pToC320 como el
molde y los cebadores siguientes:
El fragmento resultante fue cortado con
EcoRI/ApaI para producir un fragmento de aproximadamente 180
bp que fue luego clonado en pToC320 que había sido digerido con
EcoRI/ApaI. El plásmido resultante, pToC336, fue secuenciado
para confirmar que el fragmento de PCR fue intacto. El fragmento
BamHI/SacI de 2,6kb de pToC336 conteniendo la región de
codificación y la secuencia no traducida 3' de AmyR y un
fragmento EcoRI/BamHI de aproximadamente 700 bp conteniendo
el promotor tpi fue clonado en pUC19 digerido con
EcoRI/SacI. El sitio de BamHI dirigido hacia abajo del
promotor tpi fue introducido in vitro, mientras que
el sitio EcoRI es un sitio endógeno del clon del tpi
original. El plásmido resultante, llamado pToC342, fue cortado con
HindIII, desfosforilado y ligado a un fragmento de 1,8 kb de
HindIII conteniendo el gen pyrG de A. oryzae,
dando como resultado un plásmido que fue llamado pToC359. La
estructura de ambos pToC342 y pToC359 está mostrada en la Fig. 4,
donde Ptpi representa el promotor tpi y TamyR representa la
región no codificante 3' de amyR. La clonación del gen
pyrG ha sido previamente descrita en WO 95/35385.
JaL250 es un pyrG mutante de JaL228
seleccionado por su resistencia al ácido
5-fluoro-orótico. JaL228 ha sido
descrito en la solicitud de patente DK1024/96 depositada el
19-09-1996. JaL250 fue transformado
con pToC359 usando procedimientos estándar y seleccionando el
alivio del requisito de uridina. Los transformantes fueron
reaislados dos veces a través de las conidiosporas y crecieron
durante cuatro días en YP + 2% de maltosa a 30ºC. La glucoamilasa
segregada fue medida por la capacidad para seccionar
p-nitrofenilo
a-D-gluco-piranosido.
Los transformantes tenían 5-31 unidades arbitrarias
de glucoamilasa/ml en el caldo de fermentación, mientras que JaL228
tenía 2-3 unidades/ml. El mejor transformante fue
denominado ToC1200. El análisis Southern indicó que las copias
múltiples de pToC359 se habían integrado en el genoma de ToC1200.
Debido al promotor de \alpha-amilasa, ToC1200
puede ser usado ventajosamente como una cepa huésped para los
plásmidos de expresión.
Ejemplo
4
El promotor de la TAKA-amilasa
está sometido a la represión del catabolito de carbono. En los
Aspergilli, la represión del catabolito de carbono está al
menos parcialmente mediada por medio del represor transcripcional
CreA, un homólogo a MIG1 de S. cerevisiae. Los sitios de
enlace de ADN en los promotores bajo el control de CreA son
conocidos por ser ricos en GC y aparentemente idénticos a los
sitios MIG1 en S. cerevisiae. El promotor de la
TAKA-amilasa contiene diferentes sitios de enlace
CreA potenciales. Para determinar si este promotor está implicado
en la represión del catabolito de carbono, tres sitios de este tipo
fueron mutados, pero proporcionaron sólo un alivio parcial de la
represión del catabolito de carbono. Por el contrario, la
introducción de copias de AmyR constitutivamente expresadas
en cepas que contenían el promotor modificado acoplado a un gen
indicador alivió completamente la represión del indicador.
Tres sitios fueron identificados como sitios de
enlace CreA potenciales en el promotor de la
TAKA-amilasa por comparación de la secuencia a los
sitios CreA y MIG1 conocidos.
Los sitios resultantes tuvieron las secuencias
siguientes:
Las bases subrayadas fueron cambiadas por A
porque estos cambios son conocidos por destruir los sitios de
enlace MIG1. Las sustituciones fueron hechas usando procedimientos
de mutagénesis sitio específica estándares. Se construyó un vector
de expresión, pToC297, conteniendo el promotor modificado y la
secuencia no transcrita 3' del gen de glucoamilasa de A.
niger. pToC297 es idéntico a pToC68 descrito en WO 91/17243
excepto por los cambios en el promotor. Ambos plásmidos tienen un
único sitio BamHI entre el promotor y el terminador.
Un fragmento de BamHI de aproximadamente
950 bp conteniendo el ADNc que codifica una lipasa de Humicola
lanuginosa fue clonado en pToC297. (La clonación y expresión de
la lipasa de H. lanuginosa han sido previamente descritas en
EP 305 216.) El plásmido resultante, pToC298, fue transformado en
IFO4177 de A. oryzae por cotransformación con el gen
amdS de A. nidulans, y su estructura está mostrada en
la Fig. 5, donde Ptaka-creA representa el sitio de
unión CreA deficitario del promotor de la
TAKA-amilasa. Los transformantes fueron reaislados
dos veces a través de las conidiosporas y este transformante,
ToC1075, que produce lipasa, fue elegido para una evaluación
adicional. ToC1075 y un transformante p960 de IFO4177 (previamente
descrito en EP 305 216) conteniendo la lipasa fusionada al promotor
TAKA de tipo salvaje crecieron a 30ºC en 10 ml de YP conteniendo un
2% o 10% de glucosa. Se tomaron muestras diarias para el análisis de
la lipasa del caldo de fermentación. El contenido de lipasa fue
medido por electroforesis inmunológica en cohete usando un
anticuerpo policlonal dirigido contra la lipasa purificada. El
caldo de fermentación consumido de IFO4177 de A. oryzae no
reaccionó con el anticuerpo.
El contenido de glucosa del caldo de
fermentación fue asimismo medido a diario usando
Tes-tape de Lilly.
En el día uno, la glucosa fue detectada en todos
los cultivos, pero en el día dos la glucosa sólo pudo ser detectada
en los cultivos que contenían originalmente el 10%. Los resultados
de producción de lipasa, mostrados en la Fig. 6, indican que el
promotor de tipo salvaje está reprimido hasta que ya no hay glucosa
presente. Por lo tanto, cuando la glucosa se agota, la lipasa
empieza a acumularse. La Fig. 6 también muestra que el promotor
modificado no está tan firmemente regulado, ya que se producen unos
niveles bajos de lipasa en presencia de glucosa en el 10% de la
fermentación de glucosa. Por lo tanto, hay una desrepresión parcial
de glucosa vista en ToC1075.
ToC1075 fue transformado con pToC342 por
cotransformación con el plásmido conteniendo bar, pMT1623.
Las cepas que contenían múltiples copias de pToC342 y que
retuvieron el cassette de expresión de lipasa fueron identificadas
por el análisis de Southern blot; se identificó una cepa de este
tipo. ToC1075 y ToC1139 fueron dejados crecer a 30ºC en 10 ml de YP
conteniendo el 2% o el 10% glucosa, y se evaluaron las muestras a
diario con respecto a la lipasa y a la glucosa. La lipasa fue
medida por el seccionamiento del
para-nitrofenil-butirato. El
contenido de glucosa fue medido con Tes-tape de
Lilly. Los resultados, mostrados en la Fig. 7, indican que ToC1075,
como anteriormente, proporciona un alivio parcial de la represión
de glucosa mientras que la producción de lipasa por ToC1139 es
independiente de la presencia de glucosa.
Ejemplo
5
Las síntesis de a-amilasa y
glucoamilasa en A. niger, como en A. oryzae, son
reguladas por la fuente de carbono. Es en consecuencia posible que
A. niger también contenga un gen amyR. Esta hipótesis
fue evaluada buscando la hibridación cruzada entre el gen
amyR de A. oryzae y el ADN cromosómico de A.
niger.
El ADN fue obtenido a partir de A. niger
por los métodos convencionales. El ADN fue seccionado con BamHI,
BglII, EcoRI, HindIII, SalI, XmaI o XbaI, y los fragmentos de
ADN resultantes fueron separados por electroforesis en un gel de
agarosa. El ADN fue luego manchado en una membrana de nitrocelulasa
e hibridado con una sonda marcada con ^{32}P conteniendo parte
del gen amyR de A. oryzae estructural. La sonda fue
hecha por PCR en pToC320 y comienza en el bp. nº. 1683 y termina en
el bp. nº. 2615 como se muestra en la SEC ID NO: 1. La hibridación
fue llevada a cabo en 10x Solución de Denhardt, 5x SSC; 10 mM de
EDTA; 1% de SDS; 0,15 mg/ml de polyA; 0,05 mg/ml de ARNt de
levadura) a 50ºC durante toda la noche. Después de la hibridación,
la membrana fue lavada bajo condiciones de astringencia en aumento
y la radioactividad en la membrana fue analizada por un
Phospholmager. La Figura 8 muestra el resultado cuando la membrana
ha sido lavada en 2x SSC; 0,1% de SDS a 58ºC. Las bandas únicas
pueden ser vistas con varias enzimas de restricción. Así, el gen
amyR de A. niger puede ser clonado basándose en este
resultado de la hibridación cruzada.
Descripción:
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\global\parskip0.000000\baselineskip
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Novo Nordisk NS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Novo Alle
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Bagsvaerd
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Dinamarca
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (CÓDIGO ZIP): DK-2880
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TELÉFONO: +45 4442 2668
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- TELEFAX: +45 4442 6080
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Factor de transcripción
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 9
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA DE LECTURA INFORMÁTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, versión #1.30 (EPO)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 3980 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Aspergillus oryzae
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 3980 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Aspergillus oryzae
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: exón
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- UBICACIÓN:1691..2676
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: intrón
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- UBICACIÓN:2677..2742
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: exón
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- UBICACIÓN:2743..3193
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: intrón
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- UBICACIÓN:3194..3277
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: exón
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- UBICACIÓN:3278..3653
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- UBICACIÓN:unión (1691..2676, 2743..3193, 3278..3653)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 604 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cebador 4650
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTTGCATGCC GCCAGGACCG AGCAAG
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cebador 4651
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTTGGATCCT CTGTGTTAGC TTATAG
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cebador
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCCCAAGCTT CGCCGTCTGC GCTGCTGCCG
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29x pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cebador
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGGAATTCAT CAACCTCATC AACGTCTTC
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cebador
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGGAATTCAT CGGCGAGATA GTATCCTAT
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 41 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cebador
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: SÍ
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- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTTTGTAAGC TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT T
\hfill41
Claims (11)
1. Factor de transcripción capaz de regular la
transcripción dirigida por un promotor de
alfa-amilasa de un hongo filamentoso de una manera
específica para la secuencia, que comprende una secuencia de
aminoácidos tiene una identidad de al menos un 90% con la secuencia
de aminoácidos de la SEC ID NO: 3.
2. Factor de transcripción según la
reivindicación 1, que comprende la secuencia de aminoácidos de la
SEC ID NO: 3.
3. Factor de transcripción aislado que muestra
actividad en la regulación de la expresión de un promotor de
alfa-amilasa en un hongo filamentoso, que es
codificado por:
(a) la parte codificante del factor de
transcripción de la secuencia de ADN clonada en plásmido pToC320
presente en E. coli, DSM 10666, o
(b) una secuencia de ADN que tiene una identidad
de al menos un 70% con la secuencia de ADN definida en (a).
4. Factor de transcripción según la
reivindicación 3, donde la secuencia de ADN se obtiene de un hongo
filamentoso.
5. Factor de transcripción según la
reivindicación 4, donde el hongo filamentoso está seleccionado del
grupo que consiste en Ascomycetes, Basidiomycetes, Phycomycetes,
Zygomycetes, y hongos imperfectos.
6. Factor de transcripción según la
reivindicación 4, donde el hongo filamentoso está seleccionado del
grupo que consiste en Aspergillus, Fusarium, Humicola,
Penicillium, y Trichoderma.
7. Factor de transcripción según la
reivindicación 6, donde el hongo filamentoso es A. awamori, A.
niger, o A. oryzae.
8. Factor de transcripción según la
reivindicación 7, donde el hongo filamentoso es Aspergillus
oryzae.
9. Factor de transcripción según la
reivindicación 8, donde el hongo filamentoso es A. oryzae,
IFO 4177.
10. Factor de transcripción según la
reivindicación 3, donde la secuencia de ADN es obtenida de una cepa
de levadura.
11. Factor de transcripción según la
reivindicación 3, donde la secuencia de ADN es obtenida de
Eschericia coli, DSM 10666.
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