DE69734449T2

DE69734449T2 - Alpha-amylase Transkriptionsfaktor

Info

Publication number: DE69734449T2
Application number: DE69734449T
Authority: DE
Inventors: Tove Christensen
Original assignee: Novozymes AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 1996-07-05
Filing date: 1997-07-07
Publication date: 2006-08-10
Anticipated expiration: 2017-07-08
Also published as: JP2000514292A; DK0909273T3; US6555657B2; ATE307828T1; US6316220B1; US20020151073A1; US20030148500A1; EP0909273B1; ATE373493T1; DE69738158T2; EP1616580B1; DK1616580T3; ES2294644T3; JP4198753B2; AU3336597A; EP0909273A1; EP1616580A3; DE69738158D1; CN1223663A; DE69734449D1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft einen in Fadenpilzen, insbesondere in Aspergillii zu findenden Transkriptionsfaktor, den Faktor kodierende DNA-Sequenzen, seine Transformation und Expression in Pilzwirtsorganismen und die Verwendung des Faktors in derartigen Wirten zur Erhöhung der Expression eines durch den Wirt hergestellten Polypeptids von Interesse.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Transkriptionsfaktoren sind bekannte Proteine, die bei der Initiierung einer Transkription beteiligt sind. Sie wurden intensiv in vielen verschiedenen Organismen untersucht und auch in Pilzen beschrieben. Dhawale und Lane (NAR 1993 21 5537–5546) erarbeiteten vor kurzem die Transkriptionsfaktoren von Pilzen, einschließlich der Fadenpilze.
Viele der Transkriptionsfaktoren sind Regulationsproteine; sie binden sich an die Promoter-DNA und entweder aktivieren oder unterdrücken die Transkription als Reaktion auf Reize auf die Zelle.
Die Expression des α-Amylasegens in A. oryzae wird als Reaktion auf die verfügbare Kohlenstoffquelle reguliert. Das Gen wird maximal exprimiert, wenn man den Organismus auf Stärke oder Maltrose wachsen lässt (Lachmund et al. (1993) Current Microbiology 26 47–51; Tada et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 229 301–306). Die Expression von α-Amylase wird dann wie von Lachmund et al. (vorstehend), die eindringlich nahe legen, dass Transkriptionsfaktoren bei der Regulierung beteiligt sind, mit Transkriptionsgrad reguliert, jedoch wurde bis jetzt kein Gen für einen derartigen Faktor identifiziert.
Der Promoter des α-Amylasegens wurde durch Deletionsanalyse untersucht (Tada et al. (1991) Agric. Biol. Chem. 55 1939–1941; Tsuchiya et al. (1992) Biosci. Biotech. Biochem. 56 1849–1853; Nagata et al. (1993) Mol. Gen. Genet. 237 251–260). Die Autoren dieses Dokuments schlagen vor, dass eine spezifische Sequenz des Promoters für die Maltroseinduktion verantwortlich ist. Nagata et al. (vorstehend) verwendete diese Sequenz als Sonde in einem Gelverschiebungsversuch, um zu sehen, ob irgendwelche Proteine des Kernextrakts von A. nidulans an die Promotersequenz binden können. Drei derartige Proteine wurden gefunden, jedoch wurde keine Beteiligung dieser Proteine an der Expression aufgezeigt. Keines der Proteine wurde durch andere Mittel untersucht oder identifiziert. Ihre Gene bleiben gleichermaßen unbekannt.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft einen Transkriptionsfaktor, der einen α-Amylase-Promoter in Fadenpilzen reguliert.
Demzufolge betrifft die Erfindung in einem ersten Aspekt ein DNA-Konstrukt, das eine DNA-Sequenz umfasst, die einen Transkriptionsfaktor der Erfindung kodiert, wobei die DNA-Sequenz Folgendes umfasst

a) den den Transkriptionsfaktor kodierenden Teil der DNA-Sequenz, die in das in E. coli ToC1058, DSM 10666 vorliegende Plasmid kloniert ist, oder
b) ein Analogon der in a) definierten DNA-Sequenz, welches
i) mit der in a) definierten DNA-Sequenz zu mindestens 60% identisch ist, oder
ii) mit derselben Nukleotidsonde hybridisiert wie die in a) definierte DNA-Sequenz, oder
iii) einen Transkriptionsfaktor kodiert, der mit dem Transkriptionsfaktor zu mindestens 50% identisch ist, der durch eine DNA-Sequenz kodiert ist, die die in a) definierte DNA-Sequenz umfasst, und
iv) einen Transkriptionsfaktor kodiert, der mit einein Antikörper, der gegen den aufgereinigten Transkriptionsfaktor erhalten wurde, der durch die in a) definierte DNA-Sequenz kodiert ist, immunologisch reaktiv ist, oder
v) die Mutation in ToC879 komplementiert, d.h. ToC879 die Fähigkeit verleiht, auf Cyclodextrin zu wachsen und nach Transformation mit der DNA-Sequenz Lipase herzustellen.

Die einen Transkriptionsfaktor kodierende genomische DNA-Sequenz mit voller Länge wurde von einem Stamm des Fadenpilzes Aspergillus oryzae abgeleitet und in das in L. coli ToC1058, DSM 10666 vorliegende Plasmid pToC320 geklont.
Es wird angenommen, dass der Transkriptionsfaktor, der die in pToC320, DSM 10666 untergebrachte DNA-Sequenz kodiert, dieselbe Sequenz, wie derjenige, der in SEQ ID Nr. 1 und in SEQ ID Nr. 2 vorliegt, aufweist. Demzufolge soll auch, wann immer auf den den Transkriptionsfaktor kodierenden Teil der DNA-Sequenz, die in das in DSM 10666 vorliegende Plasmid pToC320 geklont ist, Bezug genommen wird, eine derartige Bezugnahme auch den den Transkriptionsfaktor kodierenden Teil der DNA-Sequenz, die in SEQ ID Nr. 1 und in SEQ ID Nr. 2 vorliegt, einschließen.
Demzufolge können die Begriffe „der den Transkriptionsfaktor kodierenden Teil der DNA-Sequenz, die in das in DSM 10666 vorliegende Plasmid pToC320 geklont ist" und „der den Transkriptionsfaktor kodierenden Teil der DNA-Sequenz, die in SEQ ID Nr. 1 und SEQ ID Nr. 2 vorliegt" austauschbar verwendet werden.
In weiteren Aspekten stellt die Erfindung einen das DNA-Konstrukt der Erfindung beherbergenden Expressionsvektor, eine das DNA-Konstrukt oder dem Expressionsvektor umfassende Zelle und ein Verfahren zur Herstellung eines Transkriptionsfaktoraktivität aufweisenden Peptids, bereit, wobei das Verfahren des Züchtens der Zelle unter Bedingungen, die die Herstellung des Transkriptionsfaktors erlauben, umfasst.
Ein derartiger Transkriptionsfaktor der Erfindung stammt typischerweise von einem Fadenpilz.
Der Begriff „Fadenpilz" soll die Gruppen Phycomycetes, Zygomycetes, Ascomycetes, Basidiomycetes und unechte Pilze, einschließlich Hyphomycetes wie der Gattung Aspergillus, Penicillium, Trichoderma, Fusarium und Humicola einschließen.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Herstellen einer Fadenpilzwirtszelle, umfassend das Einbringen eines für einen beliebigen derartigen Faktor kodierenden DNA-Fragments in einen Fadenpilz, wobei ein α-Amylase-Promoter oder ein coregulierter Promoter die Expression eines Polypeptids von Interesse in einer Weise reguliert, in welcher der Faktor in dem Pilz exprimiert wird.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Herstellen eines Polypeptids von Interesse, wobei dessen Expression durch einen α-Amylase-Promoter oder einen coregulierten Promoter reguliert wird, umfassend das Wachsenlassen einer wie vorstehend beschriebenen Fadenpilzwirtszelle unter für die Herstellung des Faktors und des Polypeptids von Interesse förderlichen Bedingungen und Gewinnen des Polypeptids von Interesse.
Schließlich betrifft die Erfindung die Verwendung des Faktors zum Regulieren der Expression eines Polypeptids von Interesse in einem Fadenpilz.
In diesem Kontext bedeutet Regulierung das Ändern der Bedingungen, unter welchen der Faktor der Erfindung aktiv ist. Dies könnte unterschiedliche Ordnungen des pH-Werts, Substrats usw. bedeuten, wodurch die erhaltene Wirkung eine verbesserte Regulierung der Expression des Proteins von Interesse ist.
Weiterhin umfasst Regulierung auch Vorkommnisse, die während der Wachstumsphase des Pilzes auftreten, während der Transkriptionsfaktor aktiv ist. Je nach den Umständen kann sowohl das Fortschreiten als auch/oder das Aufschieben der Phasen, in welcher der Faktor aktiv ist, die Expression und folglich die Ausbeute verbessern.
Zudem können die spezifischen DNA-Sequenzen, die bei der Bindung eines Transkriptionsfaktors beteiligt sind, unter Verwendung von auf dem Fachgebiet bekannten Standardverfahren identifiziert werden, wodurch es ermöglicht wird, derartige Sequenzen in andere Promoter, die gewöhnlich nicht durch den Faktor reguliert werden, einzufügen, und es ermöglicht wird, dass sich diese Promoter unter der Regulierung des Faktors befinden.
KURZE BESCHREIBUNG DER TABELLEN UND ZEICHNUNG
In den Figuren
zeigt 1 die Struktur des Plasmids pMT1657, wobei dessen Konstriktion wie in Beispiel 1 beschrieben ist;
zeigt 2. die Struktur des Plasmids pToC316, wobei dessen Konstruktion wie in Beispiel 1 beschrieben ist;
zeigt 3 die Struktur des Plasmids pToC320, wobei dessen Konstruktion wie in Beispiel 1 beschrieben ist;
zeigt 4 die Struktur der Plasmide pToC342 und pToC359, wobei deren Konstruktion wie in Beispiel 3 beschrieben ist;
zeigt 5 die Struktur des Plasmids pToC298, wobei dessen Konstruktion wie in Beispiel 4 beschrieben ist;
zeigt 6 die Ergebnisse der Lipaseherstellung durch einen p960-Transformanten von A. oryzae IFO4177, gezüchtet in YP-Medien, enthaltend 2% Glucose (
) oder 10% Glucose (
), im Vergleich mit ToC1075, gezüchtet in YP-Meden, enthaltend 2% Glucose (
) oder 10% Glucose (
) und in Beispiel 4 beschrieben;
zeigt 7 die Ergebnisse der Lipaseherstellung durch ToC1139, gezüchtet in YP-Medien, enthaltend 2% Glucose (
) oder 10% Glucose (
), im Vergleich mit ToC1075, gezüchtet in YP-Medien, enthaltend 2% Glucose (
) oder 10% Glucose (
) und in Beispiel 4 beschrieben; und
zeigt 8 die Autoradiogrammergebnisse einer DNA von A. niger, verdaut mit den folgenden Restriktionsenzymen: Bahn 2, XbaI; Bahn 3, XmaI; Bahn 4, SalI; Bahn 5, HindIII; Bahn 6, EcoRI; Bahn 7, BglII; Bahn 8, BamHI; die Bahnen 1 und 9 enthalten ³²P-markierte 1-DNA, verdaut mit BstEII. Der Versuch ist in Beispiel 5 beschrieben.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
In einem ersten Aspekt betrifft die Erfindung ein DNA-Konstrukt, umfassend eine DNA-Sequenz, die durch einen Transkriptionsfaktor kodiert wird, der einen α-Amylase-Promoter reguliert, wobei die DNA-Sequenz Folgendes umfasst:

a) den den Transkriptionsfaktor kodierenden Teil der DNA-Sequenz, die in das in E. coli ToC1058, DSM 10666 vorliegende Plasmid kloniert ist, oder
b) ein Analogon der in a) definierten DNA-Sequenz, welches
i) mit der in a) definierten DNA-Seguenz zu mindestens 60% identisch ist, oder
ii) mit derselben Nulkeotidsonde hybridisiert wie die in a) definierte DNA-Sequenz, oder
iii) einen Transkriptionsfaktor kodiert, der mit dem Transkriptionsfaktor zu mindestens 50% identisch ist, der durch eine DNA-Sequenz kodiert ist, die die in a) definierte DNA-Sequenz umfasst, und
iv) einen Transkriptionsfaktor kodiert, der mit einem Antikörper, der gegen den aufgereinigten Transkriptionsfaktor erhalten wurde, der durch die in a) definierte DNA-Sequenz kodiert ist, immunologisch reaktiv ist, oder
v) die Mutation in ToC879 komplementiert, d.h. ToC879 die Fähigkeit verleiht, auf Cyclodextrin zu wachsen und nach Transformation mit der DNA-Sequenz Lipase herzustellen.

Wie hier definiert soll eine DNA-Sequenz, die zu dem den Transkriptionsfaktor kodierenden Teil der DNA-Sequenz, die in das in E. coli ToC1058, DSM 10666 vorliegende Plasmid pToC320 geklont ist, analog ist, auf eine beliebige DNA-Sequenz hinweisen, die einen Transkriptionsfaktor kodiert, der einen α-Amylase-Promoter reguliert, wobei der Transkriptionsfaktor eine oder mehrere der vorstehend unter (i)–(v) genannten Eigenschaften aufweist.
Die analoge DNA-Sequenz kann von einem den Transkriptionsfaktor herstellenden Stamm des Fadenpilzes A. oryzae oder einem anderen verwandten Organismus isoliert werden und folglich z.B. ein Allel oder eine Speziesvariante des den Transkriptionsfaktor kodierenden Teils der DNA-Sequenz, die in das in DSM 10666 vorliegende Plasmid pToC320 geklont ist, sein.
In einer anderen Ausführungsform kann die analoge Sequenz auf der Grundlage der DNA-Sequenz, die als der den Transkriptionsfaktor kodierenden Teil von SEQ ID Nr. 1 und SEQ ID Nr. 2 darstellt, z.B. eine Untersequenz davon sein, und/oder durch Einbringen von Nukleotidsubstitutionen, die nicht gegen eine andere Aminosöuresequenz des durch die DNA-Sequenz kodierten Transkriptionsfaktors erhalten wird, sondern der Kodonverwendung des zur Herstellung des Transkriptionsfaktors vorgesehenen Wirtsorganismus entspricht oder durch Einbringen von gegen eine andere Aminosäuresequenz erhaltene Nukleotidsubstitutionen konstruiert werden.
Beim Durchführen von Nukleotidsubstitutionen sind die Änderungen von Aminosäreresten vorzugsweise von geringfügiger Natur, d.h. bewahrende Aminosäurerestsubstitutionen, die die Faltung oder Aktivität des Proteins nicht wesentlich beeinflussen, kleine Deletionen, typischerweise von ein bis etwa 30 Aminosäureresten; kleine Amino- oder Carboxyl-terminale Verlängerungen.
Beispiele für bewahrende Substitutionen befinden sich in der Gruppe von basischen Aminosäuren (wie Arginin, Lysin, Histidin), sauren Aminosäuren (wie Glutaminsäure und Aspartamsäure), polaren Aminosäuren (wie Glutamin und Asparagin), hydrophoben Aminosäuren (wie Leucin, Isoleucin, Valin), aromatischen Aminosäuren (wie Phenylalanin, Tryptophan, Tyrosin) und kleinen Aminosäuren (wie Glycin, Alanin, Serin, Threonin, Methionin). Für eine allgemeine Beschreibung für Nukleotidsubstitutionen siehe z.B. Ford, et al., (1991), Protein Expression und Purification 2, 95–107.
Es ist dem Fachmann klar, dass derartige Substitutionen außerhalb der Regionen durchgeführt werden können, die für die Funktion des Moleküls entscheidend sind, und immer noch zu einem aktiven Transkriptionsfaktor führen. Aminosäurereste, die für die Aktivität des durch ein DNA-Konstrukt der Erfindung kodierten Transkriptionsfaktors wichtig und deshalb vorzugsweise nicht Gegenstand der Substitution sind, können gemäß auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren wie stellengerichtete Mutagenese oder Alanin-Scanning-Mutagegese identifiziert werden (vgl. z.B. Cunningham und Wells, (1989), Science 244 1081–1085). In der letzteren Technik werden Mutationen an jedem Rest im Molekül eingebracht und die erhaltenen Mutantmoleküle auf biologische Aktivität (d.h.
einen α-Amylase-Promoter regulierenden Transkriptionsfaktor) getestet, um Aminosäurereste zu identifizieren, die für die Aktivität des Moleküls entscheidend sind.
Die im vorstehenden (i) genannte Homologie wird als der Identitätsgrad zwischen zwei Sequenzen bestimmt, der eine Abweichung der einen Sequenz von der anderen angibt. Die Homologie kann geeigneterweise durch von auf dem Fachgebiet bekannte Computerprogramme wie GAP, bereitgestellt im GCG-Programmpaket (Needleman, S. B. und Wunsch, C. D., (1970), Journal von Molecular Biology 48 44–453), bestimmt werden. Unter Verwendung von GAP mit den folgenden Einstellungen zum DNA-Sequenzvergeich: GAP-Bildungsstrafe von 5,0 und GAP-Verlängerungsstrafe von 0,3, weist die Kodierungsregion der DNA-Sequenz mit dem den Transkriptionsfaktor kodierenden Teil der in SEQ ID Nr. 1 und SEQ ID Nr. 2 dargestellten DNA-Sequenz einen Identitätsgrad von vorzugsweise mindestens 60%, stärker bevorzugt mindestens 70%, stärker bevorzugt mindestens 80%, stärker bevorzugt mindestens 90%, stärker bevorzugt mindestens 95% auf.
Die im vorstehenden (ii) genannte Hybridisierung soll angeben, dass die analoge DNA-Sequenz unter bestimmten spezifischen detaillierter im nachstehenden Abschnitt Materialien und Verfahren beschriebenen Bedingungen zu der gleichen Sonde wie die den Transkriptionsfaktor kodierende DNA-Sequenz hybridisiert. Die zu verwendende Olionukleotidsonde ist die DNA-Sequenz, die den den Transkriptionsfaktor kodierenden Teil der in SEQ ID Nr. 1 oder SEQ ID Nr. 2 dargestellten DNA-Sequenz oder einem Fragment davon entspricht.
Die im vorstehenden (iii) genannte Homologie wird als der Idenitiätsgrad zwischen den beiden Sequenzen bestimmt, der eine Abweichung der ersten Sequenz von der zweiten angibt. Die Homologie kann geeigneterweise durch auf dem Fachgebiet bekannte Computerprogramme wie GAP, bereitgestellt in GCG-Programmpaket (Needleman, S. B. und Wunsch, C. D., vorstehend), bestimmt werden. Unter Verwendung von GAP mit den folgenden Einstellungen zum Transkriptionsfaktor-Sequenzvergeich: GAP-Bildungsstrafe von 3,0 und GAP-Verlängerungsstrafe von 0,1, weist der durch eine analoge DNA-Sequenz kodierte Transkriptionsfaktor mit dem Transkriptionsfaktor, der durch ein DNA-Konstrukt kodiert wird, das den den Transkriptionsfaktor kodierenden Teil der in SEQ ID Nr. 2 dargestellten DNA-Sequenz, z.B. mit der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 3 umfasst, einen Identitätsgrad von vorzugsweise mindestens 50%, stärker bevorzugt mindestens 60%, stärker bevorzugt mindestens 70%, noch stärker bevorzugt mindestens 80%, speziell mindestens 90% auf.
In Verbindung mit der Eigenschaft (iv) kann die immunologische Reaktivität durch das im nachstehenden Abschnitt Materialien und Verfahren beschriebene Verfahren bestimmt werden.
In Bezug auf die Eigenschaft (v) ist das Komplementierungsverfahren hier in Beispiel 1 beschrieben.
Die einen Transkriptionsfaktor der Erfindung kodierende DNA-Sequenz kann von dem Stamm Aspergillus oryzae IFO 4177 unter Verwendung von Standardverfahren, z.B. wie in Sambrook, et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Lab.; Cold Spring Harbor, NY, beschrieben isoliert werden.
Allgemeine RNA- und DNA-Isolierungsverfahren sind auch in WO 93/11248 und WO 94/14953 offenbart, wobei die Inhalte davon hier unter Bezugnahme eingebracht sind. Eine detailliertere Beschreibung des Komplementierungsverfahrens ist hier in Beispiel 1 bereitgestellt.
In einer anderen Ausführungsform kann die einen Transkriptionsfaktor der Erfindung kodierende DNA gemäß bekannten Verfahren günstigerweise von einer geeigneten Quelle wie einem beliebigen der nachstehend erwähnten Organismen unter Verwendung von synthetischen Oligonukleotidsonden, die auf der Grundlage einer hier offenbarten DNA-Sequenz hergestellt sind, isoliert werden. Zum Beispiel kann eine geeignete Oligonukleotidsonde auf der Grundlage des den Transkriptionsfaktor kodierenden Teils der als SEQ ID Nr. 1 vorliegenden Nukleotidsequenzen oder einer beliebigen Untersequenz davon oder auf der Grundlage der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 3 hergestellt werden.
Die Erfindung betrifft insbesondere einen die Expression des α-Amylase-Promoters in einem Fadenpilz regulierenden Transkriptionsfaktor, wobei der wie in Beispiel 2 angegebene Faktor sogar die Expression von andren Genen regulieren kann.
In diesem Kontext soll der Ausdruck „Fadenpilz" die Gruppen Phycomycetes, Zygomycetes, Ascomycetes, Basidiomycetes und unechte Pilze, einschließlich Hyphomycetes wie die Gattung Aspergillus, Penicillium, Trichoderma, Fusarium und Humicola einschließen.
In diesem Kontext bedeutet der Ausdruck „α-Amylase-Promoter" eine Sequenz von Basen unmittelbar stromaufwärts von einem α-Amylasegen, die RNA-Polymerase erkennt und diese bindet, um die Transkription des für die α-Amylase kodierenden Gens zu unterstützen.
Wie angegeben, sind Transkriptionsfaktoren von vielen Organismen bekannt, und es ist deshalb zu erwarten, dass ähnliche oder entsprechende von anderen Pilzen der Gattung Aspergillus, Penicillium, Trichoderma, Fusarium und Humicola usw. stammende Faktoren gefunden werden können, die die Wirkung auf die Verbesserung der Expression eines Polypeptids aufweisen, das sich unter der Regulierung von Amylase-Promotern in einem beliebigen zu einer beliebigen dieser Gattungen gehörenden Pilz befindet.
Ein Vergleich der DNA-Sequenz, die für den den α-Amylase-Promoter regulierenden Transkriptionsfaktor kodiert, zeigte denselben Homologiegrad zu einem die Expression von Glucosidase in Candida regulierenden Transkriptionsfaktor (CASUCI) und zu MAL63 von Saccharomyces cerevisiae wie in Kelly und Kwon-Chung, (1992) J. Bacteriol. 174 222–232, offenbart.
Es wird gegenwärtig erwogen, dass eine DNA-Sequenz, die einen zu dem Transkriptionsfaktor der Erfindung homologen Transkriptionsfaktor kodiert, d.h. eine analoge DNA-Sequenz, von anderen Mikroorganismen erhalten kann. Zum Beispiel kann die DNA-Sequenz durch ein ähnliches Durchmustern einer cDNA-Bilbliothek von anderen Mikroorganismen, wie einem Stamm von Aspergillus, Saccharomyces, Erwinia, Fusarium oder Trichoderma abgeleitet werden.
Ein Isolat eines Stamms von A. oryzae, dessen für einen Transkriptionsfaktor der Erfindung kodierendes Gen inaktiviert wurde, wurde von den Erfindern gemäß dem Budapester Vertrag über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentprozeduren bei der DSM, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, DEUTSCHLAND, hinterlegt.

Hinterlegungsdatum: 6. MAI 1996 (06.05.96)

Referenznummer der Hinterleger: ToC879 = NN049238

DSM-Bezeichnung: Aspergillus oryzae DSM No. 10671
Der hinterlegte Stamm Aspergillus oryzae DSM Nr. 10671 kann zum Isolieren eines erfindungsgemäßen Transkriptionsfaktors von einem beliebigen Stamm von Aspergillus oryzae und einem beliebigen anderen Pilzstamm mit einem derartigen Gen durch wie nachstehend beschriebene Komplementierung verwendet werden.
Das Expressionsplasmid pToC320, das die den Transkriptionsfaktor der Erfindung kodierende genomische DNA-Sequenz mit voller Länge umfasst wurde in einem Stamm von E. coli transformiert, wodurch der Stamm ToC1058 erhalten wurde, der von den Erfindern gemäß dem Budapester Vertrag über die DSMZ, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, DEUTSCHLAND hinterlegt wurde.

Hinterlegungsdatum: 6. MAI 1996 (06.05.96)

Referenznummer der Hinterleger: ToC1058 = NN049237

DSM-Bezeichnung: E. coli DSM No. 10666
Erfindungsgemäß sind Faktoren dieses Typs, die von den Spezies A. oryzae, A. niger, A. awamori usw., insbesondere A. oryzae IFO4177 stammen, bevorzugt.
Es wurde gefunden, dass der Transkriptionsfaktor der Erfindung nicht nur bei der Regulierung des α-Amylase-Promoters sondern auch bei der Regulierung des Glucoamylase-Promoters von A. oryzae beteiligt ist.
Insbesondere umfasst die Erfindung einen beliebigen Faktor mit einer Aminosäuresequenz, die eine ein oder mehrere Fragmente oder Kombinationen von Fragmenten der als SEQ ID Nr. 3 dargestellten Aminosäuresequenz umfasst.
Trunkierte Formen des Transkriptionsfaktors können ebenfalls aktiv sein. Der Begriff trunkierte Formen bedeutet Modifikationen des Transkriptionsfaktors, in welchen N-terminale, C-terminale oder ein oder mehrere interne Fragmente deletiert wurden.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft eine DNA-Sequenz die für einen beliebigen dieser Faktoren kodiert.
In diesem Aspekt umfasst die Erfindung insbesondere eine DNA-Sequenz, die für einen oder mehrere Fragmente der als SEQ ID Nr. 3 dargestellten Aminosäuresequenz kodiert.
Spezieller betrifft die Erfindung eine DNA-Sequenz, die ein oder mehrere Fragmente oder eine Kombination von Fragmenten der als SEQ ID Nr. 1 und SEQ ID Nr. 2 dargestellten DNA-Sequenz umfasst.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Herstellen einer Fadenpilzwirtszelle, umfassend das Einbringen eines beliebigen der vorstehend erwähnten DNA-Fragmente in einen Fadenpilz, wobei der α-Amylase-Pormoter oder ein anderer coregulierter Promoter die Expression eines Polypeptids von Interesse in einer Weise reguliert, in welche der Faktor in dem Pilz exprimiert wird.
Die Einbringung des DNA-Fragments kann durch jedes beliebige bekannte Standardverfahren zum Einbringen von DNA in einen Fadenpilz wie unter Verwendung eines Expressionsvektors und einer wie nachstehend beschriebenen Wirtszelle durchgeführt werden.
Deshalb stellt die Erfindung auch einen rekombinanten Expressionsvektor bereit, der das DNA-Konstrukt der Erfindung umfasst.
Der Expressionsvektor der Erfindung kann ein beliebiger Expressionsvektor sein, der günstigerweise rekombinanten DNA-Prozeduren unterzogen wurde, und die Wahl des Vektors hängt häufig von der Wirtszelle ab, in welcher er einzubringen ist.
Folglich kann der Vektor ein autonom replizierender Vektor, d.h. ein Vektor, der als extrachromosomale Einheit vorliegt, wobei dessen Replikation von der chromosomalen Replikation unabhängig ist, z.B. ein Plasmid sein. In einer anderen Ausführungsform kann der Vektor einer sein, der beim Einbringen in eine Wirtszelle in das Wirtszellengenom integriert und zusammen mit dem (den) Chromosom(en), in welches er integriert wurde, repliziert wird.
Im Expressionsvektor sollte die den Transkriptionsfaktor kodierende DNA-Sequenz entweder auch das mit dem Transkriptionsfaktor verbundene Expressionssignal enthalten oder funktionsfähig an eine geeignete Promoter- und Terminatorsequenz gebunden sein. Der Promoter kann eine beliebige in der Wirtszelle der Wahl Transkribtionsaktivität zeigende DNA-Sequenz sein und von Genen abgeleitet werden, die für die Wirtszelle entweder homolog oder heterolog sind. Die zum Binden der für den Transkriptionsfaktor, den Promoter bzw. den Terminator kodierenden DNA-Sequenzen und zu deren Einfügen in geeignete Vektoren verwendeten Verfahren sind dem Fachmann bekannt (vgl. Sambrook et al., vorstehend.).
Beispiele für geeignete Promoter zur Verwendung in Fadenpilzwirtszellen sind z.B. der ADH3-Promoter von A. nidulans (McKnight, et al. (1985) The EMBO J. 4 2093–2099) oder der tpiA-Promoter. Beispiele für andere nützliche Promoter sind diejenigen, die von der genkodierenden α-Amylase von Aspergillus oryzae, der neutralen α-Amylase von Aspergillus niger, der säurestabilen α-Amylase von Aspergillus niger, der Glucoamylase (gluA) von Aspergillus niger, Aspergillus awamori oder Aspergillus. oryzae, der alkalischen Protease (alp) von A. oryzae, der Nitratreduktase (niaD) von A. oryzae der Triosephosphatisomerase (tpi) von Aspergillus oryzae, der Acetamidase von Aspergillus nidulans oder einem für ein biosynthetisches Gen einer Aminosäure wie argB kodierenden Aspergillus-Promoter abgeleitet sind.
In noch einem anderen Aspekt stellt die Erfindung eine Wirtszelle bereit, die das DNA-Konstrukt der Erfindung und/oder den rekombinanten Expressionsvektor der Erfindung umfasst.
Vorzugsweise ist die Wirtszelle der Erfindung eine eukariontische Zelle, insbesondere eine Pilzzelle wie eine Hefe- oder Fadenpilzzelle. Insbesondere kann die Zelle zu einer Spezies von Trichoderma, vorzugsweise Trichoderma harzianum oder Trichoderma reesei oder einer Spezies von Aspergillus, besonders bevorzugt Aspergillus oryzae oder Aspergillus niger gehören. Pilzzellen können durch ein Verfahren unter Beteiligung von Protoplastbildung und Transformation der Protoplaste, gefolgt von Regeneration der Zellwand in einer an sich bekannten Weise transformiert werden. Die Verwendung von Aspergillus als Wirtsorganismus ist in EP 238 023 (Novo Nordisk A/S) beschrieben, wobei der Inhalt davon hier unter Bezugnahme eingebracht ist. Die Wirtszelle kann auch eine Hefezelle, z.B. einen Stamm von Saccharomyces, insbesondere Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces kluyveri oder Saccharomyces uvarum, ein Stamm von Schizosaccharomyces sp. wie Schizosaccharomyces pombe, ein Stamm von Hansenula sp., Pichia sp., Yarrowia sp. wie Yarrowia lipolytica oder Kluyveromyces sp. wie Kluyveromyces lactis sein.
Das endogene amyR-Gen der Wirtszelle kann durch andere Mittel deletiert oder inaktiviert werden. Die Einbringung von amyR-Steuerung durch einen heterologen Promoter führt dann zu einem völlig neuen Regulationsschema des α-Amylase-Promoters. Wird z.B. amyR mit dem niaD-Promoter von A. oryzae vereinigt, wird der α-Amylase-Promoter durch Nitrat induzierbar. Wird statt dem niaD-Promoter ein palC-regulierter Promoter verwendet, wird die Aktivität des α-Amylase-Promoters durch den pH-Wert reguliert.
Die Erfindung umfasst auch ein Verfahren zum Herstellen eins Polypeptids von Interesse, wobei man eine wie vorstehend beschriebene Wirtszelle unter zur Herstellung des Faktors und des Polypeptids von Interesse förderlichen Bedingungen wachsen lässt und das Polypeptid von Interesse gewonnen wird.
Das zum Züchten der transformierten Wirtszellen verwendete Medium kann ein beliebiges herkömmliches Medium sein, das für das Wachstum der fraglichen Wirtszellen geeignet ist. Das exprimierte Polypeptid von Interesse kann günstigerweise in das Kulturmedium sekretiert und durch bekannte Verfahren, einschließlich Abtrennen der Zellen von dem Medium durch Zentrifugation oder Filtration, Ausfällen von proteinhaltigen Bestandteilen des Mediums durch ein Salz wie Ammoniumsulfat, gefolgt von chromatographischen Verfahren wie Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie oder dergleichen daraus gewonnen werden.
Erfindungsgemäß kann das Verfahren zum Herstellen eines Polypeptids von Interesse verwendet werden, bei welchem es sich um ein medizinisches Polypeptid, insbesondere derartige medizinische Polypeptide wie Wachstumshormon, Insulin, Blutgerinnungsfaktor und dergleichen handelt.
Das Verfahren kann auch zur Herstellung von industriellen Enzymen wie Proteasen, Lipasen, Amylasen Glucoamylasen, Oxidoreduktasen, Carbohydrasen, Carbonylhydrolasen, Cellulasen, Esterasen usw. verwendet werden.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung kann der Transkriptionsfaktor zum Verbessern der Expression eines Polypeptids von Interesse in einem Fadenpilz wie einem Pilz der Gattung Aspergillus, Trichoderma, Penicillium, Fusarium, Humicola usw., insbesondere der Spezies A. oryzae, A. niger, A. awamori usw. und insbesondere A. oryzae verwendet werden.
Der Transkriptionsfaktor der Erfindung kann folglich zum Verbessern der Expression eines medizinischen Polypeptids wie Wachstumshormon, Insulin, Blutgerinnungsfaktor usw. verwendet werden.
Ebenso kann die Expression von industriellen Enzymen wie Proteasen, Lipasen, Amylasen Glucoamylasen, Oxidoreduktasen, Carbohydrasen, Carbonylhydrolasen, Cellulasen, Esterasen usw. durch die Verwendung des Transkriptionsfaktors der Erfindung verbessert werden.
Der Transkriptionsfaktor kann auch zum Identifizieren der Sequenzen des α-Amylase-Promoter, an welchen er sich bindet, verwendet werden. Zum Beispiel könnte dies durchgeführt werden, indem ein GST-Vereinigungsprotein mit der DNA-Bindungsdomäne von amyR wie dem Zinkfinger zur Herstellung in E. coli hergestellt wird. Derartige Verbindungsproteine können günstigerweise unter Verwendung von im Handel erhältlichen Kits, z.B. des „GST Gene Fusion Kit" vom Pharmacia hergestellt werden. Das gereinigte GST-Vereinigungsprotein kann dann in herkömmlichen in-vitro-Techniken wie Gelverschiebungstests oder DNA-Fußabdrucksanalyse (Kulmburg, P., et al. (1992) Molecular und Cellular Biology 12 1932–1939; Lutfiyya, L. L., und Johnston, M. (1996) Molecular und Cellular Biology 16 4790–4797) verwendet werden. Die Identifizierung der AmyR-Bindestelle ermöglicht es, diese Sequenzen in andere gewöhnlich nicht durch AmyR regulierte Promoter einzufügen.
MATERIALIEN UND VERFAHREN
Hybridisierung:
Geeignete Hybridisierungsbedingungen zur Bestimmung der Hybridisierung zwischen einer Nukleotidsonde und einer „analogen" DNA-Sequenz der Erfindung kann wie vorstehend beschrieben definiert werden. Die zu verwendende Oligonukleotidsonde ist die DNA-Sequenz, die dem den Transkriptionsfaktor kodierenden Teil der in SEQ ID Nr. 1 dargestellten DNA-Sequenz, d.h. den Nukleotiden 1691..2676 + 2743..3193 + 3278..3653 in SEQ ID Nr. 1, oder einem Fragment davon, z.B. den Nukleotiden 1770–1800 in SEQ ID Nr. 1 entspricht.
Hybridisierungsbedingungen
Geeignete Bedingungen zum Bestimmen der Hybridisierung zwischen einer Nukleotidsonde und einer homologen DNA- oder RNA-Sequenz beinhalten das Voreinweichen der die zu hybridisierenden DNA-Fragmente oder RNA enthaltenden Filters in 5× SSC (Standardkochsalzcitratpuffer) über eine Dauer von 10 Minuten und Vorhybridisieung des Filters in einer Lösung von 5× SSC (Sambrook, et al., vorstehend), 5× Denhardt-Lösung (Sambrook, et al., vorstehend), 0.5%igem SDS und 100 μg/ml denaturierter mit Ultraschall behandelter Lachssperma-DNA (Sambrook, et al., vorstehend), gefolgt von Hybridisierung der gleichen Lösung, enthaltend eine zufällig geprimte (Feinberg, A. P. und Vogelstein, B. (1983) Anal. Biochem. 132 6–13), ³²P-dATP-markierte (spezifische Aktivität > 1 × 10⁹ cpm/μg) Sonde über eine Dauer von 12 Stunden bei 65°C. Der Filter wird dann zweimal über eine Dauer von 30 Minuten in 2× SSC, 0.5%igem SDS bei vorzugsweise nicht mehr als 50°C, stärker bevorzugt nicht mehr als 55°C, stärker bevorzugt nicht mehr als 60°C, stärker bevorzugt nicht mehr als 65°C, noch stärker bevorzugt nicht mehr als 70°C, insbesondere nicht mehr als 75°C gewaschen.
Moleküle, an welche die Nukleotidsonde unter diesen Bedingungen hybridisiert, werden unter Verwendung eines Phospho-Image-Detektors nachgewiesen.
Immunologische Kreuzreaktivität:
Bei der Bestimmung von immunologischer Kreuzreaktivität zu verwendende Antikörper können durch die Verwendung eines gereinigten Transkriptionsfaktors hergestellt werden. Spezieller kann Antiserum gegen den Transkriptionsfaktor durch Immunisieren von Kaninchen (oder Nagern) gemäß dem von N. Axelsen et al. in: A Manual von Quantitative Immunoelectrophoresis, Blackwell Scientific Publications, 1973, Chapter 23 oder A. Johnstone und R. Thorpe, Immunochemistry in Practice, Blackwell Scientific Publications, 1982 (insbesondere Seite 27–31) beschriebenen Verfahren erhalten werden. Gereinigte Immunoglobuline können z.B. durch Salzausfällung ((NH₄)₂SO₄), gefolgt von Dialyse und Ionenaustauschchromatographie, z.B. über DEAE-Sephadex von den Antiseren erhalten werden. Die immunochemische Charakterisierung von Proteinen kann entweder durch Outcherlony-Doppeldiffusionsanalyse (O. Ouchterlony in: Handbook von Experimental Immunology (D. M. Weir, ed.), Blackwell Scientific Publications, 1967, Seite 655–706), durch Kreuz-Immunoelektrophorese (N.
Axelsen et al., supra, Chapters 3 und 4) oder durch Rocket-Immunoelektrophorese (N. Axelsen et al., op cit., Chapter 2) durchgeführt werden.
BEISPIELE
BEISPIEL 1
Klonen des amyR-Transkriptionsfaktors von A. oryzae
amyR wurde durch Komplementierung des mutanten Stamms von A. oryzae, der zwei verschiedene Proteine, beide unter Kontrolle des TAICA-Amylase Promoters, nicht exprimieren konnte, geklont. Der mutante Stamm ToC879 von A. oryzae wurde durch Mutagenese des Stamms SRe440, enthaltend eine Lipase (HLL), die cDNA unter Kontrolle des TAKA-Promoters kodiert, und eine Kopie des von seinem eigenen Promoter transkribierten TAKA-Amylasegens, hergestellt.
Der Mutant wurde identifiziert und durch seinen Amylase-negativen (Amylase^–) Phenotyp isoliert und anschließend ebenfalls als Lipase-negativ (Lipase^–) dargestellt.
Der Stamm ToC879 enthält intakte Kopien von beiden Expressionskassetten. Der Amylase-Phenotyp macht ToC879 unfähig, auf Platten, enthaltend 1% Cyclodextrin als einzige Kohlenstoffquelle, zu wachsen, während der parentale Stamm SRe440 auf derartigen Platten wächst.
ToC879 wurde bei der DSM unter der Bezeichnung DSM Nr. 10671 hinterlegt.
amyR wurde durch Cotransformieren von ToC879 mit einer Cosmid-Bibliothek von A. oryzae und einem autonom replizierenden Plasmid auf pHelp1-Basis (D. Gems, I. L. Johnstone, und A. J. Clutterbuck (1991) Gene 98 61–67), das das Glufosinat Resistenz verleihende bar-Gen von Streptomyces hygroscopicus trägt isoliert. Die Transformanten wurden auf Platten, enthaltend Cyclodextrin als die einzige Kohlenstoffquelle, einer Selektion unterzogen und auf eine gleichzeitige Umwandlung zu dem Lipase⁺-Phenotyp durchgemustert.
Die transformierende DNA wurde aus Kolonien, die auf Cyclodextrin wachsen konnten, eingefangen. Ein Subklonen führte zur Isolierung eines DNA-Fragments mit 4,3 kb, das beide Phenotypen von ToC879 komplementieren konnte. Das Gen, das auf diesem Fragment untergebracht war, wurde amyR genannt.
Konstruktion des pHelp1-Derivats pMT1657
Ein Plasmid, pMT1612, wurde durch Ligation (und anschließende Transformation in E. coli DH5a) der folgenden vier Fragmente hergestellt:

i) Des Vektors pToC65 von E. coli (beschrieben in EP 531 372 ), geschnitten mit SphI/XbaI,
ii) Eines PCR-Fragments (enthaltend den amdS-Promoter von A. nidulans), geschnitten mit SphI/BamHI,
iii) Eines BamHI/XhoI-Fragments mit 0,5 kb von pBP1T (B. Staubinger et al., (1992) Fungal Genetics Newsletter 39 82–83), enthaltend das bar-Gen und
iv) Eines XhoI/XbaI-Fragments mit 0,7 kb von pIC AMG/Term (BP-Anmeldung Nr. 87103806.3), enthaltend den Glucoamylasetranskriptionterminator von A. niger.

Das den amdS-Promoter enthaltende PCR-Fragment wurde unter Verwendung des Plasmids pMSX-6B1 (M. E. Katz et al., (1990) Mol. Gen. Genet. 220 373–376) als Substrat-DNA und der beiden Oligonukleotide 4650 (SEQ ID Nr. 4) und 4561 (SEQ ID Nr. 5) als Primer hergestellt.
pMSX-6B1 enthält eine amdS-Promoteraufwärtsmutation, genannt I666.
pMT1612 wurde mit HindIII geschnitten, dephosphoryliert und an ein die AMA1-Sequenz enthaltendes HindIII-Fragment mit 5,5 kb von pHelp1 ligiert. Das erhaltene Plasmid, pMT1657 ist in Aspergilli selbstreplizierend und kann durch erhöhte Resistenz gegenüber Glufosinat selektiert werden. pMT1657 ist in 1 dargestellt, wobei PamdS den amdS-Promoter von vorstehendem Fragment ii) darstellt, bar vorstehendes Fragment iii) darstellt und Tamg vorstehendes Fragment iv) darstellt.
Konstruktion der Cosmid-Bibliothek
Eine Cosmid-Bibliothek von Aspergillus oryzae wurde im Wesentlichen gemäß den Anweisungen des Lieferantens des „SuperCos1-Cosmidvektorkits" (Stratagene Cloning Systems, La Jolla CA, USA) konstruiert.
Genomische DNA von A. oryzae IFO4177 wurde von Protoplasten, die durch Standardverfahren hergestellt waren (Christensen, T., et. al. (1988) Biotechnology 6 1419–1422) hergestellt.
Nach der Isolierung wurden die Protoplaste durch Zentrifugation mit 2500 UpM für eine Dauer von 5 Minuten in einer Labofuge T (Heto) pelletiert; wurde das Pellet dann in 10 mM NaCl, 20 nM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA, 100 μg/ml Proteinase K und 0,5% SDS wie im Manual vom Supereos1-Cosmidvektorkit angegeben suspendiert; wurde der Rest der DNA-Präparation gemäß den Anweisungen des Kits durchgeführt.
Die Größe der genomischen DNA wurde durch Elektrophorese unter Verwendung der CHEF-Gelapparatur (Bio-Rad Laboratories, Hercules CA, USA) analysiert. Ein 1%iges Agarosegel wurde für eine Dauer von 20 Stunden bei 200 Volt mit einem Puls von 10–50 Sekunden gefahren. Das Gel wurde mit Ethidiumbromid gefärbt und fotografiert. Die DNA wies eine Größe von 50 – > 100 kb auf. Die DNA wurde unter Verwendung von Sau3A teilweise verdaut. Die durch den gleichen Typ der CHEF-Gelanalyse wie vorstehend gemessene Größe der verdauten DNA betrug 20–50 kb. Der CsC1-Gradient-Band-SuperCos1-Vektor wurde gemäß dem Manual hergestellt. Die Bindung und Packung wurde gleichermaßen wie im Manual beschrieben durchgeführt.
Nach Titrieren der Bibliothek wurde das gesamte verpackte Gemisch von einer Ligation und Verpackung in die Wirtszellen, XL1-Blue MR, transfektiert und auf 50 μg/ml Ampicillin-LB-Platten aufgestrichen. Etwa 3800 Kolonien wurden erhalten. Cosmid-Präparate von 10 Kolonien zeigten, dass sie alle Einfügungen der erwarteten Größe aufwiesen. Die Kolonien wurden einzeln aufgenommen und in Mikrotiterplattemnulden mit 100 μl LB (100 μg/ml Ampicillin) geimpft und bei 37°C über Nacht inkubiert. 100 μl 50%iges Glycerin wurden jeder Mulde zugesetzt und die gesamte Bibliothek bei –80°C eingefroren. Insgesamt 3822 Kolonien wurden aufbewahrt.
Dies stellt das Genom von A. oryzae etwa 4,4-fach dar. Nach der Aufnahme der Kolonien wurden die Platten abgeschabt, die Abschabung gepoolt und die gesamte Bibliothek ebenfalls in vier Pools als eingefrorenes Glycerinstammmaterial aufbewahrt. Die vier Pools wurden ToC901–ToC904 genannt.
Die einzeln eingefrorenen Kolonien in der Bibliothek wurden auf LB-Platten (100 μg/ml Ampicillin) unter Verwendung einer Mulinadel-Vorrichtung mit 6 Reihen von 8 Nadeln, die in eine Hälfte einer Mikrotiterplatte passte, geimpft. Platten wurden hergestellt, die Kolonien aller Klone in der Bibliothek enthielten.
Die Platten wurden bei 37°C über Nacht inkubiert. Sterilisierte Filter des Typs Whatman 540, die auf die Größe einer Petrischale zugeschnitten waren, wurden auf die Kolonien gesetzt, die für eine Dauer von zwei weiteren Stunden bei 37°C inkubiert wurden. Die Filter wurden auf LB-Platten, enthaltend 200 μg/ml Chloramphenicol, überführt und die Platten über Nacht bei 37°C inkubiert.
Am nächsten Tag wurden die Filter zweimal in 0,5 M NaOH für eine Dauer von 5 Minuten, dann zweimal in 0,5 M Tris-HCl (pH 7,4) für eine Dauer von 5 Minuten und dann zweimal in 2× SSC für eine Dauer von 5 Minuten gewaschen. Die Filter wurden mit Ethanol befeuchtet und durchgetrocknet.
Selektion von amyR-Klonen
Cosmid-DNA wurde von ToC901–904 hergestellt und durch Cotransformation mit pMT1657 in ToC879 eingebracht. Das Transformationsverfahren ist in der EP-Anmeldung Nr. 87103806.3 beschrieben. Etwa 8700 Transformanten wurden durch Resistenz gegen 1 mg/ml Glufosinat in Minimalplatten (Cove D. J. (1966) BBA 113 51–56), enthaltend 1 M Sacharose für osmotische Stabilisierung und 10 mM (NH₄)₂SO₄ ausgewählt.
Zehn zufällig ausgewählte Transformanten wurden einmal auf demselben Plattentyp erneut isoliert. Conidiosporen von diesen 10 Transformanten wurden in Minimalmedium, enthaltend 1 mg/ml Glufosinat, geimpft und man ließ sie bei 30°C wachsen, bis genügend Mycelium für die DNA-Präparation geerntet werden konnte. DNA wurde wie in T. Christensen et al. (vorstehend) beschrieben hergestellt.
Die ungeschnittene DNA wurde auf 0,7%iges Agarosegel aufgetragen, und eine Elektrophorese wurde durchgeführt, gefolgt von Southernblotten. Der Blot wurde mit einem ³²P-markiertem SuperCos1-spezifischen DNA-Fragment hybridisiert. Jeder der zehn Transformanten zeigte eine Bande mit höherer Mobilität als die lineare chromosomale DNA. Jede der Banden hybridisierte auf einer pHelp1-spezifischen Sonde, was darauf hinwies, dass die Cotransformationsfrequenz der Cosmid-Bibliothek nahe 100% lag, und dass die Cosmide in den autonomen pHelp1 integriert wurden.
Die Transformanten waren, wie für pHelp1-Transfornanten erwartet, unstabil. Weniger als 10% der Condiosporen von einer Glufosinat-resistenten Kolonie wurde gegen Glufosinat-resistente Vermehrung erhalten.
Conidiosporen von allen der Transformanten wurden in 8 Pools aufgefangen und auf Minimalplatten (Cove D. J., vorstehend), enthaltend 1 mg/ml Glufosinat, 10 mM (NH₄)₂SO₄ und 1% b-Cyclodextrin (Kleptose von Roquette Frères, 62136 Lestem, Frankreich), aufgestrichen.
Vier Kolonien wurden von einem der Pools und eine von einem der anderen Pools erhalten. zwei der Kolonien von dem ersten Pool wurden einmal auf demselben Plattentyp erneut isoliert.
Conidiosporen der erneut isolierten Kolonien wurden auf Minimalplatten mit entweder Glucose oder Cyclodextrin als Kohlenstoffquelle und auf Glufosinat-enthaltende Platten aufgestrichen. Die Glufosinatresistenz und die Fähigkeit, auf Cyclodextrin zu wachsen, waren beides unstabile Phenotypen mit denselben Instabilitätsgrad. Dies wies darauf hin, dass das die Fähigkeit zum Wachsen auf Cyclodextrin verleihende Gen physikalisch an pMT1657 in den Transformanten gebunden war.
Kolonien von den erneut isolierten Platten wurden ausgeschnitten und durch Rocket-Immunoelektrophorese (RIE) unter Verwendung eines gegen die HLL-Lipase erhaltenen Antikörpers analysiert. Die Transformanten ergaben eine klare Reaktion mit dem Antikörper, während die ToC879-Kolonien, die auf Maltose wuchsen, keine Reaktion ergaben. Dies führte zu dem Rückschluss, dass die Expression sowohl von Amylase (d.h., das Wachstum auf Cyclodextrin) als auch von Lipase (d.h. Antikörperbindung) in diesen Transformanten wieder hergestellt wurde. Das für diesen Phenotyp verantwortliche Gen wurde amyR genannt.
Isolierung des amyR-Gens
Zum Einfangen des amyR-Gens von den Amylase⁺-, Lipase⁺-Transformanten von ToC879, wurden nacheinander zwei verschiedene Vorgangsweisen verwendet.
DNA wurde von Myceliumwachstum in Minimalmedium mit Cyclodextrin als Kohlenstoffquelle präpariert.
In der ersten Vorgehensweise wurde die DNA unter Verwendung des Gigapack^®-II-Kits von Stratagene in einem Versuch, das ursprüngliche Cosmid aus der Gesamt-DNA herauszufangen, in λ-Köpfen verpackt. Die Verpackungsreaktion wurde mit XL1-Blue MR E. coli unter den von dem Kit-Liferanten spezifizierten Bedingungen inkubiert. Die Zellen von E. coli wurden auf LB-Platten mit 50 μg/ml Ampicillin aufgestrichen. Zwei Kolonien erschienen auf den Platten; die diese enthaltenden Cosmide waren identisch und wurden TnC1012 genannt.
Die zweite Vorgehensweise der gesamten DNA wurde in einem Versuch zum Transformieren von kompetenten DH5a-Zellen von E. coli verwendet. Sechzehn Kolonien wurden isoliert, und es zeigte sich, dass sie sechs verschiedene Plasmide durch Restriktionsenzymverdau enthielten. Jedes der Plasmide wurde mit EcoRI verdaut und einer Southern-Analyse unterzogen. Eine ³²P-markierte Sonde eines Gemischs aus pMT1657 und SuperCos1 wurde verwendet, um DNA-Fragmente zu identifizieren, die kein Teil von irgendwelchen dieser Vektoren waren. Zwei EcoRI-Fragmente mit einer Größe von etwa 0,7 und 1,2 kb hybridisierten in keiner dieser Sonden. Das Fragment mit 1,2 kb wurde isoliert, mit ³²P markiert und als Sonde in einem Hybridisierungsversuch verwendet, in welchem die Filter den Teil der Cosmid-Bibliothek enthielten, der gegen die ursprünglichen Transformanten erhalten wurde. Sechs Cosmide von dem Pool (ToC904), enthaltend etwa 1000 Klone, hybridisierten.
Unter diesen zeigte es sich von einem, dass sie durch Restriktionsenzymverdau identisch waren, was zur Isolierung von vier verschiedenen Cosmiden führte. Alle Cosmide enthielten auch zumindest Teile des TAKA-Amylasegens. Die vier Cosmide und das Cosmid ToC1012 wurden in ToC879 durch Cotransformation mit pMT1623, einem das bar-Gen unter Kontrolle des tpi-Promoters von A. oryzae tragenden Plasmid auf pUC-Basis transformiert. Fünfzehn Transformanten von jeder Cotransformation wurden durch Resistenz gegen Glufosinat isoliert und auf die Fähigkeit, auf Cyclodextrin zu wachsen, getestet.
Acht Transformanten von ToC1012 und drei Transformanten von einem der anderen Cosmide, 41B12, konnten wachsen. Keiner der Transformanten der anderen Cosmide wuchs. Der Grund dafür, dass nicht alle der Transformanten von ToC1012 und 41B12 wachsen konnten, bestand wahrscheinlich in einer Reflektion der Cotransformationshäufigkeit in jedem Versuch. Kolonien der auf Cyclodextrin gewachsenen Transformanten wurden durch RIE analysiert und zeigten, dass sie alle Lipase herstellten.
DNA-Fragmente, die durch Verdauen von 41B12 mit entweder BglII, HindIII oder PstI erhalten wurden, wurden in pUC19 geklont, um amyR von dem Cosmid zu subklonen. Die Subklone wurden in ToC879 transformiert, und die Transformanten auf die wie vorstehend beschriebene Fähigkeit, auf Cyclodextrin zu wachsen und Lipase herzustellen analysiert. Wie in 2 dargestellt, zeigte es sich, dass ein Plasmid, genannt pToC316, ein HindIII-Fragment mit etwa 9 kb enthielt, das derart identifiziert wurde, dass es amyR enthielt.
Ein weiteres Subklonen führte zu einem Plasmid, genannt pToC320, enthaltend ein HindIII/SacI-Fragment mit 4,3 kb, das in 3 dargestellt ist und anschließend auf einer ABI-DNA-Squenzapparatur unter Verwendung sowohl von weiterem Subklonen als auch Primerwanderung anschließend sequenziert wurde.
Eine DNA-Sequenz mit 3980 bp, einschließend das amyR-Gen, ist in SEQ ID Nr. 1 dargestellt. Die hergeleitete Aminosäuresequenz ist in SEQ ID Nr. 3 dargestellt und zeigt eine Zinkfingersequenz des Gal-4-Typs zwischen den Aminosäuren 28–54. Von derartigen Sequenzen ist es bekannt, dass sie an DNA binden (Reece, R. J., und Ptashne, M. (1993) Science 261 909–910).
amyR bildet sich eng an den drei Amylase-Genen in IFO4177 ab, da es von einem Cosmid isoliert wurde, das auch Amylase-spezifische DNA-Fragmente enthält. Das Abbilden des Cosmids zeigte, dass das α-Amylasegen und amyR 5–6 kb weit auseinander liegen. Eine Southernanalyse der genomischen DNA zeigte, dass nur eine Kopie von amyR in IFO4177 vorliegt und bestätigte, dass es nahe an einem der Amylasegene abbildet.
Analyse von amyR cDNA
mRNA wurde durch das Verfahren von Wahleithner, J. A., et al. (1996, Curr. Genet. 29 395–403) von einer Kultur von A. oryzae, gewachsen in maltosehaltigem Medium unter für die α-Amylaseherstellung vorteilhaften Bedingungen, hergestellt. Doppelstrang-cDNA wurde durch Standardverfahren hergestellt und für PCR-Reaktionen mit den folgenden Primern verwendet:
Eine PCR-Reaktion mit den Primern 20866 und 23087 führte zu einem Fragment mit etwa 1,1 kb. Das Fragment wurde mit EcoRI und HindIII verdaut; diese Restriktionsstellen wurden in die Primer eingebracht und in einen mit denselben Enzymen geschnittenen pUC19-Vektor geklont.
Die Einfügung des erhaltenen Primers wurde sequenziert, das Ergebnis lokalisierte ein Intron in diesen Teil des Gens. Das Intron ist in SEQ ID Nr. 2 angegeben.
Eine andere PCR-Reaktion mit dem oligodT-Primer und Primer 20866 führte zu keinem eindeutigen Fragment. Ein Aliquot dieser Reaktion wurde als Ausgangspunkt über eine neue Reaktion mit dem oligodT-Primer und dem Primer 20865 verwendet, was zu einem Fragment mit etwa 1,1 kb führte. Dieses Fragment wurde mit EcoRI und HindIII verdaut und in pUC19 geklont.
Ein Sequenzieren zeigte, dass das Fragment den 3'-Teil von amyR enthielt und ein anderes Intron lokalisiert wurde. Dies ist auch in SEQ ID Nr. 2 angegeben. Drei unabhängige Plasmide wurden am 3'-Ende sequenziert, und zwei polyA-Additionsstellen wurden lokalisiert, eine an bp Nr. 3827 und eine an bp Nr. 3927.
BEISPIEL 2
Quantifizieruug von Glucoamylasesynthese in einem amyR^–-Stamm
A. oryzae stellt eine Glucoamylase her, die durch das glaA-Gen kodiert ist, das durch dieselbe Substanz wie α-Amylase reguliert wird (Y. Hata et al. (1992) Curr. Genet. 22 85–91). Um zu sehen, ob auch amyR an der Regulierung von glaA beteiligt ist, wurde die Synthese von Glucoamylase unter induzierenden Bedingungen im amyR^–-Stamm ToC879 und im amyR-wt-Stamm Re440, von welchem ToC879 direkt abgeleitet war, gemessen.
Conidiosporen von jedem Stamm wurden in 10 ml YPM (YP, enthaltend 2% Maltose) geimpft, und man ließ sie für eine Dauer von 4 Tagen bei 30°C wachsen. Die Überstände wurden aufgefangen und durch Inkubation mit p-Nitrophenyl-α-D- Glucopyranosid, einem Substrat, das beim Spalten durch Glucoamylase gelb wird, auf Glucoamylasegehalt analysiert. In dem verwendeten Verfahren wurden 0,5 ml Fermentationsbrühe mit 1 ml 0,1 M Na-Acetat, pH = 4,3, enthaltend 1 mg/ml des Substrats, gemischt. Die Proben wurden für eine Dauer von 3 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert, und 1,5 ml 0,1 M Na₂B₄O₇ wurden zugesetzt. Die gelbe Farbe wurde in einem Spektrofotometer bei 400 nm gemessen. Kontrollproben wurden durch Mischen der Überstände zuerst mit dem Borat und dann mit der Substratlösung hergestellt. Die Ergebnisse lauteten: Reaktions-Kontrolle (OD-Einheiten)

SRe440 0,655

ToC879 0,000
Die Abwesenheit von jeglicher OD-Ablesung in der von ToC879 entnommenen Probe weist deutlich darauf hin, dass die Synthese von Glucoamylase von A. oryzae die Expression des AmyR-Transkriptionsfaktors erforderte.
BEISPIEL 3
Überexpression von AmyR
Ein Plasmid, pToC342, enthaltend die Kodierungsregion und mit dem Promoter für das tpi-Gen von A. oryzae vereinigte nichtkodierende 3'-Sequenzen von amyR, wurde konstruiert. Das tpi-Gen kodiert für Triosephosphatisomerase, ein konstitutionell exprimierendes Enzym, dam beim primären Stoffwechsel beteiligt ist. Das tpi-Gen von A. oryzae wurde durch Kreuzhybridisierung mit einem cDNA-Klon von A. nidulans gemäß dem Verfahren von McKnight, G. L. et al, (1986, Cell 46 143–147) isoliert. Ein Sequenzieren führte zur Identifikation des Strukturgens. Der verwendete Promoter war ein Fragment mit etwa 700 bp, unmittelbar stromaufwärts von der Kodierungsregion. pToC342 konnte die Mutation in ToC879 komplementieren. pToC342 wurde des Weiteren das pyrG-Gen von A. oryzae zugefügt und das erhaltene Plasmid, pToC359, wurde in JaL250, ein pyrG-Mutant von JaL228, beschrieben in der Patentanmeldung DK1024/96, eingereicht am 19.09.1996, transformiert. Es wurde gefunden, dass mehrere Kopien von pToC359 enthaltende Stämme erhöhte Glucoamylasegehalte synthetisieren.
Konstruktion von pToC342 und pToC359
Eine PCR-Reaktion wurde mit pToC320 als Templat und den folgenden Primern durchgeführt:
Das erhaltene Fragment wurde mit EcoRI/ApaI geschnitten, um ein Fragment mit etwa 180 bp herzustellen, das dann in pToC320 geklont wurde, das mit EcoRI/ApaI verdaut war. Das erhaltene Plasmid, pToC336, wurde sequenziert, um zu bestätigen, dass das PCR-Fragment intakt war. Das BamHI/SacI-Fragment von pToC336 enthaltend die Kodierungsregion und die untranslatierte 3'-Sequenz von amyR und ein EcoRI/BamHI-Fragment mit etwa 700 bp, enthaltend den tpi-Promoter, wurde in mit EcoRI/SacI verdautes pUC19 geklont. Die BamHI-Stelle stromabwärts des tpi-Promoters wurde in vitro eingebracht, wohingegen die EcoRI-Stelle eine endogene Stelle von dem ursprünglichen tp-Klon ist. Das erhaltene Plasmid, genannt pToC342, wurde mit HindIII geschnitten, dephosphoryliert und an ein HindIII-Fragment mit 1,8 kb, enthaltend das pyrG-Gen von A. oryzae, gebunden, was zu einem Plasmid führte, das pToC359 genannt wurde. Die Struktur sowohl von pToC342 als auch pToC359 ist in 4 dargestellt, worin Ptpi den tpi-Promoter und TamyR die nichtkodierende 3'-Region von amyR darstellt. Das Klonen des pyrG-Gens wurde früher in WO 95/35385 beschrieben.
Expression in A. oryzae JaL250
JaL250 ist ein pyrG-Mutant von JaL228, selektiert durch Resistenz gegenüber 5-Fluororotinsäure. JaL228 wurde in der Patentanmeldung DK1024/96. eingereicht am 19.09.1996, beschrieben. JaL250 wurde mit pToC359 unter Verwendung von Standardverfahren und durch Selektieren auf Erleichterung des Uridinerfordernisses transformiert. Die Transformanten wurden zweimal durch Conidiosporen erneut isoliert, und man ließ sie für eine Dauer von 4 Tagen in YP + 2% Maltose bei 30°C wachsen. Sekretierte Glucoamylase wurde durch die Fähigkeit gemessen, p-Nitrophenyl-α-D-glucopyranosid zu spalten. Die Transformanten wiesen 5–31 willkürliche Glucoamylaseeinheiten/ml in der Fermentationsbrühe auf, während JaL228 2–3 Einheiten/ml aufwies. Der beste Transformant wurde ToC1200 genannt. Eine Southernanalyse zeigte, dass mehrere Kopien von pToC359 in das Genom von ToC1200 integriert waren. Auf Grund des α-Amylasepromoters kann ToC1200 vorteilhaft als Wirtsstamm für Espressionsplasmide verwendet werden.
BEISPIEL 4
Kohlenstoffkatabolitrepression des TAKA-Promoters
Der TAKA-Amylasepromoter ist Gegenstand einer Kohlenstoffkatabolitrepression. In Aspergilli wird die Kohlenstoffkatabolitrepression zumindest teilweise über den Transkriptionsrepressor CreA, ein Homologon für S. cerevisiae MIG1, vermittelt. Es ist bekannt, dass die DNA-Bindungsstellen in Promotern unter CreA-Konttrolle GC-reich sind und scheinbar mit dem MIG1-Stellen in S. cerevisiae identisch sind. Der TAKA-Amylasepromoter enthält mehrere potenzielle CreA-Bindungsstellen. Zum Bestimmen dessen, ob dieser Promoter an der Kohlenstoffkatabolitrepression beteiligt ist, wurden drei derartige Stellen mutiert, stellten jedoch nur eine teilweise Erleichterung der Kohlenstoffkatabolitrepression bereit. Im Gegensatz dazu erleichterte die Einbringung von Kopien von konstitutionell exprimiertem AmyR in Stämmen, enthaltend den an ein Reportergen gekoppelten modifizierten Promoter, die Repression des Reporters völlig.
Konstruktion eines TAKA-Amylasepromoters mit deletierter CreA-Stelle
Drei Stellen wurden als mögliche CreA-Bindungsstellen im TAKA-Amylasepromoter durch Sequenzvergleich mit bekannten CreA- und MIG-Stellen identifiziert. Die resultierenden Stellen weisen die folgenden Sequenzen auf:
Die unterstrichenen Basen wurden zu A's geändert, da es bekannt ist, dass derartige Änderungen MIG-Bindungsstellen zerstören. Die Substitutionen wurden unter Verwendung von standardmäßigen stellenspezifischen Mutageneseverfahren durchgeführt. Ein Expressionsvektor, pToC297, enthaltend den modifizierten Promter und die nichttranskribierte 3'-Sequenz des Glucoamylasegen von A. niger, wurde konstruiert. pToC297 ist mit dem in WO 91/17243 beschriebenen in pToC68 mit Ausnahme der Änderungen im Promoter identisch. Beide Plasmide weisen eine einheitliche BamHI-Stelle zwischen dem Promoter und dem Terminator auf
Expression einer Lipase, die durch einen CreA^–-TAKA-Amylasepromoter reguliert ist
Ein BamHI-Fragment mit etwa 950 bp, enthaltend die cDNA, die eine Lipase von Humicola lanuginosa kodiert, wurde in pToC297 geklont. (Das Klonen und die Expression der Lipase von H. lanuginosa wurde früher in EP 305 216 beschrieben). Das erhaltene Plasmid, pToC298, wurde in A. oryzae IFO4177 durch Cotransformation mit dem amdS-Gen von A. nidulans transformiert, und dessen Struktur ist in 5 dargestellt, wobei Ptaka-creA den TAKA-Amalyasepromoter mit fehlender Cre-Bindungsstelle darstellt. Die Transformanten wurden zweimal durch Conidiosporen erneut isoliert, und ein derartiger Transformant, ToC1075, der Lipase herstellt, wurde für eine weitere Beurteilung ausgewählt. Man ließ ToC1075 und ein p960-Transformant von IFO4177 (früher beschrieben in EP 305 216 ), enthaltend die Lipase, die mit dem TAKA-Promoter oder vom Wildtyp vereinigt war, bei 30°C in 10 ml YP, enthaltend 2% oder 10% Glucose, wachsen. Proben wurden täglich zur Analyse von Lipase in der Fermentationsbrühe entnommen. Der Lipasegehalt wurde Rocket-Iimmunoelektrophorese unter Verwendung eines gegen gereinigte Lipase erhaltenen polyklonalen Antikörpers gemessen. Verbrauchte Fermentationsbrühe von A. oryzae IFO4177 reagierte nicht mit dem Antikörper. Der Glucosegehalt der Fermentationsbrühe wurde gleichermaßen täglich unter Verwendung von Tes-tape von Lilly gemessen.
Am Tag eins wurde Glucose in allen Kulturen nachgewiesen, jedoch konnte am Tag zwei Glucose nur in Kulturen nachgewiesen werden, die ursprünglich 10% enthielt. Die in 6 dargestellten Ergebnisse der Lipaseherstellung weisen darauf hin, dass der Promoter vom Wildtyp repressiert wird, bis die Glucose nicht mehr vorliegt. Folglich beginnt, wenn die Glucose verbraucht wird, Lipase zu akkumulieren. 6 zeigt auch, dass der modifizierte Promoter nicht so eng reguliert wird, wenn geringe Lipasegehalte in Gegenwart von Glucose in der 10%igen Glucosefermentation hergestellt wird. Folglich liegt eine teilweise Glucosederepression, ersichtlich in ToC1075, vor.
Erleichterung der Kohlenstoffkatabolitrepression von Lipase in ToC1075 durch pToC342
ToC1075 wurde mit pToC342 durch Cotransformation mit dem bar-enthaltenden Plasmid, pMT1623 transformiert. Stämme, die mehrere Kopien von pToC342 enthielten und die Lipaseexpressionskassette bewahrten, wurden durch Southernblot-Analyse identifiziert. Ein derartiger Stamm war. Man ließ ToC1075 und ToC1139 bei 30°C in 10 ml YP, enthaltend entweder 2% oder 10% Glucose, wachsen, und Proben wurden täglich auf Lipase und Glucose getestet. Die Lipase wurde durch Spaltung mit para-Nitrophenylbutyrat gemessen. Der Glucosegehalt wurde mit Tes-tape von Lilly gemessen. Die in 7 dargestellten Ergebnisse, weisen darauf hin, dass ToC1075 wie vorher eine teilweise Erleichterung der Glucoserepression bereitstellt, während die Lipaseproduktion durch ToC1139 von der Gegenwart von Glucose unabhängig ist.
BEISPIEL 5
Southernanalyse von A. niger für das amyR-Gen
Die Synthesen von α-Amylase und Glucoamylase in A. niger, werden wie in A. oryzae durch die Kohlenstoffquelle reguliert. Es ist deshalb wahrscheinlich, dass A. niger ebenfalls ein amyR-Gen enthält. Diese Hypothese wurde durch Untersuchen auf Kreutzhybridisierung zwischen dem amyR-Gen von A. oryzae und der chromosomalen DNA von A. niger getestet.
DNA wurde durch herkömmliche Verfahren aus A. niger hergestellt. Die DNA wurde mit BamHI BglII, EcoRI, HindIII, SalI XmaI oder XbaI geschnitten, und die erhaltenen DNA-Fragmente wurden durch Elektrophorese auf einem Agarosegel getrennt. Die DNA wurde dann auf eine Nitrocellulosemembran geblottet und mit einer ³²P-markierten Sonde, enthaltend einen Teil des strukturellen amyR-Gens von A. oryzae, hybridisiert. Die Sonde war durch PCR von pToC320 hergestellt und beginnt bei Bp. Nr. 1683 und endet bei Bp. Nr. 2615, wie in SEC ID Nr. 1 dargestellt. Die Hybridisierung wurde in 10× Denhardt-Lösung, 5× SSC, 10 mM EDTA, 1% SDS, 0,15 mg/ml polyA, 0,05 mg/ml Hefe-tRNA) bei 50°C über Nacht durchgeführt. Nach der Hybridisierung wurde die Membran unter Bedingungen erhöhter Stringens gewaschen und die Radioaktivität der Membran durch einen Phosphor-Imager analysiert. 8 zeigt das Ergebnis, als die Membran in 2× SSC, 0,1% SDS bei 58°C gewaschen wurde. Einheitliche Banden sind mit verschiedenen der Restriktionsenzyme ersichtlich. Folglich kann das amyR-Gen von A. niger auf der Grundlage dieses Kreuzhybridisierungsergebnisses geklont werden.
IN DER PATENTSCHRIFT ZITIERTE LITERATURANGABEN
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SEQUENZLISTE

Claims

Transkriptionsfaktor, der einen α-Amylase-Promotor reguliert, wobei der Faktor eine oder mehrere trunkierte Formen der als SEQ ID Nr. 3 gezeigten Aminosäuresequenz umfasst.
Transkriptionsfaktor, der einen Glukoamylase-Promotor aus Aspergillus oryzae reguliert, wobei der Faktor eine oder mehrere trunkierte Formen der als SEQ ID Nr. 3 gezeigten Aminosäuresequenz umfasst.
DNA-Konstrukt mit einer DNA-Sequenz, die für den Faktor gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2 kodiert.
DNA-Konstrukt, das eine DNA-Sequenz umfasst, die einen Transkriptionsfaktor kodiert, der beim Regulieren der Expression eines α-Amylase-Promotors in einem Fadenpilz Aktivität aufweist, wobei die DNA-Sequenz folgendes umfasst a) den Transkriptionsfaktor kodierenden Teil der DNA-Sequenz, die in das in E. coli ToC1058, DSM 10666 vorliegende Plasmid kloniert ist, oder b) ein Homologen der in a) definierten DNA-Sequenz, welches i) mit der in a) definierten DNA-Sequenz zu mindestens 60% identisch ist, oder ii) mit der gleichen Nukleinsäuresonde hybridisiert wie die in a) definierte DNA-Sequenz, wobei die Hybridisierung das Vor-Einweichen des die DNA-Fragmente oder RNA zur Hybridisierung enthaltenden Filters in 5× SSC über eine Dauer von 10 Minuten, und Prähybridisierung des Filters in einer Lösung von 5× SSC, 5× Denhardt-Lösung, 0,5% SDS und 100 μg/ml denaturierter, mit Ult raschall behandelter Lachssperma-DNA mit nachfolgender Hybridisierung in der gleichen Lösung, enthaltend eine zufällig-geprimte ³²P/dATP-markierte Sonde (spezifische Aktivität > 1 × 10⁹ cpm/μg) über eine Dauer von 12 Stunden bei ca. 65°C, wonach der Filter zweimal über eine Dauer von 30 Minuten in 2× SSC, 0,5% SDS bei 50°C gewaschen wird, umfasst oder iii) einen Transkriptionsfaktor kodiert, der zu mindestens 50% identisch mit dem Transkriptionsfaktor ist, der durch eine DNA-Sequenz kodiert wird, die die in a) definierte DNA-Sequenz umfasst, oder iv) einen Transkriptionsfaktor kodiert, der mit einem Antikörper, der gegen den aufgereinigten Transkriptionsfaktor erhalten wurde, der durch die in a) definierte DNA-Sequenz kodiert ist, immunologisch reaktiv und v) die Mutation in DSM Nr. 10671 komplementiert, d.h. DSM Nr. 10671 die Fähigkeit verleiht, auf Cyclodextrin zu wachsen und Lipase nach Transformation mit der DNA-Sequenz herzustellen.
DNA-Konstrukt gemäß einem der Ansprüche 3 bis 4, bei der die DNA-Sequenz aus einem Fadenpilz erhältlich ist.
DNA-Konstrukt gemäß Anspruch 5, wobei der Fadenpilz zu einer der Gruppen Phycomycetes, Zygomycetes, Ascomycetes, Basidiomycetes und unechten Pilzen (Fungi imperfecti), einschließlich Hyphomycetes wie die Gattungen Aspergillus, Penicillium, Trichoderma, Fusarium und Humicola, insbesondere ein Stamm von Aspergillus sp., und insbesondere von A. oryzae gehört.
DNA-Konstrukt gemäß Anspruch G, wobei die DNA-Sequenz isoliert ist aus oder hergestellt ist auf der Grundlage einer DNA-Bibiliothek eines Stammes von Aspergillus oryzae.
DNA-Konstrukt gemäß Anspruch 3 bis 5, wobei die DNA-Sequenz aus einem Hefestamm, insbesondere Saccharomyces erhältlich ist.
DNA-Konstrukt gemäß Anspruch 4, wobei die DNA-Sequenz aus Eschericia coli DSM 10666 isoliert ist.
Rekombinanter Expressionsvektor, der ein DNA-Konstrukt gemäß einem der Ansprüche 3 bis 9 umfasst.
Zelle, die ein DNA-Konstrukt gemäß einem der Ansprüche 3 bis 9, oder einen rekombinanten Expressionsvektor gemäß Anspruch 10 umfasst.
Zelle gemäß Anspruch 11, welche eine eukaryontische Zelle, insbesondere eine Pilzzelle, wie eine Hefezelle oder eine Fadenpilzzelle ist.
Zelle gemäß Anspruch 12, welche ein Stamm von Aspergillus sp., insbesondere ein Stamm von A. niger oder A. oryzae ist.
Zelle gemäß Anspruch 12, welche ein Stamm von Trichoderma sp., insbesondere T. reesei ist.
Zelle gemäß Anspruch 12, welchen ein Stamm von Saccharomyces, insbesondere ein Stamm von S. cerevisiae ist.
Verfahren zum Herstellen eines Polypeptides von Interesse, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: Züchten einer Zelle gemäß einem der Ansprüche 11 bis 15 für die Herstellung des Faktors und des interessierenden Polypeptides förderlichen unter Bedingungen, und Gewinnen des Polypeptides von Interesse.
Verfahren gemäß Anspruch 16, wobei der Pilz ein Pilz der Gattung Aspergillus, Trichoderma, Penicillium, Fusarium oder Humicola ist.
Verfahren gemäß Anspruch 17, wobei die Zelle ausgewählt ist aus den Spezies A. oyzae, A. niger oder A. awamori.
Verfahren gemäß Anspruch 16, 17 oder 18, wobei das Polypeptid von Interesse ein medizinisches Polypeptid ist.
Verfahren gemäß Anspruch 19, wobei das medizinische Polypeptid ein Wachstumshormon, Insulin, oder ein Blutgerinnungsfaktor ist.
Verfahren gemäß Anspruch 16, 17, oder 18, wobei das Polypeptid ein industrielles Enzym ist.
Verfahren gemäß Anspruch 21, wobei das industrielle Enzym eine Carbonylhydrolase, Carbohydrase, Protease, Lipase, Amylase, Cellulase, Oxidoreductase, Glucoamylase, oder Esterase ist.
Verwendung eines Faktors gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2 zur Erhöhung der Expression eines Polypeptides von Interesse in einem Fadenpilz.
Verwendung gemäß Anspruch 23, wobei der Pilz ein Pilz aus der Gattung Aspergillus, Penicillium, Trichoderma, Fusarium und Humicola, insbesondere ein Stamm aus Aspergillus sp., und insbesondere aus A. oryzae sp ist.
Verwendung gemäß Anspruch 24, wobei der Pilz ausgewählt ist aus den Spezies A. oryzae, A. niger, A. awamori, T. reesei, oder T. harzianum.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 23 bis 25, wobei das Polypeptid von Interesse ein medizinisches Polypeptid ist.
Verwendung gemäß Anspruch 26, wobei das medizinische Polypeptid ein Wachstumshormon, Insulin oder Blutgerinnungsfaktor ist.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 23 bis 25, wobei das Polypeptid ein industrielles Enzym ist.
Verwendung gemäß Anspruch 28, wobei das industrielle Enzym eine Carbonylhydrolase, Carbohydrase, Protease, Lipase, Amylase, Cellulase, Oxidoreductase, Glucoamylase oder Esterase ist.