DE69228665T2

DE69228665T2 - Eukaryotisches Expressionssystem

Info

Publication number: DE69228665T2
Application number: DE69228665T
Authority: DE
Inventors: Roelof Ary Lans Nl-3062 Zd Rotterdam Bovenberg; Pieter Nl-2671 Vz Naaldwijk Van Solingen; Adrianus Wilhelmus Hermanus Nl-2671 Wz Naaldwijk Vollebregt
Original assignee: DSM NV
Current assignee: Koninklijke DSM NV
Priority date: 1991-12-23
Filing date: 1992-12-17
Publication date: 1999-07-22
Anticipated expiration: 2012-12-18
Also published as: ES2131518T3; EP0549062A2; EP0549062A3; DE69228665D1; ATE177788T1; JPH06189765A; EP0549062B1

Description

Die Anmeldung betrifft ein Genexpressions- und Proteinsekretionssystem für eukaryontische Zellen, insbesondere für Pilzzellen.
Die gewerbliche Herstellung von Proteinen ist ein Hauptziel der industriellen Biotechnologie. Zu diesem Zweck werden eine Reihe von Organismen, bei denen es sich zumeist um Mikroorganismen handelt, verwendet, insbesondere Bakterien der Spezies Escherichia, Bacillus, Actinomycetes; Hefen der Spezies Saccharomyces und Kluyveromyces; und filamentöse Pilze der Spezies Aspergillus und Trichoderma. Die Fähigkeit zur Einführung und Expression von neuen DNA-Sequenzen in lebende Zellen hat zahlreiche neue Möglichkeiten zur Proteinerzeugung durch Mikroorganismen geschaffen.
Die Entwicklung von zuverlässigen Genübertragungssystemen für filamentöse Pilze hat ein starkes Interesse an der Anwendung dieser Mikroorganismen bei gewerblichen Proteinherstellungsverfahren hervorgerufen. Dieses Interesse erklärt sich aufgrund folgender Tatsachen:
1) von Natur aus sind filamentöse Pilze zur Synthese und Sekretion großer Mengen an Proteinen befähigt;
2) mehrere Pilze weisen eine lange Geschichte der industriellen Anwendung auf und gelten allgemein als sichere ("generally recognized as save" = GRAS) Erzeugerorganismen;
3) es stehen beachtliche Kenntnisse und Erfahrungen über die großtechnische Fermentierung und Verarbeitung von Pilzkulturen zur Verfügung;
4) die Struktur von in filamentösen Pilzen erzeugten heterologen Proteinen ist sehr ähnlich (oder identisch) mit der authentischen Struktur dieser Proteine im Hinblick auf endständige Gruppen, Modifikation und Faltung. Dies wird bei Verwendung von Bakterien- oder Hefezellen als Wirten für die heterologe Genexpression häufig nicht erreicht;
5) die Stabilität von transformierter rDNA in Pilzstämmen.
Trotz aller dieser günstiger Merkmale wird nur eine begrenzte Anzahl von filamentösen Pilzspezies bei Proteinerzeugungsverfahren eingesetzt. Ferner erreicht die Expression von heterologen Proteinen bei diesen filamentösen Pilzspezies im allgemeinen keinen ebenso hohen Wirkungsgrad wie die Expression von homologen Proteinen.
Somit besteht ein starkes Bedürfnis nach Systemen, die eine wirkungsvolle Genexpression und Proteinsekretion ermöglichen und die das Repertoire von filamentösen Pilzwirten für die Proteinerzeugung erweitern, insbesondere zur Anwendung auf Penicillium chrysogenum. P. chrysogenum ist der Pilz, der weltweit seit mehr als 40 Jahren für die gewerbliche Erzeugung von Penicillin eingesetzt wird. Infolgedessen wurden zahlreiche Erfahrungen über die Fermentation von P. chrysogenum gesammelt. Außerdem stehen Mutanten von P. chrysogenum, die kein Penicillin erzeugen, zur Verfügung, wodurch die Schwierigkeit der Verunreinigung des erzeugten Proteins mit Penicillin vermieden wird. Bisher ist ein derartiges wirksames Genexpressions- und Proteinsekretionssystem nicht verfügbar.
Filamentöse Pilzspezies, wie Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Mucor miehei und Trichoderma reesei werden bei der industriellen Erzeugung von Enzymen, beispielsweise zur Verwendung in der Nahrungsmittelindustrie, eingesetzt; vergl. z. B. Strijkert (Antonie von Leeuwenhoek, Bd. 53 (1987), S. 357-362) und Unkles (in: Molecular and Genetic Aspects of Nitrate Assimilation, Hrsg. J. L. Wray und J. R. Kinghorn (1989), S. 341- 363, Oxford Science Publications, Oxford, UK).
Aspergillus niger (D. Cullen et al., Biotechnology, Bd. 5 (1987), S. 369-376; A. Haarki et al., Biotechnology, Bd. 7 (1989), S. 596-600; und EP-A-420358), Aspergillus nidulans (G. L. Gray et al., Gene, Bd. 48 (1986), S. 41-53; und D. I. Gwynne et al., Biotechnology, Bd. 5 (1987), S. 713-719) und Aspergillus oryzae (T. Christensen et al., Biotechnology, Bd. 6 (1988), S. 1419-1422) wurden ebenfalls für die Expression von verschiedenen heterologen Proteinen zur Anwendung in Nahrungsmitteln und Detergentien sowie in der pharmazeutischen Industrie herangezogen.
Die verwendeten Expressionssysteme setzen Sequenzen für die Initiation und Termination der Transkription und Translation sowie Sequenzen für die Prozessierung und Sekretion des exprimierten Proteins ein, das aus dem A. niger-Glucoamylase (gla)-Gen, dem T. reesei-Cellobiohydrolase (cbhI)-Gen, dem A. oryzae-α-Amylase-Gen und dem A. nidulans-Alkoholdehydrogenase (alcA)-Gen erhalten worden ist (D. I. Gwynne et al., a. a. O.; A. Haarki et al., a. a. O.; und T. Christensen et a. l., a. a. O.).
Die vorliegende Erfindung stellt ein wirksames Genexpressions- und Proteinsekretionssystem für eukaryontische Mikroorganismen, insbesondere für filamentöse Pilze, bereit, nämlich Transkriptions- und Translations- Initiationssequenzen und Transkriptions-Terminationssequenzen, die die in der Sequenzliste 1 dargestellten Nucleotidsequenzen von Nucleotid 1 bis Nucleotid 426 bzw. von Nucleotid 850 bis Nucleotid 1514 oder im wesentli chen die gleichen Nucleotidsequenzen oder funktionelle Teile davon umfassen. Typischerweise stammen diese Regulierungssequenzen aus dem Gen Y. Auch die Verwendung der Regulierungssequenzen in einem transformierten Wirt, insbesondere in einem filamentösen Pilzwirt, vorzugsweise in P. chrysogenum, zur Expression eines Gens durch Fusion des offenen Leserasters dieses Gens mit den Regulierungssequenzen wird bereitgestellt.
Schließlich werden Sekretions-Signalkodierungssequenzen bereitgestellt, die die in der Sequenzliste 1 dargestellten Nucleotidsequenzen von Nucleotid 427 bis 537 oder im wesentlichen die gleichen Nucleotidsequenzen oder funktionelle Teile davon umfassen. Ferner wird die Verwendung dieser Sekretions-Signalkodierungssequenzen gegebenenfalls zusammen mit den vorstehend angegebenen Transkriptions- und Translations-Initiationssequenzen und/oder Terminationssequenzen in einem transformierten Wirt, insbesondere in einem filamentösen Pilzwirt, vorzugsweise in P. chrysogenum, zur Sekretion eines Proteins durch Fusion der Nucleotidsequenzen, die für dieses Protein kodieren und dieses exprimieren, mit diesen Sekretions-Signalkodierungssequenzen bereitgestellt.

Kurze Beschreibung der Figuren

- Fig. 1: schematische Darstellung des Plasmids pRH01.
- Fig. 2A: Northern-Blot-Analyse der Gen Y-Expression; Bahn 1: P. chrysogenum Wisconsin 54-1255/Lactose; Bahn 2: P. chrysogenum npe10/Lactose; Bahnen 3-7: P. chrysogenum Wisconsin 54-1255 bei Sättigungsmengen (Bahnen 3-4) und begrenzenden Mengen (Bahnen 5-7) von Glucose.
- Fig. 2B: SDS-PAAGE-Analyse von Proteinen aus der Fermentationsbrühe; Bahn 1: Molekulargewichtsmarker (LMW-Marker 94 000/67 000/43 000/30 000/20 100/14 400, Pharmacia, Schweden); Bahnen 2-3: P. chrysogenum Wisconsin 54-1255-Brühe aus einer Glucose-Kultur (Bahn 3) und einer Lactose-Kultur (Bahn 2); Bahnen 4-5: P. chrysogenum npe10-Brühe aus einer Glucose-Kultur (Bahn 5) und einer Lactose-Kultur (Bahn 4).

Kurze Beschreibung der Sequenzlisten

- Sequenzliste 1: Nucleotidsequenz des Gens Y von P. chrysogenum und abgeleitete Aminosäuresequenz.
- Sequenzliste 2: Aminosäuresequenz des Proteins Y von P. chrysogenum.
- Sequenzliste 3: partielle Nucleotidsequenz von Y-cDNA.
- Sequenzliste 4: partielle N-terminale Aminosäuresequenz des Proteins Y von P. chrysogenum.
- Sequenzlisten 5-19: Nucleotidsequenzen des aus synthetischen Oligonucleotiden abgeleiteten Gens Y.
Es wird ein wirksames Protein-Expressionssystem unter Verwendung von filamentösen Pilzspezies als Wirten, insbesondere von Penicillium chrysogenum, bereitgestellt. Das Expressionssystem liefert DNA-Sequenzen für eine wirksame Initiation der Transkription (Promotor) und Translation, DNA-Sequenzen für eine wirksame Termination der Transkription und 3'- mRNA-Prozessierung (Terminator) sowie DNA-Sequenzen, die für eine wirksame Prozessierung und Sekretion des exprimierten Proteins erforderlich sind.
Die DNA-Sequenzen des Expressionssystems wurden aus dem Gen Y (beschrieben in EP-A-354624), das aus dem filamentösen Pilz P. chrysogenum isoliert worden war, abgeleitet. Das Gen Y wurde in starkem Maße in P. chrysogenum exprimiert, und Y wurde in wirksamer Weise in die Kulturbrühe sezerniert. Die Expression eines in Frage stehenden Proteins wird durch Fusion des offenen Leserasters des in Frage stehenden Proteins mit den Gen Y-Sequenzen erreicht. Fusionen werden unter Anwendung verschiedener molekulargenetischer Techniken, die aus dem Stand der Technik bekannt sind, durchgeführt. Die Struktur der Fusionsgene kann je nach der Fusionsstelle der Sequenzen, die für das in Frage stehende Protein kodieren, mit den Gen Y-Sequenzen erheblich variieren. In Analogie zu anderen Expressionssystemen könnte es erforderlich sein, verschiedene Fusionsgene zu konstruieren und experimentell das optimale Fusionskonstrukt für die Expression zu bestimmen (M. Ward et al., Biotechnology, Bd. 8 (1990), S. 435-440; und WO-90/15860).
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kodiert das Fusionsgen für die folgende Aminosäuresequenz:
MQITTVALFLFAAMGGVATPIESVSNDLDARAEAGVL
(vergl. Sequenzliste 1) (Einbuchstaben-Code) oder für funktionelle Teile davon als Sekretionssignal. Fusionskonstrukte werden in einen filamentösen Pilzwirt, vorzugsweise in P. chrysogenum und insbesondere in einen Stamm von P. chrysogenum, der kein Penicillin erzeugt, nach bekannten Verfahren transformiert. Transformanten werden unter Verwendung eines Pilz-Selektionsmarkers, beispielsweise des S. hindustanus-Phleomycin-Resistenzgens (Drocourt et al., Nucl. Acids Res., Bd. 18 (1990), S. 4009), des A. nidulans-amdS-Gens (Beri und Turner, Curr. Genet., Bd. 11 (1987), S. 693-641) oder des niao-Gens (Gouka et al., J. Biotechn., Bd. 20 (1991), S. 189-200) oder des facA-Gens (EP-A-487118) von P. chrysogenum, ausgewählt. Die Transformanten werden gereinigt und in bezug auf die Expression des in Frage stehenden Proteins getestet. Die Expression des Gens Y unterlag einer Glucose-Repression. Daher wird die Expression von Proteinen unter Verwendung des Gen Y-Expressionssystems durch die Menge an Glucose im Fermentationsmedium gesteuert.
Gemäß einem weiteren erfindungsgemäßen Aspekt werden die Gen Y-Promotor- und Terminatorsequenzen für die regulierte Expression von intrazellulären Proteinen auf hohem Niveau durch Weglassen der Y-Sekretionssignalsequenz bei der Genfusion verwendet. Diese Anwendung kann besonders wertvoll sein, um in kontrollierter Weise die Konzentration eines Proteins zu erhöhen, d. h. Penicillin-Biosyntheseenzyme oder Proteine, die natürlicherweise in P. chrysogenum nicht vorkommen, wie Cephalosporin- oder Cephamycin-Biosyntheseenzyme.
Gemäß einem weiteren erfindungsgemäßen Aspekt können die Gen Y-Promotorsequenzen sich als sehr wertvolles Werkzeug bei der Isolierung und Identifizierung von Regulationsfaktoren erweisen, die bei der Regulierung von Penicillin-Biosynthesegenen, die ebenfalls einer Glucose-Repression unterliegen, beteiligt sind. Übliche Regulationsfaktoren lassen sich nunmehr identifizieren und von Faktoren abtrennen, die spezifisch an der Regulierung von Penicillin-Biosynthesegenen beteiligt sind.
Obgleich das Gen Y-Expressionssystem aus P. chrysogenum erhalten wurde, läßt es sich auch auf andere filamentöse Pilzwirte, wie Penicillia, Acremonium, Aspergilli, Trichoderma und Mucor mit bekannten Fermentationseigenschaften, anwenden. Eine heterologe Expression von Promotoren, Terminatoren und Sekretionssignalen ist eine übliche Beobachtung bei Untersuchungen über die Genexpression in filamentösen Pilzen. Alternativ lassen sich nunmehr Gen Y-Homologe leicht nachweisen und aus anderen Pilzspezies isolieren, indem man die P. chrysogenum-Gen Y-Sequenz als Sonde verwendet oder indem man das PCR-Verfahren (Polymerase-Kettenreaktion) und vom Gen Y abgeleitete Oligonucleotidsonden einsetzt.
Das geklonte Gen Y von P. chrysogenum kann auch zur Erzeugung von mutanten Y-Genen mit verbesserten Expressions- und/oder Sekretionseigenschaften unter Anwendung bekannter molekulargenetischer Techniken herangezogen werden. Ferner wurde festgestellt, daß Hybridsequenzen für die Expression und Sekretion von Proteinen sich durch eine Kombination der Gen Y-Sekretionssignalsequenzen mit anderen Promotor- oder Terminatorsequenzen erhalten lassen. Gen Y-Promotor-, Sekretionssignal- und Termina torsequenzen oder funktionelle Teile davon können als individuelle Kassetten in vollständigen Expressionssystemen angesehen und eingesetzt werden.
Außerdem umfaßt die Erfindung Gene mit unterschiedlichen Nucleotidsequenzen, die zum Y-Gen von P. chrysogenum oder Teilen davon homolog sind. Als homolog werden hier Nucleotidsequenzen definiert, die bei einem Sequenzvergleich mit dem Gen Y unter Anwendung des BestFit-Programms der Wisconsin Sequence Analysis Software Package (Version 6.0, Erscheinungsjahr 1989, GCG, University of Wisconsin, USA) einen Identitätswert von mindestens 70% zeigen, wobei die Parametereinstellungen "gap weight" 5,000 und "length weight" 0,300 verwendet werden. Homologe Gene lassen sich aus natürlichen Quellen isolieren oder können durch Mutagenese des Gens Y von P. chrysogenum erzeugt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden Proteine in P. chrysogenum unter Verwendung von homologen Gen Y-Expressionssignalen exprimiert.
Die folgenden Beispiele dienen der Erläuterung und stellen keinesfalls eine Beschränkung dar.

Beispiele

Die Vorgehensweisen in dieser Anmeldung für die Genklonierung, Gencharakterisierung, Genmanipulation und Genhandhabung sind aus dem Stand der Technik bekannt und werden beispielsweise von Sambrook et al., (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, USA, 1989) hinreichend beschrieben.
Der mutante Stamm npe10, der aus P. chrysogenum Wisconsin 54-1255 erhalten wurde, wurde beim Centraal Bureau voor Schimmelcultures, Oosterstraat 1, 3742 SK Baarn, Niederlande, am 13. März 1990 unter der Hinterlegungsnummer CBS 143.90 hinterlegt.

Beispiel 1

Gen Y

Die Isolierung des Gens Y unter Anwendung eines Differentialscreeningverfahrens ist ausführlich in EP-A-354624 beschrieben.
Das Gen Y wurde zunächst an rekombinanten lambda-Phagen B9, L5 und G5 (EP-A-354624) mit einem Gehalt an genomischer DNA von P. chrysogenum isoliert und zu einem 4 Kilobasen (kb)-SphI-Restriktionsfragment kartiert. Das das SphI-Restriktionsfragment von lambda G5 enthaltende Gen Y wurde in den Vektor pTZI8RR (Pharmacia, Schweden) in zwei Orientierungen subkloniert. Die erhaltenen Plasmide erhielten die Bezeichnung pRH01 bzw. pRH02. Das Plasmid pRH01 ist in Fig. 1 schematisch dargestellt. Die Plas mide pRH01 und pRH02 wurden zur Erzeugung einer ausführlicheren Restriktionskarte der von 4 kb-P. chrysogenum-abgeleiteten DNA (Fig. 1) und zur genaueren Lokalisierung des Gens Y durch Hybridisierungsanalyse mit einem 1,2 kb-SacI-HindIII-Restriktionsfragment in der Nähe des Zentrums des 4 kb-SphI-Fragments verwendet. Gemäß EP-A-354624 hergestellte einzelsträngige cDNA wurde als Sonde für das differentielle Screening verwendet. Die Transkriptionsrichtung des Gens Y wurde ferner durch Hybridisierungsanalyse von SacI (5')- bis HindIII (3')-Restriktionsstellen unter Verwendung der gleichen Sonde und von aus den Plasmiden pRH01 und pRH02 abgeleiteter einzelsträngiger DNA bestimmt. Die Plasmide pRH01 und pRH02 wurden zur Bestimmung der Nucleotidsequenz einer 1,5 kb-Region, die das SacI- HindIII-Restriktionsfragment umfaßt, verwendet (Sequenzliste 1). Die Sequenzanalyse wurde gemäß bekannten Verfahren durchgeführt (Sanger et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, Bd. 74 (1977), S. 5463-5467).

Beispiel 2

Gen Y-cDNA

Gen Y-cDNA wurde unter Anwendung einer PCR-Strategie erhalten. Die PCR-Technik und andere Verfahren zur cDNA-Klonierung, -Charakterisierung, -Handhabung und -Manipulation sind bekannt und bei Sambrook et al. (a. a. O.) und Innis et al. (PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Academic Press, 1990) hinreichend beschrieben.
Vollständige RNA wurde aus einer Penicillin erzeugenden Kultur von P. chrysogenum unter Verwendung von RNAzolR (Cinna/Biotecx Lab. Int. Inc., Texas, USA) gemäß den Herstellerangaben isoliert.
PolyA&spplus;-RNA wurde aus vollständiger RNA durch oligo-dT-Cellulose- Chromatographie unter Verwendung eines mRNA-Reinigungskits (Pharmacia, Schweden) isoliert. Etwa 60 ug polyA&spplus;-RNA wurden aus etwa 200 ug Gesamt- RNA isoliert und in 200 ul RNase-freiem H&sub2;O gelöst.
Die Synthese von mRNA/cDNA-Hybriden wurde mit reverser Transkriptase und unter Verwendung von oligo-dT als Primer durchgeführt. Eine typische Reaktion umfaßte folgende Bestandteile: 17 ul polyA&spplus;-mRNA, 1,9 ul RNAsin (40 U/ul, Promega, USA), 10 ul 5x RT-Puffer (250 mM Tris·HCl, pH-Wert 8,3, 15 mM MgCl&sub2;, 375 mM KCl), 10 ul 50 mM DTT (Dithiothreit), 5 ul 8 mM dNTP-Gemisch (dATP, dCTP, dTTP und dGTP in einer Konzentration von jeweils 8 mM), 5 ul BSA (Rinderserumalbumin (1 mg/ml, Sigma, USA)) und 2,5 ul Maloney reverse Transkriptase (200 U/ul, BRL, BRD).
Das Reaktionsgemisch wurde 60 Minuten bei 37ºC inkubiert, wobei nach 30-minütiger Inkubationszeit eine zusätzliche Aliquotmenge von 1 ul re verser Transkriptase zugesetzt wurde. Die Umsetzung wurde gestoppt, indem das Reaktionsgemisch mit 50 ul H&sub2;O, 10 ul 0,2 M EDTA und 110 ul Chloroform versetzt wurde. Nucleinsäuren wurden durch Chloroformextraktion und Fällung mit Ethanol gereinigt. Nach Zentrifugation wurde das Pellet in 10 ul H&sub2;O in Lösung gebracht, wobei man eine mRNA/cDNA-Hybridkonzentration von etwa 0,5 mg/ml erhielt.
Oligonucleotide wurden chemisch mit einem DNA-Synthesegerät (Applied Biosystems, CA, USA) synthetisiert. Die Sequenz der in Tabelle I dargestellten Oligonucleotide leitet sich von der in der Sequenzliste 1 aufgeführten Genomsequenz des Gens Y ab.

Tabelle I

Nucleotidsequenz von für die cDNA-Synthese und Nucleotidsequenzanalyse verwendeten Oligonucleotiden

Oligo

AB2277 5'-CCC GGG ACT AGT ATG CAA ATC ACC ACA GTT GCC-3'
AB2278 5'-CCC GGG ACT AGT ATG ACC CTC AAT TCC ATA TAG-3'
AB2280 5'-CCC GGG GGA TCC TCA CAG GGC ATC TCG CAT ATC-3'
AB2308 5'-CCC GGG ACT AGT GCC AGT CAC CGT GTC AAG CGT-3'
AB2309 5'-CCC GGG ACT ACT CCA CCC GTA AGA ATA TAC CAG-3'
AB2312 5'-CCC GGG ACT ACT TTG GAC CTG AGC ATT GTA TGT-3'
AB2313 5'-CCC GGG GGA TCC GAT GGG AGT GAT ACT ATA TGG-3'
AB2314 5'-CCC GGG ACT AGT ATA TCC CAT ACC TTA AGT ACT-3'
AB2315 5'-CCC GGG GGA TCC AGT ACT TAA GGT ATG GGA TAT-3'
AB2316 5'-CCC GGG GGA TCC TAT TTA CAT TCG TTC TTA GAT-3'
AB2317 5'-CCC GGG GGA TCC GTT CTT TGT GGG TGT AGG GTA-3'
AB2319 5'-CCC GGG GGA TCC ACG ATC AAA AGA TGC TGG ATA-3'
AB2425 5'-CCC GGG ACT AGT TAT AGT ATC ACT CCC ATC ACA-3'
AB2426 5'-GGG CTT GAG ATG ATG ATC-3'
reverser
Primer 5' -AAC AGC TAT GAC CAT-3'
Die Oligonucleotide enthielten üblicherweise 21 Nucleotide, die zum Gen Y komplementär waren, und eine flankierende Sequenz von 12 Nucleotiden, die die SpeI- und SmaI- bzw. BamHI- und SmaI-Restriktionsenzym-Erkennungsstellen enthielten. Die Oligonucleotide wurden in 10 mM Tris·HCl, pH-Wert 8,0, 1 mM EDTA, gelöst. Optimale Konzentrationen für die PCR wurden elektrophoretisch an 4% Nu Sieve-GTG (FMC, USA)-Agarosegelen in 1x TBE-Puffer (45 mM Tris·Borat, 1 mM EDTA, pH-Wert 8,0; Sambrook, a. a. O.) und durch PCR-Experimente bestimmt.
Die PCR wurde zur Isolierung der Gen Y-cDNA herangezogen. Ein typisches PCR-Reaktionsgemisch enthielt folgende Bestandteile (Volumen 50 ul): 5 ul 10x R-Puffer (500 mM KCl, 100 mM Tris·HCl, pH-Wert 8,3), 20 mM MgCl&sub2;, 0,1% (Gew./Vol.) Gelatine, 8 ul eines dNTP-Gemisches (jeweils 1,25 mM dATP, dCTP, dGTP und dTTP), gegebenenfalls 5 ul DNA-Verdünnungspuffer (10 mM Tris·HCl, pH-Wert 8,0, 1 mM EDTA, 10 mM NaCl), etwa 0,05-0,1 ug mRNA/cDNA-Hybrid, etwa 0,5 ug Oligonucleotid (jeweils) und H&sub2;O zur Auffüllung auf das Endvolumen von 50 ul.
Die PCR wurde unter Verwendung von 1,3 Einheiten Taq-DNA-Polymerase und einer PCR-Vorrichtung (DNA Thermal Cycler, Perkin Elmer Cetus, USA), durchgeführt. Es wurden etwa 20-25 Zyklen je nach Fragmentlänge durchgeführt (pro Zyklus: 2 Minuten 94ºC; 2 Minuten 55ºC; 3 Minuten 72ºC, je nach Fragmentlänge). Im letzten Zyklus wurde die Denaturierungsstufe weggelassen. Die PCR-Produkte wurden durch Elektrophorese an 1,4% Nu Sieve- Agarosegelen in 1x TBE-Puffer analysiert. Die PCR-Produkte wurden durch Extraktion mit Chloroform, Fällung mit Ethanol und unter Verwendung einer RDP-Mini-Säule (Bio-Rad, CA, USA) gereinigt. Die PCR-Produkte wurden schließlich in H&sub2;O gelöst, mit den Restriktionsenzymen SpeI und BamHI verdaut und in mit SpeI, BamHI-verdauten pBluescript II KSR-Vektor (Strategene, CA, USA) ligiert, wobei man sich standardmäßiger Klonierungsverfahren bediente. Die E. coli-Stämme HB101 (Boyer et al., J. Mol. Biol., Bd. 41 (1969), S. 459-465; und Sambrook et al., a. a. O.) oder WK6 (Zell und Fritz, EMBO J., Bd. 6 (1987), S. 1809-1815) wurden zur Transformation und Plasmidvermehrung verwendet. Die Nucleotidsequenz von geklonten PCR-Fragmenten wurde unter Verwendung von doppelsträngiger Plasmid-DNA oder durch Isolierung von vom Plasmid abgeleiteter einzelsträngiger DNA durch Superinfektion von Transformanten mit der Helferphage M13K07 (Vieira, J. Meth. Enzymol., Bd. 153 (1987), S. 3-11) und durch Verwendung mehrerer Oligonucleotide, die beide von pBluescript und vom Gen Y abgeleitet waren, gemäß bekannten Verfahren (Sanger, a. a. O.) bestimmt.
Die Nucleotidsequenz der Gen Y-cDNA, die aus den Sequenzen von mehreren unterschiedlichen, überlappenden PCR-Fragmenten zusammengestellt wurde, ist in der Sequenzliste 3 dargestellt. Die aus der cDNA Sequenz abgeleitete Aminosäuresequenz ist in der Sequenzliste 1 aufgeführt.

Beispiel 3

Funktionelle Struktur des Gens Y

Die funktionelle Struktur des Gens Y ist in der Sequenzliste 1 zusammengefaßt.
Die Nucleotide 1 bis 1514 bedeuten die genomische Sequenz des Gens Y. Die Nucleotide 553 bis 628 und 719 bis 786 bedeuten die Position von zwei Introns, die den offenen Leseraster (ORF) unterbrechen. Zwei im Raster befindliche ATG-Startcodons finden sich in den Positionen 427-430 bzw. 466-469. Ein UAG-Stoppcodon findet sich in der Position 847-849, was je nach dem verwendeten ATG-Codon den ORF auf die Nucleotide 427 bis 849 oder die Nucleotide 466 bis 849 begrenzt. Der identifizierte ORF kodiert für ein kleines, cysteinreiches Protein von 55 Aminosäuren mit einem berechneten Molekulargewicht (MG) von 10013 D.
Die N-terminale Aminosäure weist einen hohen Gehalt an hydrophoben Aminosäuren auf, der typisch für an der Sekretion beteiligte Leadersequenzen ist.
Die Nucleotide 1 bis 426 definieren (teilweise) die für die Initiation der Transkription erforderliche Region (Promotor), die 5'-Endprozessierung von Y-mRNA (nicht-translatierter Leader) und die Initiation der Translation. Sie werden als Transkriptions- und Translations-Initiationsregulierungssequenz bezeichnet. Innerhalb dieser Sequenz wurden typische Promotorelemente erkannt: eine CAAT-Box bei den Nucleotiden 225-228 und eine TATA-Box bei den Nucleotiden 312-315, gefolgt von einer pyrimidinreichen Sequenz.
Die für die Termination der Transkription und die 3'-Endprozessierung von Y-mRNA erforderliche Region ist auf die Nucleotide 850 bis 1514 begrenzt und wird als Transkriptionsterminationssequenz bezeichnet.

Beispiel 4

Expression von Y

P. chrysogenum-Stämme wurden in einem standardmäßigen Komplexmedium (Revilla et al., J. of Bacteriol., Bd. 168 (1986), S. 947-952; und Revilla et al., J. Antibiot., Bd. 37 (1984), S. 781-789), das entweder Glucose oder Lactose als definierte Kohlenstoffquelle enthielt, gezüchtet. Nach einer Zeitspanne von 2-5 Tagen wurde die Gesamt-RNA aus dem Myzel gemäß Beispiel 2 isoliert.
Proben mit einem Gehalt an etwa 20 ug Gesamt-RNA wurden unter Verwendung von Glyoxal und DMSO (Sambrook, a. a. O.) denaturiert und der Elek trophorese an 1,0%-Agarosegelen in 10 mM Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,0 unterworfen.
Im Anschluß an die Elektrophorese wurde die RNA durch Blotting auf Nylon-Membranen (GeneScreen&spplus;, New England Nuclear, USA) gemäß den Herstellerangaben aufgebracht. Northern-Blots wurden sodann mit einem Gemisch aus zwei Sonden, die beide mit einem willkürlichen Primer-Markierungskit (Boehringer) und α[³²P]-dATP (3000 Cu/mMol, Amersham, UK) markiert waren, versetzt. Die Sonde 1, d. h. das 4 kb SphI-Restriktionsfragment von Plasmid pHR01 (Beispiel 1), wurde zum Nachweis von Y-mRNA verwendet. Die Sonde 2, d. h. das 1,2 kb-HindII-Restriktionsfragment des Plasmids pGJ02 (Veenstra et al., J. Biotechnol., Bd. 19 (1990), S. 81-90) wurde zum Nachweis von penDE-mRNA verwendet. Die letztgenannte Sonde erzeugt auch durch Kreuzhybridisierung ein Signal mit 5S-rmA (Veenstra et al., In: 50 Years of Penicillin Application, Symposium in Honour of Sir Edward P. Abraham, 8. September 1990, Berlin, BRD), das als Kontrolle für die Menge der aufgesetzten RNA verwendet wird. Standardmäßige stringente Bedingungen für die Hybridisierung und den Waschvorgang der Membranen wurden aufrechterhalten (Sambrook, 1989, a. a. O.).
Typische Ergebnisse sind in Fig. 2A dargestellt, aus der die hohe Konzentration an Y-mRNA im Vergleich zu penDE-mRNA hervorgeht. Die Expression des Gens Y wird durch die Anwesenheit von überschüssiger Glucose reprimiert und durch die Abwesenheit von überschüssiger Glucose dereprimiert und/oder induziert.
Ferner wird auch eine wirksame und regulierte Expression des Gens Y im Stamm npe10, einem Nichtpenicillin-Derivat von P. chrysogenum Wisconsin 54-1255, dem der pcbAB-pcbc-penDE-Gencluster fehlt (EP-A- 448180), beobachtet.
Die Expression des Gens Y wurde ferner auf dem Proteinniveau durch Analyse der in der Brühe von P. chrysogenum-Kulturen vorhandenen Proteine untersucht. Brüheproben wurden filtriert und durch Fällung mit Methanol eingeengt. Die Proteinzusammensetzung des Filtrats wurde an denaturierendem 17,5-20% PAAGE (Acrylamid : Bisacrylamid 39 : 1 Gew./Gew.)-0,1% SDS-Slabgelen unter Verwendung von Tris·Glycin-SDS-Puffer (25 mM Tris, 192 mM Glycin, 0,1% SDS, pH-Wert 8,5 als Laufpuffer gemäß Laemmli (Nature, Bd. 227 (1970), S. 680-685) analysiert.
Im Anschluß an die Elektrophorese wurden die Proteine in situ mit Coomassie Brilliant Blue R250 gefärbt und photographiert. Ein typisches Ergebnis ist in Fig. 2B dargestellt. Aus Fig. 2B ist ersichtlich, daß ein Protein der erwarteten Größe von etwa 8 kD unter den Bedingungen der Y- mRNA-Expression in starkem Maße exprimiert wird. Neben den in Fig. 2B dargestellten Stämmen zeigten P. chrysogenum-Stämme, die Mehrfachkopien des Gens Y enthielten und durch Transformation des Gens Y erhalten worden waren, eine erhöhte Konzentration des 8 kD-Proteins in Kulturfiltraten.

Beispiel 5

Identifizierung von Y

Die Identifizierung des 8 kD-Proteins in Kulturfiltraten von P. chrysogenum als das Y-Genprodukt wurde durch partielle N-terminale Aminosäure-Sequenzanalyse erreicht. Der Stamm P. chrysogenum Wisconsin 54-1255 wurde gemäß den Angaben in Beispiel 4 unter Y-exprimierenden Bedingungen gezüchtet (Lactose als definierte Kohlenstoffquelle). Die Kulturbrühe wurde gewonnen, filtriert und eingeengt. Die Proteine wurden an denaturierenden SDS-PAAGE-Gelen gemäß den Angaben in Beispiel 4 abgetrennt. Im Anschluß an die Elektrophorese wurden die Proteine auf eine PVDF-Membran (Polyvinylidendifluorid, 0,45 um Porengröße, Millipore, MA, USA) unter Verwendung eines halbtrockenen Blotting-Systems (Nova Blot, LKB, Schweden) aufgetragen. Nach dem Blotting wurden die Proteine durch Färbung mit Coomassie Brilliant Blue R250 sichtbar gemacht. Membranschnitte, die das 8 kD-Protein enthielten, wurden gewonnen und für die N-terminale Sequenzanalyse gemäß dem Edman-Abbau unter Verwendung eines automatischen Analysengeräts (Applied Biosystems, USA) verwendet. Die bestimmte Aminosäuresequenz ist in der Sequenzliste 4 aufgeführt. Die Sequenzanalyse bestätigt die Identität des 8 kD-Proteins als Y-Genprodukt. Die Aminosäuren 1 bis 21 des reifen, sezernierten Y entsprechen den Aminosäuren 38 bis 58 des ORF, beginnend beim ersten ATG-Codon (vergl. Beispiel 3 und Sequenzliste 1). Die Leadersequenz zur Prozessierung und Sekretion von Y ist dabei auf die Sequenz der Aminosäuren -37-1, die in der Sequenzliste 1 aufgeführt ist, begrenzt.

Beispiel 6

Phytase-Expression in Penicillium chrysogenum unter Verwendung von Gen Y-Expressionssignalen

Eine P. chrysogenum-Phytase-Expressionskassette wird durch Fusion von Sequenzen des Phytase-Gens von Aspergillus ficuum, das für die reife Form von Phytase kodiert (EP-A-420358), mit Expressionssignalen des Gens Y, d. h. den Promotor-, Sekretionssignal- und Terminatorsequenzen des Gens Y, konstruiert. Die Fusion wird durch Anwendung des PCR-Verfahrens (Innis, a. a. O.) vorgenommen. Sie führt zum Ersatz der Nucleotide 538 bis 846 in der Sequenzliste 1 durch die Nucleotide 382 bis 1715 der Phytase- Gensequenz, die in Fig. 6 von EP-A-420358 veröffentlicht ist. Die Plasmide pRH01 (Fig. 1) und pAF2-25 (EP-A-420358) werden in den PCR-Experimenten verwendet. Das gebildete Plasmid pPYPH01 enthält die Y-Phytase- Genfusion sowie das S. hindustanus-Phleomycin-Resistenzgen unter der Kontrolle des Promotors des Phosphoglycerat-kinase (PGK)-Gens von P. chrysogenum.
pPYPH01 wird in P. chrysogenum durch Transformation gemäß bekannten Verfahren eingeführt (Veenstra et al., a. a. O.). Transformanten werden in bezug auf ihre Resistenz gegenüber Phleomycin ausgewählt, gereinigt und sodann in bezug auf die Expression von Phytase gemäß den in EP-A-420358 ausführlich beschriebenen Verfahren analysiert.

SEQUENZPROTOKOLL

(1) ALLGEMEINE ANGABEN:

(i) ANMELDER: Gist-brocades N. V.
(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Eukaryontisches Expressionssystem
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 19
(iv) COMPUTERLESBARE FASSUNG:
(A) DATENTRÄGER: Floppy Disk
(B) COMPUTER: IBM PC kompatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Version #1.25 (EPO)
(v) DATEN DER VORLIEGENDEN ANMELDUNG:
ANMELDENUMMER:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 1514 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Doppelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
(B) STAMM: Penicillium chrysogenum
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Exon
(B) Lage: 427..552
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Intron
(B) Lage: 553..628
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Exon
(B) Lage: 629..718
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Intron
(B) Lage: 719..786
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Exon
(B) Lage: 787..846
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) Lage: Verbindung (427..552, 629..718, 787..846)
(D) SONSTIGE ANGABEN: /Codon_Start = 427 /Produkt = "antifungales Protein (Präprotein)"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: sig_Peptid (Signalpeptid)
(B) Lage: 427..537
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: mat_Peptid (reifes Peptid)
(B) Lage: 538..846
(C) ERMITTLUNGSMETHODE: experimentell
(D) (SONSTIGE ANGABEN): /Produkt = "Antifungales Protein" /Nachweis = experimentell

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:

GCCAGTCACC GTGTCAAGCG TTCAGCCGTT TCTCTGCTTT TTAGGAAATT GATTACCACT 60
AGGTAAGCCC AAAAATATCT TCCTGGTAAA CAAGTAGTGC ATTCTTACCC CGGAGGCTGA 120
AGCAGGTAAG GGATTTTGGA GAGACCCCAC CCGTAAGAAT ATACCAGCCA AGAGGTCCAG 180
TATCCTGAAG TATGTGAGGC ATTAATGTCA TTGGAGAAGT CATGCAATCC ATAAGCTGCC 240
ACCCCCAAGA TGACTGCATT GGACCTGAGC ATTGTATCTG TCACCTTTCA CACAGAGCTC 300
ATGATCTGGT TTATAAAGGC GGCTTCATGA CCCTCAATTC CATATAGTAT CACTCCCATC 360
ACAGCATTTC GATATCTTCA ACCACTTTAA CCTTCTCCAG AGGATCATCA TCTCAAGCCC 420
AATGGTTTTT GGTTCCCTTC TTGTTGGTGA TATGCGAGAT GCCCTGTGAT TCTCGAAGCT 936
TACTACCCTA CACCCACAAG GAACTCGGAA CCAAGGAACT GCTCGGTGGG TGATACATAT 996
ACACCCAGTA TCTATCCAGC TTCAATTTTG GGCGAATTTT GTTTCTTATT TCATAAAGAC 1056
ACTCGTTTGA TATGTAGCTA GATATTGTTG CTCATCAACG AAATCGTTGT AGATTATCGA 1116
ATATATCCAG CATCTTTTGA TCGTAGTCGG AAGTGAAATG GAGTACTATG ATACGACACA 1176
TGTACATTGT AAGCAGAAAT AGGCTAGAGG GATAACTATC AAACTGCTGC AGCAGCGCTA 1236
CTCTTGCTTC TGTGCGGGGT CAAACTTGTT TGCGAGCCGG ACTGCCAAAT CAGGGTCTGG 1296
GTAATCCTGG GGGCCGATTC CCTGTTATGC GGTAAGGATT AACTGGGGTT CTCAAAATGT 1356
TTCACACAGC CACTTCGTTA TTCCTTATAC CTGCCAAAAT CCCGCAATTT AATTCCTTAG 1416
TACACCCGTT ATACATCTAT CGCTGATAAG GTTTATCATA GGTACAATAG CTTTGATTAT 1476
AGGGACACGT CCAATGCTTA AATGCCAATTT CCTTAACA 1514

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 2

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 92 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 3:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 355 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA zu mRNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(VI) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
(A) ORGANISMUS: Penicillium chrysogenum

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr.: 3:

ATGCAAATCA CCACAGTTGC CCTTTTTCTC TTCGCTGCAA TGGGCGGGT AGCCACCCCC 60
ATTGAGTCTG TATCAAACGA CCTCGATGCC AGGGCTGAGG CCGGTGTCCT GGCCAAATAC 120
ACCGGAAAAT GCACCAAATC TAAGAACGAA TGTAAATACA AGAACGATGC TGGAAAGGAC 180
ACTTTTATCA AGTGCCCCAA GTTTGATAAC AAGAAGTGCA CCAAGGATAA TAACAAATGT 240
ACCGTCGACA CCTACAACAA CGCTGTCGAT TGTGACTAGA TGGTCTCTGC GATCACCAGG 300
GCATTTAATG GTTTTTGGTT CCCTTCTTGT TGGTGATATG CGAGATGCCC TGTGA 355

2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 4:

(1) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 21 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(v) ART DES FRAGMENTS: N-terminal
(vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
(A) (ORGANISMUS): Penicillium chrysogenum (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4:

2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 5:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 33 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (synthetisch)
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(vi) ORIGINALQUELLE:
(C) INDIVIDUUM/ISOLAT: AB2277

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 5:

CCCGGGACTA GTATGCAAAT CACCACAGTT GCC 33

2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 6:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 33 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (synthetisch)
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(vi) URSPRÜNGLICHE QUELLE:
(C) INDIVIDUUM/ISOLAT: AB2278

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 6:

CCCGGGACTA GTATGACCCT CAATTCCATA TAG 33

2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 7

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 33 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (synthetisch)
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(vi) URSPRÜNGLICHE QUELLE:
(C) INDIVIDUUM/ISOLAT: AB2280

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 7:

CCCGGGGGAT CCTCACAGGG CATCTCGCAT ATC 33

2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 8:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 33 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (synthetisch)
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(vi) URSPRÜNGLICHE QUELLE;
(C) INDIVIDUUM/ISOLAT: AB2308

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 8:

CCCGGGACTA GTGCCAGTCA CCGTGTCAAG CGT 33

2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 9:

(A) LÄNGE: 33 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (synthetisch)
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(vi) URSPRÜNGLICHE QUELLE:
(C) INDIVIDUUM/ISOLAT: AB2309

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 9:

CCCGGGACTA GTCCACCCGT AAGAATATAC CAG 33

2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 10:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 33 Basenpaare
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (synthetisch)
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(vi) URSPRÜNGLICHE QUELLE:
(C) INDIVIDUUM/ISOLAT: AB2312

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 10

CCCGGGACTA GTTTGGACCT GAGCATTGTA TGT 33

2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 11.

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 33 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKULTYP: DNA (synthetisch)
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(vi) URSPRÜNGLICHE QUELLE:
(C) INDIVIDUUM/ISOLAT: AB2313

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 11:

CCCGGGGGAT CCGATGGGAG TGATACTATA TGG 33

2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 12:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 33 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (synthetisch)
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(vii) UNMITTELBARE QUELLE:
(B) CLON: AB2314

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 12:

CCCGGGACTA GTATATCCCA TACCTTAAGT ACT 33

2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 13:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 33 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (synthetisch)
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(vi) URSPRÜNGLICHE QUELLE:
(C) INDIVIDUUM/ISOLAT: AB2315

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 13:

CCCGGGGGAT CCAGTACTTA AGGTATGGGA TAT 33

2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 14:

(1) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 33 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (synthetisch)
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(vi) URSPRÜNGLICHE QUELLE:
(C) INDIVIDUUM/ISOLAT: AB2316

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 14:

CCCGGGGGAT CCTATTTACA TTCGTTCTTA GAT 33

2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 15:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 33 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGEORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (synthetisch)
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(vi) URSPRÜNGLICHE QUELLE:
(C) INDIVIDUUM/ISOLAT: AB2317

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 15:

CCCGGGGGAT CCGTTCCTTG TGGGTGTAGG GTA 33

2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 16:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 33 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (synthetisch)
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(vi) URSPRUNGLICHE QUELLE:
(C) INDIVIDUUM/ISOLAT: AB2319

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 16:

CCCGGGGGAT CCACGATCAA AAGATGCTGG ATA 33

2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 17:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 33 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (synthetisch)
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(vi) URSPRÜNGLICHE QUELLE:
(C) INDIVIDUUM/ISOLAT: AB2425

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 17:

CCCGGGACTA GTTATAGTAT CACTCCCATC ACA 33

2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 18:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 18 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (synthetisch)
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(vi) URSPRÜNGLICHE QUELLE:
(C) INDIVIDUUM/ISOLAT: AB2426

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 18:

GGGCTTGAGA TGATGATC 18

2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 19:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 16 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (synthetisch)
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(vi) URSPRÜNGLICHE QUELLE:
(C) INDIVIDUUM/ISOLAT: reverser Sequenzierungsprimer

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 19:

AACAGCTATG ACCATG 16

Claims

1. Transkriptions- und Translations- Initiationsregulierungsregion, stammend aus dem Gen Y von Penicillium chrysogenum, oder ein Homologes davon.

2. Region nach Anspruch 1, das sich bis zum Nucleotid 426 von SEQ ID NO: 1 erstreckt.

3. Region nach Anspruch 1, das sich bis zum Nucleotid 537 von SEQ ID NO: 1 erstreckt.

4. Transkriptions-Terminationsregulierungsregion, stammend aus dem Gen Y von Penicillium chrysogenum, oder ein Homologes davon.

5. Für ein Proteinsekretionssignal kodierende Sequenz, umfassend die in SEQ ID NO: 1 dargestellte Nucleotidsequenz vom Nucleotid 427 bis zum Nucleotid 537 oder ein Homologes davon.

6. Proteinsekretionssignal-Kodierungssequenz, kodierend für eine Peptidsequenz, die die in SEQ ID NO: 2 dargestellte Aminosäuresequenz von der Aminosäure -37 bis zur Aminosäure -1 umfaßt, oder ein Homologes davon.

7. Verwendung der Transkriptions- und Translationsinitiationsregion gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Expression eines gewünschten Proteins in einem transformierten Wirt, umfassend die Fusion dieser Transkriptions- und Translations-Initiationsregion mit der für das Protein kodierenden Nucleotidsequenz.

8. Verwendung der Sekretionssignal-Kodierungssequenz gemäß Anspruch 5 oder 6 für die Sekretion eines gewünschten Proteins durch einen transformierten Wirt, umfassend die Fusion der Sekretionssignal-Kodierungssequenz mit einer Nucleotidsequenz, die für eine reife Form des Proteins kodiert.

9. Verwendung nach Anspruch 7 oder 8, wobei es sich beim transformierten Wirt um einen filamentösen Pilz, vorzugsweise Penicillium chrysogenum, handelt.

10. Verfahren zur Herstellung eines Proteins von Interesse, dadurch gekennzeichnet, daß eine Pilzwirtszelle mit einem Expressionssystem transformiert wird, das den offenen Leseraster des Proteins von Interesse, der mit der Transkriptions- und Translations- Initiationsregulierungsregion der Ansprüche 1 bis 3 fusioniert ist, die das Protein von Interesse exprimierenden transformierten Wirtszellen isoliert werden und die auf diese Weise erhaltenen Zellen unter Bedingungen, die zur Expression des Proteins von Interesse führen, gezüchtet werden.

11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei der offene Leseraster des Proteins von Interesse ferner mit einer Transkriptions-Terminationsregulierungsregion nach Anspruch 4 versehen ist.