DE60032585T2

DE60032585T2 - Hyphenwachstum in pilzen

Info

Publication number: DE60032585T2
Application number: DE60032585T
Authority: DE
Inventors: Nigel Los Gatos DUNN-COLEMAN; Geoffrey Turner; Sarah E. Harehills POLLERMAN; Stephen D. Memmott
Original assignee: University of Sheffield; Genencor International Inc
Current assignee: Sheffield Sheffield South Gb, University of; Danisco US Inc
Priority date: 1999-03-24
Filing date: 2000-03-22
Publication date: 2008-04-10
Anticipated expiration: 2020-03-23
Also published as: WO2000056893A1; EP1163344A1; CA2366211A1; AU775284B2; CA2366211C; AU3909800A; EP1163344B1; JP2002539790A; CA2814831A1; DK1163344T3; ATE349529T1; US6995239B1; JP4756743B2; DE60032585D1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen das Hyphenwachstum in Pilzen und beschreibt insbesondere die Modulation von Genen, welche mit dem Hyphenwachstum in filamentösen Pilzen assoziiert sind. Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren und Systeme für die Herstellung von Proteinen und/oder Chemikalien aus filamentösen Pilzen bereit, welche die Modulation von Genen, die mit dem Hyphenwachstum assoziiert sind, umfassen.
Hintergrund der Erfindung
Obgleich die Anzahl beschriebener Pilzarten sich auf ungefähr 64000 beläuft, wird es geschätzt, dass über eine Million Spezies existieren, was diese zu einer vielfältigen Gruppe von Organismen macht. Etwa 90% der Pilze wachsen in der Form eines ausstrahlenden Systems von sich verzweigenden Hyphen, welches als das Myzel bekannt ist. Diese Art des Wachstums reflektiert einen von unitären Organismen, wie Hefen, unterschiedlichen Lebensstil mit deutlichen Vorteilen für die Ausbreitung über Oberflächen und die Durchdringung von Substraten (Carlile, 1994, The Growing Fungus, Hrsg.: Gow, N.A.R. & Gadd, G. M., Chapman & Hall, S. 3-19). Bis heute sind sehr wenig Gene charakterisiert worden, welche die Pilzverzweigung beeinflussen. Das am besten charakterisierte Gen ist cot1, welches aus dem Pilz Neurospora crassa isoliert wurde. Cot-1 ist eine temperatursensitive Mutation, welche zu einer übermäßigen Verzweigung führt, und die Sequenz, deren Funktion unbekannt ist, scheint eine cAMP-abhängige Proteinkinase zu codieren (Yarden et al., 1992, EMBO J. 11:2159-2166).
Filamentöse Pilze finden eine industrielle Bedeutung als Produzenten von Antibiotika, Enzymen, Feinchemikalien und Lebensmitteln (Aspergillus: 50 Years On (1994) Band 29, Hrsg.: S. D. Martinelli & J. R. Kinghorn, S. 561-596). Es bleibt ein Bedarf im Fachgebiet nach verbesserten Verfahren zur Herstellung von Proteinen in filamentösem Pilz. Filamentöse Pilze sind ebenfalls bekannte Pathogene von Pflanzen und Tieren. Deshalb wird das Verständnis der genetischen Grundlage des Pilzwachstums eine Einsicht in Bezug auf mögliche Anti-Pilz-Therapien gewähren.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung basiert, zum Teil, auf der Ermittlung von Aspergillus-Genen, welche mit der Pilzmorphologie und insbesondere mit der Hyphen-Verzweigung assoziiert sind. Eine lineare Beziehung zwischen dem Ausmaß der Hyphen-Verzweigung (gemessen als Hyphenwachstumseinheit-Länge) und der Kulturviskosität im Fermenter (gemessen durch das Drehmoment, ausgeübt auf den Rheometer-Impeller) ist beobachtet worden. Die Isolation von sich übermäßig verzweigenden Pilzmutanten und die Identifizierung von Genen, die mit der übermäßigen Pilzverzweigung assoziiert sind, liefert eine Methode zur Modulierung der Pilzmorphologie, wodurch ein Weg zur Steuerung der Viskosität und zur Verbesserung der Fermenter-Leistung bereitgestellt wird.
Die vorliegende Erfindung beruht des Weiteren, zum Teil, auf der Identifizierung einer A. nidulans-Mutante für die Herstellung von HbrA (wobei die Mutante hierin als HbrA2 bezeichnet wird), welche einen hyper-verzweigenden Phänotyp bei der restriktiven Temperatur, 42°C, aufzeigt. Die Mutation HbrA2 scheint das Wachstum von A. nidulans bei 26°C nicht zu beeinflussen, aber führt zu einem hyper-verzweigenden, eingeschränkten Wachstums-Phänotyp bei 42°C. Die HbrA2-Mutante, umfassend die heterologe Nukleinsäure, welche die M. meihei-Protease codiert, war in der Lage, die Protease bei 26°C zu sezernieren. Die HbrA2-Mutante war unfähig, die Protease bei 37°C zu sezernieren, aber war fähig, die endogene Alpha-Amylase bei höheren Temperaturen als 37°C zu sezernieren. Die vorliegende Erfindung sieht die Aminosäuresequenz, HbrA, und Nukleinsäuresequenz für hbrA und Verfahren zur Herstellung von heterologem Protein oder Chemikalien in Pilzen durch Modulieren der Expression von Proteinen, welche mit dem Hyphenwachstum assoziiert sind, wie HbrA, vor.
Folglich sieht die vorliegende Erfindung ein isoliertes Protein vor, das in der Lage zum Modulieren des Hyphenwachstums in Pilzen ist, welches mindestens 70%, mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90% oder mindestens 95% Identität zu der Aminosäuresequenz, wie offenbart in SEQ ID Nr.: 2, aufweist. In einer Ausführungsform ist das Protein, das zum Modulieren des Hyphenwachstums in der Lage ist, HbrA, welches die Aminosäuresequenz, wie offenbart in SEQ ID Nr.: 2, aufweist. Die vorliegende Erfindung sieht Polynukleotide vor, codierend die Aminosäure mit der Sequenz, wie gezeigt in SEQ ID Nr.: 2, sowie Polynukleotide mit mindestens 60%, mindestens 65%, mindestens 70%, mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90% oder mindestens 95% Identität zu dem Polynukleotid, wel ches die Sequenz, wie gezeigt in SEQ ID Nr.: 1 aufweist. In einer Ausführungsform ist das Polynukleotid komplementär zu dem Polynukleotid, welches die Sequenz, wie gezeigt in SEQ ID Nr.: 1, aufweist. In einer anderen Ausführungsform besitzt das Polynukleotid die Nukleinsäuresequenz, wie offenbart in SEQ ID Nr.: 1. Die vorliegende Erfindung sieht des Weiteren Wirtszellen und Expressionsvektoren, welche ein Polynukleotid, das SEQ ID Nr.: 2 codiert, umfassen.
In einer Ausführungsform ist die Wirtszelle ein Pilz und in einer anderen ist sie ein filamentöser Pilz, einschließlich Aspergillus, Trichoderma, Mucor und Fusarium. In noch einer weiteren Ausführungsform schließt die Aspergillus-Spezies, ohne aber darauf eingeschränkt zu sein, A. niger, A. nidulans, A. oryzae und A. fumigatus ein.
Die vorliegende Erfindung sieht auch ein Verfahren zur Herstellung eines gewünschten Proteins in einem Pilz vor, umfassend den Schritt des Kultivieren eines rekombinanten Pilzes, der ein Polynukleotid umfasst, welches das gewünschte Protein codiert, unter Bedingungen, die für die Herstellung des gewünschten Proteins geeignet sind, wobei der rekombinante Pilz ferner ein Polynukleotid umfasst, welches ein Protein codiert, das zur Modulierung des Hyphenwachstums in dem Pilz in der Lage ist, wobei das Protein, welches zum Modulieren des Hyphenwachstums in der Lage ist, mindestens 70%, mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90% oder mindestens 95% Identität zu der Aminosäuresequenz, wie offenbart in SEQ ID Nr.: 2, aufweist, wobei das Polynukleotid, welches ein Protein codiert, das zum Modulieren des Hyphenwachstums in der Lage ist, bezüglich des Pilzes heterolog ist und rekombinant in den Pilz eingebracht worden ist. Das Verfahren kann ferner den Schritt des Gewinnens des gewünschten Proteins umfassen.
In noch einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besitzt das Polynukleotid, welches ein Protein codiert, das zum Modulieren des Hyphenwachstums in der Lage ist, mindestens 60%, mindestens 65%, mindestens 70%, mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90% oder mindestens 95% Identität zu dem Polynukleotid, welches die Sequenz, wie gezeigt in SEQ ID Nr.: 1, aufweist, oder ist komplementär zu dem Polynukleotid, welches die Sequenz, wie gezeigt in SEQ ID Nr.: 1, aufweist. In einer anderen Ausführungsform weist das Polynukleotid die Nukleinsäuresequenz, wie gezeigt in SEQ ID Nr.: 1, auf.
Die vorliegende Erfindung sieht auch ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Pilzes vor, der ein Polynukleotid umfasst, codierend ein Protein, das zum Modulieren des Hyphenwachstums in der Lage ist, umfassend die Schritte des Erhaltens eines Polynukleotids, welches das Protein codiert, das fähig zum Modulieren des Hyphenwachstums ist, wobei das Polynukleotid mindestens 60% Identität zu der Nukleinsäure mit der Sequenz, wie gezeigt in SEQ ID Nr.: 1, aufweist, oder zu dem Polynukleotid mit der Sequenz, wie gezeigt in SEQ ID Nr.: 1, komplementär ist, des Einbringens des Polynukleotids in eine Wirtszelle, welche ein Pilz ist; und des Wachsenlassens der Wirtszelle unter Bedingungen, die für die Herstellung des Proteins, welches zur Modulierung von Hyphenwachstum in der Lage ist, geeignet sind. In einer anderen Ausführungsform schließt der filamentöse Pilz Aspergillus-, Trichoderma-, Mucor- und Fusarium-Spezies ein. In noch einer anderen Ausführungsform schließt die Aspergillus-Spezies A. niger, A. nidulans, A. oryzae und A. fumigatus ein. In einer anderen Ausführungsform besitzt das Polynukleotid die Sequenz, wie gezeigt in SEQ ID Nr.: 1.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die 1A-1D veranschaulichen die Nukleinsäuresequenz (SEQ ID Nr.: 1; hbrA) und die Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr.: 2) für HbrA.
Die 2A-2B veranschaulichen eine Aminosäure-Alignierung der Aminosäuresequenz für hbrA; A. fugmigatus (afvac); Ratte (ratvac); Hefe-slp-Gen (slp1_yeast); C. elegans (slp1_ceel).
Die 3 veranschaulicht die Amylase-Sekretion durch hbr/creA-Mutanten.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Definitionen
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck "Protein, assoziiert mit Hyphenwachstum" auf ein Protein, welches fähig zum Modulieren des Hyphenwachstums in einem Pilz ist. Veranschaulichend für derartige Proteine sind die Proteine HbrA 1-9, welche hierin in den Beispielen offenbart werden. Der Begriff "HbrA" bezieht sich auf die Aminosäuresequenz, wie gezeigt in SEQ ID Nr.: 2. Die vorliegende Erfindung umfasst Proteine, assoziiert mit dem Hyphenwachstum im Pilz, welche mindestens 70%, mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90% oder mindestens 95% Identität zu der Aminosäuresequenz, wie offenbart in SEQ ID Nr.: 2, aufweisen. Die prozentuale Identität auf dem Nukleinsäure-Niveau wird bestimmt unter Verwendung des FastA-Programms, und die prozentuale Identität auf dem Aminosäure-Niveau wird bestimmt unter Verwendung des TFastA, welche beide die Methode von Pearson und Lipman (PNAS USA, 1988, 85:2444-2448) anwenden. Die vorliegende Erfindung umfasst ebenfalls Mutanten, Varianten und Derivate von HbrA, solange die Mutante, Variante oder das Derivat zum Modulieren des Hyphenwachstums in einem Pilz in der Lage ist.
Wie hierin verwendet, bezieht sich "Nukleinsäure" auf eine Nukleotid- oder Polynukleotidsequenz, und Fragmente oder Bereiche davon, und auf DNA oder RNA von genomischem oder synthetischem Ursprung, welche doppelsträngig oder einzelsträngig, ungeachtet dessen, ob der Sinn- oder Antisinn-Strang repräsentiert wird, sein kann. Wie hierin verwendet, bezieht sich "Aminosäure" auf Peptid- oder Proteinsequenzen oder Abschnitte davon.
Die Begriffe "isoliert" oder "gereinigt", wie hierin verwendet, beziehen sich auf eine Nukleinsäure oder Aminosäure, welche von wenigstens einem Bestandteil entfernt ist, mit welchem sie natürlicherweise assoziiert ist.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck "heterolog", wenn auf ein mit dem Hyphenwachstum assoziiertes Protein Bezug genommen wird, auf ein Protein, welches in natürlicher Weise nicht in einer Pilzzelle vorkommt. Der Begriff "homolog", wenn auf ein Protein, das mit Hyphenwachstum assoziiert ist, Bezug genommen wird, bezieht sich auf ein Protein, das in dem Pilz nativ oder natürlich vorkommt. Die Erfindung schließt Pilzwirtszellen ein, welche das homologe Protein, das mit Hyphenwachstum assoziiert ist, bei höherer Kopienanzahl herstellen, als dies in dem natürlich vorkommenden Pilzwirt gefunden wird, und wobei die Erzeugung bei einer höheren Kopienanzahl durch rekombinante DNA-Technologie bewerkstelligt wird.
Wie hierin verwendet, bedeutet der Ausdruck "überexprimierend" bei Bezugnahme auf die Produktion eines Proteins in einer Wirtszelle, dass das Protein in größeren Mengen hergestellt wird als dessen Produktion in seiner natürlich vorkommenden Umgebung.
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Die vorliegende Erfindung betrifft die Identifizierung von HbrA in A. nidulans. Die Mutation von HbrA, hierin bezeichnet als HbrA2, wurde dem Chromosom VII durch parasexuelle Analyse zugeordnet (Aspergillus: 50 Years On (1994) Band 20, Hrsg.: S. D. Martinelli & J. R. Kinghorn, S. 41-43). Bei 37°C versagt die Mutante hbrA2, anders als Wildtyp-A. nidulans, darin, rekombinant exprimierte M. meihei-Protease zu sezernieren. Die translatierte Sequenz des hbrA2-Gens zeigt signifikante Identität mit dem Hefe SLP/VPS33-Sec1-Genprodukt. Verfügbare Daten zeigen, dass SLP/VPS33 Sec1 ein Protein codiert, welches essenziell für die Vakuolen- Proteinsortierung ist. SLP1-Mutanten versagen darin, Proteine zu den Vakuolen zu lenken, und sie werden entlang eines Standardweges zur cytoplasmatischen Membran geschickt. Die exakte Natur und Funktion des SLP1/VPS33 Sec1-Proteins ist unbekannt, aber es ist ein Mitglied der SEC1-Familie und kann ein membranassoziiertes Protein sein, welches bei der Lenkung von Vesikeln zu Vakuolen beteiligt ist. Die Deletion von VPS33 in Hefe ist nicht lethal, aber führt zu einem langsamen Wachstum, Temperaturempfindlichkeit und dem Verlust von Vakuolen, wie durch Lichtmikroskopie mit Färbung und Elektronenmikroskopie enthüllt wird. Fluoreszenzmikroskopie hat gezeigt, dass, wie SLP1/VSP33-Mutanten in Hefe, HbrA2 defizient hinsichtlich der Vakuolen-Assemblierung bei der nicht-permissiven Temperatur ist.
Die Mutation HbrA2 scheint das Wachstum von A. nidulans bei 26°C nicht zu beeinflussen, aber führt zu einem Hyperverzweigungs-Phänotyp mit eingeschränktem Wachstum bei 42°C. Der Hyperverzweigungs-Phänotyp zeigt eine umfangreiche Verzweigung im apikalen Kompartiment auf, anders als der Wildtyp-A. nidulans. Die Mutante wächst langsam bei der nichtpermissiven Temperatur, was zu hochkompakten Kolonien auf Agar-Medien fährt. Mucor meihei-Protease wurde in Wildtyp- A. nidulans transformiert und in die hbrA2-Mutante eingekreuzt. Die hbrA2-Mutante, umfassend die heterologe Nukleinsäure, welche die M. meihei-Protease codiert, war in der Lage, die Protease bei 26°C zu sezernieren. Die hbrA2-Mutante war nicht in der Lage, die Protease bei 37°C zu sezernieren, aber war in der Lage, die endogene Alpha-Amylase bei höheren Temperaturen als 37°C zu sezernieren.
Im Hinblick auf die Beobachtung, dass hbrA-Mutanten zur Herstellung von Fremdprotein nicht in der Lage sind, scheint es so, dass die gentechnische Veränderung von Pilzzellen zum Modulieren der Expression von mit Hyphenwachstum assoziierten Proteinen, insbesondere die Mutanten HbrA 1-9, eine Methode zur Steigerung der Produktion von Proteinen oder Chemikalien im Pilzwirt vorsehen wird. In einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wäre es wünschenswert, die Expression von Proteinen zu erhöhen, welche mit dem Hyphenwachstum assoziiert sind. In einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wäre es wünschenswert, die Expression von Proteinen, welche mit dem Hyphenwachstum assoziiert sind, durch dem Fachmann auf dem Gebiet bekannte Methoden zu verringern oder zu eliminieren.
I. HbrA-Aminosäure- und hbrA-Nukleinsäure-Sequenzen
Die vorliegende Erfindung stellt die Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr.: 2) HbrA und Nukleinsäuresequenz (SEQ ID Nr.: 1) für hbrA bereit. Die vorliegende Erfindung umfasst Aminosäurevari anten mit mindestens 70% Identität zu der Aminosäure[mit den Sequenz, wie gezeigt in SEQ ID Nr.: 2, solange die Variante zum Modulieren des Hyphenwachstums in der Lage ist. Die prozentuale Identität auf dem Nukleinsäure-Niveau wird unter Verwendung des FastA-Programms bestimmt, und die prozentuale Identität auf dem Aminosäure-Niveau wird unter Verwendung des TFastA bestimmt, welche beide die Methode von Pearson und Lipman (PNAS USA, 1988, 85:2444-2448) verwenden. Alternativ dazu wird Identität bestimmt mittels des MegAlign-Programms von DNAstar (DNASTAR, Inc. Maidson, WI 53715) mittels des Jotun-Hein-Verfahrens (1990, Method in Enzymology, 183: 626-645) mit einem Lücken-Strafwert (Gap-Penalty) = 11, einem Lückenlängen-Strafwert = 3 und "Paarweise Alignierungs-Parameter Ktuple" = 2. Wie der Fachmann auf dem Gebiet leicht erkennen wird, kann eine Vielzahl von Polynukleotiden HbrA codieren. Die vorliegende Erfindung überspannt alle solchen Polynukleotide. HbrA und andere Polynukleotide, codierend Proteine, welche mit dem Hyphenwachstum assoziiert sind, können durch im Fachgebiet bekannte Standardverfahren zum Beispiel aus klonierter DNA (z. B. DNA-"Bibliothek"), genomischen DNA-Bibliotheken, durch chemische Synthese, sobald identifiziert, durch cDNA-Klonierung oder durch die Klonierung von genomischer DNA oder Fragmenten davon, gereinigt aus einer gewünschten Zelle, erhalten werden (siehe zum Beispiel Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; Glover, D. M. (Hrsg.), 1985, DNA Cloning: A Practical Approach, MRL Press, Ltd., Oxford, Großbritannien, Band I, II). Aus genomischer DNA abgeleitete Nukleinsäure-Sequenzen können regulatorische Regionen zusätzlich zu codierenden Regionen enthalten. Ungeachtet der Herkunft kann das isolierte Polynukleotid, welches das mit Hyphenwachstum assoziierte Protein codiert, molekular in einen geeigneten Vektor zur Vermehrung des Gens kloniert werden.
Bei der molekularen Klonierung des Gens aus genomischer DNA, werden DNA-Fragmente erzeugt, von denen einige das gewünschte Gen codieren werden. Die DNA kann an spezifischen Stellen unter Verwendung verschiedener Restriktionsenzyme gespalten werden. Alternativ dazu kann man DNAse in Gegenwart von Mangan verwenden, um die DNA zu fragmentieren, oder die DNA kann physikalisch geschert werden, wie zum Beispiel durch Schallbehandlung. Die linearen DNA-Fragmente können dann gemäß der Größe durch Standardtechniken separiert werden, einschließlich, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, Agarose- und Polyacrylamidgelelektrophorese und Säulenchromatographie.
Sobald die DNA-Fragmente erzeugt sind, kann eine Identifizierung des spezifischen DNA-Fragments, welches das Gen enthält, auf verschiedenen Wegen durchgeführt werden. Zum Bei spiel kann ein Polynukleotid, codierend ein Protein, das mit Hyphenwachstum assoziiert ist, oder seine spezifische RNA, oder ein Fragment davon, wie eine Sonde oder ein Primer, isoliert und markiert und danach in Hybridisierungs-Assays zum Nachweisen verwandter Gene eingesetzt werden (Benton, W., und Davis, R., 1977, Science 196:180; Grunstein, M., und Hogness, D., 1975, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72: 3961). Diejenigen DNA-Fragmente, welche eine wesentliche Sequenzähnlichkeit mit der Sonde gemeinsam haben, werden unter stringenten Bedingungen hybridisieren.
Es gibt ebenfalls Pilzmikroorganismus-Polynukleotidsequenzen, welche in der Lage sind, an die Nukleotidsequenz von SEQ ID Nr.: 1 unter Bedingungen von mäßiger bis maximaler Stringenz zu hybridisieren. Die Hybridisierungsbedingungen basieren auf der Schmelztemperatur (Tm) des Nukleinsäure-Bindungskomplexes, wie es in Berger und Kimmel gelehrt wird (1987. Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Band 152, Academic Press, San Diego CA), und verleihen eine definierte "Stringenz", wie nachstehend erläutert.
"Maximum-Stringenz" tritt typischerweise bei etwa Tm – 5°C (5°C unter der Tm der Sonde); "hohe Stringenz" bei etwa 5°C bis 10°C unterhalb Tm; "intermediäre Stringenz" bei etwa 10°C bis 20°C unterhalb Tm; und "niedrige Stringenz" bei etwa 20°C bis 25°C unterhalb der Tm auf. Wie der Fachmann auf dem Gebiet verstehen wird, kann eine Hybridisierung bei Maximum-Stringenz angewandt werden, um identische Polynukleotidsequenzen zu identifizieren oder zu detektieren, während eine Hybridisierung bei intermediärer oder niedriger Stringenz angewandt werden kann, um Polynukleotidsequenz-Homologe zu identifizieren oder zu detektieren.
Der Begriff "Hybridisierung", wie hierin verwendet, soll "das Verfahren, durch welches ein Strang von Nukleinsäure sich mit einem komplementären Strang durch Basenpaarung zusammenfügt" (Coombs J (1994) Dictionary of Biotechnology, Stockton Press, New York NY) einschließen.
Das Amplifikationsverfahren, wie durchgeführt in Polymerase-Kettenreaktion(PCR)-Technologien, wird in Dieffenbach, C.W., und G.S. Dveksler (1995, PCR Primer, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview NY) beschrieben. Eine Nukleinsäuresequenz mit wenigstens etwa 10 Nukleotiden und so viel wie etwa 60 Nukleotiden aus SEQ ID Nr.: 1, vorzugsweise etwa 12 bis 30 Nukleotiden, und stärker bevorzugt etwa 20-25 Nukleotiden, kann als eine Sonde oder PCR-Primer verwendet werden.
Expressionssysteme
Die vorliegende Erfindung sieht Wirtszellen, Expressionsverfahren und Systeme für die Produktion von gewünschten Proteinen in einem Wirtspilz vor. Sobald Nukleinsäure, codierend ein Protein, das mit Hyphenwachstum assoziiert ist, erhalten wird, können rekombinante Wirtszellen, welche die Nukleinsäure enthalten, unter Verwendung von im Fachgebiet allgemein bekannten Techniken konstruiert werden. Molekularbiologie-Techniken werden offenbart in Sambrook et al., Molecular Biology Cloning: A Laborstory Manual, zweite Ausgabe (1989), Cold Spring Harbor Laborstory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989). Nukleinsäure, welche Proteine codiert, die mit dem Hyphenwachstum assoziiert sind, und welche mindestens 60% Identität zu hbrA aufweist, wird erhalten und unter Verwendung geeigneter Vektoren in eine Wirtszelle transformiert. Eine Vielzahl von Vektoren und Transformations- und Expressionskassetten, die für die Klonierung, Transformierung und Expression in Pilzen geeignet sind, ist dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt.
Typischerweise enthält der Vektor oder die Kassette Sequenzen, welche Transkription und Translation der Nukleinsäure steuern, einen selektierbaren Marker und Sequenzen, welche die autonome Replikation oder die chromosomale Integration erlauben. Geeignete Vektoren umfassen eine Region 5' des Gens, welche transkriptionelle Initiations-Steuerungselemente beinhaltet, und eine Region 3' des DNA-Fragments, welche die transkriptionelle Termination steuert. Diese Steuerungsregionen können aus zu dem Wirt homologen oder heterologen Genen abgeleitet sein, solange die gewählte Steuerungsregion dazu in der Lage ist, in der Wirtszelle zu funktionieren.
Initiations-Steuerungsregionen oder Promotoren, welche zum Antreiben der Expression des Proteins, welches mit dem Hyphenwachstum assoziiert ist, in einer Wirtszelle nützlich sind, sind dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt. Praktisch jedweder zum Antreiben dieser Proteine fähige Promotor ist für die vorliegende Erfindung geeignet. Nukleinsäure, welche das Protein codiert, wird funktionsfähig durch Initiationscodons an gewählte Expressions-Steuerungsregionen für eine effektive Expression des Proteins verknüpft. Sobald geeignete Kassetten konstruiert sind, werden sie für das Transformieren der Wirtszelle verwendet.
Allgemeine Transformationsvorgehensweisen werden gelehrt in Current Protocols in Molecular Biology (Band 1, herausgegeben von Ausubel et al., John Wiley & Sons, Inc. 1987, Kapitel 9) und beinhalten Calciumphosphat-Verfahren, Transformation unter Verwendung von PEG und Elektroporation. Für Aspergillus und Trichoderma können PEG- und Calcium-vermittelte Proto- Plasten-Transformation angewandt werden (Finkelstein, DB 1992 Transformation. In Biotechnology of Filamentous Fungi, Technologe and Products (hrsg. von Finkelstein & Bill) 113-156. Die Elektroporation von Protoplasten wird offenbart in Finkelestein, DB 1992 Transformation. In Biotechnologe of Filamentous Fungi. Technologe and Products (hrsg. von Finkelstein & Bill) 113-156. Mikroprojektions-Beschuss auf Konidien wird beschrieben in Fungaro et al. (1995) Transformation of Aspergillus nidulans by microprojection bombardment an intact conidia. FEMS Microbiology Letters 125: 293-298. Von Agrobacterium vermittelte Transformation wird in Groot et al. (1998) Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of filamentous fungi. Nature Biotechnologe 16: 839-842, beschrieben.
Wirtszellen, welche die Sequenz für hbrA umfassen und das Protein exprimieren, können durch eine Vielzahl von Vorgehensweisen, welche dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt sind, identifiziert werden. Diese Vorgehensweisen schließen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, DNA-DNA oder DNA-RNA-Hybridisierung und Protein-Bioassay- oder Immunoassay-Techniken ein, welche Membran-basierende, Lösungs-basierende oder Chip-basierende Technologien für den Nachweis und/oder die Quantifizierung der Nukleinsäure oder des Proteins einschließen. Für die Herstellung eines gewünschten Proteins in einer Pilzwirtszelle wird ein Expressionsvektor, der wenigstens eine Kopie von ein gewünschtes Protein codierender Nukleinsäure umfasst, in die rekombinante Wirtszelle transformiert, umfassend Nukleinsäure, die ein mit Hyphenwachstum assoziiertes Protein codiert, und unter Bedingungen kultiviert, die zur Expression des Proteins geeignet sind. Beispiele von gewünschten Proteinen schließen Enzyme, wie Hydrolasen, einschließlich Proteasen, Cellulasen, Amylasen, Carbohydrasen und Lipasen; Isomerasen, wie Racemasen, Epimerasen, Tautomerasen oder Mutasen; Transferasen, Kinasen und Phosphatasen, neben Proteinen von therapeutischem Wert, ein. Alternativ dazu kann es vorteilhaft sein, Proteine, die mit dem Hyphenwachstum assoziiert sind, herunter zu regulieren oder zu mutieren, um die Viskosität im Fermenter zu reduzieren.
III. Vektorsequenzen
Expressionsvektoren, verwendet beim Exprimieren des hprA in Pilzzellen, oder des gewünschten Proteins in Pilzzellen, umfassen wenigstens einen Promotor, assoziiert mit dem Protein, wobei der Promotor in der Wirtszelle funktional ist. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Promotor der Wildtyp-Promotor für das Protein und in einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Promotor bezüglich des Proteins heterolog, aber ist in der Pilzwirtszelle noch funktional. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Er findung wird Nukleinsäure, welche das Protein codiert, stabil in das Mikroorganismus-Genom integriert.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält der Expressionsvektor eine Mehrfachklonierungsstellen-Kassette, welche vorzugsweise mindestens eine Restriktionsendonuklease-Stelle umfasst, die für den Vektor einzigartig ist, um die Leichtigkeit von Nukleinsäuremanipulation zu erleichtern. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Vektor des Weiteren einen oder mehrere selektierbare Marker. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck selektierbarer Marker auf ein Gen, das zur Expression in dem Wirt in der Lage ist, was die Leichtigkeit der Selektion derjenigen Wirte, welche den Vektor enthalten, ermöglicht.
IV. Assay der Aktivität von mit Pilzwachstum assoziierten Proteinen
Die in den Beispielen I und II gezeigten Ergebnisse veranschaulichen die Verwendung einer temperaturbasierenden Screening- bzw. Rasteruntersuchung zur Identifizierung von Mutanten, welche eine Pilzverzweigung bewirken. Der unerwartete Vorteil der Verwendung einer derartigen temperaturbasierenden Rasteruntersuchung ist die Fähigkeit, HbrA-Mutanten oder Mutanten von mit dem Hyphenwachstum assoziierten Proteinen zu identifizieren, welche einen unterschiedlichen Effekt auf den Export von nativen oder endogenen Genen gegenüber dem Export von rekombinant eingebrachtem heterologen Protein aufweisen. Dieser Typ von Screening-Verfahren erleichtert die Isolierung von Stämmen, welche zu einer erhöhten Sekretion von heterologem Protein in der Lage sind. Deshalb stellt die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren für die Identifizierung von Hyperverzweigungs-Mutanten bereit, welche die Proteinsekretion erhöhen, umfassend die Schritte des Erhaltens von Pilzmutanten, des Unterwerfens der Mutanten unter eine Selektion unter gewünschten Bedingungen, und des Identifizierens der gewünschten Mutanten. In einer Ausführungsform umfasst die Identifizierung das Selektieren hinsichtlich Hyphenwachstum. In einer anderen Ausführungsform umfasst die Selektion das Wachsenlassen und/oder die Sekretion von heterologen Proteinen bei einer eingeschränkten Temperatur.
Beispiele
Beispiel 1

Dieses Beispiel veranschaulicht die Isolierung des hbrA-Gens. Um das hbrA-Gen zu isolieren, wurde DNA aus vereinigten Cosmiden der Chromosomen-sortierten Cosmid-Bibliothek von Wildtyp-DNA aus A. nidulans hergestellt, erhalten vom FGSC (Funal Genetic Stock Center, Department of Microbiology, University of Kansas Medical Center, Kansas City, KS 66160). 5 Pools von jeweils 20 Cosmiden wurden in Transformationsexperimenten verwendet. Um die Transformationseffizienz zu überprüfen, wurde eine hbrA2, argB-Doppelmutante als ein Empfänger für Cotransformation unter Verwendung einer Mischung von Cosmid-DNA und des transformierenden Vektors Arp, welcher das argB-Gen und eine replizierende Sequenz trägt, verwendet. Nach der Transformation wurden Protoplasten regeneriert und auf Medium ohne Arginin bei 42°C selektiert. Einer der Cosmid-Pools führte zur Entstehung von wenigen stark wachsenden, in normaler Weise Konidien bildenden, Kolonien in einem Hintergrund von Arg+ Hbr^–-Transformanten. Der Pool wurde in 4 Pools von 5 Cosmiden unterteilt, und die Transformation wurde wiederholt. Ein einzelnes Cosmid wurde isoliert, welches in der Lage war, die hbrA2-Mutation zu komplementieren, wodurch das Wildtypwachstum wiederhergestellt wurde. Die Subklonierung dieses Cosmids führte zur Identifizierung eines EcoRI-Fragments, welches die transformierende Sequenz trug. Die EcoRI/BamHI-Fragmente versagten darin, die Mutation zu komplementieren, was nahe legt, dass die BamHI-Stelle innerhalb des hbrA-Gens liegt. Das Fragment wurde isoliert und einer Nukleinsäuresequenzierung unterzogen. Die Nukleinsäure- und Aminosäuresequenz für das des hbrA-Gen ist in den 1A-1D gezeigt. Die Tabelle I zeigt die Proteaseaktivität für Hbr2 sowie andere indentifizierte Hyperverzweigungs-Mutanten bei den permissiven und nicht-permissiven Temperaturen. Tabelle I

Stamm	Mittlere Proteaseaktivität (Einheiten/Gramm Biomasse) bei 26°C			Mittlere Proteaseaktivität (Einheiten/Gramm Biomasse) bei 37°C
Stamm	48 Stunden	72 Stunden	48 Stunden	72 Stunden
Wildtyp	963+/–57	703+/–12	380+/–44	339+/–40
HbrA2	857+/–18	1237+/–155	0+/–0	0+/–0
Hbr3	689+/–76	1194+/–234	0+/–0	0+/–0
Hbr6	0+/–0	1892+/–122	0+/–0	0+/–0
Hbr8	0+/–0	2165+/–156	0+/–0	487+/–10

Diese Befunde zeigen, dass ein zuvor uncharakterisiertes Gen von filamentösen Pilzen, hbrA, eine Rolle im heterologen Protein-Export spielt.
Beispiel 2
Dieses Beispiel beschreibt die Charakterisierung von Hyperverzweigungs-Mutanten von A. nidulans. Nachstehend folgt Tabelle II, welche die chromosomale Lokalisierung der hbr-Mutanten zeigt.

hbr-Mutante Chromosomale Lokalisierung

hbr1 I

hbrA2 VII

hbr3 I

hbr4 III

hbr5 VIII

hbr6 III

hbr7 III

hbr8 I

hbr9 III
Alle Mutationen waren rezessiv und nicht aneinander gekoppelt und repräsentieren zuvor uncharakterisierte Mutationen, welche die pilzliche Hyper-Verzweigung und Proteinsekretion beeinflussen bzw. bewirken. Die Fähigkeit von hbrA2-Mutante, das endogene Protein Alpha-Amylase bei 37°C zu sezernieren, wurde untersucht durch Wachsen lassen der hbrA2:creA^–-Doppelmutante auf Petrischalen mit Stärke als der einzigen Kohlenstoffquelle (das CreA-Gen ist ein negativ wirkender Regulator der Kohlenstoff-Katabolismus-Repression. Mutationen von CreA (CreA^–) verursachen eine Kohlenstoff-Katabolismus-Derepression von Enzymen, wie Alpha-Amylase). Die Doppelmutante hbrA2:creA–, wie hbrA+:creA–, war gezeigtermaßen in der Lage, das endogene Protein Alpha-Amylase zu sezernieren, siehe 3.
Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass das hbrA-Gen in unerwarteter Weise eine Rolle in der Sekretion heterologer Proteine spielt.
Die hbr3-Mutante, wie die hbrA2-Mutante, erzeugt geringfügig mehr M. meihei-Protease als der Wildtyp bei 26°C. Bei 37°C erzeugt die hbr3-Mutante, wie die hbrA2-Mutante, die M. meihei-Protease nicht. Die hbrA2-Mutation ist auf dem Chromosom VII lokalisiert, die hbr3-Mutation ist auf dem Chromosom I lokalisiert. Diese Ergebnisse zeigen, dass das hbr3-Genprodukt ebenfalls eine Rolle im heterologen Protein-Export spielt. Deshalb scheint es, dass eine Modulation der Expression des Wildtyp-hbr3-Genprodukts vorteilhaft zur Erhöhung des heterologen Protein-Exports wäre.

Die Mutationen hbr6 und hbr8, welche auf den Chromosomen III bzw. I lokalisiert sind, produzieren signifikant höhere Spiegel an M. meihei-Protease als der Wildtyp bei 26°C und scheinen die Sekretion von heterologem Protein in einem filamentösen Pilz zu erhöhen, der im Temperaturbereich von rund 26°C wachsen gelassen wird. Deshalb scheint es so, dass auch die Modulation der Expression der Wildtyp-hbr6- und hbr8-Genprodukte eine Nützlichkeit bei der Erhöhung des heterologen Protein-Exports aufweist. Mutantenversionen der hbr6- und hbr8-Gene besitzen keine oder signifikant geringere M. meihei-Sekretion als der Wildtyp, wie gezeigt durch Tabelle III. Tabelle III

Stamm	Mittlere Proteaseaktivität (Einheiten/Gramm Biomasse) bei 26°C		Mittlere Proteaseaktivität (Einheiten/Gramm Biomasse) bei 37°C
Stamm	48 Stunden	72 Stunden	48 Stunden	72 Stunden
Wildtyp	963+/–57	703+/–12	380+/–44	339+/–40
hbr5	46+/–60	1152+/–133	533+/–53	1648+/–797
hbr7	0+/–0	1098+/–53	580+/–60	1581+/–660
hbr4	844+/–114	1688+/–67	343+/–26	260+/–15
hbr9	0+/–0	268+/–16	0+/–0	1562+/641

Die Tabelle II veranschaulicht, dass die Sekretion von M. meihei-Protease in den hbr5- und hbr7-Mutanten, verglichen mit dem Wildtyp, geringfügig mehr Protease bei 26°C nach 72 Stunden und signifikant mehr Protease bei 72 Stunden bei 37°C ergibt.
Die hbr4-Mutante produzierte signifikant mehr M. meihei-Protease als der Wildtyp nach 72 Stunden bei 26°C, aber signifikant weniger Protease nach 72 Stunden bei 37°C. Allerdings produzierte die hbr4:creA^–-Doppelmutante signifikant höhere Spiegel an Alpha-Amylase/Flächen einheit der Pilzkolonie als der Wildtypstamm, der nur die creA^–-Mutation enthielt. Diese Ergebnisse weisen auf eine signifikante Rolle für das hbr4-Genprodukt nicht nur in Bezug auf die Pilzmorphologie und die Erhöhung der nativen Proteinsekretion, sondern auch auf eine Rolle für dieses Genprodukt beim heterologen Protein-Export hin.
Die hbr9-Mutation zeigte eine geringe Expression von M. meihei-Protease bei 26°C, aber signifikant höhere Spiegel an M. meihei-Protease und Alpha-Amylase/Flächeneinheit der Pilzkolonie als der Wildtyp.
SEQUENZAUFLISTUNG

Claims

Isoliertes Protein, das zum Modulieren des Hyphen-Wachstums in Pilzen in der Lage ist, das mindestens 70% Identität zu der Aminosäuresequenz, wie offenbart in SEQ ID Nr.: 2, aufweist.
Protein von Anspruch 1, welches mindestens 80%, oder mindestens 90% oder mindestens 95% Identität zu der Aminosäuresequenz, wie offenbart in SEQ ID Nr.: 2, aufweist.
Protein von Anspruch 1, welches die Aminosäuresequenz, wie offenbart in SEQ ID Nr.: 2, aufweist.
Isoliertes Polynukleotid, das die Aminosäuresequenz codiert, welche die Sequenz, wie gezeigt in SEQ ID Nr.: 2, aufweist.
Isoliertes Polynukleotid von Anspruch 4, das mindestens 60% Identität zu dem Polynukleotid mit der Sequenz, wie gezeigt in SEQ ID Nr.: 1, aufweist oder zu dem Polynukleotid mit der Sequenz, wie gezeigt in SEQ ID Nr.: 1, komplementär ist.
Isoliertes Polynukleotid von Anspruch 5, das die Nukleinsäuresequenz, wie offenbart in SEQ ID Nr.: 1, aufweist.
Expressionsvektor, der das Polynukleotid von Anspruch 4 umfasst.
Wirtszelle, welche den Expressionsvektor von Anspruch 7 umfasst.
Wirtszelle von Anspruch 8, welche ein filamentöser Pilz ist.
Wirtszelle von Anspruch 9, wobei der filamentöse Pilz Aspergillus, Trichoderma, Mucor und Fusarium einschließt.
Verfahren zur Herstellung eines gewünschten Proteins in einem Pilz, umfassend den Schritt des Kultivierens eines rekombinanten Pilzes, der ein das gewünschte Protein codierendes Polynukleotid umfasst, unter Bedingungen, die für die Herstellung des gewünschten Proteins geeignet sind, wobei der rekombinante Pilz ferner ein Polynukleotid umfasst, codierend ein Protein, das zum Modulieren des Hyphen-Wachstums in dem Pilz in der Lage ist, wobei das Protein mindestens 70% Identität zu der Aminosäuresequenz, wie offenbart in SEQ ID Nr.: 2, aufweist, wobei das Polynukleotid, codierend ein Protein, das zum Modulieren des Hyphen-Wachstums in der Lage ist, bezüglich des Pilzes heterolog ist und rekombinant in den Pilz eingebracht worden ist.
Verfahren von Anspruch 11, ferner umfassend den Schritt des Gewinnens des gewünschten Proteins.
Verfahren von Anspruch 11, wobei das Polynukleotid, welches ein Protein codiert, das zum Modulieren des Hyphen-Wachstums in dem Pilz in der Lage ist, ein replizierendes Plasmid umfasst.
Verfahren von Anspruch 11, wobei das Polynukleotid, welches ein Protein codiert, das zum Modulieren des Hyphen-Wachstums in dem Pilz in der Lage ist, in das Pilzgenom integriert ist.
Verfahren von Anspruch 11, wobei das Protein, das zum Modulieren des Hyphen-Wachstums in dem Pilz in der Lage ist, die Aminosäuresequenz, wie gezeigt in SEQ ID Nr.: 2, aufweist.
Verfahren von Anspruch 11, wobei das Polynukleotid, welches ein Protein codiert, das zum Modulieren des Hyphen-Wachstums in der Lage ist, mindestens 60% Identität zu dem Polynukleotid mit der Sequenz, wie gezeigt in SEQ ID Nr.: 1, aufweist oder zu dem Polynukleotid mit der Sequenz, wie gezeigt in SEQ ID Nr.: 1, komplementär ist.
Verfahren von Anspruch 14, wobei das Polynukleotid die Nukleinsäuresequenz, wie gezeigt in SEQ ID Nr.: 1, aufweist.
Verfahren von Anspruch 11, wobei der Pilz ein filamentöser Pilz ist.
Verfahren von Anspruch 18, wobei der filamentöse Pilz Aspergillus-, Trichoderma-, Mucor- und Fusarium-Spezies einschließt.
Verfahren von Anspruch 19, wobei der Aspergillus A. niger, A. nidulans, A. oryzai und A. fumigatus einschließt.
Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Pilzes, umfassend ein Polynukleotid, das ein zum Modulieren des Hyphen-Wachstums fähiges Proteins codiert, das mindestens 70% Identität zu der Aminosäuresequenz, wie offenbart in SEQ ID Nr.: 2, aufweist, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) Erhalten eines Polynukleotids, welches das Protein codiert, wobei das Polynukleotid mindestens 60% Identität zu dem Polynukleotid mit der Sequenz, wie gezeigt in SEQ ID Nr.: 1, aufweist oder zu dem Polynukleotid mit der Sequenz, wie gezeigt in SEQ ID Nr.: 1, komplementär ist, (b) Einbringen des Polynukleotids in eine Wirtszelle, welche ein Pilz ist; und (c) Wachsenlassen der Wirtszelle unter Bedingungen, die für die Herstellung des Proteins, das zum Modulieren des Hyphen-Wachstums in der Lage ist, geeignet sind.
Verfahren von Anspruch 21, wobei die Wirtszelle einen filamentösen Pilz einschließt.
Verfahren von Anspruch 22, wobei der filamentöse Pilz Aspergillus, Trichoderma, Mucor und Fusarium einschließt.
Verfahren von Anspruch 23, wobei die Aspergillus-Spezies A. niger, A. nidulans, A. oryzae und A. fumigatus einschließt.
Verfahren zur Herstellung eines gewünschten Proteins in einem Pilz, umfassend den Schritt des Kultivierens eines rekombinanten Pilzes, der ein das gewünschte Protein codierendes Polynukleotid umfasst, unter Bedingungen, die für die Herstellung des gewünschten Proteins geeignet sind, wobei der rekombinante Pilz eine Mutation in einer endogenen Nukleinsäure umfasst, welche ein Protein codiert, das zum Modulieren des Hyphen-Wachstums in der Lage ist, wobei die Mutation zur Inhibition der Herstellung des Proteins, das zum Modulieren des Hyphen-Wachstums in der Lage ist, durch den Pilz führt, wobei das Protein, das zum Modulieren des Hyphen-Wachstums in der Lage ist, mindestens 70% Identität zu der Aminosäuresequenz, wie offenbart in SEQ ID Nr.: 2, aufweist.