DE4317260A1

DE4317260A1 - Acetyl-CoA-Carboxylase kodierende DNA-Sequenz

Info

Publication number: DE4317260A1
Application number: DE4317260A
Authority: DE
Inventors: Reinhard Dr Toepfer; Wolfgang Dipl Biol Schulte; Jeff Prof Dr Schell
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Priority date: 1993-01-22
Filing date: 1993-05-24
Publication date: 1994-07-28

Description

Die Erfindung betrifft eine DNA-Sequenz, die für die Acetyl- CoA-Carboxylase kodiert, und die Allele sowie Derivate dieser DNA-Sequenz.

Im Fettsäurestoffwechsel der Prokaryonten und Eukaryonten stellt das Enzym Acetyl-CoA-Carboxylase (EC 6.4.1.2) ein wichtiges Schlüsselenzym dar. Sie katalysiert in einer Zwei- Schritt-Reaktion die ATP-abhängige Carboxylierung von Acetyl- CoA zu Malonyl-CoA (A.W. Alberts und P.R. Vagelos, The Enzymes (Boyer PD ed), Bd. 6, S. 37-82, 3. Auflage, Academic Press, New York, 1972) gemäß den folgenden Reaktionsgleichungen:

BCCP + HCO₃⁻ Biotincarboxylase BCCP-COO⁻ + ADP + Pi

BCCP-COO⁻ + Acetyl-CoA Transcarboxylase BCCP + Malonyl-CoA.

Die Acetyl-CoA-Carboxylase (ACC) wurde biochemisch besonders an tierischen Systemen und E.coli untersucht, wobei in jüngster Zeit auch molekularbiologische Untersuchungen an den verschiedensten Organismen vorgenommen worden sind, wie beispielsweise bei der Ratte (F. Lopez-Casillas, D.H. Bai, X. Luo, I.S. Kong, M.S. Hermodson und K.H. Kim, PNAS 85, S. 5784-5788 (1988)), dem Huhn (T. Takai, C. Yokoymama, K. Wada und T. Tanabem J. Biol. Soc. 263, S. 2651-2657, (1988)), der Hefe (W. Al-Feel, S.S. Chirala und S.J. Wakil, PNAS 89, S. 4534-4538, (1984)) und E.coli (J.-H. Alix, DNA 8: S. 779-789 (1989); H. Kondo, K. Shiratuchi, T. Yoshimoto, T. Masuda, A. Kitazono, D. Truru, M. Anai, M. Sekiguchi und T. Tanabe, PNAS 88: S. 9730-9733 (1991); S.-J. Li und J.E. Cronan, Jr., J. Biol. Chem. 267, S. 855-863 (1992a)).

Bei Bakterien besteht das ACC-Enzym aus drei verschiedenen Polypetidketten, die aus drei funktionellen Einheiten bestehend aus der Biotincarboxylase (BC), dem Biotin Carboxy Carrier Protein (BCCP) und der Transcarboxylase (TC) (H.G. Wood und R.E. Barden, Annu. Rev. Biochem. 46, S. 385-413, (1977)) zusammengesetzt sind. Teile der Amino säuresequenz des E.coli ACC-Enzyms im Bereich der Biotin Domäne wurden von M.R. Sutton, R.R. Fall, A.M. Nervi, A.W. Alberts, P.R. Vagelos und R.A. Bradshaw, J. Biol.Chem. 252, S. 3934-3940 (1977)) identifiziert. Die Gene für das BCCP und die BC aus E.coli (J.-H. Alix, supra) sowie für die TC (S.-J. Li und J.E. Cronan, supra) wurden kürzlich beschrieben. Die von der Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Molekulargewichte dieser Proteine betragen 17 kD für das BCCP, 49 kD für die BC und 35 kD für die α-Untereinheit der TC bzw. 33 kD für die β-Untereinheit der TC.

Bei Tieren, Hefe und Pflanzen sind die genannten drei funktionellen Einheiten bzw. Domänen in einem Polypeptid zusammengefaßt (D.G. Hardie und P. Cohen, FEBS Letters 91, S. 1-7 (1978), M. Mishina, R. Roggenkamp und E. Schweizer, Eur. J. Biochem. 111, S. 79-87 (1980), B. Egin-Bühler, R. loyal und J. Ebel, Arch. Biochem. Biophys. 203, S. 90-100, (1979), A.R. Slabas und A. Hellyer, Plant Sci 39, S. 177-182, (1985), Hellyer et al J.L. Harwood, Ann. Rev. Plant. Physiol. 39, S. 101-138 (1988)). Die Molekulargewichte einer multi funktionellen Untereinheit liegen über 200 kD. Die ACC der Ratte besitzt ein Molekulargewicht von 265 kD (Lopez-Casillas et al, supra), die der Hefe ein Molekulargewicht von 251 kD (Al-Feel et al, supra) und die aus Pflanzen schwankt zwischen 210 und 240 kD (Hellyer et al supra).

Eine Übersicht über die Momologien der bekannten ACC-Enzyme zeigt Tabelle 1.

Tabelle 1

Tabelle 1 zeigt die Prozentwerte an identischen Aminosäuren bzw. des Momologiegrades bei Acetyl-CoA-Carboxylasen vom Huhn, von der Ratte, von der Hefe und von E.coli. Es zeigt sich ein deutig, daß die ACC-Enzyme auch über die verschiedenen Organismen einen relativ hohen Grad an Verwandtschaft zeigen. Trotz des großen evolutionären Abstandes zwischen Ratte/Huhn einerseits und Hefe andererseits bestehen immerhin noch etwa 66% Homologie über die gesamte Aminosäuresequenz. Greift man einzelne Bereiche heraus, so sind Homologien von etwa 80% bis zu 100% in einigen Abschnitten festzustellen (Al-Feel et al supra) . Bemerkenswert ist die gleiche Organisationsform eukaryontischer ACCs hinsichtlich der Abfolge der Domänen BC-BCCP-CT. Dies spricht für eine frühzeitige Fusion der einzelnen Gene der Prokaryonten im Zuge der Evolution der Eukaryonten. Die hohe Konservierung der ACCs ist durch die hohe Kreuzreaktivität von Antikörpern zwischen Ratte, Huhn und Hefe experimentell bestätigt (Al-Feel et al, supra).

Die Regulation der Acetyl-CoA-Carboxylase in den verschiedenen Organismen ist noch weitgehend ungeklärt. In Pflanzen hat man bisher die Enzymaktivität an zwei verschiedenen experimen tellen Systemen untersucht, nämlich in Chloroplasten und sich entwickelnden Rapssamen. Es hat sich herausgestellt, daß in sich entwickelnden Rapssamen die Aktivität der ACC vor der Bipideinlagerung induziert wird, dann aber rasch abnimmt, wenn die volle Lipideinlagerung erreicht worden ist (E. Turnham und D.H . . Northcote (1983) Biochem. J. 212, S. 223-229) . Das be deutet, daß eine Regulation über das Endprodukt erfolgt. Darüber hinaus scheint die ACC die gesamte de novo-Fettsäure biosynthese als die Umsatzrate begrenzendes Enzym zu regulieren (P.D. Simcox, W. Garland, V. De Lica, D.T. Canvin und D.T. Dennis, Can J Bot 57, S. 1008-1014 (1979); Turnham und Northcote, supra). Diese experimentellen Befunde machen die Acetyl-CoA-Carboxylase bei Pflanzen zu einem interessanten Objekt für den Eingriff in den Fettsäurestoffwechsel mit der Perspektive der Ertragserhöhung oder der Änderung des Fett säuremusters bei geeigneter Überproduktion der ACC im Samen.

Untersuchungen über die Wirkungsweise von verschiedenen Herbiziden, die zur Bekämpfung von Ungräsern, wie beispiels weise Gramineen, in Beständen dicotyler Kulturpflanzen einge setzt werden, haben gezeigt, daß bestimme Herbizide durch Hemmung der ACC in den Stoffwechsel von Gramineen eingreifen. Bisher sind Substanzen drei verschiedener Stoffklassen be schrieben worden, die eine herbizide Wirkung durch Interaktion mit der ACC entfalten. So hemmen Derivate der Aryloxyphenoxypropionsäure (z. B. Diclofop, Fenoxaprop, Fluazifop und Haloxyfop) (K. Kobek et al Z Naturforschung 43c, S. 47-54 (1988)), der Cyclohexan-1,3-dione (z. B. Cycloxydim, Clethodim und Setoxydim) (M. Focke und H.K. Lichtenthaler, Z. Naturforschung 42c, S. 1361-1363 (1987)) oder von PP600 (3-Isopropyl-6-(N-[2,2-dimethylpropyl] acetamido-1,3,5-triazin-2,4-(IH,3H)dion) (K.A. Walker, S.M. Ridley und J.L. Lewis Harwood, Phytochem 29, S. 3743-3747 (1990)) die ACC sensitiver Pflanzen. Wie die inhibitorische Wirkung im Detail erfolgt und warum ACCs von dicotylen Pflanzen nicht gehemmt werden, ist z.Z. noch unklar.

In der EP-A-0 469 810 wird ein biotinhaltiges Polypeptid mit einem Molekulargewicht von 50 kD, welches eine Untereinheit einer pflanzlichen Acetyl-CoA-Carboxylase darstellt, beschrie ben. Es ist jedoch unter anderem festgestellt worden, daß der 229 bp große Klon CC 8 der Fig. 8 kein Aminosäure-Leseraster aufweist, das eine aussagekräftige Momologie zu einer der be kannten ACC-Aminosäuresequenzen aufweist. Das läßt unwei gerlich den Schluß zu, daß der in der EP-A-0 469 810 ver wendete Antikörper nicht spezifisch gegenüber ACC oder zu mindest einer Untereinheit von ACC ist.

Es ist Aufgabe der Erfindung, eine DNA-Sequenz zur Verfügung zu stellen, mit der einerseits durch homologe oder heterologe Expression in pflanzlichen Systemen die Qualität und Quantität von pflanzlichen Ölen oder Fetten verändert werden kann und andererseits durch heterologe Expression Herbizidresistenzen in beispielsweise Nutzpflanzen gegenüber den verschiedensten Herbiziden verliehen bzw. übertragen werden kann.

Diese Aufgabe wird mit einer DNA-Sequenz gemäß Patentanspruch 1 gelöst.

Die Erfindung betrifft weiterhin einen genomischen Klon, der eine DNA-Sequenz enthält, die für die Acetyl-CoA-Carboxylase kodiert, und die Allele sowie Derivate dieser DNA-Sequenz.

Die Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur Herstellung von Pflanzen, Pflanzenteilen und Pflanzenprodukten, bei dem auf gentechnologischem Weg eine DNA-Sequenz, die für die Acetyl-CoA-Carboxylase kodiert, übertragen wird.

Die Erfindung betrifft schließlich auch die Verwendung dieser DNA-Sequenz zur Verleihung bzw. Übertragung von Herbizid resistenzen oder Veränderung der Qualität und Quantität von pflanzlichen Ölen und Fetten.

Die Figuren dienen zur Erläuterung der vorliegenden Erfindung. Es zeigen:

Fig. 1 einen Sequenzvergleich der Aminosäuresequenzen von biotinabhängigen und verwandten Enzymen in ihrer BC-Domäne;

Fig. 2 die Darstellung der DNA- bzw. Aminosäure sequenz der degenerierten Oligonukleotide 3455 und 3464;

Fig. 3a die DNA-Sequenz und die daraus abgeleitete Aminosäuresequenz im Ein-Buchstaben-Code des 260 bp PCR-Fragments als spezifische Hybridi sierungssonde;

Fig. 3b den Vergleich der Aminosäuresequenz der ACC der Ratte (obere Zeile) mit der Aminosäuresequenz aus Fig. 3a (untere Zeile)

Fig. 4 die Restriktionskarten der in den genomischen Klonen BnACC3, BnACC8, BnACC10 und BnACC1 inserierten DNA-Sequenzen;

Fig. 5 das Sequenzierungsschema eines 11,9 kb DNA- Fragments der 13,7 kb DNA-Sequenz des genomischen Klons BnACC8;

Fig. 6 die 11,9 kb DNA-Sequenz des DNA-Fragments aus Fig. 5;

Fig. 7 die funktionellen Bereiche in der DNA-Sequenz aus Fig. 6 und die aus den DNA-Sequenzen abgeleiteten Aminosäuresequenzen im Ein- Buchstaben-Code;

Fig. 8 die schematische Darstellung der funktionellen Bereiche der DNA-Sequenz aus Fig. 6; und

Fig. 9 eine Southernblot-Hybridisierung (Kreuz hybridisierung) verschiedener genomischer Pflanzen-DNA mit einem Teil des ACC-Gens des genomischen Klons BnACC8.

Es ist selbstverständlich, daß im Rahmen der Erfindung auch allelische Varianten und Derivate der erfindungsgemäßen DNA- Sequenz erfaßt sind, unter der Voraussetzung, daß diese modifizierten DNA-Sequenzen für die Acetyl-CoA-Carboxylase kodieren. Zu den allelischen Varianten und Derivaten zählen beispielsweise Deletionen, Substitutionen, Insertionen, Inversionen oder Additionen der erfindungsgemäßen DNA-Sequenz.

Das Gen für die Acetyl-CoA-Carboxylase ist in allen Pflanzen vorhanden und daher aus diesen auf verschiedenen Wegen isolierbar. So läßt sich das Gen beispielsweise mit Hilfe von spezifischen Antikörpern oder Oligonukleotidsonden aus genomischer Pflanzen-DNA isolieren. Als besonders geeignetes Pflanzenmaterial hat sich der Raps (Brassica napus) der Sorte Akela erwiesen.

In der vorliegenden Erfindung wurde als Ausgangsmaterial zur Isolation von genomischen Klonen, welche das Gen für die ACC enthalten, eine in einem Phagen angelegte Genbank des Genoms von Raps (Brassica napus) der Sorte Akela verwendet. Diese Genbank wurde mit einer mittels PCR (polymerase chain reaction) hergestellten Hybridisierungssonde nach Genen für die ACC durchsucht. Auf diese Weise wurde ein genomischer Klon mit der Bezeichnung BnACC8 isoliert, welcher das vollständige Strukturgen der ACC aus Raps auf einem 13,7 kb XbaI-Fragment enthält. Dieser genomische Klon ist unter der Nummer DSM 7384 hinterlegt.

Des weiteren wurden die genomischen Klone BnACC3, BnACC10 und BnACC1 isoliert, die ebenfalls das Strukturgen der ACC aus Raps oder zumindest Teile davon auf jeweils ca. 20 kb, 15 kb bzw. 15 kb DNA-Fragmenten enthalten.

Das 13,7 kb DNA-Fragment wurde in Form von XbaI/Smal-Frag menten in geeignete Vektoren subkloniert und sequenziert. Die aus den DNA-Sequenzen abgeleiteten Aminosäuresequenzen wurden mit der ACC-Aminosäuresequenz der Ratte aus der Fig. 2 des Artikels von F. Lopez-Casillas, supra, per Computeranalyse verglichen. Es ist auf der Grundlage von Aminosäuresequenz homologien festgestellt worden, daß das 13,7 kb DNA-Fragment das Acetyl-CoA-Carboxylase-Gen enthält.

In der Fig. 4 sind die Restriktionskarten der in den genomischen Klonen BnACC3, BnACC8, BnACC10 und BnACC1 inserierten DNA-Fragmente gezeigt. Mit Ausnahme der überlappenden Klone BnACC3 und BnACC8, die zu einer Klasse von Genen gehören, wurde jeweils nur ein Vertreter (BnACC10 und BnACC1) zweier weiterer Klassen von genomischen Klonen dar gestellt. Die schwarz markierten Bereiche zeigen DNA-Bereiche an, die mit der eingesetzten Sonde hybridisieren. Begrenzt werden die DNA-Fragmente durch die Schnittstellen des Klonierungsvektors Lambda FIX®II, die durch "Y" symbolisiert sind: XbaI, SacI, NotI, SacI und SalI auf einer Seite bzw. SalI, SacI, NotI, SacI und XbaI auf der anderen Seite. Der sequenzierte Bereich des 13.7 kb DNA-Fragments aus BnACC8 wurde durch einen weißen Balken markiert.

Es wurden 11,9 kb des 13,7 kb DNA-Fragments aus BnACC8 unter Anwendung üblicher Verfahren sequenziert. Fig. 5 zeigt das Sequenzierungsschema. Mit Hilfe von Pfeilen läßt sich erkennen, welche DNA-Bereiche sequenziert wurden. Als Orientierung sind die Restriktionsschnittstellen angegeben, die ebenfalls in Fig. 4 bei BnACC8 gezeigt sind.

Die vollständige DNA-Sequenz der 11,9 kb des 13,7 kb DNA- Fragments aus BnACC8 ist in Fig. 6 wiedergegeben. Die DNA- Sequenz umfaßt am 5′-Ende die Sequenz des Polylinkers (in kleinen Buchstaben) und erstreckt sich am 3′-Ende mit 678 bp über die EcoRI-Schnittstelle hinaus. Der sequenzierte Bereich ist in Fig. 4 als weiser Balken markiert.

Auf den sequenzierten 11,9 kb des 13,7 kb DNA-Fragments aus BnACC8 ist das ACC-Strukturgen enthalten. Hierzu wird auf Fig. 7 verwiesen, die die DNA-Sequenz aus Fig. 6 mit ihren funktionellen Bereichen zeigt. Regulatorische Elemente, wie die CAAT-Box (Positionen 431-434), die TATA-Box (Positionen 564-567) sowie ein Polyadenylierungssignal (Positionen 11431- 11436) sind unterstrichen. Der Bereich der ersten etwa 600 bp stellt einen Teil des Promotors dar, der jedoch über diesen Bereich hinausgehen dürfte. Der Promotor kann aus dem Klon BnACC3 isoliert werden, der mehr DNA-Sequenzen in 5′-Richtung aufweist. Das ATG-Startcodon der ACC befindet sich in Position 654 und das dazugehörende TAA-Stoppcodon in Position 11291. Nachgewiesene Exon-/Introngrenzen wurden schwarz unterlegt. Mögliche Exon- und Introngrenzen zwischen den Positionen 6902 und 8018 (grau unterlegt) konnten nicht identifiziert werden.

Bei den schwarz unterlegten Exonbereichen in der Sequenz wurden die entsprechenden Aminosäuresequenzen angegeben. Die Exon-/Introngrenzen wurden aufgrund der Ähnlichkeit zu Acetyl- CoA Carboxylasen aus anderen Organismen (Ratte) (F. Lopez- Casillas, supra) festgelegt, soweit nicht mittels PCR diese Grenzen bestimmt worden sind (Positionen 2448-2961). Das erste Exon des Gens beginnt bei "ATG" als Startcodon mit einem offenen Leseraster. Die 5′-nichttranslatierten Bereiche sind daher nicht schwarz unterlegt. Die Markierung des letzten Exons endet am entsprechenden Stoppcodon, so daß der 3′-nicht translatierte Bereich ebenfalls nicht markiert ist.

In Fig. 8 sind die funktionellen Bereiche der ACC-Sequenz des Klons BnACC8 schematisch wiedergegeben. Die Exons sind schwarz unterlegt. In grau ist der Bereich dargestellt, für den eine Exon/Intron-Zuordnung nicht möglich ist. ATG bedeutet das Startcodon, MKM die konservierte Biotinbindungsstelle und TAA das Stoppcodon. Des weiteren lassen sich die drei Domänen eindeutig auf der Sequenz zuordnen: BC = Biotin-Carboxylase, BCCP = Biotin-Carboxy-Carrier Protein, CT = Carboxyltrans ferase. Die drei Domänen wurden aufgrund von Homologie zur ACC anderer Organismen festgestellt.

In Kreuzhybridisierungen mit genomischer DNA von Arabidopsis thaliana, Brassica napus, Arvena sativa, Hordeum vulgare, Oryza sativa, Triticum aestivum und Zea mays wurde festgestellt, daß sich Teile der erfindungsgemäßen ACC-Sequenz zur Isolation von ACC-Genen aus anderen Pflanzen eignen. In Fig. 9 wurde als DNA-Sonde ein SmaI/SacI-Fragment (siehe Fig. 4) aus dem Klon BnACC8 eingesetzt. Die genomischen DNAs der verschiedenen Pflanzen wurden mit ECO RI gespalten und einem Southernblot unterworfen. Die Kreuzaktivität der Sonde wird über mono- und dicotyle Pflanzen beobachtet.

Die erfindungsgemäße DNA-Sequenz, die für die Acetyl-CoA- Carboxylase kodiert, die Allele und Derivate dieser DNA- Sequenz können mit Hilfe gentechnologischer Verfahren in Pflanzen zur Regulation des Fettsäurestoffwechsels (in Form von anti-sense oder Überexpression)eingeführt bzw. übertragen werden.

Antisensekonstruktionen z. B. mit dem offenen Leseraster von Position 9143 bis zur Position 11290 der erfindungsgemäßen DNA-Sequenz von Fig. 6 können genutzt werden, um die Aktivität der ACC in einer Pflanze zu hemmen. Dies kann insbesondere durch geeignete regulatorische Elemente im Samen erfolgen. Dadurch kann ein Stau an Acetyl-CoA erzeugt werden, da dieses Intermediat nicht mehr in den Fettsäurestoffwechsel abfließen kann und somit den Stoffwechsel z. B. einer Pflanzenzelle beeinflußt:

1. Mit geeigneten regulatorischen Elementen kann somit ein "suicide gene" hergestellt werden, wenn eine Antisensekon struktion dazu führt, daß die Bildung von Fettsäuren in einer Zelle unterbleibt. In der Bekämpfung von Pflanzenkrankheiten kann in dieser Weise eine hypersensitive Reaktion ausgelöst werden.
2. Durch Hinzufügen zusätzlicher Gene, deren Genprodukte Acetyl-CoA verwenden, kann der Rückstau von Acetyl-CoA verhindert werden. Zum Beispiel können die Gene für die Synthese von z. B. Polyhydroxybutyrat (PHB) (Piorier et al. 1992, Science 256, Seiten 520-523) spezifisch in bestimmten Geweben/Organen/Zelltypen einer Pflanze vorzugsweise Speicher geweben, wie Samen (Endosperm, Kotyledon); Wurzeln; diverse Typen von Knollen) exprimiert werden. Wird gleichzeitig in denselben Teilen der Pflanze eine ACC-Antisensekonstruktion exprimiert, dann kann das nicht verwertete Acetyl-CoA zur Synthese von PHBs verwandt werden.

Aus der erfindungsgemäßen DNA-Sequenz lassen sich Oligonu kleotide ableiten, um eine cDNA oder Stücke einer cDNA zu synthetisieren. Diese cDNA oder Stücke davon können allein oder in Verbindung mit Teilen des genomischen Klons genutzt werden, um eine vollständige cDNA zu isolieren. Auch sind diese cDNA bzw. cDNA-Stücke verwendbar für eine Antisense expression.

So können einzelne cDNA-Fragmente oder die gesamte cDNA zur Komplementation von Mutanten der ACC z. B. in Mikroorganismen verwendet werden. Damit werden die Mikroorganismen (Mutanten aus E. coli fabE; Silbert et al. 1976, J.Bakteriol.126, Seiten 1351-1354); Harder et al. 1972, PNAS 69, Seiten 3105-3109 und aus Hefe (Schweizer et al. etwa 1980) unter nicht-permissiven Bedingungen durch die pflanzliche ACC funktionell komplementiert und sind unmittelbar vom pflanzlichen Enzym abhängig. Damit ergibt sich die Möglichkeit zur Selektion auf das pflanzliche Enzym und ein Testsystem zur Entwicklung und Optimierung von Hemmstoffen für die ACC. Dadurch können neben besseren Wirkstoffen für den Einsatz als Herbizide auch resistente Formen des ACC Enzyms nach Mutagenese des Gens (oder Bereichen des Gens) entwickelt oder selektiert werden.

Die cDNA kann ferner genutzt werden, um größere Mengen des Proteins oder Teile des Proteins zu gewinnen. Dieses hergestellte Protein kann für Studien zum Reaktionsmechanismus und der Regulation eingesetzt werden oder um die dreidimen sionale Struktur des Enzyms oder von Teilen des Enzyms auf zu klären. Der zuletzt genannte Punkt ist besonders für ein "protein modelling" bedeutsam, da es die Einpassung von z. B. Hemmstoffen in die Struktur des Proteins erlaubt.

Die ACC-Gensequenz, die Allele und Derivate dieser Sequenz werden vorzugsweise zusammen mit geeigneten Promotoren, insbesondere in rekombinanten Vektoren in die Pflanzen eingeführt.

Alle Arten von Pflanzen können für diesen Zweck transformiert werden. In diesem Zusammenhang seien Nutzpflanzen, Garten pflanzen und Zierpflanzen genannt. Unter den Nutzpflanzen sind Brassica napus, B. rapa, Kokos- und Ölpalme, Sonnenblume und Lein besonders bevorzugt.

Die erfindungsgemäße DNA-Sequenz, die für die ACC kodiert, kann insbesondere eingesetzt werden, um Herbizidresistenzen in Nutzpflanzen, darunter insbesondere Getreidepflanzen, gegen über bestimmten Herbiziden zu erzielen. Als bevorzugt zu transformierende Pflanzen seien Mais, Weizen, Gerste, Reis und Roggen genannt.

Die gentechnologische Einführung der ACC-DNA-Sequenz, die Allele und Derivate dieser Sequenz kann mit Hilfe üblicher Transformationstechniken durchgeführt werden. Solche Techniken umfassen Verfahren wie direkten Gentransfer, wie beispiels weise Mikroinjektion, Elektroporation, Particle gun, virale Vektoren und Liposomen-vermittelten Transfer sowie die Übertragung von entsprechenden rekombinanten Ti-Plasmiden oder Ri-Plasmiden und die Transformation durch Pflanzenviren.

Bei einer Zellkultur einer monokotylen Pflanze, wie beispielsweise Gerste, Weizen oder Mais, kann der Nachweis der Transformation durch Selektion mit einem geeigneten Herbizid durchgeführt werden. Des weiteren kann der Nachweis durch Southern-Blots mit beispielsweise Intronsequenzen der Raps- ACC-DNA als Hybridisierungssonde erbracht werden.

Somit betrifft die Erfindung ebenso Pflanzen, Pflanzenteile und Pflanzenprodukte, die nach einem der obigen Verfahren hergestellt bzw. transformiert worden sind.

Die nachfolgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung.

Beispiele Beispiel 1: Herstellung der Hybridisierungssonde für die Acetyl-CoA-Carboxvlase (ACC) (a) Herstellung degenerierter Oligonukleotide

Ausgehend von einem Sequenzvergleich verschiedener biotin haltiger Proteine wurden synthetische Oligonukleotide von konservierten Abschnitten der ACC-Sequenzen abgeleitet. Hierzu sei auf Fig. 1 verwiesen, die einen Sequenzvergleich der Aminosäuresequenz von biotinabhängigen und verwandten Enzymen in ihrer BC-Domäne zeigt. Diese Figur geht auf Abb. 3 aus der Publikation von Kondo et al, supra, zurück. Die Ab kürzungen in der linken Spalte haben folgende Bedeutungen:

EACC = ACC aus E.coli;
cACC = ACC vom Huhn;
rPCCα = α-Untereinheit der Propionyl-CoA-Carboxylase von der Ratte;
yPC = Pyruvat-Carboxylase aus der Hefe und
ECPSN = n-terminale Hälfte der Carbamoylphosphat-Synthetase.

Identische Aminosäuren sind eingerahmt und streng konservierte Reste durch Punkte markiert. Zusätzlich wurden durch Pfeile und Zahlen die konservierten Sequenzen in Fig. 1 hervorge hoben, die zur Herstellung bzw. Ableitung der degenerierten Oligonukleotide 3455 und 3464 dienten.

Die Oligonukleotide wurden auf einem Applied Biosystems DNA- Synthesizer (Model 380B) synthetisiert und sind in Fig. 2 wiedergegeben. Beide Oligonukleotide sind in 5′-3′-Orien tierung dargestellt, so daß beim Vergleich mit Fig. 1 die Aminosäuresequenz des Oligonukleotids 3464 in umgekehrter Richtung gelesen werden muß.

Aufgrund des degenerierten genetischen Codes und der möglichen Variabilität der Aminosäuresequenz an einzelnen Positionen wurden in den Oligonukleotiden unterschiedliche Basen eingebaut, z. B. C oder T bzw. A oder G im Oligonukleotid 3464. Darüber hinaus wurde I eingeführt, welches eine Wechselwirkung mit allen Nukleotiden eingehen kann und damit als unspezifi sche Base zu betrachten ist.

(b) Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

Ausgehend von einem µg PolyA+RNA wurde mit Avian Myelo blastosisvirus (AMV) Reverser Transkriptase während 30 Minuten bei einer Temperatur von 37°C eine cDNA-Synthese mit dem Oligonukleotid 3464 als Primer durchgeführt. Nach Inaktivie rung der Reversen Tranakriptase durch Erhitzen während fünf Minuten bei einer Temperatur von 95°C wurde in demselben Reaktionsansatz die PCR-Reaktion mit 50 pmol Endkonzentration je Primer (3455 und 3464) und vier Einheiten Ampli-Taq® Poly merase (Perkin Elmer Cetus) durchgeführt. Die Reaktionen wurden unter folgenden Bedingungen durchgeführt:

a) Pufferbedingungen: 10 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,0; 50 mM KCl; 1,5 mM MgCl₂; 0,01 0° Gelatine und 5 mM dNTPs;
b) Reaktionstemperaturen: 3 Minuten bei einer Temperatur von 92°C zum erstmaligen Denaturieren, dann 30 Temperaturzyklen mit jeweils 2 Minuten bei einer Temperatur von 92°C zum Denaturieren, 2 Minuten bei einer Temperatur von 51°C zum Annealen der Oligonukleotide und 2,5 Minuten bei einer Temperatur von 72°C zur Amplifikation der DNA und abschließend 2,5 Minuten bei einer Temperatur von 72°C, um eine vollständige Synthese der letzten Syntheseprodukte zu erreichen.
c) Klonierung der Amplifikationsprodukte
Überstehende einzelsträngige DNA der PCR-Produkte wurden mittels der Kleenov-Polymerase aufgefüllt (Sambrook et al, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989)) und anschließend mit Polynukleotidkinase phosphoryliert (Sambrook et al, supra) Die Aufreinigung der PCR-Produkte erfolgte gemäß Standard protokollen nach Sambrook et al, supra, durch Agarose-Gel elektrophorese, Gelelution, Reinigung mit Phenol/Chloroform und der abschließenden Fällung mit Isopropanol. Die auf diese Weise gereinigte DNA wurde in SmaI gespaltene pBluescipt®- Vektor-DNA legiert und kloniert.
d) DNA-Sequenzierung
Zur Bestimmung der DNA-Sequenz von in pBluescript® her gestellten Subklonen und solchen DNA-Sequenzen, bei denen Deletionen mittels Exonuklease III hergestellt worden sind (siehe auch Beispiel 2) (Sambrook et al, supra) wurden nach der Methode von Sanger et al Proc. Natl. Acad. Sci. 74, S. 5463-5467 (1977) sequenziert. Die Sequenzdaten wurden mit Hilfe der Computer-Software der "University of Wisconsin Genetics Computer Group" (Devereux et al Nucl. Acids Res. 12, S. 387-395 (1984)) analysiert. Die Homologiestudien erfolgten mit dem Programm "Bestfit".
e) Synthese einer spezifischen Hybridisierungssonde mittels PCR
Ausgehend von PolyA+RNA aus unreifen Samen vom Raps (Brassica napus) (etwa 2-3 Wochen alt) wurden nach einer cDNA-Erststrang synthese mittels PCR-Reaktionen DNA-Fragmente amplifiziert. Die dazu erforderlichen Oligonukleotide wurden aufgrund eines Homologievergleiches u. a. zwischen der ACC vom Huhn und aus E.coli (Fig. 1) synthetisiert. Rechnerisch sollte sich mit diesen (degenerierten) Oligonukleotiden ein Produkt von 260 bp Länge amplifizieren lassen, das für 86 Aminosäuren kodiert. Daher wurden Amplifikationsprodukte in dieser Größenordnung aus dem erhaltenen Produktgemisch isoliert, in pBluescript® kloniert und durch DNA-Sequenzierung identifiziert. Neben anderen unspezifischen PCR-Produkten konnte eines kloniert werden, daß die erwartete Größe von 260 bp hat und über ein offenes Leseraster von 86 Aminosäuren verfügt (Fig. 3a). Dieses Produkt, wird die Homologie auch im Bereich der Oligonukleotide mitgerechnet, weist 77,9% identische Aminosäuren im Vergleich zur ACC der Ratte auf und eine Homologie von 88,4% (Fig. 3b). Berechnet man die Identität bzw. Homologie nur auf die amplifizierte Sequenz, also ohne den Bereich der Oligonukleotide, die auch Fehlpaarungen zu lassen, so ergeben sich immerhin noch Werte von 73,2% identi schen Aminosäuren bzw. 85,9% Homologie zwischen den Protein sequenzen der ACC von Ratte und Raps. Diese Zahlen zeigen, daß das klonierte PCR-Produkt einen Teil der ACC aus Raps kodiert und somit als spezifische Hybridisierungssonde eingesetzt werden kann. Aufgrund der Lage der Homologie zur ACC der Ratte zwischen den Aminosäuren der Positionen 304 und 389 (Fig. 3b) war zu erwarten, daß das klonierte PCR-Fragment nur cDNAs erkennt, die über 6000 bp lang sind.

Beispiel 2: Charakterisierung eines genomischen Klons mit einer DNA-Sequenz die für ACC kodiert

Aus einer Genbank von Raps (Brassica napus) der Sorte Akela, die im Vektor Lambda FIX®II (Stratagene) konstruiert worden war, wurden mit Hilfe des unter Beispiel 2 beschriebenen, klonierten PCR-Fragmentes 10 genomische Klone isoliert und charakterisiert. Sie lassen sich aufgrund ihrer Restriktions karten in 3 Klassen einteilen. Fig. 4 zeigt die Restrik tionskarten der genomischen Klone BnACC3, BnACC8, BnACC10 und BnACC1. Der Klon, BnACC8, der zur am häufigsten vertretenen Klasse gehört, enthält ein DNA-Fragment mit einer Größe von 13,7 kb. Dieses DNA-Fragment umfaßt das vollständige Strukturgen der ACC aus Raps. Das DNA-Fragment wurde in Form von XbaI-SmaI-Fragmenten in pBluescript® subkloniert sequenziert. Die Sequenzierungsstrategie ist in Fig. 5 wiedergegeben. Die DNA-Sequenz der ACC ist in Fig. 6 gezeigt.

Claims

1. DNA-Sequenz, die für die Acetyl-CoA-Carboxylase kodiert, und die Allele sowie Derivate dieser DNA-Sequenz.

2. DNA-Sequenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus Pflanzen isoliert ist.

3. DNA-Sequenz nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus Raps (Brassica napus) isoliert ist.

4. DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Größe von 13,7 kb aufweist.

5. Genomischer Klon, der eine DNA-Sequenz enthält, die für die Acetyl-CoA-Carboxylase kodiert, und die Allele sowie Derivate dieser DNA-Sequenz.

6. Genomischer Klon nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenz aus Pflanzen isoliert ist.

7. Genomischer Klon nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenz aus Raps (Brassica napus) isoliert ist.

8. Genomischer Klon nach einem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenz eine Größe von 13,7 kb aufweist.

9. Genomischer Klon BnACC8 (DSM 7384).

10. Verfahren zur Herstellung von Pflanzen, Pflanzenteilen und Pflanzenprodukten, die Herbizidresistenz aufweisen, bei dem eine DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder eine aus den genomischen Klonen nach einem der Ansprüche 5 bis 9 stammende DNA-Sequenz auf gen technologischem Weg übertragen wird.

11. Verfahren zur Herstellung von Pflanzen, Pflanzenteilen und Pflanzenprodukten, deren Qualität und Quantität hinsichtlich der Öl- und Fettsäureproduktion verändert ist, bei dem eine DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder eine aus den genomischen Klonen nach einem der Ansprüche 5 bis 9 stammende DNA-Sequenz auf gentechnolo gischem Weg übertragen wird.

12. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenz durch Mikroinjektion, Elektroporation, Particle gun, Übertragung von entsprechenden rekombi nanten Ti-Plasmiden oder Ri-Plasmiden, Liposomen vermitteltem Transfer oder durch Pflanzenviren übertragen wird.

13. Verwendung einer DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder einer aus den genomischen Klonen nach einem der Ansprüche 5 bis 9 stammende DNA-Sequenz zur Übertragung von Herbizidresistenzen in Pflanzen.

14. Verwendung einer DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder einer aus den genomischen Klonen nach einem der Ansprüche 5 bis 9 stammende DNA-Sequenz zur Veränderung der Qualität und Quantität hinsichtlich der Öl- und Fettsäureproduktion in Pflanzen.

15. Pflanzen, Pflanzenteile und Pflanzenprodukte, hergestellt nach einem Verfahren des Anspruchs 10 oder 11 und 12.