EP1070120A1 - Amp-deaminase - Google Patents

Amp-deaminase

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Publication number
EP1070120A1
EP1070120A1 EP99919138A EP99919138A EP1070120A1 EP 1070120 A1 EP1070120 A1 EP 1070120A1 EP 99919138 A EP99919138 A EP 99919138A EP 99919138 A EP99919138 A EP 99919138A EP 1070120 A1 EP1070120 A1 EP 1070120A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
plant
amp deaminase
expression cassette
sequences
expression
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP99919138A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Jens Lerchl
Andreas Reindl
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BASF SE
Original Assignee
BASF SE
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by BASF SE filed Critical BASF SE
Publication of EP1070120A1 publication Critical patent/EP1070120A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance

Definitions

  • a first object of the present invention is a DNA sequence SEQ ID NO: 1 containing the coding region of a plant AMP deaminase from Arabidopsis thaliana (see Figure 2).
  • the invention also relates to functionally equivalent DNA sequences which code for an AMP deaminase gene and which, based on the total length of the gene, have a sequence homology with the DNA sequence SEQ ID NO: 1 of 40 to 100%.
  • the expression can take place specifically in the leaves, in the seeds or in other parts of the plant.
  • Such transgenic plants, their reproductive material as well 10 whose plant cells, tissues or parts are a further subject of the present invention.
  • the expression cassette according to the invention can also be used to transform bacteria, cyanobacteria, yeasts, filamentous fungi and algae with the aim of producing sufficient amounts of the enzyme AMP-deaminase.
  • Another object of the invention is a protein from Arabidopsis thaliana characterized by the amino acid sequence SEQ ID NO: 2 or derivatives or parts of this protein with AMP deaminase activity. Compared to Saccharomyces cerevisiae, the homology at the amino acid level is 43-47% identity (see Figure 4).
  • Vegetable proteins with AMP deaminase activity with an amino acid sequence homology to the Arabidopsis thaliana AMP deaminase of 80-100% identity are particularly preferred.
  • AMP deaminase is a suitable target for herbicides.
  • the complete cDNA sequence of the AMP deaminase from Arabidopis thaliana is cloned into an expression vector (pQE, Qiagen) and overexpressed in E. coli (see Example 3).
  • the AMP deaminase protein expressed with the aid of the expression cassette according to the invention is particularly suitable for the detection of inhibitors specific for AMP deaminase.
  • test system Using the test system according to the invention, a large number of chemical compounds can be checked quickly and easily for herbicidal properties.
  • the method makes it possible to selectively reproducibly select those with great potency from a large number of substances, in order to subsequently carry out further in-depth tests known to the person skilled in the art.
  • the invention further relates to herbicides which can be identified using the test system described above.
  • the invention also relates to transgenic plants transformed with an expression cassette according to the invention, and to transgenic cells, tissues, parts and propagation material of such plants.
  • Transgenic crop plants such as e.g. Barley, wheat, rye, corn, soy, rice, cotton, sugar beet, canola, sunflower, flax, hemp, potato, tobacco, tomato, rapeseed, alfalfa, lettuce and the various tree, nut and wine species, as well as legumes.
  • increasing the inosine-5 '-phosphate (IMP) content means for at least the artificially acquired ability of an increased IMP biosynthesis by functional overexpression of the AMP deaminase gene in the plant compared to the non-genetically modified plant a generation of plants.
  • the sequencing of recombinant DNA molecules was carried out with a laser fluorescence DNA sequencer from ABI according to the method of Sanger (Sanger et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA74, 5463-5467). Fragments resulting from a polymerase chain reaction were sequenced and checked in order to avoid polymerase errors in constructs to be expressed.
  • RNA from plant tissues was isolated as in Logemann et al. ((1987) Anal. Biochem. 163, 21). For the analysis, 20 ⁇ g RNA were separated in a 1.5% agarose gel containing formaldehyde and transferred to nylon membranes (Hybond, Amersham). The detection of specific transcripts was carried out as described for Amasino ((1986) Anal. Biochem. 152,
  • the cDNA fragments used as a probe were radioactively labeled with a random primed DNA labeling kit (Boehringer, Mannheim) and hybridized according to standard methods (see Hybond user instructions, Amersham). Hyridization signals were visualized by autoradiography using X-OMAT AR films from Kodak.
  • the agrobacterial strain LBA4404 (Clontech) or other suitable strains can be used.
  • the vectors pUC19 Yanish-Perron, Gene 33 (1985), 103-119) pBluescript SK- (Stratagene), pGEM-T (Promega), pZerO (Invitrogen), pBinl9 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711-8720) and pBinAR (Höfgen and Willmitzer, Plant Science 66 (1990) 221-230).
  • the reaction mixtures contained 8 ng / ⁇ l genomic DNA from Escherichia coli, 0.5 ⁇ M of the corresponding oligonucleotides, 200 ⁇ M nucleotides (Pharmacia), 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8.3 at 25 ° C., 1.5 mM) MgCl 2 ) and 0.02 U / ⁇ l Taq polymerase (Perkin Elmer).
  • the amino acid sequence begins with the third base after the linker sequences (bold ends of the sequence in Figure 2) in the third reading frame and can be translated into an 860 amino acid polypeptide, or from the first methionine start codon into a polypeptide of 839 amino acids (see Figure 3). Alternatively, the methionine in position 46 can be used, so that a polypeptide of 824 amino acids would result.
  • oligonucleotide sequences were derived from the determined sequence and provided with a BamHI restriction site and two overhanging bases.
  • the oligonucleotides are underlined and numbered in Figure 2. Potential methionine start codons are shown in bold.
  • the PCR reaction mixtures contained 8 ng / ⁇ l pBS-AMPl DNA, 0.5 ⁇ M of the corresponding oligonucleotides, 200 ⁇ M nucleotides (Pharmacia), 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8.3 at 25 ° C., 1, 5 mM MgCl 2 ) and 0.02 U / ⁇ l Taq polymerase (Perkin Elmer).
  • the amplification conditions were set as follows:
  • nucleotides 11749-11939 was isolated as a PvuII-HindiII fragment and after addition of Sphl -Line cloned to the PvuII interface between the SpHI-HindIII interface of the vector.
  • the plasmid pBinAR was produced (Höfgen and Willmitzer (1990) Plant Science 66, 221-230).
  • the PCR fragments I, II and III were cloned into the BamHI site of the vector pBinAR in both orientations and used to transform tobacco plants.
  • Regenerated shoots are obtained on 2MS medium with kanamycin and claforan, transferred to soil after rooting and after cultivation for two weeks in a climatic chamber in a 16 hour light / 8 hour dark rhythm at 60% humidity for foreign gene expression or altered metabolite contents and phenotypic 18th

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft eine DNA codierend für ein Polypeptid mit AMP-Deaminase (EC 3.5.4.6, Adenosintriphosphat Aminohydrolase) Aktivität. Zudem betrifft die Erfindung die Verwendung dieser Nukleinsäure zur Herstellung eines Testsystems.

Description

AMP-Deaminase
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft eine DNA codierend für ein Polypeptid mit AMP-Deaminase (EC 3.5.4.6, Adenosintriphosphat Aminohydrolase) Aktivität. Zudem betrifft die Erfindung die Verwendung einer Nukleinsäure kodierend für ein Protein mit AMP-Deami- nase-Aktivität pflanzlichen Ursprungs zur Herstellung eines Test- systems zur Identifizierung von Inhibitoren der AMP-Deaminase. Weiterhin betrifft die Erfindung die Verwendung der Nukleinsäure kodierend für pflanzliche AMP-Deaminase zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhter Resistenz gegenüber Inhibitoren der AMP- Deaminase.
Pflanzen sind in der Lage, aus Kohlendioxid, Wasser und anorganischen Salzen ihre Zellkomponenten zu synthetisieren.
Dieser Prozeß ist nur möglich, indem biochemische Reaktionen zum Aufbau organischer Substanzen genutzt werden. Pflanzen müssen auch die Nukleotide als Bestandteile der Nukleinsäuren de-novo synthetisieren.
Es ist anzunehmen, daß die effiziente Bildung, Nutzung und Verteilung der Nukleotide die Zellteilung und das Wachstum einer Pflanze stark beeinflussen. Da Pflanzen auf einen funktionierenden Nukleotidstoffwechsel angewiesen sind, bietet sich dieser Stoffwechsel als mögliches Ziel für den Einsatz von Herbiziden an. Einige bekannte Wirkstoffe (z.B. 5' -Phosphohydantocidin, Ala- nosin oder Hadacidin) inhibieren die Adenylosuccinat Synthe- tase(Stayton et al . , 1983, Curr. Top. Cell. Regul . , 22, 103-141; Siehl et al., 1996, Plant Physiol., 110, 753-758). Die von der Adenylosuccinat Synthetase katalysierte Reaktion ist in Abbildung 1 dargestellt. Hydantocidin wirkt dabei als Prodrug. Der Wirkstoff wird in planta durch Phosphorylierung an der 5'OH-Gruppe zum Herbizid metabolisiert (Siehl et al., 1996, Plant Physiol., 110, 753-758) .
Neben den Enzymreaktionen der de novo Purinbiosynthese (z.B. Adenylosuccinat Synthetase) sind auch Recycling Prozesse und Abbau - mechanismen ein wichtiges Prinzip zur Regulation des Nukleotidstoffwechseis . Eine besondere Stellung nimmt allerdings die AMP Deaminase ein. So kann auch AMP (Adenosinmonophospat) wieder zu IMP (Inosin-5' -phosphat) deaminiert werden. Das Enzym katalysiert folgende Reaktion: 2
AMP + H20 < — > IMP + NH4
Das Protein wurde aus verschiedenen Pflanzen partiell angereinigt und regulatorische Eigenschaften untersucht, so z.B. aus Spinat- blättern (Yoshino und Murakami, 198, Z. Pflanzenphysiologie, 99, S. 331-338), Topinambur-Jerusalem Artischocken (Le Floc'h und La- fleuriel, 1983, Physiologie Vergetale, 21 (1), 15-2), Erbsensamen (Turner und Turner, 1961, Biochem. J. 79, 143) und Zellkulturen von Catharantus roseus, kleines Immergrün (Yabuki et al. 1992, Phytochemistry, 31 (6), 1905-1909). Dabei scheint dem Enzym eine zentrale Rolle in der Regulation des Adenylatpools einer Zelle zuzukommen (Chapman und Atkinson, 1973, J. Biol. ehem., 248, 8309; Solano und Coffee,1978; Yoshino et al., 1979).
Es konnte gezeigt werden, daß der bekannte Naturstoff Coformycin herbizide Wirkung auf Pflanzen zeigt, und daß der Wirkstoff in seiner phosphorylierten Form (5 '-Phosphocoformycin) der eigentliche Inhibitor der AMP-Deaminase ist (Frieden et al., 1980, Biochem. 5303; Merkler et al., 1990, Biochem. 29, 8358-8364; Dancer et al., 1997, Plant Physiol., 114 (1), 119-129). Die Patentschrift WO 96/01326 beschreibt eine Methode zur Suche nach Herbiziden in einem AMP-Deaminase Enzymtest (siehe auch: Pillmoor Pe- stic. Sei., 1998, 52, 75-80).
Gene, die für AMP-Deaminasen kodieren, wurden aus vielen Organismen isoliert. In Säugern scheinen Genfamilien der AMP-Deaminase vorzuliegen (Morisaki et al. 1990, J. Biol. Chem. 265 (20), 11482-11486). Weitere codierende Sequenzen wurden aus Schizosac- charomyces pombe (accession P50998) und Saccharomyces cerevisiae (accession P15274) isoliert. Aus Bakterien sind lediglich Adenin- Deaminasen bekannt, AMP-Deaminasen konnten nicht isoliert werden. Durch Sequenzvergleiche lassen sich "expressed-sequence-tags" sogenannte est-Sequenzen aus Reis (GenBank Acc: C26026) und Arabi- dopsis (T21250) mit Ähnlichkeit zu Hefe AMP -Deaminasen finden. Vollständige cDNA Sequenzen pflanzlicher AMP-Deaminasen sind bisher nicht beschrieben worden.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war die Isolierung einer vollständigen pflanzlichen cDNA kodierend für das Enzym AMP-Deaminase und deren funktioneile Expression in bakteriellen oder eukaryon- tischen Zellen zur einfachen und kostengünstigen Gewinnung des Enzyms für die Durchführung von Inhibitor-Enzym-Bindungsstudien.
Weitere Aufgabe der Erfindung war die Überexpression des AMP-Dea- minase Gens in Pflanzen zur Herstellung von Pflanzen, die tolerant gegenüber Inhibitoren der AMP-Deaminase sind. 3
Die Aufgabe wurde gelöst durch Isolierung des für das pflanzliche^ Enzym AMP-Deaminase kodierende Gen, sowie dessen funktioneile Expression in bakteriellen oder pflanzlichen Zellen bzw. Pflanzen.
Ein erster Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine DNA-Sequenz SEQ ID NO:l enthaltend die Kodierregion einer pflanzlichen AMP-Deaminase aus Arabidopsis thaliana (siehe Abbildung 2).
Weiterer Gegenstand der Erfindung sind DNA-Sequenzen, die von dieser SEQ ID NO:l abgeleitet sind oder mit dieser hybridisieren und die für ein Protein kodieren, das die biologische Aktivität einer AMP-Deaminase besitzt.
Gegenstand der Erfindung sind auch Expressionskassetten, deren Sequenz für eine AMP-Deaminase aus Arabidopsis thaliana oder deren funktionelles Äquivalent kodieren. Die Nukleinsäuresequenz kann dabei z.B. eine DNA- oder eine cDNA-Sequenz sein.
Die erfindungsgemäßen Expressionskassetten beinhalten außerdem regulative Nukleinsäuresequenzen, welche die Expression der kodierenden Sequenz in der Wirtszelle steuern. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt eine erfindungsgemäße Expressionskassette stromauf ärts, d.h. am 5 '-Ende der kodierenden Sequenz, einen Promotor und stromabwärts, d.h. am 3 '-Ende, ein Polyadeny- lierungssignal und gegebenenfalls weitere regulatorische Elemente, welche mit der dazwischenliegenden kodierenden Sequenz für das AMP-Deaminase-Gen operativ verknüpft sind. Unter einer operativen Verknüpfung versteht man die sequenzielle Anordnung von Promotor, kodierender Sequenz, Terminator und ggf. weiterer regu- lativer Elemente derart, daß jedes der regulativen Elemente seine Funktion bei der Expression der kodierenden Sequenz bestimmungsgemäß erfüllen kann.
Die Herstellung einer erfindungsgemäßen Expressionskassette er- folgt durch Fusion eines geeigneten Promotors mit einer geeigneten AMP-Deaminase-DNA Sequenz und einem Polyadenylierungssignal nach gängigen Rekombinations- und Klonierungstechniken, wie sie beispielsweise in T. Maniatis, E.F. Fritsch und J. Sambrook, Mo- lecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labora- tory, Cold Spring Harbor, NY (1989) sowie in T.J. Silhavy, M.L. Berman und L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) und in Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience (1987) beschrie- ben sind. 4
Insbesondere bevorzugt sind Sequenzen, die ein Targeting in den Apoplasten, in Piastiden, die Vakuole, das Mitochondrium, das En- doplasmatische Retikulum (ER) oder durch ein Fehlen entsprechender operativer Sequenzen einen Verbleib im Kompartiment des Ent- Stehens, dem Zytosol, gewährleisten (Kermode, Crit. Rev. Plant Sςi. 15, 4 (1996), 285-423).
Beispielhaft kann die pflanzliche Expressionskassette in den Tabak-Transformationsvektor pBinAR-Hyg eingebaut werden (siehe Bei- spiel 5) .
Als Promotoren der erfindungsgemäßen Expressionskassette ist grundsätzlich jeder Promotor geeignet, der die Expression von Fremdgenen in Pflanzen steuern kann. Vorzugsweise verwendet man insbesondere einen pflanzlichen Promotor oder einen Promotor, der einem Pflanzenvirus entstammt. Insbesondere bevorzugt ist der CaMV 35S-Promotor aus dem Blumenkohl-Mosaik-Virus (Franck et al., Cell 21(1980) 285-294). Dieser Promotor enthält unterschiedliche Erkennungssequenzen für transkriptionale Effektoren, die in ihrer Gesamtheit zu einer permanenten und konstitutiven Expression des eingeführten Gens führen (Benfey et al., EMBO J. 8 (1989) 2195-2202).
Die erfindungsgemäße Expressionskassette kann auch einen chemisch induzierbaren Promotor enthalten, durch den die Expression des exogenen AMP-Deaminase-Gens in der Pflanze zu einem bestimmten Zeitpunkt gesteuert werden kann. Derartige Promotoren wie z.B. der PRPl-Promotor (Ward et al., Plant.Mol. Biol.22 ( 1993) , 361-366), ein durch Salizylsäure induzierbarer Promotor (WO 95/1919443), ein durch Benzenesufonamid-induzierbarer
(EP 388186), ein durch Tetrazyklin-induzierbarer (Gatz et al., (1992) Plant J. 2,397-404), ein durch Abscisinsäure-induzierbarer (EP335528) bzw. ein durch Ethanol- oder Cyclohexanon-induzierba- rer (W09321334) Promotor sind in der Literatur beschrieben und können u.a. verwendet werden.
Weiterhin sind insbesondere solche Promotoren bevorzugt, die die Expression in Geweben oder Pflanzenteilen sicherstellen, in denen die Biosynthese von Purinen bzw. dessen Vorstufen stattfindet. Insbesondere zu nennen sind Promotoren, die eine blattspezifische Expression gewährleisten. Zu nennen sind der Promotor der cytoso- lischen FBPase aus Kartoffel oder der ST-LSI Promotor aus Kartoffel (Stockhaus et al., EMBO J. 8 (1989) 2445-245).
Mit Hilfe eines samenspezifischen Promotors kann ein Fremdprotein stabil bis zu einem Anteil von 0,67% des gesamten löslichen Samenproteins in den Samen transgener Tabakpflanzen exprimiert wer- 5 den (Fiedler und Conrad, Bio/Technology 10(1995), 1090-1094). Die- erfindungsgemäße Expressionskassette kann daher beispielsweise einen samenspezifischen Promotor (bevorzugt den Phaseolin-Promo- tor, den USP- oder LEB4-Promotor) , das LEB4-Signalpeptid, das zu exprimierende Gen und ein ER-Retentionssignal enthalten.
Viele Leguminosen transportieren fixierten Stickstoff in Form von Ureiden aus den Knöllchen in die oberirdischen Gewebe (Schubert, 1986, Ann. Rev. Plant Phys. 37, 539-574). Ureide werden über die Purinbiosynthese gebildet. Mithilfe eines Nodien-(Knöllchen-) spezifischen Promotors kann in Leguminosen spezifisch die AMP-Deaminase-Expression und damit die Ureidbiosynthese modifiziert werden. Erfindungsgemäße Genexpressionskassetten können dementsprechend den Promotor der Phosphoribosylpyrophosphat Amido- transferase aus Glycine max (siehe auch Genbank Accession Nummer U87999) oder einen anderen Nodien-spezifischen Promotor wie in EP 249676 beschrieben beinhalten.
Die inserierte Nukleotid-Sequenz kodierend für eine AMP-Deaminase kann synthetisch hergestellt oder natürlich gewonnen sein oder eine Mischung aus synthetischen und natürlichen DNA-Bestandteilen enthalten. Im allgemeinen werden synthetische Nukleotid-Sequenzen mit Kodons erzeugt, die von Pflanzen bevorzugt werden. Diese von Pflanzen bevorzugten Kodons können aus Kodons mit der höchsten Proteinhäufigkeit bestimmt werden, die in den meisten interessanten Pflanzenspezies exprimiert werden. Bei der Präparation einer Expressionskassette können verschiedene DNA-Fragmente manipuliert werden, um eine Nukleotid-Sequenz zu erhalten, die zweckmäßigerweise in der korrekten Richtung liest und die mit einem korrekten Leseraster ausgestattet ist. Für die Verbindung der DNA-Fragmente miteinander können an die Fragmente Adaptoren oder Linker angesetzt werden.
Die Sequenzhomologie zwischen AMP-Deaminase aus Hefe und aus Pflanze beträgt auf DNA-Ebene bezogen auf einen ausgewählten hoch homologen Teilbereich 57%, z.B. in der Region von Base 1345-2715 der Sequenz M30449 (Genbank Accession Number), erstellt mithilfe des BLAST Programms (Altschul et al.,(1990), J. Mol. Biol. :215:403-419;Gish and States, ( 1993 ) , Nature Genet. §:266-272). Im beschriebenen Teilfragment sind Teilbereiche von 20-30 Nukleotiden so homolog, daß eine ausreichende Erfolgswahrscheinlichkeit für ein Oligonukleotid-gestütztes Screening nach AMP-Deaminase aus anderen Pflanzen besteht. Methoden der Hybridisierung mit kurzen Oligonukleotiden zur Erfassung von zu detek- tierenden DNA-Sequenzen, die nur in kleinen Bereichen eine gute Homologie zur Vergleichsequenz haben, sind in Sambrook et al. 6
(1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-309-6) beschrieben.
Gegenstand der Erfindung sind auch funktioneil äquivalente DNA- Sequenzen, die für ein AMP-Deaminase-Gen kodieren und die bezogen auf die Gesamtlänge des Gens eine Sequenzhomologie mit der DNA- Sequenz SEQ ID NO: 1 von 40 bis 100 % aufweisen.
Bevorzugter Gegenstand der Erfindung sind funktioneil äquivalente DNA-Sequenzen, die für ein AMP-Deaminase-Gen kodieren und die bezogen auf die Gesamtlänge des Gens eine Sequenzhomologie mit der DNA-Sequenz SEQ ID NO: 1 von 60 bis 100 % aufweisen.
Besonders bevorzugter Gegenstand der Erfindung sind funktioneil äquivalente DNA-Sequenzen, die für ein AMP-Deaminase-Gen kodieren und die bezogen auf die Gesamtlänge des Gens eine Sequenzhomologie mit der DNA-Sequenz SEQ ID NO: 1 von 80 bis 100 % aufweisen.
Funktioneil äquivalente Sequenzen, die für ein AMP-Deaminase-Gen kodieren, sind erfindungsgemäß solche Sequenzen, welche trotz abweichender Nukleotidsequenz noch die gewünschten Funktionen besitzen. Funktionelle Äquivalente umfassen somit natürlich vorkommende Varianten der hierin beschriebenen Sequenzen sowie künstliche, z.B. durch chemische Synthese erhaltene, an den Kodon-Ge- brauch einer Pflanze angepaßte, künstliche Nukleotid-Sequenzen.
Unter einem funktioneilen Äquivalent versteht man insbesondere auch natürliche oder künstliche Mutationen einer ursprünglich isolierten für eine AMP-Deaminase kodierende Sequenz, welche wei- terhin die gewünschte Funktion zeigen. Mutationen umfassen Substitutionen, Additionen, Deletionen, Vertauschungen oder Inser- tionen eines oder mehrerer Nukleotidreste. Somit werden beispielsweise auch solche Nukleotidsequenzen durch die vorliegende Erfindung mit umfaßt, welche man durch Modifikation dieser Nu- kleotidsequenz erhält. Ziel einer solchen Modifikation kann z.B. die weitere Eingrenzung der darin enthaltenen kodierenden Sequenz oder z.B. auch die Einfügung weiterer Restriktionsenzym-Schnittstellen sein.
Funktionelle Äquivalente sind auch solche Varianten, deren Funktion, verglichen mit dem Ausgangsgen bzw. Genfragment, abgeschwächt oder verstärkt ist.
Außerdem sind artifizielle DNA-Sequenzen geeignet, solange sie, wie oben beschrieben, die gewünschte Eigenschaft der Erhöhung des IMP-Gehaltes in der Pflanze durch Überexpression des AMP-Deami- nase-Gens in Kulturpflanzen vermitteln. Solche artifiziellen DNA- 7 Sequenzen können beispielsweise durch Rückübersetzung mittels Mo- £ lecular Modelling konstruierter Proteine, die AMP-Deaminase-Akti- vität aufweisen oder durch in vitro-Selektion ermittelt werden. Besonders geeignet sind kodierende DNA-Sequenzen, die durch Rück- Übersetzung einer Polypeptidsequenz gemäß der für die Wirtspflanze spezifischen Kodon-Nutzung erhalten wurden. Die spezifische Kodon-Nutzung kann ein mit pflanzengenetischen Methoden vertrauter Fachmann durch Computerauswertungen anderer, bekannter Gene der zu transformierenden Pflanze leicht ermitteln.
Als weitere erfindungsgemäße geeignete äquivalente Nukleinsäure- Sequenzen sind zu nennen Sequenzen, welche für Fusionsproteine kodieren, wobei Bestandteil des Fusionsproteins ein pflanzliches AMP-Deaminase -Polypeptid oder ein funktionell äquivalenter Teil davon ist. Der zweite Teil des Fusionsproteins kann z.B. ein weiteres Polypeptid mit enzymatischer Aktivität sein oder eine anti- gene Polypeptidsequenz mit deren Hilfe ein Nachweis auf AMP-Deaminase -Expression möglich ist (z.B. myc-tag oder his-tag) . Bevorzugt handelt es sich dabei jedoch um eine regulative Protein- sequenz, wie z.B. ein Signal- oder Transitpeptid, das das AMP- Deaminase-Protein an den gewünschten Wirkort leitet.
Zweckmäßigerweise sollten die erfindungsgemäßen Promotor- und die Terminator-Regionen in Transkriptionsrichtung mit einem Linker oder Polylinker, der eine oder mehrere Restriktionsstellen für die Insertion dieser Sequenz enthält, versehen werden. In der Regel hat der Linker 1 bis 10, meistens 1 bis 8, vorzugsweise 2 bis 6 Restriktionsstellen. Im allgemeinen hat der Linker innerhalb der regulatorischen Bereiche eine Größe von weniger als 100 bp, häufig weniger als 60 bp, mindestens jedoch 5 bp. Der erfindungsgemäße Promotor kann sowohl nativ bzw. homolog als auch fremdartig bzw. heterolog zur Wirtspflanze sein. Die erfindungsgemäße Expressionskassette beinhaltet in der 5 ' -3 ' -Transkriptionsrichtung den erfindungsgemäßen Promotor, eine beliebige Sequenz und eine Region für die transkriptionale Termination. Verschiedene Terminationsbereiche sind gegeneinander beliebig austauschbar.
Ferner können Manipulationen, die passende Restriktionsschnittstellen bereitstellen oder die überflüssige DNA oder Restrikti- onsschnittstellen entfernen, eingesetzt werden. Wo Insertionen, Deletionen oder Substitutionen wie z.B. Transitionen und Transversionen in Frage kommen, können in vitro-Mutagenese, "primerre- pair", Restriktion oder Ligation verwendet werden. Bei geeigneten Manipulationen, wie z.B. Restriktion, "chewing-back" oder Auffül- len von Überhängen für "bluntends", können komplementäre Enden der Fragmente für die Ligation zur Verfügung gestellt werden. 8
Von besonderer Bedeutung für den erfindungsgemäßen Erfolg ist das - Anhängen des spezifischen ER-Retentionssignals SEKDEL (Schouten, A. et al. Plant Mol. Biol. 30 (1996), 781 - 792), die durchschnittliche Expressionshöhe wird damit verdreifacht bis vervier- facht. Es können auch andere Retentionssignale, die natürlicherweise bei im ER lokalisierten pflanzlichen und tierischen Proteinen vorkommen, für den Aufbau der Kassette eingesetzt werden.
Bevorzugte Polyadenylierungssignale sind pflanzliche Polyadeny- lierungssignale, vorzugsweise solche, die im wesentlichen T-DNA- Polyadenylierungssignale aus AgroJacteriu-m tumefaciens , insbesondere des Gens 3 der T-DNA (Octopin Synthase) des Ti-Plasmids pTiACH5 entsprechen (Gielen et al., EMBO J. 3 (1984) 835 ff) oder funktionelle Äquivalente.
Zur Transformation einer Wirtspflanze mit einer für eine AMP-Deaminase kodierenden DNA wird eine erfindungsgemäße Expressionskassette als Insertion in einen rekombinanten Vektor eingebaut, dessen Vektor-DNA zusätzliche funktioneile Regulationssignale, bei- spielsweise Sequenzen für Replikation oder Integration enthält. Geeignete Vektoren sind unter anderem in "Methods in Plant Mole- cular Biology and Biotechnology" (CRC Press), Kap. 6/7, S.71-119 beschrieben.
Die Übertragung von Fremdgenen in das Genom einer Pflanze wird als Transformation bezeichnet. Es werden dabei die beschriebenen Methoden zur Transformation und Regeneration von Pflanzen aus Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen zur transienten oder stabilen Transformation genutzt. Geeignete Methoden sind die Protoplasten- transformation durch Polyethylenglykol-induzierte DNA-Aufnähme, der biolistische Ansatz mit der Genkanone, die Elektroporation, die Inkubation trockener Embryonen in DNA-haltiger Lösung, die Mikroinjektion und der durch Agrobacterium vermittelte Gentransfer. Die genannten Verfahren sind beispielsweise in B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, herausgegeben von S.D. Kung und R. Wu, Academic Press (1993) 128-143 sowie in Potrykus An- nu.Rev.Plant Physiol.Plant Molec.Biol. 42 (1991) 205-225) beschrieben. Vorzugsweise wird das zu exprimierende Konstrukt in einen Vektor kloniert, der geeignet ist, AgroJbaσter u-m turne fa- ciens zu transformieren, beispielsweise pBinl9 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711).
Mit einer erfindungsgemäßen Expressionskassette transformierte Agrobakterien können ebenfalls in bekannter Weise zur Transformation von Pflanzen, insbesondere von Kulturpflanzen, wie Getreide, Mais, Soja, Reis, Baumwolle, Zuckerrübe, Canola, Sonnenblume, 9
Flachs, Hanf, Kartoffel, Tabak, Tomate, Raps, Alfalfa, Salat und - den verschiedenen Baum-, Nuß- und Weinspezies sowie Leguminosen verwendet werden, z.B. indem verwundete Blätter oder Blattstücke in einer Agrobakterienlösung gebadet und anschließend in geeigne- ten Medien kultiviert werden.
Der Biosyntheseort von Purinen ist im allgemeinen das Blattgewebe, so daß eine blattspezifische Expression des AMP-Deaminase -Gens sinnvoll ist. Es ist jedoch naheliegend, daß die Purin-Bio- Synthese nicht auf das Blattgewebe beschränkt sein muß, sondern auch in allen übrigen Teilen der Pflanze beispielsweise in fetthaltigen Samen - gewebespezifisch erfolgen kann.
Viele Leguminosen transportieren fixierten Stickstoff in Form von Ureiden aus den Knöllchen in die oberirdischen Gewebe (Schuber, 1986, Ann. Rev. PlantPhys. 37,539-574). Ureide werden über die Purinbiosynthese bebildet. Mithilfe eines Nodien-(Knöllchen-) spezifischen Promotors kann in Leguminosen spezifisch die AMP-Deaminase-Expression und damit die Ureidbiosynthese odifi- ziert werden, z.B. unter Verwendung des Promotors der Phosphori- bosylpyrophosphat Amidotransferase aus Glycine max (siehe auch Genbank Accession Nummer U87999) oder unter Verwendung eines anderen Nodien-spezifischen Promotors (z.B. beschrieben in EP249676).
Darüberhinaus ist eine konstitutive Expression des exogenen AMP- Deaminase-Gens von Vorteil. Andererseits kann aber auch eine induzierbare Expression wünschenswert erscheinen.
Unter Verwendung der oben zitierten Rekombinations- und Klonie- rungstechniken können die erfindungsgemäßen Expressionskassetten in geeignete Vektoren kloniert werden, die ihre Vermehrung, beispielsweise in E. coli, ermöglichen. Geeignete Klonierungsvekto- ren sind u.a. pBR332, pUC-Serien, M13mp-Serien und pACYC184. Be- sonders geeignet sind binäre Vektoren, die sowohl in E. coli als auch in Agrobakterien replizieren können.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung einer erfindungsgemäßen Expressionskassette zur Transformation von Pflanzen, Pflanzenzellen, -geweben oder Pflanzenteilen. Vorzugsweise ist Ziel der Verwendung die Erhöhung des AMP-Deaminase Gehaltes in der Pflanze.
Dabei kann je nach Wahl des Promotors die Expression spezifisch in den Blättern, in den Samen oder anderen Teilen der Pflanze erfolgen. Solche transgenen Pflanzen, deren Vermehrungsgut sowie 10 deren Pflanzenzellen, -gewebe oder -teile sind ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Die erfindungsgemäße Expressionskassette kann darüberhinaus auch zur Transformation von Bakterien, Cyanobakterien, Hefen, filamen- tösen Pilzen und Algen mit dem Ziel der Herstellung von ausreichenden Mengen des Enzyms AMP-Deaminase eingesetzt werden.
Weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Protein aus Arabidopsis thaliana gekennzeichnet durch die Aminosäuresequenz SEQ ID NO:2 bzw. Derivate oder Teile dieses Proteins mit AMP-Deaminase Aktivität. Im Vergleich zu Saccharomyces cerevisiae beträgt die Homologie auf Aminosäureebene 43 - 47 % Identität (siehe Abbildung 4 ) .
Gegenstand der Erfindung sind auch pflanzliche Proteine mit AMP- Deaminase Aktivität mit einer Aminosäuresequenzhomologie zu der Arabidopsis thaliana AMP-Deaminase von 20 - 100 % Identität.
Bevorzugt sind pflanzliche Proteine mit AMP-Deaminase Aktivität mit einer Aminosäuresequenzhomologie zu der Arabidopsis thaliana AMP-Deaminase von 50 - 100 % Identität.
Besonders bevorzugt sind pflanzliche Proteine mit AMP-Deaminase Aktivität mit einer Aminosäuresequenzhomologie zu der Arabidopsis thaliana AMP-Deaminase von 80 - 100 % Identität.
Wie bereits erwähnt ist die AMP-Deaminase ein geeignetes Target für Herbizide. Um noch effizientere Hemmstoffe der AMP-Deaminase finden zu können, ist es notwendig, geeignete Testsysteme, mit denen Inhibitor-Enzym-Bindungsstudien durchgeführt werden können, zur Verfügung zu stellen. Hierzu wird beispielsweise die komplette cDNA-Sequenz der AMP-Deaminase aus Arabidopis thaliana in einen Expressionsvektor (pQE, Qiagen) kloniert und in E. coli überexprimiert (siehe Beispiel 3).
Das mit Hilfe der erfindungsgemäßen Expressionskassette expri- mierte AMP-Deaminase-Protein eignet sich besonders zur Auffindung von für die AMP-Deaminase spezifischen Hemmstoffen.
Dazu kann die AMP-Deaminase beispielsweise in einem Enzymtest eingesetzt werden, bei dem die Aktivität der AMP-Deaminase in An- und Abwesenheit des zu testenden Wirkstoffs ermittelt wird. Aus dem Vergleich der beiden Aktivitätsbestimmungen läßt sich eine qualitative und quantitative Aussage über das Hemmverhalten des zu testenden Wirkstoffes machen (siehe Beispiel 4). 11
Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Testsystems kann eine Vielzahl von chemischen Verbindungen schnell und einfach auf herbizide Eigenschaften überprüft werden. Das Verfahren gestattet es, reproduzierbar aus einer großen Anzahl von Substanzen gezielt solche mit großer Wirkstärke auszuwählen, um mit diesen Substanzen anschließend weitere, dem Fachmann geläufige vertiefte Prüfungen durchzuführen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Herbizide, die mit dem oben beschriebenen Testsystem identifizierbar sind.
Durch Überexpression der für eine AMP-Deaminase kodierenden Gensequenz Seq ID NO: 1 in einer Pflanze wird eine erhöhte Resistenz gegenüber Inhibitoren der AMP-Deaminase erreicht. Die derart her- gestellten transgenen Pflanzen sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung.
Die Wirksamkeit der Expression des transgen exprimierten AMP-Dea- minase-Gens kann beispielsweise in vitro durch Sproßmeristemver- mehrung oder durch einen Keimungstest ermittelt werden. Zudem kann eine in Art und Höhe veränderte Expression des AMP-Deami- nase-Gens und deren Auswirkung auf die Resistenz gegenüber Hemmstofen der AMP-Deaminase an Testpflanzen in Gewächshausversuchen getestet werden.
Gegenstand der Erfindung sind außerdem transgene Pflanzen, transformiert mit einer erfindungsgemäßen Expressionskassette, sowie transgene Zellen, Gewebe, Teile und Vermehrungsgut solcher Pflanzen. Besonders bevorzugt sind dabei transgene Kulturpflanzen, wie z.B. Gerste, Weizen, Roggen, Mais, Soja, Reis, Baumwolle, Zuckerrübe, Canola, Sonnenblume, Flachs, Hanf, Kartoffel, Tabak, Tomate, Raps, Alfalfa, Salat und die verschiedenen Baum-, Nuß- und Weinspezies, sowie Leguminosen.
Weiterer Gegenstand der Erfindung sind Pflanzen, die nach Expression der DNA-SEQ ID NO:l in der Pflanze einen erhöhten IMP-Gehalt aufweisen.
Erhöhung des inosin-5 ' -phosphat (IMP) -Gehaltes bedeutet im Rahmen der vorliegenden Erfindung die künstlich erworbene Fähigkeit einer erhöhten IMP- Biosyntheseleistung durch funktioneile Überexpression des AMP-Deaminase-Gens in der Pflanze gegenüber der nicht gentechnisch modifizierten Pflanze für die Dauer mindestens einer Pflanzengeneration. 12
Die Erfindung wird durch die nun folgenden Beispiele erläutert, ist aber nicht auf diese beschränkt:
Beispiele
A. Gentechnische Verfahren, die den Ausführungsbeispielen zugrunde liegen:
Allgemeine Klonierungsverfahren
Klonierungsverfahren wie z.B. RestriktionsSpaltungen, Agarose- Gelelektrophorese, Reinigung von DNA-Fragmenten, Transfer von Nukleinsäuren auf Nitrozellulose und Nylon Membranen, Verknüpfen von DNA-Fragmenten, Transformation von Escherichia coli Zellen, Anzucht von Bakterien und Sequenzanalyse rekombinanter DNA wurden wie bei Sambrook et al. (1989) (Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-309-6) beschrieben durchgeführt.
Sequenzanalyse rekombinanter DNA
Die Sequenzierung rekombinanter DNA-Moleküle erfolgte mit einem Laserfluoreszenz-DNA-Sequenzierer der Firma ABI nach der Methode von Sanger (Sanger et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sei. USA74, 5463-5467). Fragmente resultierend aus einer Polymerase Kettenre- aktion wurden zur Vermeidung von Polymerasefehlern in zu expri- mierenden Konstrukten sequenziert und überprüft.
Analyse von Gesamt-RNA aus pflanzlichen Geweben
Gesamt-RNA aus pflanzlichen Geweben wurde wie bei Logemann et al.((1987) Anal. Biochem. 163, 21) isoliert. Für die Analyse wurden jeweils 20 μg RNA in einem Formaldehyd-haltigen l,5%igen Aga- rosegel aufgetrennt und auf Nylon Membranen (Hybond, Amersham) überführt. Der Nachweis spezifischer Transkripte wurde wie bei Amasino beschrieben durchgeführt ((1986) Anal. Biochem. 152,
304). Die als Sonde eingesetzten cDNA-Fragmente wurden mit einem Random Primed DNA Labeling Kit (Boehringer, Mannheim) radioaktiv markiert und nach Standardmethoden hybrisiert (Siehe Hybond-Be- nutzerhinweise, Amersham). HyridisierungsSignale wurden durch Au- toradiographie mithilfe von X-OMAT AR Filmen der Fa. Kodak sichtbar gemacht.
Die im folgenden verwendeten Bakterienstämme (E. coli, XL-I Blue) wurden von Stratagene bzw. Pharmacia im Fall von NP66 bezogen. Der zur Pflanzentransformation verwendete Agrobakterienstamm (Agrobacterium tumefaciens, C58C1 mit dem Plasmid pGV2260 oder pGV3850kan) wurde von Deblaere et al. beschrieben (Nucl. Acids 13
Res. 13 (1985) 4777). Alternativ können auch der Agrobakterien- stamm LBA4404 (Clontech) oder andere geeignete Stämme eingesetzt werden. Zur Klonierung können die Vektoren pUC19 (Yanish-Perron, Gene 33(1985), 103-119) pBluescript SK- ( Stratagene ) , pGEM-T (Promega), pZerO (Invitrogen) , pBinl9 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12(1984) 8711-8720) und pBinAR (Höfgen und Willmitzer, Plant Science 66 (1990) 221-230) benutzt werden.
Beispiel 1
PCR-Amplifikation des AMP-Deaminase-Gens mit Hilfe synthetischer Oligonukleotide.
Der Arabidopsis est-Klon codierend für die AMP-Deaminase wurde über das Arabidopsis Biological Resource Center (Ohio State Uni- versity) bezogen. Es handelt sich dabei um einen partiellen cDNA Klon (T21250), der nicht dem Vollängentranskript der AMP-Deaminase entspricht. Eine PCR-Amplikation des Arabidopsis AMP-Deaminase Teilfragments wurde in einem DNA-Thermal Cycler der Firma Perkin Eimer durchgeführt. Die verwendeten Oligonukleotide
5 '-Primer CGAGATAGCTCGTAAC und 3' -PRIMER AGCCCACTCATATTATT wurden der ermittelten Sequenz entnommen. Die Reaktionsgemische enthielten 8 ng/μl genomische DNA aus Escherichia coli, 0,5 μM der entsprechenden Oligonukleotide, 200 μM Nukleotide (Pharmacia), 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8,3 bei 25°C, l,5mM MgCl2) und 0.02 U/μl Taq Polymerase (Perkin Eimer).
Die Amplifikationsbedingungen wurden wie folgt eingestellt:
Anlagerungstemperatur: 52°C, 1 min
Denaturierungstemperatur: 92°C, 1 min
Elongationstemperatur: 72°C, 1,5 min
Anzahl der Zyklen: 40
Das resultierende Fragment umfaßt einen kleinen Teil des est- Klons T21250, mit dessen Hilfe ein heterologes Screening einer Arabidopsis thaliana cDNA Bank durchgeführt wurde (Stratagene). Es wurden 3,0 x 105 Lambda Phagen der cDNA-Bibliothek aus Arabidopsis thaliana (Stratagene) auf Agarplatten mit E. coli XLI-Blue als Bakterienstamm ausplattiert. Die Phagen-DNA wurde mittels
Standardverfahren (Sambrook et al. (1989); Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0=87969-309-6) auf Nitrocellulosefilter (Gelman Sciences) überführt und auf den Filtern fixiert. Als Hy- bridisierungssonden diente das oben beschriebene PCR-Fragment, das mit Hilfe eines "Multiprime DNA labelling Systems" (Amersham Buchler) in Anwesenheit von α-32P-dCTP (spezifische Aktivität 3000 Ci/mmol) nach Herstellerangaben radioaktiv markiert wurden. 14
Die Hybridisierung der Membranen erfolgte nach Prähybridisierung ~ bei 60°C in 3 x SSPE, 0,1% Natriumdodecylsulfat (w/v), 0,02% Poly- vinylpyrolidon (w/v), 0,02% Ficoll 400 (w/v) und 50 mg/ml Kalb- sthymus DNA für 12-16 Stunden (Sambrook et al. (1989); Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-309-6). Anschließend wurden die Filter 60 Minuten in 2 x SSPE, 0,1% Natriumdodecylsulfat (w/v) bei 60°C gewaschen. Positiv hybridisierende Phagen wurden durch Autoradiographie sichtbar gemacht und durch Standardtechniken gereinigt und vereinzelt.
Beispiel 2
Sequenzanalyse der cDNA Klone codierend für ein Protein mit AMP- Deaminase Aktivität.
Es resultierten 64 cDNA Klone codierend für ein Polypeptid mit hohen Homologien zur AMP-Deaminase aus Hefe (siehe Abbildung 4). Die beiden längsten Klone sind identisch und zeigen im Restrikti- onsverdau ein 2880 Basenpaar langes EcoRl-Fragment. Dieser läng- ste Klon codierend für die AMP-Deaminase aus Arabidopsis thaliana wurde AMPl genannt. Das Plasmid beträgt die Bezeichnung pBS-AMPl. Die cDNA (siehe Abbildung 2) hat einen offenen Leseraster von 2578 Basenpaaren mit einem Stop-Codon in Position 2579-2581. Die Aminosäuresequenz beginnt mit der dritten Base nach den Linker- Sequenzen ( fett gedruckte Enden der Sequenz in Abbildung 2 ) im dritten Leseraster und kann in ein 860 Aminosäuren langes Polypeptid übersetzt werden, bzw. ab dem ersten Methionin-Startcodon in ein Polypeptid von 839 Aminosäuren (siehe Abbildung 3). Alternativ kann noch das Methionin in Position 46 benutzt werden, so- daß ein Polypeptid von 824 Aminosäuren resultieren würde.
Während in Hefe die Proteinaktivität zytosolisch lokalisiert ist, wurde in Pflanzen eine zytosolische und eine potentiell mitochon- driale Aktivität beschrieben (Yoshino und Murakami, 198, Z. Pflanzenphysiologie, 99, S. 331-338). Aufgrund des Leserasters der vorliegenden cDNA Sequenz läßt sich ableiten, daß es sich möglicherweise um die mitochondriale Form oder die zytosolische Form handeln könnte, die wahlweise durch Nutzung verschiedener Startcodons entstehen können. Es ist auffallend, daß mit Beginn des Leserasters ab Base 3 der codierenden Sequenz eine hohe Zahl hydrophiler Serin- und Threoninreste abwechselnd mit aliphati- schen Aminosäureresten vor den Methionincodons präsent sind, was auf eine Transitsequenz für Mitochondrien oder Piastiden hindeutet. Allgemein wird angenommen, daß die Purinbiosynthese im Pla- stiden abläuft. Kürzlich wurde aber gezeigt, daß die Enzyme der Purinbiosynthese auch in Mitochondrien lokalisiert sind (At- kins et al. 1997, Plant Physiol. 113, 127-135). Aufgrund des Le- 15 serasters der vorliegenden cDNA Sequenz liegt die Annahme nahe, daß es sich möglicherweise um die mitochondriale, plästidäre oder die zytosolische Form handeln könnte, die wahlweise durch Nutzung verschiedener Startcodons entsteht. Die beiden längsten Klone zeigen einen durchgängigen offenen Leseraster mit zwei potentiellen Startcodons am N-Terminus. Verglichen mit der Hefesequenz ist das zweite Startcodon ca. an der Position, an der auch die Hefesequenz beginnt (siehe Abbildung 4). Über die gesamt Proteinlänge ist die pflanzliche Sequenz ca. 59-63% ähnlich zur Hefesequenz und ca. 43-47% identisch je nach Wahl der Vergleichsparameter
(Lasergene Software, Programm MegAlign) . Dabei fällt auf, daß der N-Terminus der pflanzlichen AMP-Deaminase nur schwache Homologie im Gegensatz zum C-Terminus der Hefesequenz aufweist.
Beispiel 3
Erzeugung von Überexpressionsvektoren in E. coli
Es wurden aus der ermittelten Sequenz folgende Oligonukleotidse- quenzen abgeleitet und mit einer BamHI-Restriktionsschnittstelle sowie zwei überhängenden Basen versehen. Die Oligonukleotide sind in Abbildung 2 unterstrichen und numeriert. Potentielle Methionin Startcodons sind fett dargestellt.
1. 5 '-Primer aaggatccATGTTACTCTCTCTTCTGAG,
2. 5 ' -Primer aaggatccATGGAACCCAATATTTAC,
3. 5 '-Primer aaggatccATGCATTTCAAGGCAC,
4. 3 '-Primer aaggatccTTATGGAACAACTTCATCAG,
Die Verwendung der drei verschiedenen 5 ' -Primer in Kombination mit dem 3 ' -Primer führen zu unterschiedlich langen PCR-Produkten (Fragment I, II, III), die dem vollständigen Leserahmen (Fragment I, Primer 1 + 4 ) , der Sequenz ab dem ersten Met-Startcodon (Fragment II, Primer 2 +4) bzw. dem zweiten Startcodon (Fragment III, 3 + 4) entsprechen.
Die PCR-Reaktionsgemische enthielten 8 ng/μl pBS-AMPl DNA, 0,5 μM der entsprechenden Oligonukleotide, 200 μM Nukleotide (Pharmacia), 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8,3 bei 25°C, 1,5 mM MgCl2) und 0.02 U/μl Taq Polymerase (Perkin Eimer). Die Amplifikations- bedingungen wurden wie folgt eingestellt:
Anlagerungstemperatur: 52°C, 1 min
Denaturierungstemperatur: 92°C, 1 min Elongationstemperatur: 72°C, 2,5 min 16
Anzahl der Zyklen: 30
Die PCR-Fragmente wurden in die Überexpressionsvektoren pET15b, pETlla und pQE9 kloniert und zur Proteinproduktion mittels IPTG- 5 Induktion nach Standardmethoden eingesetzt, (siehe Handbuch: The Quiaexpressionist(1992) , Fa.Quiagen, Hilden).
Beispiel 4
10 Enzymassay der pflanzlichen AMP-Deaminase aus E.coli mittels Überexpressionskulturen
E.coli wurde mittels Druckaufschlußverfahrens an der French Press unter Maximaldruck in einer 20 ml Druckkammer oder mithilfe einer
15 Glaskugelmühle (IMA-Desintegrator) aufgeschlossen. 10 ml Puffer (0,1M KH2P04; pH 7,5; 0,4M Saccharose, 0,1 mM DTT) werden pro 1 g Zellpellet verwendet. Durch Zugabe der 2,5 fachen Menge an Glasperlen (d=0,5mm) wird das Pellet in der Glaskugelmühle 20 min bei 4°C und 2500rpm aufgeschlossen. Der Aufschluß wird bei 4°C und
20 100.000g für 20 Minuten zentrifugiert. Die Bestimmung der Enzymaktivität wurde in einem photometrischen Assay durch Messung bei 260 nm an einem Photometer (Uvikon 933, Kontron) durchgeführt. Die Wahl der Überexpressionsvektoren ermöglichte auch eine Aufreinigung der AMP-Deaminase über den Histidin-Anker nach Stan-
25 dardmethoden in einem Schritt zur Homogenität, wenn DTT im Aufschlußpuffer weggelassen wurde (vergl. auch Handbuch: The Quiaex- pressionist,Fa. Quiagen, Hilden).
Das Homogenat wurde in folgendem Medium durch Dialyse in 40 mM 30 Citrat, pH 6,5 (eingestellt mit 5 N NaOH), 0,05% BSA (w/v), 100 mM KCl umgepuffert.
Je 10-100μl der umgepufferten Enzymfraktion wurden auf 700 μl mit Puffer aufgefüllt und durch Zugabe von lOOμl einer 1 mM AMP-Lö-
35 sung, 0,5mM ATP-Lösung und lμM Diadenosin-pentaphosphat-Lösung die Extinktionsabnahme über 2-10 min gegen eine Referenzküvette mit 700 μl Reaktionspuffer und 100 μl eines Proteinhomogenats un- transformierter E. coli Kultur gemessen. Es wurden gleiche Mengen Gesamtprotein für die Messungen der Referenz gegen den Meßwert
40 eingesetzt.
Beispiel 5
Erzeugung pflanzlicher Expressionskassetten 45 17
In das Plasmid pBinl9 (Bevan et al. (1980) Nucl. Acids Res. 12, ~ 8711) wurde ein 35S CaMV Promotor als EcoRl-Kpnl-Fragment (entsprechend den Nukleotiden 6909-7437 des Cauliflower-Mosaik-Virus (Franck et al. (1980) Cell 21, 285)) inseriert. Das Polyadenylie- rungssignal des Gens 3 der T-DNA des Ti-Plasmides pTiACH5 (Gielen et al., (1984) EMBO J. 3, 835), Nukleotide 11749-11939 wurde als PvuII-HindiII-Fragment isoliert und nach Addition von Sphl-Lin- kern an die PvuII-Schnittstelle zwischen die SpHI-Hindlll Schnittstelle des Vektors kloniert. Es entstand das Plasmid pBi- nAR (Höfgen und Willmitzer (1990) Plant Science 66, 221-230). Die PCR-Fragmente I, II und III (siehe oben) wurden in die BamHl- Schnittstelle des Vektors pBinAR in beiden Orientierungen kloniert und zur Transformation von Tabakpflanzen eingesetzt.
Die resultierenden Plasmide tragen die Bezeichnungen pBinAMP-20, pBinαAMP-0, pBinAMP-0, pBinαAMP-0, pBinAMP+26, pBintxAMP+26 und entsprechen den in Beispiel 3 beschriebenen Fragmenten I, II, III aus oben beschriebenen PCR-Ansätzen.
Beispiel 6
Herstellung transgener Tabakpflanzen
Die Plasmide pBinAMP-20, pBinαAMP-20, pBinAMP-0, pBinαAMP-0, pBi- nAMP+26, pBinαAMP+26 wurden in Agrobacterium tumefaciens
C58Cl:pGV2260 transformiert (Deblaere et al, 1984, Nucl. Acids. Res. 13, 4777-4788). Zur Transformation von Tabakpflanzen (Nico- tiana tabacum cv. Samsun NN) wurde eine 1:50 Verdünnung einer Übernachtkultur einer positiv transformierten Agrobakterienkolo- nie in Murashige-Skoog Medium ((1962) Physiol. Plant. 15, 473) mit 2% Saccharose (2MS-Medium) benutzt. Blattscheiben steriler Pflanzen (zu je ca. 1 cm2) wurden in einer Petrischale mit einer 1:50 Agrobakterienverdünnung für 5-10 Minuten inkubiert. Es folgte eine 2-tägige Inkubation in Dunkelheit bei 25°C auf 2MS-Me- dium mit 0,8% Bacto-Agar. Die Kultivierung wurde nach 2 Tagen mit 16 Stunden Licht/8 Stunden Dunkelheit weitergeführt und in wöchentlichem Rhythmus auf MS-Medium mit 500 mg/1 Claforan (Cefota- xime-Natrium) , 50 mg/1 Kanamycin, 1 mg/1 Benzylaminopurin (BAP), 0,2 mg/1 Naphtylessigsäure und 1,6 g/1 Glukose weitergeführt. Wachsende Sprosse wurden auf MS-Medium mit 2% Saccharose, 250 mg/1 Claforan und 0,8% Bacto-Agar überführt.
Regenerierte Sprosse werden auf 2MS-Medium mit Kanamycin und Claforan erhalten, nach Bewurzelung in Erde überführt und nach Kul- tivierung für zwei Wochen in einer Klimakammer im 16 Stunden hell/8 Stunden dunkel-Rhythmus bei 60% Luftfeuchte auf Fremdgenexpression bzw. veränderte Metabolitgehalte und phänotypische 18
Wachstumsmerkmale untersucht. Veränderte Nukleotidgehalte können * z.B. nach der Methode von Stitt et al. (1982, FEBS Letters, 145, 217-222) bestimmt werden.
Beispiel 7
Zum Nachweis der Toleranz der AMP-Deaminase-überexprimierenden transgenen Tabakpflanzen gegen AMP-Deaminase Hemmstoffe wurden diese mit unterschiedlichen Mengen an Coformycin oder anderen AMP-Deaminase Hemmern behandelt. In allen Fällen konnte im Gewächshaus gezeigt werden, daß die eine AMP-Deaminase überexpri- mierenden Pflanzen im Vergleich zur Kontrolle eine Toleranz gegenüber den eingesetzten Hemmstoffen zeigen.

Claims

19Patentansprüche
1. DNA-Sequenz, enthaltend die Kodierregion einer pflanzlichen 5 AMP-Deaminase, dadurch gekennzeichnet, daß diese DNA-Sequenz die Nukleotidabfolge SEQ ID No:l aufweist.
2. DNA-Sequenzen, die mit der DNA-Sequenz SEQ ID NO: 1 gemäß Anspruch 1 oder Teilen davon oder Derivaten, die durch Inser-
10 tion, Deletion oder Substitution von diesen Sequenzen abgeleitet sind, hybridisieren und für ein Protein kodieren, das die biologische Aktiviät einer AMP-Deaminase besitzt.
3. Expressionskassette enthaltend regulatorische Nukleinsäurese- 15 quenzen und eine DNA-Sequenz gemäß Anspruch 1 oder 2.
4. Protein mit AMP-Deaminase-Aktivität, enthaltend eine Aminosäuresequenz, die eine Teilsequenz von mindestens 100 Aminosäuren aus SEQ ID NO: 2 darstellt.
20
5. Protein nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß es als Aminosäuresequenz die Teilsequenz 50-750 aus SEQ ID NO: 2 enthält.
25 6. Protein nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß es als Aminosäuresequenz die in SEQ ID NO: 2 dargestellte Sequenz enthält.
7. Bakterien, enthaltend eine DNA-Sequenz gemäß Anspruch 1 oder 30 2 oder Teilen davon oder Derivate, die durch Insertion, Deletion oder Substitution von diesen Sequenzen abgeleitet sind.
8. Hefen, enthaltend eine DNA-Sequenz gemäß Anspruch 1 oder 2 oder Teilen davon oder Derivaten, die durch Insertion, Dele-
35 tion oder Substitution von diesen Sequenzen abgeleitet sind.
9. Pflanzenzellen enthaltend eine Expressionkassette gemäß Anspruch 3.
40 10. Pflanzen enthaltend eine Expressionkassette gemäß Anspruch 3.
45 Abb. 20
11. Verwendung von DNA-Sequenzen gemäß Anspruch 1 oder 2 oder s Teilen oder Derivaten, die durch Insertion, Deletion oder Substitution von diesen Sequenzen abgeleitet sind, zur Einführung in pro- oder eukaryontische Zellen, wobei diese Se- 5 quenzen gegebenenfalls mit Steuerelementen, die die Transkription und Translation in den Zellen gewährleisten, verknüpft sind und zur Expression einer translatierbaren mRNA, die die Synthese einer AMP-Deaminase bewirkt, führen.
10 12. Verwendung der Expressionskassette gemäß Anspruch 3 zur Transformation von Pflanzen.
13. Verwendung der Expressionskassette gemäß Anspruch 3 zur Herstellung eines Testsystems zur Identifizierung von Inhibito-
15 ren der AMP-Deaminase.
14. Verwendung einer Pflanze enthaltend eine Expressionskassette gemäß Anspruch 3 zur Herstellung von AMP-Deaminase.
20 15. Verwendung der Expressionskassette gemäß Anspruch 3 zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhter Resistenz gegenüber Inhibitoren der AMP-Deaminase durch verstärkte Expression einer DNA-Sequenz gemäß Anspruch 1 oder 2.
25 16. Verwendung der Expressionskassette gemäß Anspruch 3 zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhtem Gehalt an IMP.
17. Testsystem basierend auf der Expression einer Expressionskassette gemäß Anspruch 3 zur Identifizierung von Inhibitoren
30 der AMP-Deaminase.
18. Herbizide Wirkstoffe, identifizierbar mittels eines Testsystems gemäß Anspruch 17.
35 19. Verfahren zur Transformation einer Pflanze dadurch gekennzeichnet, daß man eine Expressionskassette gemäß Anspruch 3 in eine Pflanzenzelle, in Kallusgewebe, eine ganze Pflanze oder Protoplasten von Pflanzenzellen einbringt.
40 20. Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhter Resistenz gegenüber Inhibitoren der AMP-Deaminase durch verstärkte Expression einer DNA-Sequenz gemäß Anspruch 1 oder 2.
21. Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhtem Gehalt an 45 IMP durch verstärkte Expression einer DNA-Sequenz gemäß Anspruch 1 oder 2. 21
22. Pflanze mit erhöhter Resistenz gegenüber Inhibitoren der AMP-^ Deaminase enthaltend eine Expressionskassette gemäß Anspruch 3.
23. Pflanze mit erhöhtem Gehalt an IMP enthaltend eine Expressionskassette gemäß Anspruch 3.
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