CN103805629B - 鼠灰链霉菌amp脱氨酶基因的毕赤酵母真核表达方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种鼠灰链霉菌AMP脱氨酶基因的毕赤酵母真核表达方法。该方法以鼠灰链霉菌基因组为模板，设计特异性引物扩增AMP脱氨酶基因序列，在其两端加入酶切位点和组氨酸标签，并亚克隆至组成型表达载体pGAP9K以构建重组质粒，酶切线性化后电转化毕赤酵母，筛选阳性克隆转化子，接种至发酵培养基进行液体发酵培养，取发酵液上清，即得AMP脱氨酶表达产物。本发明首次在毕赤酵母中成功表达了鼠灰链霉菌来源的AMP脱氨酶，实验结显示该重组酶具有较高的酶活，且酶活性稳定，易于纯化，可应用于食品、医药等领域，为AMP脱氨酶的工业化生产奠定了基础。
Description
技术领域
本发明涉及AMP脱氨酶基因的真核表达，具体涉及一种鼠灰链霉菌来源的AMP脱氨酶基因的真核表达方法及其表达产物的应用，属于分子生物学技术领域。
背景技术
AMP脱氨酶，英文名为AMP deaminase，简写为AMPD，是一种氨基水解酶，其可催化AMP使其脱去氨基生成肌苷酸（IMP）和NH3，IMP在食品以及制药等领域中有重要应用。另外，AMP脱氨酶是嘌呤核苷酸代谢循环中的三种主要酶类之一，对于维持机体免疫力和腺苷酸能荷具有重要作用。因此，AMP脱氨酶是工业生产中一种重要的酶。
AMP脱氨酶广泛存在于各种生物体内。其最早由鼠骨骼肌制备，随后又由人红血细胞制备，目前工业化生产中通常由酵母、霉菌等微生物发酵产AMP脱氨酶，但是在酶的提取纯化、酶活性以及稳定性等方面存在诸多问题。因此，利用DNA重组技术，将微生物来源的AMP脱氨酶基因在特定宿主中进行重组表达，可以有效改善上述问题。现在国内关于AMP脱氨酶基因重组表达的研究从未报道过，国外关于该酶的重组表达的研究较少，仅在申请号为CN200580013789.3的专利“放线菌来源的AMP脱氨酶及其应用”（申请人：天野酶株式会社）中报道过一次。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本申请人经过研究改进，提供一种鼠灰链霉菌AMP脱氨酶基因的真核表达方法。本发明首次在毕赤酵母中成功表达了鼠灰链霉菌来源的AMP脱氨酶，实验结显示该重组酶具有较高的酶活，且酶活性稳定。
本发明的技术方案如下：
鼠灰链霉菌AMP脱氨酶基因的毕赤酵母真核表达方法，其特征在于：以鼠灰链霉菌基因组为模板，设计特异性引物扩增AMP脱氨酶基因序列，在其两端加入酶切位点和组氨酸标签，并亚克隆至组成型表达载体pGAP9K以构建重组质粒，酶切线性化后电转化毕赤酵母，筛选阳性克隆转化子，接种至发酵培养基进行液体发酵培养，取发酵液上清，即得AMP脱氨酶表达产物。
具体地，所述方法步骤如下：
（1）鼠灰链霉菌AMP脱氨酶基因的克隆
以鼠灰链霉菌基因组为模板，以序列为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的引物对通过PCR特异性扩增AMP脱氨酶基因，在其两端均加入EcoRI酶切位点和组氨酸标签，纯化回收PCR产物；
(2）重组表达载体的构建
将组成型表达载体pGAP9K和步骤（1）所得PCR产物分别用EcoRI酶切纯化，连接所得酶切产物并转化E.coli JM109，筛选阳性克隆菌株；
（3）线性化重组质粒对毕赤酵母的电转以及阳性克隆转化子的筛选
提取步骤（2）所得阳性克隆菌株质粒，经SacI线性化后电转化PichiapastorisGS115，使用步骤（1）所述引物对筛选阳性克隆转化子；
（4）重组菌的摇瓶发酵培养
将步骤（2）所得阳性克隆转化子接种至YPD培养基进行种子培养，取对数生长期24h的种子液以体积比3%的接种量接种至液体发酵培养基，于30℃、200r/min摇瓶发酵培养96h，取发酵液上清，即得AMP脱氨酶表达产物；所述液体发酵培养基成分如下：甘油2wt%，蛋白胨2wt%、酵母膏1wt%、KH2PO40.5wt%，MgSO4·7H2O0.05wt%，pH值为6.0。
优选地，步骤（1）所述鼠灰链霉菌选自鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus）MCCCNo.1A01641。
本发明还提供了上述鼠灰链霉菌AMP脱氨酶基因的毕赤酵母真核表达方法制备得到的AMP脱氨酶表达产物在食品及医药领域的应用。
本发明的有益技术效果在于：
本发明首次以鼠灰链霉菌AMP脱氨酶基因组为模板，通过重组表达载体pGAP9K-AMPD的构建、转化与阳性克隆转化子的筛选、重组菌瓶摇发酵培养条件（包括培养基碳源、氮源、种子液接种龄、接种量、培养基pH值、发酵时间）的精心优化和筛选，在毕赤酵母（Pichia pastoris GS115）中成功表达了鼠灰链霉菌来源的AMP脱氨酶；试验结果显示：本发明制备的重组AMP脱氨酶表达产物具有较高的酶活，酶活性稳定，在培养基碳源添加量为2wt%、培养基pH为6.0，接种龄为24h，发酵时间96h的发酵条件下，重组菌GS115酶活可达到2230±60U/ml，且重组酶带组氨酸标签，易于纯化，可应用于食品、医药等领域，为AMP脱氨酶的工业化生产奠定了基础。
附图说明
图1为实施例2重组表达质粒pGAP9K-AMPD酶切验证电泳图。
图2为实施例4不同碳源对GS115重组菌产酶影响的示意图。
图3为实施例4碳源添加量对GS115重组菌产酶影响的示意图。
图4为实施例4不同氮源对GS115重组菌产酶影响的示意图。
图5为实施例4接种龄对GS115重组菌产酶影响的示意图。
图6为实施例4接种量对GS115重组菌产酶影响的示意图。
图7为实施例4发酵培养基pH对GS115重组菌产酶影响的示意图。
图8为实施例4不同发酵时间对GS115重组菌产酶影响的示意图。
具体实施方式
以下结合附图，并通过实施例对本发明进行具体说明。
以下实施例所涉及实验材料如下：
菌株：鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus）购自中国海洋微生物菌种保藏管理中心（MCCC），保藏编号MCCC No.1A01641，以下简称鼠灰链霉菌MCCC1A01641；E.coli JM109购自大连宝生物工程有限公司；所述毕赤酵母Pichiapastoris GS115表达系统购自Invitrogen公司。
所涉及其他试剂及试剂盒均为国产或进口商品。
实施例1鼠灰链霉菌AMP脱氨酶基因的克隆
以鼠灰链霉菌MCCC1A01641基因组为模板，设计引物对AMPDF2/AMPDR2特异性扩增鼠灰链霉菌AMP脱氨酶基因，在其两端均加入EcoRI酶切位点（下划线表示）和组氨酸标签（双下划线表示），引物对AMPDF2/AMPDR2序列如下：
AMPDF2：
5’-GCGGAATTCCATCATCATCATCATCATGCGCCGCCGCCCCGGCAG-3’(SEQ ID NO:1)；
AMPDR2：
5’-GCCGAATTCTCAATGATGATGATGATGATGCCCCCGGGCGTGCGCCC-3’(SEQ ID NO:2)；
用胶纯化试剂盒纯化所得PCR产物。
实施例2重组表达载体pGAP9K-AMPD的构建
将组成型表达载体pGAP9K和步骤（1）所得PCR产物分别用EcoRI酶切纯化，于16℃连接过夜，连接产物转化E.coli JM109，提取pGAP9K-AMPD-JM109菌株质粒，酶切验证，筛选出pGAP9K-AMPD-JM109阳性菌株。重组表达质粒pGAP9K-AMPD酶切验证电泳图如图1所示。
实施例3线性化重组质粒pGAP9K-AMPD对GS115的电转化以及转化子的筛选
提取实施例2所得pGAP9K-AMPD-JM109阳性菌株质粒，经SacI线性化后电转化Pichia pastoris GS115，涂布MD平板，3～5天后挑取单菌落，通过蜗牛酶法提取重组质粒，使用实施例1所述特异性引物对AMPDF2/AMPDR2进行PCR验证，筛选得到阳性克隆转化子。将阳性克隆转化子接种至YPD培养基进行种子培养。
实施例4重组菌瓶摇发酵培养条件的优化
4.1考察不同碳源对重组菌产酶的影响
以2wt%蛋白胨为氮源，分别以2wt%甘油﹑乳糖﹑蔗糖﹑麦芽糖﹑可溶性淀粉以及葡萄糖为碳源对重组菌进行摇瓶发酵，结果如图2所示。结果表明：各种碳源对重组菌的生长和酶活影响差别较大，其中以甘油为碳源时，不仅菌体量达到最高，而且AMP脱氨酶的酶活也最高；以葡萄糖作为碳源时，菌体量和酶活也较好，仅次于甘油；但分别以乳糖﹑蔗糖﹑麦芽糖﹑可溶性淀粉为碳源时，不仅菌体生长不好，而且酶活很低，因此，选择甘油作为碳源。在以甘油为碳源时，继续考察甘油的添加量对重组菌生长和产酶的影响。分别配制含有0.5wt%﹑1wt%﹑2wt%﹑3wt%﹑4wt%﹑5wt%甘油的发酵培养基，对重组菌进行摇瓶培养，72h后取样测菌体浓度和酶活，如图3所示。结果表明，当甘油浓度≤20g/L时，菌体浓度和酶活随着甘油浓度的增加而不断上升；当甘油浓度>20g/L时，随着甘油浓度的不断上升菌体量不再增加，而酶活在逐渐降低，这可能是由于过高的甘油浓度对重组酶的表达有抑制作用。因此，选择2wt%的甘油为碳源。
4.2考察不同氮源对重组菌产酶的影响
以2wt%甘油为碳源，分别以2wt%(NH4)2SO4（A）﹑KNO3（B）﹑麸皮（C）﹑棉籽粉（D）﹑玉米浆（E）﹑蛋白胨（F）﹑酵母膏（H）﹑牛肉膏（I）单一氮源以及蛋白胨+酵母膏（2:1）（J）﹑蛋白胨+牛肉膏（2:1）（K）复合氮源为氮源进行摇瓶发酵，72h后测菌体浓度和酶活，结果如图4所示。结果表明：无机氮源产酶能力较低且菌体生长相对较差；有机氮源更有利于促进产酶且有利于菌体的生长，其中，以蛋白胨+酵母膏（2:1）为氮源时酶活最大。因此，选取蛋白胨+酵母膏（2:1）作为氮源。
4.3考察接种龄对重组菌产酶的影响
分别取处于对数生长期12﹑16﹑20﹑24﹑28﹑32﹑36h的种子液以2%接种量转接至50ml发酵培养基（甘油2wt%，蛋白胨2wt%，酵母膏1wt%，KH2PO40.5wt%,MgSO4·7H2O0.05wt%,pH6.0。）中，摇瓶培养72h后，取样测菌体浓度和酶活，结果如图5所示。结果表明：对数期内，菌体浓度随着菌龄的增大而增加，而酶活在对数期20h达到最大，之后逐渐降低。因此，最适接种龄为20h。
4.4考察接种量对重组菌产酶的影响
将种龄为20h的种子液分别以体积比1%﹑2%﹑3%﹑4%﹑5%的接种量接到50ml发酵培养基（同上）中，72h后取样测菌体浓度和酶活，结果如图6所示。结果显示：在1%～5%范围内，重组菌的菌体浓度与接种量成正相关。酶活测定结果显示在接种量为3%时酶活最大，高于或低于3%接种量时酶活均有所降低。因此，最佳接种量为3%。
4.5考察培养基pH对重组菌产酶的影响
配制pH值分别为4.0﹑4.5﹑5.0﹑5.5﹑6.0﹑6.5﹑7.0﹑7.5的50ml发酵培养基（同上），按20h种龄﹑体积比3%接种量接入种子液，72h后测菌体浓度和酶活，结果如图7所示。结果显示：pH值为4.0～6.0时菌体量逐渐增大，pH值为6.0-7.5时菌体量变化不大；pH值为4.0时没有酶活，pH为6.0时重组酶活性最大，当pH大于6.0时，随着pH值增大酶活逐渐降低。因此，培养基最适pH确定为6.0。
4.6考察发酵时间对重组菌产酶的影响
配制pH值为6.0的50ml发酵培养基（同上），按20h种龄﹑3%接种量接入种子液，30℃﹑200r/min摇瓶培养，分别培养48h﹑60h﹑72h﹑84h﹑96h﹑108h﹑120h后，取样测酶活，结果如图8所示。结果显示：培养96h时重组酶活性最大。
实施例5正交试验
根据正交设计原理以及实施例4发酵培养条件单因素试验结果，设计了四因素三水平正交试验方案，正交试验因素参见表1。
表1正交试验因素表
注：其他发酵条件为：发酵培养基其他成分为蛋白胨2wt%，酵母膏1wt%，KH2PO40.5wt%,MgSO4·7H2O0.05wt%,pH6.0；种子液接种量为体积比3%；于30℃、200r/min摇瓶培养。
正交试验结果如表2所示。
表2正交试验结果表
从表2可以看出，上述四个因素对酶活影响由大到小依次为：碳源添加量>培养基pH>发酵时间>接种龄，最佳组合为A2B2C3D2，即碳源添加量为2wt%、培养基pH为6.0，接种龄为24h，发酵时间96h。在该发酵条件下，重组菌GS115酶活达到2230±60U/ml。
以上所述的仅是本发明的优选实施方式，本发明不限于以上实施例。可以理解，本领域技术人员在不脱离本发明的精神和构思的前提下直接导出或联想到的其他改进和变化，均应认为包含在本发明的保护范围之内。
Claims (1)
1.鼠灰链霉菌AMP脱氨酶基因的毕赤酵母真核表达方法，其特征在于具体步骤如下：
(1)鼠灰链霉菌AMP脱氨酶基因的克隆
以鼠灰链霉菌基因组为模板，以序列为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的引物对通过PCR特异性扩增AMP脱氨酶基因，在其两端均加入EcoRI酶切位点和组氨酸标签，纯化回收PCR产物；
(2)重组表达载体的构建
将组成型表达载体pGAP9K和步骤(1)所得PCR产物分别用EcoRI酶切纯化，连接所得酶切产物并转化E.coli JM109，筛选阳性克隆菌株；
(3)线性化重组质粒对毕赤酵母的电转化以及阳性克隆转化子的筛选
提取步骤(2)所得阳性克隆菌株质粒，经SacI线性化后电转化Pichia pastorisGS115，使用步骤(1)所述引物对筛选阳性克隆转化子；
(4)重组菌的摇瓶发酵培养
将步骤(2)所得阳性克隆转化子接种至YPD培养基进行种子培养，取对数生长期24h的种子液以体积比3％的接种量接种至液体发酵培养基，于30℃、200r/min摇瓶发酵培养96h，取发酵液上清，即得AMP脱氨酶表达产物；所述液体发酵培养基成分如下：甘油2wt％，蛋白胨2wt％、酵母膏1wt％、KH2PO40.5wt％，MgSO4·7H2O 0.05wt％，pH值为6.0；
步骤(1)所述鼠灰链霉菌选自鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)MCCC No.1A01641。
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