DE19949000A1

DE19949000A1 - PRPP-Amidotransferase aus Pflanzen

Info

Publication number: DE19949000A1
Application number: DE1999149000
Authority: DE
Inventors: Jens Lerchl; Thomas Ehrhardt; Uwe Sonnewald; Ralf Boldt
Original assignee: BASF SE
Current assignee: BASF SE
Priority date: 1999-10-11
Filing date: 1999-10-11
Publication date: 2001-04-12
Also published as: CA2387159A1; WO2001027248A1; EP1220894A1; WO2001027248A8; AU7915900A

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft DNA-Sequenzen, codierend für ein Polypeptid mit PRPP-Amidotransferase (EC 2.4.2.14) Aktivität. Zudem betrifft die Erfindung die Verwendung dieser Nukleinsäuren zur Herstellung eines Testsystems.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Identifizierung pflanzli cher PRPP-Amidotransferase (Phosphoribosylpyrophosphat-Amido transferase, E.C. 2.4.2.14) als neues Ziel für herbizide Wirk stoffe. Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin DNA-Sequen zen kodierend für ein Polypeptid mit PRPP-Amidotransferase Aktivität. Zudem betrifft die Erfindung die Verwendung einer Nu kleinsäure kodierend für ein Protein mit PRPP-Amidotransferase Aktivität pflanzlichen Ursprungs zur Herstellung eines Test systems zur Identifizierung von Inhibitoren der PRPP-Amidotrans ferase mit herbizider Wirkung. Weiterhin betrifft die Erfindung die Verwendung der Nukleinsäure SEQ-ID No. 1 oder SEQ-ID No. 3 kodierend für pflanzliche PRPP-Amidotransferase zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhter Resistenz gegenüber Inhibitoren der PRPP-Amidotransferase, sowie zur Herstellung von Pflanzen mit mo difiziertem Gehalt an Purinnukleotiden.

Pflanzen sind in der Lage, aus Kohlendioxid, Wasser und anorgani schen Salzen ihre Zellkomponenten zu synthetisieren.

Dieser Prozeß ist nur möglich, indem biochemische Reaktionen zum Aufbau organischer Substanzen genutzt werden. Nukleotide werden in Pflanzen de novo synthetisiert. Als Bestandteil der Nuklein säuren kommt ihnen besondere Bedeutung zu. In kovalenter Bindung aktivieren Nukleotide Kohlenhydrate für die Biosynthese von Poly sacchariden. Ferner aktivieren sie Kopfgruppen für die Bio synthese von Lipiden. Nukleotide sind in nahezu alle Stoffwech selwege eingebunden. Nucleosidtriphosphate, vor allem ATP, trei ben die meisten energieaufwändigen Reaktionen der Zelle. Adenin nukleotide sind darüber hinaus auch als Komponente in essentiellen Faktoren wie Coenzym A, sowie Nicotinamid- und Fla vin-Coenzymen zu finden, die an vielen zellulären Reaktionen be teiligt sind. Die gekoppelte Hydrolyse von Guanosin-5'-tri phosphat (GTP) definiert für diverse zelluläre Prozesse, wie Pro teintranslation, Microtubuli-Assemblierung, vesikulären Transport, Signaltransduktion und Zellteilung eine Reaktionsrich tung. Ferner stellen Nukleotide die Ausgangsmetabolite zur Bio synthese von Methylxanthinen wie Coffein und Theobromin in Pflan zenfamilien der Rubiaceae und Theaceae dar.

Gene, die für PRPP-Amidotransferase kodieren, wurden aus ver schiedenen Organismen isoliert.

CDNAs die für PRPP-Amidotransferase Enzyme codieren konnten aus diversen bakteriellen, tierischen und pflanzlichen Organismen isoliert und charakterisiert werden. Pflanzliche PRPP-Amidotrans ferase cDNAs wurden über Komplementation von E. coli purE-Mutan ten sowie über DNA-Hybridisierungstechniken aus Glycine max, Vigna aconitifolia sowie aus Arabidopsis thaliana isoliert (Ito et al., Plant Molecular Biology 26(1994), 529-533; Kim et al., The Plant Journal 7(1995), 77-86). Sequenzhomologien deuten dar auf hin, daß die codierten Enzyme, ebenso wie PRPP-Amidotransfe rase aus E. coli 4Fe-4S-Cluster enthalten. Die im Vergleich zu E. coli N-terminal verlängerten PRPP-Amidotransferase Aminosäurese quenzen aus Pflanzen ähneln plastidären Signalsequenzen.

In Pflanzen finden sich mehrere PRPP-Amidotransferase Isoenzyme, die differentiell exprimiert werden. Die RNA für AtATase1 aus Arabidopsis thaliana akkumuliert beispielsweise präferentiell in den Wurzeln, während die AtATase2-Transkripte stärker in jungen Blättern und Blüten gefunden wird (Ito et al., Plant Molecular Biology 26(1994), 529-533). In Vigna aconitifolia accumuliert eine PRPP-Amidotransferase RNA hauptsächlich in Wurzelknöllchen und wird in Wurzelgeweben durch L-Glutamin induziert (Kim et al., The Plant Journal 7(1995), 77-86).

Da Pflanzen auf einen effektiven Nukleotidstoffwechsel angewiesen sind, läßt sich annehmen, daß sich die beteiligten Enzyme als Ziel für Herbizide eignen. So wurden bereits Wirkstoffe beschrie ben, welche die pflanzliche de novo Purinbiosynthese inhibieren. Beispielhaft ist der Naturstoff Hydanthocidin zu nennen, welcher nach Phosphorylierung in planta die Adenylosuccinat-Synthetase (ASS), inhibiert (Siehl et al., Plant Physiol. 110(1996), 753-758).

Inhibitoren für Enzyme der Purin-Biosynthese sind darüber hinaus für ihre pharmakologische Wirkung in Tieren und Mikroorganismen bekannt: Folat-Analoga inhibieren unter anderem das Enzym GAR- Transformylase und wirken antiproliferativ, antiinflammatorisch und immunosuppressiv. Mycophenolsäure (MPA) wirkt als Hemmstoff der IMP-Dehydrogenase im GMP-Syntheseweg antimikrobiell, antivi ral und immunosuppressiv (Kitchin et al., Journal of the American Academy of Dermatology 37(1997), 445-449).

Bakterielle PRPP-Amidotransferase kann beispielsweise durch Glu taminantagonisten, wie Azaserin, 6-Diazo-5-Oxo-L-Norleucin (DON) oder L-2-Amino-4-Oxo-5-Chlorpentansäure sowie durch Mercaptopu rine und Thioquanosine gehemmt werden. Glutaminantagonisten sind nicht spezifisch für PRPP-Amidotransferase und wirken auch auf andere Enzyme der Purinbiosynthese, wie z. B. die Formylglycinami dinribotid-Synthase. Ein Nachweis der Wirksamkeit von Glutami nantagonisten auf pflanzliche PRPP-Amidotransferase steht noch aus.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es zu belegen, daß PRPP- Amidotransferase in Pflanzen ein geeignetes herbizides Target ist, die Isolierung einer vollständigen pflanzlichen cDNA kodie rend für das Enzym PRPP-Amidotransferase und deren funktionelle Expression in bakteriellen oder eukaryontischen Zellen, sowie die Herstellung eines effizienten und einfachen PRPP-Amidotransferase Testsystems für die Durchführung von Inhibitor-Enzym-Bindungsstu dien.

Die Aufgabe wurde gelöst durch Isolierung von Genen, die für das pflanzliche Enzym PRPP-Amidotransferase kodieren, der Herstellung von Antisensekonstrukten der PRPP-Amidotransferase, sowie der funktionellen Expression der PRPP-Amidotransferase in bakteriel len oder eukaryontischen Zellen.

Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft die Isolierung von Vollängen-cDNAs codierend für funktionelle PRPP-Amidotransfe rase (E.C.2.4.2.14) aus Tabak (Nicotiana tabacum).

Ein erster Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine DNA-Se quenz SEQ-ID No. 1 oder SEQ-ID No. 3 enthaltend die Kodierregion einer pflanzlichen PRPP-Amidotransferase aus Tabak, siehe Bei spiel 1.

Weiterer Gegenstand der Erfindung sind DNA-Sequenzen, die von SEQ-ID No. 1 oder SEQ-ID No. 3 abgeleitet sind oder mit einer dieser Sequenzen hybridisieren und die für ein Protein kodieren, das die biologische Aktivität einer PRPP-Amidotransferase be sitzt.

Tabakpflanzen der Linie Nicotiana tabacum cv. Samsun NN, die ein Antisensekonstrukt der PRPP-Amidotransferase tragen, wurden näher charakterisiert. Die Pflanzen zeigen in unterschiedlichem Maße eine Wachstumsretardierung, sowie ein Ausbleichen der Blätter. Die transgenen Linien sowie die Nachkommen der 1. und 2. Genera tion wiesen ein verringertes Wachstum in Erde auf. In Pflanzen mit verringertem Wachstum konnte eine im Vergleich zum Wildtyp reduzierte PRPP-Amidotransferase RNA-Menge in der Northern-Hy bridisierung detektiert werden. Ferner konnte durch Messung der Enzymaktivität eine im Vergleich mit Wildtyppflanzen verringerte Menge der PRPP-Amidotransferase Aktivität in den transgenen Linien detektiert werden, siehe Beispiel 7. Es läßt sich eine Korellation zwischen Wachstumsretardierung und Reduktion der PRPP-Amidotransferase Aktivität feststellen. Dieser klare Zusam menhang weist PRPP-Amidotransferase erstmals eindeutig als geei gnetes Zielprotein für herbizide Wirkstoffe aus.

Um effiziente Hemmstoffe der pflanzlichen PRPP-Amidotransferase finden zu können, ist es notwendig, geeignete Testsysteme, mit denen Inhibitor-Enzym-Bindungsstudien durchgeführt werden können, zur Verfügung zu stellen. Hierzu wird beispielsweise die kom plette cDNA-Sequenz der PRPP-Amidotransferase aus Tabak in einen Expressionsvektor (pQE, Qiagen) kloniert und in E. coli überex primiert, siehe Beispiel 2.

Alternativ kann jedoch die Expressionskassette enthaltend eine DNA-Sequenz SEQ-ID No. 1 oder SEQ-ID No. 3 beispielsweise in an deren Bakterien, in Hefen, Pilzen, Algen, Pflanzenzellen, Insek tenzellen oder Säugetierzellen exprimiert werden, siehe Bei spiel 4.

Das mit Hilfe der erfindungsgemäßen Expressionskassette expri mierte PRPP-Amidotransferase Protein eignet sich besonders zur Auffindung von für die PRPP-Amidotransferase spezifischen Hemm stoffen.

Dazu kann die pflanzliche PRPP-Amidotransferase beispielsweise in einem Enzymtest eingesetzt werden, bei dem die Aktivität der PRPP-Amidotransferase in An- und Abwesenheit des zu testenden Wirkstoffs ermittelt wird. Aus dem Vergleich der beiden Aktivi tätsbestimmungen läßt sich eine qualitative und quantitative Aus sage über das Hemmverhalten des zu testenden Wirkstoffes machen, siehe Beispiel 3.

Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Testsystems kann eine Vielzahl von chemischen Verbindungen schnell und einfach auf herbizide Ei genschaften überprüft werden. Das Verfahren gestattet es, repro duzierbar aus einer großen Anzahl von Substanzen gezielt solche mit großer Wirkstärke auszuwählen, um mit diesen Substanzen an schließend weitere, dem Fachmann geläufige vertiefte Prüfungen durchzuführen.

Weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Identifi zierung von Inhibitoren pflanzlicher PRPP-Amidotransferasen, mit potentiell herbizider Wirkung indem man das Gen einer pflanzli chen PRPP-Amidotransferase kloniert, in einer geeigneten Expres sionskassette - beispielsweise in Insektenzellen - zur Über expression bringt, die Zellen öffnet und den Zellextrakt direkt bzw. nach Anreicherung oder Isolierung des Enzyms PRPP-Amido transferase in einem Testsystem zur Messung der Enzymaktivität in Gegenwart von niedermolekularen chemischen Verbindungen einsetzt.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Verbindungen mit herbizider Wirkung, die mit dem oben beschriebenen Testsystem identifizierbar sind.

Inhibitoren der PRPP-Amidotransferase mit herbizider Wirkung kön nen als Defoliants, Desiccants, Krautabtötungsmittel und ins besondere als Unkrautvernichtungsmittel verwendet werden. Unter Unkraut im weitesten Sinne sind alle Pflanzen zu verstehen, die an Orten aufwachsen, an denen sie unerwünscht sind. Ob die mit Hilfe des erfindungsgemäßen Testsystems gefundenen Wirkstoffe als totale oder selektive Herbizide wirken, hängt unter anderem von der angewandten Menge ab.

Inhibitoren der PRPP-Amidotransferase mit herbizider Wirkung kön nen beispielsweise gegen folgende Unkräuter verwendet werden:
Dikotyle Unkräuter der Gattungen:
Sinapis, Lepidium, Galium, Stellaria, Matricaria, Anthemis, Ga linsoga, Chenopodium, Urtica, Senecio, Amaranthus, Portulaca, Xanthium, Convolvulus, Ipomoea, Polygonum, Sesbania, Ambrosia, Cirsium, Carduus, Sonchus, Solanum, Rorippa, Rotala, Lindernia, Lamium, Veronica, Abutilon, Emex, Datura, Viola, Galeopsis, Papa ver, Centaurea, Trifolium, Ranunculus, Taraxacum.
Monokotyle Unkräuter der Gattungen:
Echinochloa, Setaria, Panicum, Digitaria, Phleum, Poa, Festuca, Eleusine, Brachiaria, Lolium, Bromus, Avena, Cyperus, Sorghum, Agropyron, Cynodon, Monochoria, Fimbristyslis, Sagittaria, Eleo charis, Scirpus, Paspalum, Ischaemum, Sphenoclea, Dactyloctenium, Agrostis, Alopecurus, Apera.

Gegenstand der Erfindung sind auch Expressionskassetten, deren Sequenz für eine PRPP-Amidotransferase aus Tabak oder deren funk tionelles Äquivalent kodieren. Die Nukleinsäuresequenz kann dabei z. B. eine DNA- oder eine cDNA-Sequenz sein.

Die erfindungsgemäßen Expressionskassetten beinhalten außerdem regulative Nukleinsäuresequenzen, welche die Expression der ko dierenden Sequenz in der Wirtszelle steuern. Gemäß einer bevor zugten Ausführungsform umfaßt eine erfindungsgemäße Expressions kassette stromaufwärts, d. h. am 5'-Ende der kodierenden Sequenz, einen Promotor und stromabwärts, d. h. am 3'-Ende, ein Polyadeny lierungssignal und gegebenenfalls weitere regulatorische Ele mente, welche mit der dazwischenliegenden kodierenden Sequenz für das PRPP-Amidotransferase-Gen operativ verknüpft sind. Unter einer operativen Verknüpfung versteht man die sequenzielle Anord nung von Promotor, kodierender Sequenz, Terminator und ggf. wei terer regulativer Elemente derart, daß jedes der regulativen Ele mente seine Funktion bei der Expression der kodierenden Sequenz bestimmungsgemäß erfüllen kann.

Die Herstellung einer erfindungsgemäßen Expressionskassette er folgt durch Fusion eines geeigneten Promotors mit einer geeigne ten PRPP-Amidotransferase-DNA Sequenz und einem Polyadenylie rungssignal nach gängigen Rekombinations- und Klonierungs techniken, wie sie beispielsweise in T. Maniatis, E.F. Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) sowie in T.J. Silhavy, M.L. Berman und L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) und in Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecu lar Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience (1987) beschrieben sind.

Gegenstand der Erfindung sind auch funktionell äquivalente DNA- Sequenzen, die für ein PRPP-Amidotransferase Gen kodieren und die bezogen auf die Gesamtlänge der DNA-Sequenz eine Sequenzhomologie mit der DNA-Sequenz SEQ-ID No. 1 oder SEQ-ID No. 3 von 40 bis 100% aufweisen.

Bevorzugter Gegenstand der Erfindung sind funktionell äquivalente DNA-Sequenzen, die für ein PRPP-Amidotransferase Gen kodieren und die bezogen auf die Gesamtlänge der DNA-Sequenz eine Sequenzhomo logie mit der DNA-Sequenz SEQ-ID No. 1 oder SEQ-ID No. 3 von 60 bis 100% aufweisen.

Besonders bevorzugter Gegenstand der Erfindung sind funktionell äquivalente DNA-Sequenzen, die für ein PRPP-Amidotransferase Gen kodieren und die bezogen auf die Gesamtlänge der DNA-Sequenz eine Sequenzhomologie mit der DNA-Sequenz SEQ-ID No. 1 oder SEQ-ID No. 3 von 80 bis 100% aufweisen.

Funktionell äquivalente Sequenzen, die für ein PRPP-Amidotransfe rase Gen kodieren, sind erfindungsgemäß solche Sequenzen, welche trotz abweichender Nukleotidsequenz noch die gewünschten Funktio nen besitzen. Funktionelle Äquivalente umfassen somit natürlich vorkommende Varianten der hierin beschriebenen Sequenzen sowie künstliche, z. B. durch chemische Synthese erhaltene, an den Ko don-Gebrauch einer Pflanze angepaßte, künstliche Nukleotid-Se quenzen.

Unter einem funktionellen Äquivalent versteht man insbesondere auch natürliche oder künstliche Mutationen einer ursprünglich isolierten für eine PRPP-Amidotransferase kodierende Sequenz, welche weiterhin die gewünschte Funktion zeigt. Mutationen umfas sen Substitutionen, Additionen, Deletionen, Vertauschungen oder Insertionen eines oder mehrerer Nukleotidreste. Somit werden beispielsweise auch solche Nukleotidsequenzen durch die vorlie gende Erfindung mit umfaßt, welche man durch Modifikation dieser Nukleotidsequenz erhält. Ziel einer solchen Modifikation kann z. B. die weitere Eingrenzung der darin enthaltenen kodierenden Sequenz oder z. B. auch die Einfügung weiterer Restriktionsenzym- Schnittstellen sein.

Funktionelle Äquivalente sind auch solche Varianten, deren Funk tion, verglichen mit dem Ausgangsgen bzw. Genfragment, abge schwächt oder verstärkt ist.

Die erfindungsgemäße Expressionskassette kann darüberhinaus auch zur Transformation von Bakterien, Cyanobakterien, Hefen, filamen tösen Pilzen und Algen mit dem Ziel der Herstellung von ausrei chenden Mengen des Enzyms PRPP-Amidotransferase eingesetzt wer den.

Weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Protein aus Tabak ge kennzeichnet durch die Aminosäuresequenz SEQ-ID NO: 2 oder SEQ-ID No. 4 bzw. Derivate oder Teile dieses Proteins mit PRPP-Amido transferase Aktivität.

Gegenstand der Erfindung sind auch pflanzliche Proteine mit PRPP- Amidotransferase Aktivität mit einer Aminosäuresequenzhomologie zu der Tabak PRPP-Amidotransferase mit den SEQ-ID NO: 2 oder SEQ-ID No. 4 von 20-100% Identität.

Bevorzugt sind pflanzliche Proteine mit PRPP-Amidotransferase Aktivität mit einer Aminosäuresequenzhomologie zu den Tabak PRPP- Amidotransferasen mit den Sequenzen SEQ-ID NO: 2 oder SEQ-ID No. 4 von 50-100% Identität.

Besonders bevorzugt sind pflanzliche Proteine mit PRPP-Amido transferase Aktivität mit einer Aminosäuresequenzhomologie zu den Tabak PRPP-Amidotransferasen mit den Sequenzen SEQ-ID NO: 2 oder SEQ-ID No. 4 von 80-100% Identität.

Weitere Aufgabe der Erfindung war die Überexpression des PRPP- Amidotransferase Gens in Pflanzen zur Herstellung von Pflanzen, die tolerant gegenüber Inhibitoren der PRPP-Amidotransferase sind.

Durch Überexpression der für eine PRPP-Amidotransferase kodieren den Gensequenz SEQ-ID No. 1 oder SEQ-ID No. 3 in einer Pflanze wird eine erhöhte Resistenz gegenüber Inhibitoren der PRPP-Amido transferase erreicht. Die derart hergestellten transgenen Pflan zen sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung.

Die Wirksamkeit der Expression des transgen exprimierten PRPP- Amidotransferase Gens kann beispielsweise in vitro durch Sproß meristemvermehrung oder durch einen Keimungstest ermittelt werden. Zudem kann eine in Art und Höhe veränderte Expression des PRPP- Amidotransferase Gens und deren Auswirkung auf die Resistenz ge genüber Hemmstoffen der PRPP-Amidotransferase an Testpflanzen in Gewächshausversuchen getestet werden.

Gegenstand der Erfindung sind außerdem transgene Pflanzen, trans formiert mit einer erfindungsgemäßen Expressionskassette, enthal tend die DNA-Sequenz SEQ-ID No. 1 oder SEQ-ID No. 3, die durch zusätzliche Expression der DNA-Sequenz SEQ-ID No. 1 oder SEQ-ID No. 3 tolerant gegenüber Inhibitoren der PRPP-Amidotransferase geworden sind, sowie transgene Zellen, Gewebe, Teile und Vermeh rungsgut solcher Pflanzen. Besonders bevorzugt sind dabei transgene Kulturpflanzen, wie z. B. Gerste, Weizen, Roggen, Mais, Soja, Reis, Baumwolle, Zuckerrübe, Canola, Sonnenblume, Flachs, Hanf, Kartoffel, Tabak, Tomate, Raps, Alfalfa, Salat und die ver schiedenen Baum-, Nuß- und Weinspezies, sowie Leguminosen.

Eine Veränderung des Nukleotidgehaltes in Pflanzen kann in ver schiedenen Fällen von Nutzen sein. Säuglingsnahrungsprodukten auf pflanzlicher Basis werden beispielsweise Nukleotide zugesetzt, um eine der Muttermilch entsprechende Nährstoffzusammensetzung zu erreichen. Weiterhin wäre ein optimierter Nukleotidgehalt im Falle der enteralen Ernährung von Patienten sinnvoll. Ein redu zierter Purin-Nukleotidgehalt in ernährungsrelevanten Pflanzen ist für die diätetische Ernährung Gicht-kranker Patienten rele vant. Nukleotide wirken ferner geschmacksbildend und geschmacks verstärkend, so daß sich ein veränderter Nukleotidgehalt auf ge schmackliche Eigenschaften von Pflanzen auswirkt.

Weiterer Gegenstand der Erfindung sind daher Pflanzen, die nach Expression der DNA-Sequenz SEQ-ID No. 1 oder SEQ-ID No. 3 in der Pflanze einen modifizierten Gehalt an Purinnukleotiden aufweisen. Dabei wird vorzugsweise der Gehalt der Purinnukleotide IMP, AMP und/oder GMP bzw. deren Di- bzw. Trinukleotide ADP, ATP oder GDP, GTP erhöht.

Eine Pflanze mit modifiziertem Gehalt an Purinnukleotiden wird beispielsweise durch Expression einer zusätzlichen DNA-Sequenz SEQ-ID No. 1 oder SEQ-ID No. 3 in sense- oder antisense-Orientie rung in der Pflanze hergestellt. Modifizierter Gehalt an Purinnu kleotiden bedeutet, daß sowohl Pflanzen mit erhöhtem Gehalt an Purinnukleotiden bei sense-Orientierung als auch Pflanzen mit er niedrigtem Gehalt an Guanosinnukleotiden bei sense-Orientierung (Cosuppression) oder antisense-Orientierung hergestellt werden können.

Erhöhung des Gehaltes an Purinnukleotiden bedeutet beispielsweise im Rahmen der vorliegenden Erfindung die künstlich erworbene Fähigkeit einer erhöhten Biosyntheseleistung für Purinnukleotide durch funktionelle Überexpression des PRPP-Amidotransferase Gens in der Pflanze gegenüber der nicht gentechnisch modifizierten Pflanze für die Dauer mindestens einer Pflanzengeneration.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung pflanz licher PRPP-Amidotransferase zur Veränderung der Konzentrationen von Methylxanthinen in Pflanzen.

Insbesondere bevorzugt sind Sequenzen, die ein Targeting in den Apoplasten, in Plastiden, die Vakuole, das Mitochondrium, das En doplasmatische Retikulum (ER) oder durch ein Fehlen entsprechen der operativer Sequenzen einen Verbleib im Kompartiment des Ent stehens, dem Zytosol, gewährleisten (Kermode, Crit. Rev. Plant Sci. 15, 4 (1996), 285-423).

Beispielhaft kann die pflanzliche Expressionskassette in den Pflanzen-Transformationsvektor pBinAR eingebaut werden, siehe Beispiel 5.

Als Promotoren der erfindungsgemäßen Expressionskassette ist grundsätzlich jeder Promotor geeignet, der die Expression von Fremdgenen in Pflanzen steuern kann. Vorzugsweise verwendet man insbesondere einen pflanzlichen Promotor oder einen Promotor, der einem Pflanzenvirus entstammt. Insbesondere bevorzugt ist der CaMV 35S-Promotor aus dem Blumenkohl-Mosaik-Virus (Franck et al., Cell 21(1980), 285-294). Dieser Promotor enthält unterschiedliche Erkennungssequenzen für transkriptionale Effektoren, die in ihrer Gesamtheit zu einer permanenten und konstitutiven Expression des eingeführten Gens führen (Benfey et al., EMBO J. 8 (1989), 2195-2202).

Die erfindungsgemäße Expressionskassette kann auch einen chemisch induzierbaren Promotor enthalten, durch den die Expression des exogenen PRPP-Amidotransferase Gens in der Pflanze zu einem be stimmten Zeitpunkt gesteuert werden kann. Derartige Promotoren wie z. B. der PRP1-Promotor (Ward et al., Plant. Mol. Biol. (1993) 22, 361-366), ein durch Salizylsäure induzierbarer Promotor (WO 95J19443), ein durch Benzenesufonamid-induzierbarer (EP 388186), ein durch Tetrazyklin-induzierbarer (Gatz et al., Plant J. (1992) 2, 397-404), ein durch Abscisinsäure-induzier barer (EP0335528) bzw. ein durch Ethanol- oder Cyclohexanon-indu zierbarer (WO 93/21334) Promotor sind in der Literatur beschrie ben und können u. a. verwendet werden.

Weiterhin sind insbesonders solche Promotoren bevorzugt, die die Expression in Geweben oder Pflanzenteilen sicherstellen, in denen die Biosynthese von Purinen bzw. dessen Vorstufen stattfindet. Insbesondere zu nennen sind Promotoren, die eine blattspezifische Expression gewährleisten. Zu nennen sind der Promotor der cyto solischen FBPase aus Kartoffel oder der ST-LSI Promotor aus Kar toffel (Stockhaus et al., EMBO J., (1989) 8, 2445-245).

Mit Hilfe eines samenspezifischen Promotors kann ein Fremdprotein stabil bis zu einem Anteil von 0,67 des gesamten löslichen Sa menproteins in den Samen transgener Tabakpflanzen exprimiert wer den (Fiedler und Conrad, Bio/Technology (1995) 10, 1090-1094). Die erfindungsgemäße Expressionskassette kann daher beispiels weise einen samenspezifischen Promotor (bevorzugt den Phaseolin- Promotor, den USP- oder LEB4-Promotor), das LEB4-Signalpeptid, das zu exprimierende Gen und ein ER-Retentionssignal enthalten.

Die inserierte Nukleotid-Sequenz kodierend für eine PRPP-Amido transferase kann synthetisch hergestellt oder natürlich gewonnen sein oder eine Mischung aus synthetischen und natürlichen DNA-Be standteilen enthalten. Im allgemeinen werden synthetische Nukleo tid-Sequenzen mit Kodons erzeugt, die von Pflanzen bevorzugt wer den. Diese von Pflanzen bevorzugten Kodons können aus Kodons mit der höchsten Proteinhäufigkeit bestimmt werden, die in den mei sten interessanten Pflanzenspezies exprimiert werden. Bei der Präparation einer Expressionskassette können verschiedene DNA- Fragmente manipuliert werden, um eine Nukleotid-Sequenz zu erhal ten, die zweckmäßigerweise in der korrekten Richtung liest und die mit einem korrekten Leseraster ausgestattet ist. Für die Ver bindung der DNA-Fragmente miteinander können an die Fragmente Adaptoren oder Linker angesetzt werden.

Außerdem sind artifizielle DNA-Sequenzen geeignet, solange sie, wie oben beispielsweise beschrieben, die gewünschte Eigenschaft der Erhöhung des Gehaltes an Purinnukleotiden in der Pflanze durch Überexpression des PRPP-Amidotransferase Gens in Kultur pflanzen vermitteln. Solche artifiziellen DNA-Sequenzen können beispielsweise durch Rückübersetzung mittels Molecular Modelling konstruierter Proteine, die PRPP-Amidotransferase Aktivität auf weisen oder durch in vitro-Selektion ermittelt werden. Besonders geeignet sind kodierende DNA-Sequenzen, die durch Rückübersetzung einer Polypeptidsequenz gemäß der für die Wirtspflanze spezifi schen Kodon-Nutzung erhalten wurden. Die spezifische Kodon-Nut zung kann ein mit pflanzengenetischen Methoden vertrauter Fachmann durch Computerauswertungen anderer, bekannter Gene der zu transformierenden Pflanze leicht ermitteln.

Als weitere erfindungsgemäße geeignete äquivalente Nukleinsäure- Sequenzen sind zu nennen Sequenzen, welche für Fusionsproteine kodieren, wobei Bestandteil des Fusionsproteins ein pflanzliches PRPP-Amidotransferase Polypeptid oder ein funktionell äquivalen ter Teil davon ist. Der zweite Teil des Fusionsproteins kann z. B. ein weiteres Polypeptid mit enzymatischer Aktivität sein oder eine antigene Polypeptidsequenz mit deren Hilfe ein Nachweis auf PRPP-Amidotransferase Expression möglich ist (z. B. myc-tag oder his-tag). Bevorzugt handelt es sich dabei jedoch um eine regula tive Proteinsequenz, wie z. B. ein Signal- oder Transitpeptid, das das PRPP-Amidotransferase Protein an den gewünschten Wirkort lei tet.

Zweckmäßigerweise sollten die erfindungsgemäßen Promotor- und die Terminator-Regionen in Transkriptionsrichtung mit einem Linker oder Polylinker, der eine oder mehrere Restriktionsstellen für die Insertion dieser Sequenz enthält, versehen werden. In der Re gel hat der Linker 1 bis 10, meistens 1 bis 8, vorzugsweise 2 bis 6 Restriktionsstellen. Im allgemeinen hat der Linker innerhalb der regulatorischen Bereiche eine Größe von weniger als 100 bp, häufig weniger als 60 bp, mindestens jedoch 5 bp. Der erfindungs gemäße Promotor kann sowohl nativ bzw. homolog als auch fremdar tig bzw. heterolog zur Wirtspflanze sein. Die erfindungsgemäße Expressionskassette beinhaltet in der 5'-3'-Transkriptionsrich tung den erfindungsgemäßen Promotor, eine beliebige Sequenz und eine Region für die transkriptionale Termination. Verschiedene Terminationsbereiche sind gegeneinander beliebig austauschbar.

Ferner können Manipulationen, die passende Restriktionsschnitt stellen bereitstellen oder die überflüssige DNA oder Restrikti onsschnittstellen entfernen, eingesetzt werden. Wo Insertionen, Deletionen oder Substitutionen wie z. B. Transitionen und Trans versionen in Frage kommen, können in vitro-Mutagenese, "primerre pair", Restriktion oder Ligation verwendet werden. Bei geeigneten Manipulationen, wie z. B. Restriktion, "chewing-backt oder Auffül len von Überhängen für "bluntends", können komplementäre Enden der Fragmente für die Ligation zur Verfügung gestellt werden.

Bevorzugte Polyadenylierungssignale sind pflanzliche Polyadeny lierungssignale, vorzugsweise solche, die im wesentlichen T-DNA- Polyadenylierungssignale aus Agrobacterium tumefaciens, ins besondere des Gens 3 der T-DNA (Octopin Synthase) des Ti-Plasmids pTiACH5 entsprechen (Gielen et al., EMBO J. 3 (1984), 835) oder funktionelle Äquivalente.

Zur Transformation einer Wirtspflanze mit einer für eine PRPP- Amidotransferase kodierenden DNA wird eine erfindungsgemäße Ex pressionskassette als Insertion in einen rekombinanten Vektor eingebaut, dessen Vektor-DNA zusätzliche funktionelle Regulati onssignale, beispielsweise Sequenzen für Replikation oder Inte gration enthält. Geeignete Vektoren sind unter anderem in "Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology" (CRC Press, Kapitel 6/7, 71-119) beschrieben.

Die Übertragung von Fremdgenen in das Genom einer Pflanze wird als Transformation bezeichnet. Es werden dabei die beschriebenen Methoden zur Transformation und Regeneration von Pflanzen aus Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen zur transienten oder stabilen Transformation genutzt. Geeignete Methoden sind die Protoplasten transformation durch Polyethylenglykol-induzierte DNA-Aufnahme, der biolistische Ansatz mit der Genkanone, die Elektroporation, die Inkubation trockener Embryonen in DNA-haltiger Lösung, die Mikroinjektion und der durch Agrobacterium vermittelte Gentrans fer. Die genannten Verfahren sind beispielsweise in B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, herausgegeben von S. D. Kung und R. Wu, Academic Press (1993) 128-143 sowie in Potrykus Annu. Rev. Plant Physiol.Plant Molec.Biol. 42 (1992), 205-225 beschrieben. Vorzugsweise wird das zu exprimierende Konstrukt in einen Vektor kloniert, der geeignet ist, Agrobacterium tumefaciens zu trans formieren, beispielsweise pBin19 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984), 8711).

Mit einer erfindungsgemäßen Expressionskassette transformierte Agrobakterien können ebenfalls in bekannter Weise zur Transforma tion von Pflanzen, insbesondere von Kulturpflanzen, wie Getreide, Mais, Soja, Reis, Baumwolle, Zuckerrübe, Canola, Sonnenblume, Flachs, Hanf, Kartoffel, Tabak, Tomate, Raps, Alfalfa, Salat und den verschiedenen Baum-, Nuß- und Weinspezies sowie Leguminosen verwendet werden, z. B. indem verwundete Blätter oder Blattstücke in einer Agrobakterienlösung gebadet und anschließend in geeigne ten Medien kultiviert werden.

Der Biosytheseort von Purinen ist im allgemeinen das Blattgewebe, so daß eine blattspezifische Expression des PRPP-Amidotransferase Gens sinnvoll ist. Es ist jedoch naheliegend, daß die Purin-Bio synthese nicht auf das Blattgewebe beschränkt sein muß, sondern auch in allen übrigen Teilen der Pflanze - beispielsweise in fetthaltigen Samen - gewebespezifisch erfolgen kann.

Darüber hinaus ist eine konstitutive Expression des exogenen PRPP- Amidotransferase Gens von Vorteil. Andererseits kann aber auch eine induzierbare Expression wünschenswert erscheinen.

Unter Verwendung der oben zitierten Rekombinations- und Klonierungstechniken können die erfindungsgemäßen Expressionskas setten in geeignete Vektoren kloniert werden, die ihre Vermeh rung, beispielsweise in E. coli, ermöglichen. Geeignete Klonie rungsvektoren sind u. a. pBR332, pUC-Serien, M13mp-Serien und pA- CYC184. Besonders geeignet sind binäre Vektoren, die sowohl in E. coli als auch in Agrobakterien replizieren können.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung einer erfindungsgemäßen Expressionskassette zur Transformation von Pflanzen, Pflanzenzellen, -geweben oder Pflanzenteilen. Vorzugsweise ist Ziel der Verwendung die Erhöhung des PRPP-Amido transferase Gehaltes in der Pflanze.

Dabei kann je nach Wahl des Promotors die Expression spezifisch in den Blättern, in den Samen oder anderen Teilen der Pflanze er folgen. Solche transgenen Pflanzen, deren Vermehrungsgut sowie deren Pflanzenzellen, -gewebe oder -teile sind ein weiterer Ge genstand der vorliegenden Erfindung.

Die Erfindung wird durch die nun folgenden Beispiele erläutert, ist aber nicht auf diese beschränkt:

Beispiele Gentechnische Verfahren, die den Ausführungsbeispielen zugrunde liegen Allgemeine Klonierungsverfahren

Klonierungsverfahren wie z. B. Restriktionsspaltungen, Agarose- Gelelektrophorese, Reinigung von DNA-Fragmenten, Transfer von Nu kleinsäuren auf Nitrozellulose und Nylon Membranen, Verknüpfen von DNA-Fragmenten, Transformation von Escherichia coli Zellen, Anzucht von Bakterien und Sequenzanalyse rekombinanter DNA wurden wie bei Sambrook et al. (1989) (Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-309-6) beschrieben durchgeführt.

Sequenzanalyse rekombinanter DNA

Die Sequenzierung rekombinanter DNA-Moleküle erfolgte mit einem Laserfluoreszenz-DNA-Sequenzierer der Firma ABI nach der Methode von Sanger (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74(1977), 5463-5467). Fragmente resultierend aus einer Polymerase Kettenre- aktion wurden zur Vermeidung von Polymerasefehlern in zu expri mierenden Konstrukten sequenziert und überprüft.

Analyse von Gesamt-RNA aus pflanzlichen Geweben

Gesamt-RNA aus pflanzlichen Geweben wurde wie bei Logemann et al. (Anal. Biochem. 163(1987), 21) isoliert. Für die Analyse wur den jeweils 20 µg RNA in einem Formaldehyd-haltigen 1,5%igen Agarosegel aufgetrennt und auf Nylon Membranen (Hybond, Amersham) überführt. Der Nachweis spezifischer Transkripte wurde wie bei Amasino beschrieben durchgeführt (Anal. Biochem. 152(1986), 304). Die als Sonde eingesetzten DNA-Fragmente wurden mit einem Random Primed DNA Labeling Kit (Roche, Mannheim) radioaktiv mar kiert und nach Standardmethoden hybridisiert (Siehe Hybond-Benut zerhinweise, Amersham). Hyridisierungssignale wurden durch Auto radiographie mithilfe von X-OMAT AR Filmen der Fa. Kodak sichtbar gemacht.

Die verwendeten Chemikalien wurden, sofern nicht anders erwähnt, in p.a. Qualität von den Firmen Fluka (Neu-Ulm), Merck (Darm stadt), Roth (Karlsruhe), Serva (Heidelberg) sowie Sigma (Deisen hofen) bezogen. Lösungen wurden mit aufbereitetem, pyrogenfreiem Wasser, im weiteren Text als H₂O bezeichnet, aus einer Milli-Q Water System Wasseraufbereitungsanlage (Millipore, Eschborn) an gesetzt. Restriktionsendonucleasen, DNA-modifizierende Enzyme und molekularbiologische Kits wurden von den Firmen AGS (Heidelberg), Amersham (Braunschweig), Biometra (Göttingen), Roche (Mannheim), Genomed (Bad Oeynnhausen), New England Biolabs (Schwalbach/Tau nus), Novagen (Madison, Wisconsin, USA), Perkin-Elmer (Weiter stadt), Pharmacia (Freiburg) Qiagen (Hilden) und Stratagene (Hei delberg) bezogen. Sie wurden, soweit nicht anders erwähnt, nach Herstellerangaben verwendet.

Die im folgenden verwendeten Bakterienstämme (E. coli, XL-1 Blue) wurden von Stratagene bezogen. E. coli AT 2465 wurde bei dem coli genetic stock centre (Yale University, New Haven) bezogen. Der zur Pflanzentransformation verwendete Agrobakterienstamm (Agro bacterium tumefaciens, C58C1 mit dem Plasmid pGV2260 oder pGV3850kan) wurde von Deblaere et al. beschrieben (Nucl. Acids Res. 13 (1985), 4777). Alternativ können auch der Agrobakterien stamm LBA4404 (Clontech) oder andere geeignete Stämme eingesetzt werden. Zur Klonierung können die Vektoren pUCl9 (Yanish-Perron, Gene 33(1985), 103-119) pBluescript SK- (Stratagene), pGEM-T (Promega), pZerO (Invitrogen), pBin19 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12(1984), 8711-8720) und pBinAR (Höfgen und Willmitzer, Plant Science 66 (1990), 221-230) benutzt werden.

Beispiel 1 Isolierung von cDNAs codierend für eine funktionelle PRPP-Amidotransferase aus Tabak

Zur Isolierung von für PRPP-Amidotransferase codierenden cDNAs aus Nicotiana tabacum wurde ein für PRPP-Amidotransferase codie render cDNA-Klon aus Arabidopsis (AtATasel; Ito et al., Plant Mo lecular Biology 26(1994), 529-533; GenBank Accession number D28868) als Matrize zur Erzeugung einer Hybridisierungssonde mittels PCR verwendet.

Die Reaktionsgemische enthielten ca. 1 ng/µl Matrizen DNA, 0,5 µM der Oligonukleotide 5'-cgc tct aga act agt gga tc-3' und 5'-tcg agg tcg acg gta tc-3', 200 µM Desoxy-Nukleotide (Pharmacia), 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8,3 bei 25°C, 1,5 mM MgCl₂) und 0.02 U/µl Taq Polymerase (Perkin Elmer).

Die Amplifikationsbedingungen wurden wie folgt eingestellt:
Anlagerungstemperatur: 50°C, 1 min
Denaturierungstemperatur: 94°C, 1 min
Elongationstemperatur: 72°C, 2 min
Anzahl der Zyklen: 30

Das resultierende Fragment von 1,9 kb wurde für ein heterologes Screening einer cDNA Bank von Nicotiana tabacum var. SR-1 (Stra tagene) verwendet. Es wurden 3,0×10⁵ Lambda Phagen der cDNA-Bi bliothek auf Agarplatten mit E. coli XL1-blue als Bakterienstamm ausplattiert. Die Phagen-DNA wurde mittels Standardverfahren (Sambrook et al. (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-309-6) auf Nitrocellulosefilter (Gelman Sciences) überführt und auf den Filtern fixiert. Als Hybridisierungssonden diente das oben beschriebene PCR-Fragment, das mit Hilfe des "Multiprime DNA labelling systems" (Amersham Buchler) in Anwesen heit von α-³²P-dCTP (spezifische Aktivität 3000 Ci/mmol) nach Herstellerangaben radioaktiv markiert wurden. Die Hybridisierung der Membranen erfolgte nach Prähybridisierung bei 60°C in 3 × SSPE, 0,1% Natriumdodecylsulfat (w/v), 0,02% Polyvinylpyrolidon (w/v), 0,02% Ficoll 400 (w/v) und 50 mg/ml Kalbsthymus DNA für ca. 12 Stunden. Anschließend wurden die Filter 60 Minuten in 2 × SSPE, 0,1% Natriumdodecylsulfat (w/v) bei 60°C gewaschen. Positiv hybridisierende Phagen wurden durch Autoradiographie sichtbar ge macht und mittels Standardtechniken vereinzelt (Sambrook et al. (1989); Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-309-6) und in Plasmide überführt (Strategene).

Nach Restriktions- und Sequenzanalyse konnten zwei unterscheid bare Klone Ntpur1.1 (Klon 7.2) enthaltend die DNA-Sequenz SEQ-ID No. 1 und Ntpur1.2 (Klon 9.2) enthaltend die DNA-Sequenz SEQ-ID No. 3 identifiziert werden, welche Leseraster mit Homolo gie zu AtATAse1 aus Arabidopsis thaliana codieren. Die Aminosäu resequenzen von Ntpur1.1 (SEQ-ID No. 2 - Länge: 573 Aminosäuren) und Ntpur1.2 (SEQ-ID No. 4 - Länge: 573 Aminosäuren) sind zu 97% identisch, siehe Tabelle 1. Die Homologie auf Aminosäureebene zu AtATase1 beträgt für Ntpur1.1 81% und für Ntpur1.2 85%. Die durchgehenden Leseraster beginnen mit Nukleotidbase 49 (Ntpur1.1) bzw. 25 (Ntpur1.2) und werden in Polypeptide von 573 Aminosäuren Länge übersetzt.

Tabelle 1

Aminosäurevergleich Ntpur1.1 × Ntpur1.2

Die pflanzlichen Proteine (Ntpur1.1, Ntpur1.2, AtATase1) weisen gegenüber PRPP-Amidotransferase Sequenzen von Bakterien und Mensch einen verlängerten N-Terminus mit einem großen Anteil ba sischer Aminosäuren auf (Tabelle 2), was auf die Funktion eines Transitpeptides für den plastidären Import hinweist (von Heijne et al., Eur. J. Biochem. 180(1989), 535-545).

Tabelle 2

Sequenzgegenüberstellung PRPP-Amidotransferase Proteine aus Arabidopsis thaliana (AtATase1), Bacillus subtilis (BacSu_purF), Mensch (pur1_hum) und Nicotiana tabaccum (Ntpur1.1, Ntpur1.2)

Beispiel 2 Expression von PRPP-Amidotransferase aus Tabak in E.coli

Mit dem Ziel, die Aktivität des durch Ntpur1.2 codierten PRPP- Amidotransferase Enzyms nachzuweisen, wurde Ntpur1.2 in E.coli exprimiert. Dazu wurde in einer (PCR) mit Pfu-Polymerase mit den Oligonucleotiden J1e336: 5'-ttttgctagcgactcgtattttgacg-3' und J1e337: 5'-aaaaagatctcaggttctaacttcat -3' und Ntpur1.2-DNA als Matrize ein Fragment von 1523 bp amplifiziert. Das erzeugte DNA- Fragment codiert für ein N-terminal um 86 Aminosäuren verkürztes PRPP-Amidotransferase Enzym, welches das anzunehmende Transitpep tid nicht mehr enthält. Diese verkürzte Form des PRPP-Amidotrans ferase Enzyms beginnt N-terminal mit den Aminosäuren MDSYFDDDD. Mittels der Oligonucleotide wurden eine NheI-Schnittstelle sowie eine BglII-Schnittstelle eingefügt, über die das erzeugte Frag ment in den mit NheI und BamHI gespaltenen Expressionsvektor pETlla (Novagen) ligiert wurde.

Zur Expression wurde der E.coli Stamm BL21(DE3)LysS (Novagen) mit dem auf diese Weise erzeugten Konstrukt pETNtpur1.2 transfor miert. Nach Übernachtkultur wurde eine Tageskultur auf OD₆₀₀ = 0,1 angeimpft und nach Erreichen einer OD₆₀₀ = 0,7 mit 1 mM IPTG indu ziert. Ein Gesamtzellextrakt wurde nach der Druckaufschlußmethode ("French-Press") in 50 mM Tris-HCl, pH 7,4; 150 mM NaCl erzeugt. Ein überexprimiertes Protein von ca. 65 kDa wurde nach SDS-Poly acrylamid-Gelelektrophorese aus dem Gel ausgeschnitten. Das Pro tein wurde zur Erzeugung von Antiseren in Kaninchen injiziert (im Auftrag durchgeführt durch die Firma Eurogentec, Herstal, Belgien).

Beispiel 3 Testsystem zur Messung der Aktivität pflanzlicher PRPP-Amido transferase Aktivität

Die vorbeschriebene Methode zur Messung pflanzlicher PRPP-Amido transferase Aktivität nach Reynolds et al. (Archieves of Bio chemistry and Biophysics 229 (1984), 623-631) ist aufgrund der Verwendung radioaktiver Substrate nicht für eine Testung im Hoch durchsatz geeignet. Es wurde daher auf Basis der bei Shid und Is hii (Journal of Biological Chemistry 66 (1969), 175-181) für PRPP-Amidotransferase aus E.coli beschriebenen Methode ein alter natives Testsystem entwickelt, mit dem die pflanzliche PRPP-Ami dotransferase Aktivität im Proteinextrakt anhand der Bildung des Reaktionsproduktes Glutamat nachgewiesen wird. Die Konzentration des entstehenden Glutamats wird dabei durch Umsetzung mit Gluta mat-Dehydrogenase (GluDH) und photometrische Verfolgung der APADH-Bildung bei 363 nm gemessen.

(PRPP = Phosphoribosylpyrophosphat, PRA = Phosphoribosylamin, APAD = 3-Acetylpyridin-Adenin-Dinucleotid, PRAT = PRPP-Amido transferase)

Dazu wurde der Reaktionsansatz (s. u.) für bis zu 60 Minuten bei 37°C inkubiert und die Reaktion durch 5-minütige Inkubation bei 95°C gestoppt.

Reaktionsansatz

Der Nachweis des gebildeten Glutamats erfolgte im Nachweisansatz (s. u.) durch photometrische Messung der APADH-Zunahme bei 363 nm nach Zugabe der Glutamat-Dehydrogenase.

Nachweisansatz

Start der Nachweisreaktion mit 2 µl (ca. 4 Units) Glutamat Dehydrogenase (Sigma)

Das Testsystem eignet sich in besonderer Weise zur Messung der PRPP-Amidotransferase Aktivität aus Pflanzenmaterial und in Ex pressionsextrakten zum Beispiel aus Baculovirus-infizierten In sektenzellen.

Beispiel 4

Funktionale Expression von PRPP-Amidotransferase aus Tabak in In sektenzellen

Zur Expression von Ntpur1.1 in Baculovirus-infizierten Insekten zellen wurde das Bacto-Bac-Expressionssystem der Firma GibcoBRL eingestzt. Dazu wurde Ntpur1.1 für eine PCR eingesetzt. Die Reak tionsgemische enthielten ca. 1 ng/µl Ntpur1.1 DNA, 0,5 µM der Oligonukleotide 5'-tat agg atc cat gga etc cta ttt tga cg-3' und 5'-atg aat tct age tgg tte taa ctt c-3', 200 µM Desoxy-Nukleotide (Pharmacia), 0.04 U/µl Pfu Polymerase (Stratagene) und wurde auf Pufferbedingungen nach Angaben des Herstellers eingestellt.

Die Amplifikationsbedingungen wurden wie folgt eingestellt:

Step 1:
Denaturierungstemperatur: 95°C, 0,5 min
Anlagerungstemperatur: 40°C, 0,5 min
Elongationstemperatur: 72°C, 2 min
Anzahl der Zyklen für Step 1: 2

Step 2:
Denaturierungstemperatur: 95°C, 0,5 min
Anlagerungstemperatur: 50°C, 0,5 min
Elongationstemperatur: 72°C, 3 min
Anzahl der Zyklen für Step 2: 25

Das PCR-Produkt wurde in den mit StuI geschnittenen Vector pFast- Bac1 (GibcoBRL) ligiert. Die korrekte Orientierung des Inserts wurde durch Kontrollverdau mit KpnI sichergestellt. Der erhaltene Transfervector pFastBacNtpur1.2 wurde nach Herstellerangaben zur Erzeugung rekombinanter Baculoviren mittels Sf21 Insektenzellen (Invitrogen) verwendet. Mit dem rekombinanten Baculovirus (BvNtpur1.2) wurden Sf21 Insektenzellen infiziert. Die Zellen wurden nach 2-4 Tagen durch Zentrifugation geerntet. Durch SDS- Polyacrylamid-Gelelektrophorese konnte im Gesamtextrakt ein Pro- tein von ca. 54kDa1 entprechend der erwarteten Größe der PRPP- Amidotransferase identifiziert werden. Ein Gesamtzellextrakt wurde nach der Druckaufschlußmethode ("French-Press") in Extrak tionspuffer (100 mM HEPES pH 8,0; 2,5 mM EDTA; 10% Glycerol; 20 mM DTE; 0,2 mM PEFA-Block) erzeugt und nach Entsalzung über eine PD10-Säule (Pharmacia) zur Messung der PRPP-Amidotransferase Aktivität im beschriebenen Assay (siehe Beispiel 3) verwendet.

Beispiel 5 Erzeugung von Vektoren zur Pflanzentransformation

Zur Erzeugung binärer Vektoren für die Pflanzentransformation wurde der Klon Ntpur1.1 mit SmaI und EcoRV gespalten und ein 1482 bp umfassendes Fragment isoliert, welches in den mit SmaI gespal tenen Vektro pBinAR (Höfgen und Willmitzer, Plant Science 66(1990), 221-230) ligiert wurde. Die auf diese Weise erhaltenen Antisense- bzw. Sense-Konstrukte wurden mit pBinAR-Ntpur1A bzw. pBinAR-Ntpur1 bezeichnet, siehe Abb. 1.

Beispiel 6 Erzeugung transgener Tabakpflanzen

Die Plasmide pBinAR-Ntpur1A bzw. pBinAR-Ntpur1 wurden in Agrobac terium tumefaciens C58C1:pGV2260 transformiert (Deblaere et al., Nucl. Acids. Res. 13(1984), 4777-4788). Zur Transformation von Tabakpflanzen (Nicotiana tabacum cv. Samsun NN) wurde eine 1 : 50 Verdünnung einer Übernachtkultur einer positiv transformierten Agrobakterienkolonie in Murashige-Skoog Medium (Murashige und Skoog Physiol. Plant. 15(1962), 473) mit 2% Saccharose (2MS-Me dium) benutzt. Blattscheiben steriler Pflanzen (zu je ca. 1 cm²) wurden in einer Petrischale mit einer 1 : 50 Agrobakterienverdün nung für 5-10 Minuten inkubiert. Es folgte eine 2-tägige Inkuba tion in Dunkelheit bei 25°C auf 2MS-Medium mit 0,8% Bacto-Agar. Die Kultivierung wurde nach 2 Tagen mit 16 Stunden Licht/8 Stun den Dunkelheit weitergeführt und in wöchentlichem Rhythmus auf MS-Medium mit 500 mg/l Claforan (Cefotaxime-Natrium), 50 mg/l Ka namycin, 1 mg/l Benzylaminopurin (BAP), 0,2 mg/l Naphtylessig säure und 1,6 g/l Glukose weitergeführt. Wachsende Sprosse wurden auf MS-Medium mit 2% Saccharose, 250 mg/l Claforan und 0,8% Bacto-Agar überführt.

Regenerierte Sprosse wurden auf 2MS-Medium mit Kanamycin und Cla foran erhalten, nach Bewurzelung in Erde überführt und nach Kul tivierung für zwei Wochen in einer Klimakammer im 16 Stunden hell/8 Stunden dunkel-Rhythmus bei 60% Luftfeuchte auf PRPP-Ami- dotransferase Expression und -Aktivität sowie auf veränderte Me tabolitgehalte und phänotypische Wachstumsmerkmale untersucht. Veränderte Nukleotidgehalte können z. B. nach der Methode von Stitt et al., FEBS Letters 145(1982), 217-222 bestimmt werden.

Beispiel 7 Analyse transgener Pflanzen

Transgene Pflanzen, die mit dem Konstrukt mit pBinAR-Ntpur1 transformiert wurden sind gekennzeichnet durch ein in unter schiedlichem Maße verringertes Wachstum sowie ein großflächiges Ausbleichen der Blätter im Vergleich zu untransformierten Kontrollpflanzen. Die RNA-Analyse durch die Northernblot-Technik wies in transgenen Linien mit dem beschriebenen Phänotyp eine verringerte Menge an Ntpur1.1-RNA auf.

Um die Korellation zur Wachstumsreduktion zu testen, wurde die PRPP-Amidotransferase Aktivität in den transgenen Linien gemessen und mit jener in untransformierten Kontrollen verglichen. Dazu wurden je ca. 30 g Blätter von ca. 20 cm hohen Pflanzen mit 50 ml Extraktionspuffer bei +4°C homogenisiert.

Extraktionspuffer:
100 mM HEPES pH 8,0
2,5 mM EDTA
10% Glycerol
20 mM DTE
0,2 mM PEFA-Block (40 mM)

Der Aufschlußextrakt wurde durch Miracloth (Calbiochem, Bad So den) filtriert und bei 16000 rpm in der Sorval Zentrifuge zentri fugiert. Der resultierende Überstand wurde mit Ammoniumsulfat bei 4°C gefällt. Die 30%-60%-Stufe wurde im Extraktionspuffer solubilisiert und über eine PD-10-Säule (Pharmacia, Schweden) entsalzt. Der so gewonnene Extrakt ist mindestens 24 h stabil, und kann bei -20°C nach Zusatz von Glycerol (50% Endkonzen tration) für längere Zeit gelagert werden. Der Extrakt kann di rekt zur Aktivitätsbestimmung eingesetzt werden.

Diese Daten stellen einen direkten Zusammenhang zwischen verrin gerter PRPP-Amidotransferase Aktivität und verringertem Wachstum der Tabakpflanzen her und weisen daher PRPP-Amidotransferase erstmals als geeignetes Zielprotein für herbizide Wirkstoffe aus.

Beispiel 8 Suche nach Inhibitoren der PRPP-Amidotransferase Aktivität

Zur Suche nach Inhibitoren der PRPP-Amidotransferase Aktivität kann der in Beispiel 3 beschriebene in vitro Assay mit Hochdurch satzmethoden verwendet werden. Die PRPP-Amidotransferase Aktivität kann dazu aus Pflanzengeweben präpariert werden, siehe Beispiel 7. Alternativ kann eine pflanzliche PRPP-Amidotransfe rase in E.coli, Insektenzellen oder einem anderen geeigneten Ex pressionssystem exprimiert werden. Auf diese Weise wurden be kannte PRPP-Amidotransferase Inhibitoren - wie Glutaminantagoni sten - identifiziert.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. DNA-Sequenz, enthaltend die Kodierregion einer pflanzlichen PRPP-Amidotransferase, dadurch gekennzeichnet, daß diese DNA- Sequenz die Nukleotidabfolge SEQ-TD No. 1 oder SEQ-ID No. 3 aufweist.

2. DNA-Sequenzen, die mit der DNA-Sequenz SEQ-ID No. 1 oder SEQ-ID No. 3 gemäß Anspruch 1 oder Teilen davon oder Deriva ten, die durch Insertion, Deletion oder Substitution von die sen Sequenzen abgeleitet sind, hybridisieren und für ein Pro tein kodieren, das die biologische Aktivität einer PRPP-Amido transferase besitzt.

3. Protein mit PRPP-Amidotransferase Aktivität, enthaltend eine Aminosäuresequenz, die eine Teilsequenz von mindestens 100 Aminosäuren aus SEQ-ID No. 2 oder SEQ-ID No. 4 darstellt.

4. Protein nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß es als Aminosäuresequenz die Teilsequenz 100-450 aus SEQ-ID No. 2 oder SEQ-ID No. 4 enthält.

5. Protein nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß es als Aminosäuresequenz die in SEQ-ID No. 2 oder SEQ-ID No. 4 dar gestellte Sequenz enthält.

6. Verwendung einer DNA-Sequenz nach Anspruch 1 oder 2 zur Ein führung in pro- oder eukaryontische Zellen, wobei diese Se quenz gegebenenfalls mit Steuerelementen, die die Transkrip tion und Translation in den Zellen gewährleisten, verknüpft ist und zur Expression einer translatierbaren mRNA, die die Synthese einer pflanzlichen PRPP-Amidotransferase bewirkt, führt.

7. Verwendung einer DNA-Sequenz nach Anspruch 1 oder 2 zur Her stellung eines Testsystems zur Identifizierung von Inhibitoren der pflanzlichen PRPP-Amidotransferase mit herbizider Wirkung.

8. Testsystem basierend auf der Expression einer DNA-Sequenz SEQ-ID No. 1 oder SEQ-ID No. 3 nach Anspruch 1 oder 2 zur Identifizierung von Inhibitoren der pflanzlichen PRPP-Amido transferase mit herbizider Wirkung.

9. Pflanze mit modifiziertem Gehalt an Purinnukleotiden herge stellt durch zusätzliche Expression einer DNA-Sequenz SEQ-ID No. 1 oder SEQ-ID No. 3 nach Anspruch 1 oder 2 in Sense- oder Antisense-Orientierung.