EP1222293A2 - Gmp-synthetase aus pflanzen - Google Patents

Gmp-synthetase aus pflanzen

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Publication number
EP1222293A2
EP1222293A2 EP00966064A EP00966064A EP1222293A2 EP 1222293 A2 EP1222293 A2 EP 1222293A2 EP 00966064 A EP00966064 A EP 00966064A EP 00966064 A EP00966064 A EP 00966064A EP 1222293 A2 EP1222293 A2 EP 1222293A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
plant
gmp synthetase
gmp
plants
activity
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP00966064A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Jens Lerchl
Thomas Ehrhardt
Uwe Sonnewald
Ralf Boldt
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BASF SE
Original Assignee
BASF SE
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Filing date
Publication date
Application filed by BASF SE filed Critical BASF SE
Publication of EP1222293A2 publication Critical patent/EP1222293A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/93—Ligases (6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance

Definitions

  • methylxanthines such as caffeine and theobromine, in particular in plant families of the Rubiaceae and Theaceae.
  • IMP phosphoribosyl pyrophosphate
  • PRPP phosphoribosyl pyrophosphate
  • IMP is synthesized in a 10-step reaction sequence. In subsequent reactions, IMP can be converted to AMP by adenylosuccinate synthetase and adenylosuccinate lyase.
  • IMP is first converted to XMP by IMP dehydrogenase, which is aminated to GMP by GMP synthetase, see Fig. 1.
  • GMP-synthetase Genes coding for GMP-synthetase have been isolated from different organisms.
  • GMP synthetase also plays a role in the balanced synthesis of guanosine nucleotides and adenosine nucleotides, since ATP is a substrate of GMP synthetase.
  • the object of the present invention was to demonstrate that GMP synthetase is a suitable herbicidal target in plants, the isolation of a complete plant cDNA coding for the enzyme GMP synthetase and its functional expression in bacterial or eukaryotic cells, and the production of an efficient and simple GMP synthetase test system for performing inhibitor-enzyme binding studies.
  • the object was achieved by isolating a gene coding for the plant enzyme GMP synthetase, the production of antisense constructs of the GMP synthetase, and the functional expression of the GMP synthetase in bacterial or eukaryotic cells.
  • One object of the present invention relates to the isolation of a full-length cDNA coding for a functional glutamine-hydrolyzing GMP synthetase (EC 6.3.5.2.) From tobacco (Nicotiana tabacum).
  • a first object of the present invention is a DNA sequence SEQ-ID NO: 1 containing the coding region of a plant GMP synthetase from tobacco, see Example 1.
  • Another object of the invention is a DNA sequence SEQ-ID No. 3 containing a part of the coding region of a plant GMP synthetase from Physcomitrella patens, see Example 2.
  • the invention furthermore relates to DNA sequences which are derived from SEQ-ID NO: 1 or SEQ-ID No: 3 or which hybridize with one of these sequences and which code for a protein which has the biological activity of a GMP synthetase.
  • Nicotiana tabacum cv. Samsun NN which carry an antisense construct of GMP synthetase, have been characterized in more detail.
  • the plants show growth retardation to different degrees.
  • the transgenic lines as well as the descendants as 1st and 2nd generation showed a reduced growth in soil.
  • a reduced amount of GMP-7M RNA compared to the wild type could be detected in the Northern hybridization.
  • a reduced amount of GMP synthetase in the transgenic lines could be detected in the Western blot experiment compared to wild type plants, see Example 7.
  • a correlation between growth retardation and reduction of the GMP synthetase protein amount can be determined. This clear connection clearly shows GMP synthetase for the first time as a suitable target protein for herbicidal active ingredients.
  • the expression cassette containing a DNA sequence SEQ-ID No. 1 are expressed, for example, in other bacteria, in yeasts, fungi, algae, plant cells, insect cells or mammalian cells, see Example 5.
  • the GMP synthetase protein expressed with the aid of the expression cassette according to the invention is particularly suitable for the detection of inhibitors specific for GMP synthetase.
  • the plant GMP synthetase can be used, for example, in an enzyme test in which the activity of the GMP synthetase is determined in the presence and absence of the active substance to be tested. By comparing the two activity determinations, a qualitative and quantitative statement about the Make inhibitory behavior of the active substance to be tested, see Example 8.
  • test system With the help of the test system according to the invention, a large number of chemical compounds can be checked quickly and easily for herbicidal properties.
  • the method makes it possible to selectively reproducibly select those with great potency from a large number of substances, in order to subsequently carry out further in-depth tests known to the person skilled in the art.
  • Another object of the invention is a method for identifying substances with herbicidal activity which inhibit GMP synthetase activity in plants, consisting of
  • transgenic plants, plant tissues or plant cells which contain an additional DNA sequence coding for an enzyme with GMP synthetase activity and are capable of overexpressing an enzymatically active GMP synthetase;
  • Another object of the invention is a method for the identification of inhibitors of plant GMP synthetases, with potentially herbicidal activity by the gene of a plant GMP synthetase is cloned, overexpressed in a suitable expression cassette - for example in insect cells -, the cells are opened and the cell extract is used directly or after enrichment or isolation of the enzyme GMP synthetases in a test system for measuring the enzyme activity in the presence of low molecular weight chemical compounds ,
  • the invention further relates to compounds with herbicidal activity which can be identified using the test system described above.
  • Another object of the invention is a method for eliminating undesirable plant growth, characterized in that the plants to be removed are treated with a compound which specifically binds to plant GMP synthetase and inhibits their function.
  • Inhibitors of GMP synthetase with herbicidal activity can be used as defoliants, desiccants, haulm killers and in particular as weed killers. Weeds in the broadest sense are understood to mean all plants that grow up in places where they are undesirable. Whether the active ingredients found with the aid of the test system according to the invention act as total or selective herbicides depends, among other things, on the amount used.
  • Inhibitors of GMP synthetase with herbicidal activity can be used, for example, against the following weeds:
  • the invention also relates to expression cassettes, the sequence of which codes for a GMP synthetase from tobacco or its functional equivalent.
  • the nucleic acid sequence can be, for example, a DNA or a cDNA sequence.
  • the invention also relates to an expression cassette containing a DNA sequence SEQ-ID No. 3 coding for part of the plant GMP synthetase from Physcomitrella patens.
  • an expression cassette according to the invention also contain regulatory nucleic acid sequences which control the expression of the coding sequence in the host cell.
  • an expression cassette according to the invention comprises upstream, i.e. at the 5 'end of the coding sequence, a promoter and downstream, i.e. at the 3 'end, a polyadenylation signal and optionally further regulatory elements which are operatively linked to the intervening coding sequence for the GMP synthetase gene.
  • An operative link is understood to mean the sequential arrangement of promoter, coding sequence, terminator and, if appropriate, further regulatory elements in such a way that each of the regulatory elements can fulfill its function as intended when expressing the coding sequence.
  • An expression cassette according to the invention is produced by fusing a suitable promoter with a suitable GMP synthetase DNA sequence and a polyadenylation signal using conventional recombination and cloning techniques, as described, for example, in J. Sambrook et al. , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) and in T.J. Silhavy, M.L. Berman and L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) and in Ausubel, F.M. et al., Curent Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience (1987).
  • the invention also relates to functionally equivalent DNA sequences which code for a GMP synthetase and which, based on the total length of the DNA sequence, have sequence homology with the DNA sequence SEQ-ID NO: 1 or SEQ-ID No. 3 have from 40 to 100%.
  • the preferred subject of the invention are functionally equivalent DNA sequences which code for a GMP synthetase and which have a sequence homology based on the total length of the DNA sequence with the DNA sequence SEQ-ID NO: 1 or SEQ-ID No. 3 have from 60 to 100%.
  • a particularly preferred object of the invention are functionally equivalent DNA sequences which code for a GMP synthetase and which, based on the total length of the DNA sequence, have a sequence homology with the DNA sequence SEQ-ID NO: 1 or SEQ-ID No. 3 have from 80 to 100%.
  • Functionally equivalent sequences which code for a GMP synthetase are, according to the invention, those sequences which, despite a different nucleotide sequence, still have the desired functions.
  • Functional equivalents thus include naturally occurring variants of the sequences described here as well as artificial, e.g. nucleotide sequences obtained by chemical synthesis and adapted to the codon use of a plant.
  • a functional equivalent is also understood to mean, in particular, natural or artificial mutations of an originally isolated sequence coding for a GMP synthetase, which furthermore shows the desired function. Mutations include substitutions, additions, deletions, exchanges or insertions of one or more nucleotide residues.
  • the present invention also includes those nucleotide sequences which are obtained by modifying this nucleotide sequence. The aim of such a modification can e.g. further narrowing down the coding sequence contained therein or e.g. also the insertion of further restriction enzyme interfaces.
  • Functional equivalents are also those variants whose function is weakened or enhanced compared to the original gene or gene fragment.
  • the expression cassette according to the invention can also be used to transform bacteria, cyanobacteria, yeasts, filamentous fungi and algae with the aim of producing sufficient quantities of the enzyme GMP synthetase.
  • Another object of the invention is a protein from tobacco characterized by the amino acid sequence SEQ-ID NO: 2 or derivatives or parts of this protein with GMP synthetase activity.
  • the invention also relates to vegetable proteins with GMP synthetase activity with an amino acid sequence homology to the tobacco GMP synthetase of 20-100% identity. Vegetable proteins with GMP synthetase activity with an amino acid sequence homology to the tobacco GMP synthetase of 50-100% identity are preferred.
  • Vegetable proteins with GMP synthetase activity with an amino acid sequence homology to the tobacco GMP synthetase of 80-100% identity are particularly preferred.
  • the invention also relates to vegetable proteins with GMP synthetase activity with an amino acid sequence homology to the Physcomitrella patens GMP synthetase of 20-100% identity.
  • Vegetable proteins with GMP synthetase activity with an amino acid sequence homology to the Physcomitrella patens GMP synthetase of 50-100% identity are preferred.
  • Vegetable proteins with GMP synthetase activity with an amino acid sequence homology to the Physcomitrella patens GMP synthetase of 80-100% identity are particularly preferred.
  • Another object of the invention was the overexpression of the GMP synthetase gene in plants for the production of plants which are tolerant of inhibitors of GMP synthetase.
  • the effectiveness of the expression of the transgenically expressed GMP synthetase gene can be determined, for example, in vitro by proliferation or by a germination test.
  • a change in the type and level of expression of the GMP synthetase gene and its effect on the resistance to inhibitors of GMP synthetase on test plants can be tested in greenhouse experiments.
  • the invention also relates to transgenic plants, transformed with an expression cassette according to the invention, containing the DNA sequence SEQ-ID No. 1, which by additional expression of the DNA sequence SEQ-ID No. 1 have become tolerant of inhibitors of GMP synthetase, as well as transgenic cells, tissues, parts and propagation material of such plants.
  • Transgenic crop plants such as e.g. Barley, wheat,
  • a change in the nucleotide content in plants can be useful in various cases.
  • Plant-based baby food products are added with nucleotides, for example, in order to achieve a nutritional composition that corresponds to breast milk.
  • an optimized nucleotide content would be useful in the case of enteral feeding of patients.
  • a reduced purine nucleotide content in nutritionally relevant plants is relevant for the dietary nutrition of patients with gout.
  • Nucleotides also have a taste-enhancing and flavor-enhancing effect, so that a changed nucleotide content affects the taste properties of plants.
  • the invention therefore furthermore relates to plants which, after expression of the DNA sequence SEQ-ID NO: 1 or SEQ-ID No: 3, have a modified content of guanosine nucleotides in the plant.
  • a plant with a modified guanosine nucleotide content is, for example, expressed by expressing an additional DNA sequence SEQ-ID No. 1 or 3 produced in sense or antisense orientation in the plant.
  • Modified content of guanosine nucleotides means that both plants with an increased content of guanosine nucleotides with sense orientation and also plants with a reduced content of guanosine nucleotides with sense orientation (cosuppression) or antisense orientation can be produced.
  • increasing the content of guanosine nucleotides means, for example, the artificially acquired ability of an increased biosynthetic capacity for guanosine nucleotides by functional overexpression of the GMP synthetase gene in the plant compared to the non-genetically modified plant for at least one plant generation.
  • Another object of the invention is the use of plant GMP synthetases to change the concentrations of methylxanthines in plants.
  • sequences which target in the apoplasts, plastids, the vacuole, the mitochondrium, the endoplasmic reticulum (ER) or, owing to the lack of corresponding operative sequences, remain in the compartment of the ent Stand, the cytosol, ensure Kermode, Crit. Rev. Plant Sei. 15, 4 (1996), 285-423).
  • the plant expression cassette can be built into the Tobacco transformation vector pBinAR, see Example 6.
  • any promoter is suitable as promoters of the expression cassette according to the invention which express the expression of
  • a plant promoter or a plant virus-derived promoter is preferably used.
  • the CaMV 35S promoter from the cauliflower mosaic virus (Franck et al., Cell 21 (1980), 285-294) is particularly preferred. This promoter contains different ones
  • the expression cassette according to the invention can also contain a chemically inducible promoter, by means of which the expression of the exogenous GMP synthetase gene in the plant can be controlled at a specific point in time.
  • a chemically inducible promoter by means of which the expression of the exogenous GMP synthetase gene in the plant can be controlled at a specific point in time.
  • promoters as e.g. the PRPl promoter (Ward et al., Plant. Mol. Biol. (1993) 22,
  • promoters are particularly preferred which ensure expression in tissues or parts of plants in which
  • Promoters that ensure leaf-specific expression should be mentioned in particular.
  • the promoter of the cytosolic FBPase from potatoes or the ST-LSI promoter from potatoes should be mentioned (Stockhaus et al., EMBO J., (1989) 8, 2445-2451).
  • a foreign protein can be stably expressed up to a proportion of 0.67% of the total soluble seed protein in the seeds of transgenic tobacco plants (Fiedler and Conrad, Bio / Technology (1995) 10, 1090-1094).
  • the expression cassette according to the invention can therefore, for example, be a seed-specific promoter (preferably the phaseolin Promoter, the USP or LEB4 promoter), the LEB4 signal peptide, the gene to be expressed and an ER retention signal.
  • a seed-specific promoter preferably the phaseolin Promoter, the USP or LEB4 promoter
  • the LEB4 signal peptide the gene to be expressed and an ER retention signal.
  • the inserted nucleotide sequence coding for a GMP synthase can be produced synthetically or obtained naturally or contain a mixture of synthetic and natural DNA components.
  • synthetic nucleotide sequences with codons are generated which are preferred by plants. These codons preferred by plants can be determined from codons with the highest protein frequency, which are expressed in most interesting plant species.
  • various DNA fragments can be manipulated in order to obtain a nucleotide sequence which expediently reads in the correct direction and which is equipped with a correct reading frame.
  • adapters or linkers can be attached to the fragments.
  • artificial DNA sequences are suitable as long as, as described above, for example, they impart the desired property of increasing the content of guanosine nucleotides in the plant by overexpressing the GMP synthetase gene in crop plants.
  • Such artificial DNA sequences can be determined, for example, by back-translation of proteins constructed using molecular modeling, which have GMP synthetase activity, or by in vitro selection. Coding DNA sequences which are obtained by back-translating a polypeptide sequence in accordance with the codon usage specific for the host plant are particularly suitable. The specific codon usage can easily be determined by a person skilled in plant genetic methods by computer evaluations of other, known genes of the plant to be transformed.
  • Sequences which code for fusion proteins are to be mentioned as further suitable nucleic acid sequences according to the invention, part of the fusion protein being a plant GMP synthetase polypeptide or a functionally equivalent part thereof.
  • the second part of the fusion protein can be, for example, a further polypeptide with enzymatic activity or an antigenic polypeptide sequence with the aid of which it is possible to detect GMP synthetase expression (for example myc-tag or his-tag).
  • this is preferably a regulatory protein sequence, such as a signal or transit peptide, which directs the GMP synthetase protein to the desired site of action.
  • the promoter and terminator regions according to the invention should expediently be provided in the transcription direction with a linker or polylinker which contains one or more restriction sites for the insertion of this sequence.
  • the linker has 1 to 10, usually 1 to 8, preferably 2 to 6, restriction sites.
  • the linker has a size of less than 100 bp, often less than 60 bp, but at least 5 bp within the regulatory ranges.
  • the promoter according to the invention can be native or homologous as well as foreign or heterologous to the host plant.
  • the expression cassette according to the invention contains in the 5 '-3' transcription direction the promoter according to the invention, any sequence and a region for the transcriptional termination. Different termination areas are interchangeable.
  • Preferred polyadenylation signals are plant polyadenylation signals, preferably those which essentially correspond to T-DNA polyadenylation signals from Agrobacterium tumefaciens, in particular gene 3 of T-DNA (Oc opinion synthase) of the Ti plasmid pTiACH5 (Gielen et al., EMBO J 3 (1984) 835 ff) or functional equivalents.
  • an expression cassette according to the invention is installed as an insert in a recombinant vector whose vector DNA contains additional functional regulation signals, for example sequences for replication or integration.
  • Suitable vectors are inter alia in "Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology” (CRC Press), Chap. 6/7, p.71-119.
  • transformation The transfer of foreign genes into the genome of a plant is called transformation.
  • the methods described for the transformation and regeneration of plants from plant tissues or plant cells for transient or stable transformation are used. Suitable methods are protoplast transformation by polyethylene glycol-induced DNA uptake, the biolistic approach with the gene cannon, the electroporation, the incubation of dry embryos in DNA-containing solution, the microinjection and the gene transfer mediated by Agrobacterium.
  • the methods mentioned are described, for example, in B. Jenes et al. , Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, edited by SD Kung and R. Wu, Academic Press (1993) 128-143 and in Potrykus Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec.Biol.
  • the construct to be expressed is preferably cloned into a vector which is suitable for transforming Agrobacterium tumefaciens, for example pBin19 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711).
  • Agrobacteria transformed with an expression cassette according to the invention can also be used in a known manner to transform plants, in particular crop plants, such as cereals, maize, soybeans, rice, cotton, sugar beet, canola, sunflower, flax, hemp, potato, tobacco, tomato, rapeseed, alfalfa , Lettuce and the various tree, nut and wine species and legumes can be used, e.g. by bathing wounded leaves or leaf pieces in an agrobacterial solution and then cultivating them in suitable media.
  • crop plants such as cereals, maize, soybeans, rice, cotton, sugar beet, canola, sunflower, flax, hemp, potato, tobacco, tomato, rapeseed, alfalfa , Lettuce and the various tree, nut and wine species and legumes can be used, e.g. by bathing wounded leaves or leaf pieces in an agrobacterial solution and then cultivating them in suitable media.
  • the biosythesis site of pyrimidines is generally the leaf tissue, so that leaf-specific expression of the GMP synthetase gene is useful.
  • the pyrimidine biosynthesis need not be restricted to the leaf tissue, but can also be carried out in a tissue-specific manner in all other parts of the plant, for example in fatty seeds.
  • constitutive expression of the exogenous GMP synthetase gene is advantageous.
  • inducible expression may also appear desirable.
  • the expression cassettes according to the invention can be cloned into suitable vectors that enable their multiplication, for example in E. coli, to be cloned.
  • suitable cloning vectors include pBR322, pUC series, Ml3mp series and pA-CYC184.
  • Binary vectors which can replicate both in E. coli and in agrobacteria are particularly suitable.
  • Another object of the invention relates to the use of an expression cassette according to the invention for the transformation of plants, plant cells, plant tissues or parts of plants.
  • the aim of the use is preferably to increase the GMP synthetase content in the plant.
  • the expression can take place specifically in the leaves, in the seeds or in other parts of the plant.
  • Such transgenic plants, their reproductive material and their plant cells, tissue or parts are a further subject of the present invention.
  • Cloning methods such as Restriction cleavages, agarose gel electrophoresis, purification of DNA fragments, transfer of nucleic acids to nitrocellulose and nylon membranes, linking of DNA fragments, transformation of Escherichia coli cells, cultivation of bacteria and sequence analysis of recombinant DNA were carried out as in Sambrook et al. (1989) (Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-309-6).
  • the sequencing of recombinant DNA molecules was carried out with a laser fluorescence DNA sequencer from ABI according to the method of Sanger (Sanger et al. (1977), Proc. Natl. Acad. Sci. USA74, 5463-5467). Fragments resulting from a polymerase chain reaction were sequenced and checked in order to avoid polymerase errors in constructs to be expressed.
  • H0 treated, pyrogen-free water
  • DNA-modifying enzymes and molecular biology kits were developed by the companies AGS (Heidelberg), Amersham (Braunschweig), Biometra (Göttingen), Röche (Mannheim), Genomed (Bad Oeynhausen), New England Biolabs (Schwalbach / Taunus), Novagen ( Madison, Wisconsin, USA), Perkin-Elmer (further Stadt), Pharmacia (Freiburg) Qiagen (Hilden) and Stratagene (Heidelberg). Unless otherwise stated, they were used according to the manufacturer's instructions.
  • E. coli, XL-1 Blue The bacterial strains used below (E. coli, XL-1 Blue) were obtained from Stratagene.
  • E. coli AT 2465 was obtained from the coli genetic stock center (Yale University, New Haven).
  • the Agrobacterium strain used for plant transformation (Agrobacterium tumefaciens, C58C1 with the plasmid pGV2260 or pGV3850kan) was developed by Deblaere et al. (Nucl. Acids Res. 13 (1985) 4777).
  • the LBA4404 agrobacterial strain (Clontech) or other suitable strains can be used.
  • the vectors pUC19 (Yanish-Perron, Gene 33 (1985), 103-119) pBluescript SK- (Stratagene), pGEM-T (Promega), pZerO (Invitrogen), pBinl9 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711-8720) and pBinAR (Höfgen and Willmitzer, Plant Science 66 (1990) 221-230).
  • EST expressed sequence tag
  • the oligonucleotides 5'-aag gat cca agc tct aag acc cta tcc-3 x and 5 v -tta gat ctt tat tcc cat tcg atg g-3 ⁇ were used for polymerase amplification Chain reaction (PCR) of a 1000 bp cDNA frag with EST F14426 used as a template in a DNA thermal cycler from Perkin Elmer.
  • PCR polymerase amplification Chain reaction
  • the reaction mixtures contained 0.1 ng / ⁇ l cDNA from tobacco, 0.5 ⁇ M of the corresponding oligonucleotides, 200
  • the amplification conditions were set as follows:
  • the fragment was used to screen a cDNA library from Nicotiana tabacum callus tissue (variety Samsun NN) in the vector ZAP Express.
  • Nicotiana tabacum callus tissue variety Samsun NN
  • the PCR fragment described above was used as the hybridization probe and was radioactively labeled with the aid of a “Multiprime DNA labeling System” (Amersham Buchler) in the presence of ⁇ - 32 P-dCTP (specific activity 3000 Ci / mmol) according to the manufacturer's instructions.
  • the membranes were hybridized after prehybridization at 60 ° C. in 3 ⁇ SSPE, 0.1% sodium dodecyl sulfate (w / v), 0.02% polyvinylpyrrolidone (w / v), 0.02% Ficoll 400 (w / v) and 50 mg / ml calf thymus DNA for 12-16 hours (Sambrook et al.
  • GMP-6 represents a partial clone which is 5'-sided shortened by 217 nucleotides compared to GMP-7M.
  • GMP-7M is similar to GMP synthetics from microorganisms and animals.
  • the greatest similarity (62%) is to a GMP synthetase from Helicobacter pylori. It is also striking that the similarities between the C-termini of the GMP synthetases are greater than those in the area of the N-termini.
  • the N-terminus of the GMP-7M amino acid sequence corresponds to the N-termini of GMP synthetases from other organisms, such as E. coli and Synechocystis sp. (Table 1) .
  • GMP-7M has no pronounced signal sequences (determined by the program PSORT, Nakai, K., Institute for Molecular and Cellular Biology, Osaka University, Japan), which could indicate a cytosolic localization of the protein.
  • Table 1 The N-terminus of the GMP-7M amino acid sequence corresponds to the N-termini of GMP synthetases from other organisms, such as E. coli and Synechocystis sp.
  • GMP-7M GMP-7M
  • Arabidopsis thaliana gua_A_est_A. T, Genbank No. F14426
  • E. coli guaA_e.c, Genbank No. 146276
  • Synechocystis sp. guaA_syn, Genbank No. 1001583
  • Helieobacter pyori guaA_h.p, Genbank No. 3122166
  • Homo sapiens guaA_human, Genbank No. 1708072.
  • Double-stranded cDNA was generated from mRNA of different ages Protonemata from Physcomitrella patens and for the production of a
  • 093_dll has a length of 1232 nucleotides and codes on a continuous reading frame for 382 amino acids.
  • the comparison with GMP-7M shows that 093_dll is a partial cDNA.
  • the homology to GMP-7M is 66.7% at the nucleotide level and 74.6% at the amino acid level.
  • the GMP-7M cDNA was used as a template for a PCR with the oligonucleotides 5 x -CCTAGCCATGGAACCTCAAAC-3 and 5 x -TATAGGATCCTACTTTG-GTCACC-3 x .
  • the reaction mixtures contained approx. 0.1 ng GMP-7M DNA, 0.5 ⁇ of the corresponding oligonucleotides, 200
  • the amplification conditions were set as follows:
  • Annealing temperature 50 ° C, 30 sec denaturation temperature: 92 ° C, 30 sec elongation temperature: 72 ° C, 3 min number of cycles: 25
  • the fragment of approx. 1670 bp obtained was ligated into the vector pTrc99A (Pharmacia) via the Ncol and BamHI sites inserted by the oligonucleotides.
  • the construct GMP-7Trc obtained was transformed into the E.coli strain AT2465 (genetic marker: thi-1, guaA21, relAl, ⁇ , spoTl) and on M9 minimal media (Sambrook et al. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-309-6) with and without 100 ⁇ g / ml guanosine plated.
  • the minimal media contained 0.4% glucose, 0.2% casa noacids, 100 ug / ml thiamine, 100 ug / ml inosine, 100 ug / ml biotin, 100 ug / ml histidine, 100 ug / ml arginine, 100 ug / ml 2 'deoxyuridine, 100 ⁇ M IPTG and 25 ⁇ g / ml ampicillin.
  • the cloning vector pTrc99A was transformed into AT2465.
  • GMP-7M cDNA from tobacco in the expression vector pTrc 99 A (see Table 2), which strongly indicates that the GMP-7M cDNA encoded for an active GMP synthetase.
  • the enzyme encoded by GMP-7M is the first functional GMP synthetase isolated from plants.
  • IPTG-induced day cultures were harvested by centrifugation and the cell pellets were digested and further processed according to the manufacturer's instructions for nickel affinity chromatography ("Qia-Express-Kit", Qiagen). In this way, the GMP synthetase could be purified to more than 95% purity.
  • the protein was used according to conventional protocols to generate antisera in rabbits (carried out on behalf of the company Eurogentec, Herstal, Belgium).
  • GMP-7I construct was used according to the manufacturer's instructions (GibcoBRL) to generate recombinant Baculovirus.
  • this virus was used to infect Sf21 insect cells in order to produce active GMP synthetase, the activity of which after disruption of the cells in 50 mM Tris-HCl, pH 7, 6, 10 mM KC1, 1 mM EDTA, 10 mM PMSF and desalination of the extract on a Sephadex G-25 column (Pharmacia, Sweden) could be measured.
  • Leaf disks of sterile plants were incubated in a Petri dish with a 1:50 agrobacterial dilution for 5-10 minutes. This was followed by a 2-day incubation in the dark at 25 ° C. on 2MS medium with 0.8% Bacto agar. The cultivation was continued after 2 days with 16 hours of light / 8 hours of darkness and on a weekly basis on MS medium with 500 mg / 1 claforan (cefotaxime sodium), 50 mg / 1 kanamycin, 1 mg / 1 benzylaminopurine (BAP), 0.2 mg / 1 naphthylacetic acid and 1.6 g / 1 glucose continued.
  • agrobacterial dilution for 5-10 minutes. This was followed by a 2-day incubation in the dark at 25 ° C. on 2MS medium with 0.8% Bacto agar. The cultivation was continued after 2 days with 16 hours of light / 8 hours of darkness and on a weekly basis on MS medium with 500 mg / 1 claforan (cef
  • Growing shoots were transferred to MS medium with 2% sucrose, 250 mg / 1 Claforan and 0.8% Bacto agar. Regenerated shoots are obtained on 2MS medium with kanamycin and claforan, transferred to soil after rooting and after cultivation for two weeks in a climatic chamber in a 16 hour light / 8 hour dark rhythm at 60% humidity for foreign gene expression or altered metabolite levels and phenotypic growth characteristics examined. Altered nucleotide contents can, for example, according to the method of Stitt et al. (FEBS Letters, 145 (1982), 217-222).
  • the transgenic GMP synthase antisense plants and their subsequent generation were characterized by reduced growth compared to WT control plants and by fading of the sink leaves. These phenotypic changes occurred at an early stage of growth (see Fig. 3).
  • a reduced amount of GMP-7M RNA compared to the wild type could be detected in the Northern hydride.
  • 40 ⁇ g total RNA from sink leaves were used. Total RNA from plant tissues was, as in Logemann et al. (Anal. Biochem. 163 (1987), 21).
  • 40 ⁇ g RNA were separated in a 1.5% agarose gel containing formaldehyde and transferred to nylon membranes (Hybond, Amersham).
  • GMP synthetase in the transgenic lines could be detected in the Western blot experiment in comparison with wild type plants.
  • total protein extracts were produced from sink leaves, separated by standard methods in SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and transferred to nitrocellulose membranes. Detection was carried out using an IgG-alkaline phosphatase conjugate and the BCIP / NBT system (Sigma).
  • Example 8 Furthermore, the in vitro assay described in Example 8 showed a reduced GMP synthetase activity in transgenic lines with reduced growth.
  • the correlative relationship between the level of expression and the activity of the GMP synthetase and the growth phenotype suggests the suitability of the GMP synthetase as a target for herbicides.
  • the systems developed according to Spector for animal enzymes can be used to measure the plant GMP synthetase activity.
  • AMP formation is made possible by coupling the reaction with AMP kinase, pyruvate kinase, lactate dehydrogenase and measurement at 340 nm.
  • the second system is based on the direct detection of GMP (guanosine monophosphate) by using the radioactively labeled substrate XMP (xanthine monophosphate) and separation in thin layer chromatography.
  • the GMP synthetase activity can also be measured using a new system, namely the coupled detection of the glutamate formed.
  • This system offers the advantage of a smaller number of coupled reaction steps and delivers higher signal strengths.
  • GMP-S GMP synthetase
  • GluDH glutamate dehydrogenase
  • APAD 3-acetylpyridine adenine dinucleotide
  • reaction mixture (see below) was incubated at 37 ° C for 60 minutes and the reaction was stopped by incubating at 95 ° C for 5 minutes.
  • detection of the glutamate formed was carried out in the detection batch (see below) by photometric measurement of the APADH increase at 363 nm.
  • the GMP synthetase activity can be prepared from plant tissues.
  • a plant GMP synthetase can be found in E. coli, insect cells or another

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft eine DNA codierend für ein Polypeptid mit GMP-Synthetase (EC 6.3.5.2) Aktivität. Zudem betrifft die Erfindung die Verwendung dieser Nukleinsäure zur Herstellung eines Testsystems.

Description

gangsmetabolite zur Biosynthese von Methylxanthinen, wie Coffein und Theobromin insbesondere in Pflanzenfamilien der Rubiaceae und Theaceae dar .
Purinnukleotide werden in Mikroorganismen, Tieren und Pflanzen de novo auf gleiche Weise ausgehend von Phosphoribosylpyrophosphat (PRPP) gebildet. In einer 10-stufigen Reaktionsfolge wird IMP synthetisiert . IMP kann in Folgereaktionen durch Adenylosuccinat- Synthetase und Adenylosuccinat-Lyase zum AMP umgesetzt werden. Zur Synthese von GMP wird IMP zunächst durch die IMP-Dehydroge- nase zum XMP umgesetzt, welches durch die GMP-Synthetase zum GMP aminiert wird, siehe Abb. 1.
Gene, die für GMP-Sythetase kodieren, wurden aus verschiedenen Organismen isoliert.
Die Ko partimentierung des Purinbiosynthesewegs in Pflanzen wurde bisher nur wenig untersucht . Der in den Wurzelknöllchen der Leguminosen in Form von Glutamin und Aspartat fixierte Stickstoff wird über den de novo Syntheseweg zunächst in Purine überführt. In den Wurzelknöllchen von Glycine max und Vigna unguiculata L. , ist dieser Weg in den Piastiden lokalisiert (Boland and Schubert, Arch. Biochem. Biophys . 220 (1983), 179-187; Shelp et al . , Arch. Biochem. Biophys. 224 (1983), 429-441). Neueren Untersuchungen zufolge sind Enzymaktivitäten des Purinbiosynthesewegs in den Wurzelknöllchen von Vigna ungiculata zudem jedoch auch in Mito- chondrien zu finden (Atkins et al . , Plant Physiology 113 (1997), 127-135; Smith et al . , Plant Molecular Biology 36 (1998), 811-820) .
Die Regulation dieses Synthesewegs wurde bislang nur in Mikroorganismen und Tieren untersucht und umfaßt Transkriptionskontrolle, Endproduktinhibierung und allosterische Regulation. Eine Schlüsselstellung im tierischen, als auch pflanzlichen System wird dem Enzym PRPP-Amidotransferase (PRPP-ATAse) des zweiten Reaktionsschritts zugeschrieben, welches durch die Endprodukte IMP, AMP und GMP allosterisch reguliert wird (Reynolds et al . , Archi- ves of Bioche istry and Biophysics 229 (1984), 623-631).
Die GMP-Synthetase spielt auch hinsichtlich einer balancierten Synthese von Guanosinnukleotiden und Adenosinnukleotiden eine Rolle, da ATP ein Substrat der GMP-Synthetase ist.
Da Pflanzen auf einen funktionierenden Nukleotidstoffwechsel an- gewiesen sind, bietet sich dieser Stoffwechsel als mögliches Ziel für neue Herbizide an. Tatsächlich wurden bereits Wirkstoffe beschrieben, die inhibierend auf Enzyme der de novo Purinbiosynt- hese wirken. Beispielhaft ist 5 '-Phosphohydantocidin zu nennen, welches ein Enzym des pflanzlichen Purin-Stoffwechsels, die Ade- nylosuccinat-Synthetase (ASS), inhibiert (Siehl et al . , Plant Physiol. 110 (1996), 753-758). Ferner existieren Inhibitoren für Enzyme dieses Stoffwechselweges aus Tieren und Mikroorganismen. Folat-Analoga inhibieren diverse Folat-abhängige Reaktionen, unter anderem das Enzym GAR-Transfor ylase und wirken antiproli- ferativ, antiinflammatorisch und immunosuppressiv. Mycophenolat (MPA) wirkt als Hemmstoff der IMP-Dehydrogenase antimikrobiell, antiviral und immunosuppressiv (Kitchin et al . , Journal of the American Academy of Dermatology 37 (1997) , 445-449) .
Der Nachweis der Eignung eines Enzyms als Herbizid-Target kann zum Beispiel durch Verringerung der Enzymaktivität mittels der Antisensetechnik in transgenen Pflanzen gezeigt werden. Wird auf diese Weise ein verringertes Wachstum bewirkt, so läßt sich damit auf eine Eignung des in seiner Aktivität reduzierten Enzyms als Wirkort für herbizide Wirkstoffe schließen. Beispielhaft wurde dies für die Acetolactat-Synthase an transgenen Kartoffelpflanzen gezeigt (Höfgen et al . , Plant Physiology 107 (1995), 469-477).
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es zu belegen, daß GMP- Synthetase in Pflanzen ein geeignetes herbizides Target ist, die Isolierung einer vollständigen pflanzlichen cDNA kodierend für das Enzym GMP-Synthetase und deren funktioneile Expression in bakteriellen oder eukaryontisehen Zellen, sowie die Herstellung eines effizienten und einfachen GMP-Synthetase Testsystems für die Durchführung von Inhibitor-Enzym-BindungsStudien.
Die Aufgabe wurde gelöst durch Isolierung eines für das pflanzliche Enzym GMP-Synthetase kodierenden Gens, der Herstellung von Antisensekonstrukten der GMP-Synthetase, sowie der funktionellen Expression der GMP-Synthetase in bakteriellen oder eukaryonti- schen Zellen.
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft die Isolierung einer Vollängen-cDNA codierend für eine funktionelle Glutamin-hy- drolysierende GMP-Synthetase (EC 6.3.5.2.) aus Tabak (Nicotiana tabacum) .
Ein erster Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine DNA-Sequenz SEQ-ID NO:l enthaltend die Kodierregion einer pflanzlichen GMP-Synthetase aus Tabak, siehe Beispiel 1. Ein anderer Gegenstand der Erfindung ist eine DNA-Sequenz SEQ-ID No. 3 enthaltend einen Teil der Kodierregion einer pflanzlichen GMP-Synthetase aus Physcomitrella patens, siehe Beispiel 2.
Weiterer Gegenstand der Erfindung sind DNA-Sequenzen, die von SEQ-ID NO: 1 oder SEQ-ID No : 3 abgeleitet sind oder mit einer dieser Sequenzen hybridisieren und die für ein Protein kodieren, das die biologische Aktivität einer GMP-Synthetase besitzt.
Tabakpflanzen der Linie Nicotiana tabacum cv. Samsun NN, die ein Antisensekonstrukt der GMP-Synthetase tragen, wurden näher charakterisiert. Die Pflanzen zeigen in unterschiedlichem Maße eine Wachstumsretardierung. Die transgenen Linien sowie die Nachkommen als 1. und 2. Generation wiesen ein verringertes Wachstum in Erde auf . In Pflanzen mit verringertem Wachstum konnte eine im Vergleich zum Wildtyp reduzierte GMP-7M RNA-Menge in der Northern- Hybridisierung detektiert werden. Ferner konnte im Western-blot Experiment eine im Vergleich mit Wildtyppflanzen verringerte Menge der GMP-Synthetase in den transgenen Linien detektiert wer- den, siehe Beispiel 7. Es läßt sich eine Korellation zwischen Wachstumsretardierung und Reduktion der GMP-Synthetase Proteinmenge feststellen. Dieser klare Zusammenhang weist GMP-Synthetase erstmals eindeutig als geeignetes Zielprotein für herbizide Wirkstoffe aus .
Um effiziente Hemmstoffe der pflanzlichen GMP-Synthetase finden zu können, ist es notwendig, geeignete Testsysteme, mit denen Inhibitor-Enzym-Bindungsstudien durchgeführt werden können, zur Verfügung zu stellen. Hierzu wird beispielsweise die komplette cDNA-Sequenz der GMP-Synthetase aus Tabak in einen Expressionsvektor (pQE, Qiagen) kloniert und in E. coli überexprimiert , siehe Beispiel 4.
Alternativ kann jedoch die Expressionskassette enthaltend eine DNA-Sequenz SEQ-ID No. 1 beispielsweise in anderen Bakterien, in Hefen, Pilzen, Algen, Pflanzenzellen, Insektenzellen oder Säugetierzellen exprimiert werden, siehe Beispiel 5.
Das mit Hilfe der erfindungsgemäßen Expressionskassette expri- mierte GMP-Synthetase-Protein eignet sich besonders zur Auffindung von für die GMP-Synthetase spezifischen Hemmstoffen.
Dazu kann die pflanzliche GMP-Synthetase beispielsweise in einem Enzymtest eingesetzt werden, bei dem die Aktivität der GMP- Synthetase in An- und Abwesenheit des zu testenden Wirkstoffs ermittelt wird. Aus dem Vergleich der beiden Aktivitätsbestimmungen läßt sich eine qualitative und quantitative Aussage über das Hemmverhalten des zu testenden Wirkstoffes machen, siehe Beispiel 8.
Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Testsystems kann eine Vielzahl von chemischen Verbindungen schnell und einfach auf herbizide Eigenschaften überprüft werden. Das Verfahren gestattet es, reproduzierbar aus einer großen Anzahl von Substanzen gezielt solche mit großer Wirkstärke auszuwählen, um mit diesen Substanzen anschließend weitere, dem Fachmann geläufige vertiefte Prüfungen durchzuführen.
Weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Identifizierung von Substanzen mit herbizider Wirkung, die die GMP- Synthetase Aktivität in Pflanzen hemmen, bestehend aus
a) der Herstellung von transgenen Pflanzen, Pflanzengeweben, oder Pflanzenzellen, die eine zusätzliche DNA-Sequenz codierend für ein Enzym mit GMP-Synthetase Aktivität enthalten und in der Lage sind eine enzymatisch aktive GMP-Synthetase über- zuexprimieren;
b) das Aufbringen einer Substanz auf transgene Pflanzen, Pflanzenzellen, Pflanzengewebe oder Pflanzenteile sowie auf nicht- transformierten Pflanzen, Pflanzenzellen, Pflanzengewebe oder Pflanzenteile;
c) das Bestimmen des Wachstums oder der Überlebensfähigkeit der transgenen und der nicht-transformierten Pflanzen, Pflanzenzellen, Pflanzengewebe oder Pflanzenteile nach der Aufbrin- gung der chemischen Substanz; und
d) dem Vergleich des Wachstums oder der Überlebensfähigkeit der transgenen und der nicht-transformierten Pflanzen, Pflanzenzellen, Pflanzengewebe oder Pflanzenteile nach der Aufbrin- gung der chemischen Substanz;
wobei die Unterdrückung des Wachstums oder der Überlebensfähigkeit der nicht-transformierten Pflanzen, Pflanzenzellen, Pflanzengewebe oder Pflanzenteile ohne jedoch das Wachstum oder die Überlebensfähigkeit der transgenen Pflanzen, Pflanzenzellen,
Pflanzengewebe oder Pflanzenteile stark zu unterdrücken, belegt, daß die Substanz aus b) herbizide Aktivität zeigt und die GMP- Synthetase Enzymaktivität in Pflanzen inhibiert.
Weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Identifizierung von Inhibitoren pflanzlicher GMP-Synthetasen, mit potentiell herbizider Wirkung indem man das Gen einer pflanzlichen GMP-Synthetase kloniert, in einer geeigneten Expressionskassette - beispielsweise in Insektenzellen - zur Überexpression bringt, die Zellen öffnet und den Zellextrakt direkt bzw. nach Anreicherung oder Isolierung des Enzyms GMP-Synthetasen in einem Testsystem zur Messung der Enzymaktivität in Gegenwart von niedermolekularen chemischen Verbindungen einsetzt.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Verbindungen mit herbizider Wirkung, die mit dem oben beschriebenen Testsystem identifizierbar sind.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Beseitigung von unerwünschtem Pflanzenwuchs, dadurch gekennzeichnet, daß die zu beseitigenden Pflanzen mit einer Verbindung be- handelt werden, die spezifisch an pflanzliche GMP-Synthetase bindet und deren Funktion inhibiert .
Inhibitoren der GMP-Synthetase mit herbizider Wirkung können als Defoliants, Desiccants, Krautabtötungsmittel und insbesondere als Unkrautvernichtungsmittel verwendet werden. Unter Unkraut im weitesten Sinne sind alle Pflanzen zu verstehen, die an Orten aufwachsen, an denen sie unerwünscht sind. Ob die mit Hilfe des erfindungsgemäßen Testsystems gefundenen Wirkstoffe als totale oder selektive Herbizide wirken, hängt unter anderem von der an- gewandten Menge ab.
Inhibitoren der GMP-Synthetase mit herbizider Wirkung können beispielsweise gegen folgende Unkräuter verwendet werden:
Dikotyle Unkräuter der Gattungen:
Sinapis, Lepidium, Galium, Stellaria, Matricaria, Anthemis, Ga- linsoga, Chenopodium, Urtica, Senecio, Amaranthus, Portulaca, Xanthium, Convolvulus, Ipomoea, Polygonum, Sesbania, Ambrosia, Cirsium, Carduus, Sonchus, Ξolanum, Rorippa, Rotala, Lindernia, Lamium, Veronica, Abutilon, Emex, Datura, Viola, Galeopsis, Papa- ver, Centaurea, Trifolium, Ranunculus , Taraxacum.
Monokotyle Unkräuter der Gattungen:
Echinochloa, Setaria, Panicum, Digitaria, Phleu , Poa, Festuca, Eleusine, Brachiaria, Lolium, Bromus, Avena, Cyperus, Sorghum, Agropyron, Cynodon, Monochoria, Fimbristylis, Sagittaria, Eleo- charis, Scirpus, Paspalum, Ischaemum, Sphenoclea, Dactyloctenium, Agrostis, Alopecurus, Apera. Gegenstand der Erfindung sind auch Expressionskassetten, deren Sequenz für eine GMP-Synthetase aus Tabak oder deren funktionel- les Äquivalent kodiert. Die Nukleinsäuresequenz kann dabei z.B. eine DNA- oder eine cDNA-Sequenz sein.
Gegenstand der Erfindung ist auch eine Expressionskassette enthaltend eine DNA-Sequenz SEQ-ID No. 3 kodierend für einen Teil der pflanzlichen GMP-Synthetase aus Physcomitrella patens .
Die erfindungsgemäßen Expressionskassetten beinhalten außerdem regulative Nukleinsäuresequenzen, welche die Expression der kodierenden Sequenz in der Wirtszelle steuern. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt eine erfindungsgemäße Expressionskassette stromaufwärts, d.h. am 5 ' -Ende der kodierenden Sequenz, einen Promotor und stromabwärts, d.h. am 3 '-Ende, ein Polyadeny- lierungssignal und gegebenenfalls weitere regulatorische Elemente, welche mit der dazwischenliegenden kodierenden Sequenz für das GMP-Synthetase-Gen operativ verknüpft sind. Unter einer operativen Verknüpfung versteht man die sequenzielle Anordnung von Promotor, kodierender Sequenz, Terminator und ggf. weiterer regulativer Elemente derart, daß jedes der regulativen Elemente seine Funktion bei der Expression der kodierenden Sequenz bestimmungsgemäß erfüllen kann.
Die Herstellung einer erfindungsgemäßen Expressionskassette erfolgt durch Fusion eines geeigneten Promotors mit einer geeigneten GMP-Synthetase-DNA Sequenz und einem Polyadenylierungssignal nach gängigen Rekombinations- und Klonierungstechniken, wie sie beispielsweise in J. Sambrook et al . , Molecular Cloning: A Labo- ratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) sowie in T.J. Silhavy, M.L. Berman und L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) und in Ausubel, F.M. et al., Cur- rent Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience (1987) beschrieben sind.
Gegenstand der Erfindung sind auch funktioneil äquivalente DNA- Sequenzen, die für eine GMP-Synthetase kodieren und die bezogen auf die Gesamtlänge der DNA-Sequenz eine Sequenzhomologie mit der DNA-Sequenz SEQ-ID NO: 1 oder SEQ-ID No . 3 von 40 bis 100 % aufweisen.
Bevorzugter Gegenstand der Erfindung sind funktionell äquivalente DNA-Sequenzen, die für eine GMP-Synthetase kodieren und die bezogen auf die Gesamtlänge der DNA-Sequenz eine Sequenzhomologie mit der DNA-Sequenz SEQ-ID NO: 1 oder SEQ-ID No. 3 von 60 bis 100 % aufweisen.
Besonders bevorzugter Gegenstand der Erfindung sind funktioneil äquivalente DNA-Sequenzen, die für eine GMP-Synthetase kodieren und die bezogen auf die Gesamtlänge der DNA-Sequenz eine Sequenzhomologie mit der DNA-Sequenz SEQ-ID NO: 1 oder SEQ-ID No. 3 von 80 bis 100 % aufweisen.
Funktionen äquivalente Sequenzen, die für eine GMP-Synthetase kodieren, sind erfindungsgemäß solche Sequenzen, welche trotz abweichender Nukleotidsequenz noch die gewünschten Funktionen besitzen. Funktionelle Äquivalente umfassen somit natürlich vorkommende Varianten der hierin beschriebenen Sequenzen sowie künstli- ehe, z.B. durch chemische Synthese erhaltene, an den Kodon-Ge- brauch einer Pflanze angepaßte, Nukleotid-Sequenzen.
Unter einem funktioneilen Äquivalent versteht man insbesondere auch natürliche oder künstliche Mutationen einer ursprünglich isolierten für eine GMP-Synthetase kodierende Sequenz, welche weiterhin die gewünschte Funktion zeigt . Mutationen umfassen Substitutionen, Additionen, Deletionen, Vertauschungen oder Inser- tionen eines oder mehrerer Nukleotidreste . Somit werden beispielsweise auch solche Nukleotidsequenzen durch die vorlie- gende Erfindung mit umfaßt, welche man durch Modifikation dieser Nukleotidsequenz erhält. Ziel einer solchen Modifikation kann z.B. die weitere Eingrenzung der darin enthaltenen kodierenden Sequenz oder z.B. auch die Einfügung weiterer Restriktionsenzym- Schnittstellen sein.
Funktionelle Äquivalente sind auch solche Varianten, deren Funktion, verglichen mit dem Ausgangsgen bzw. Genfragment, abgeschwächt oder verstärkt ist.
Die erfindungsgemäße Expressionskassette kann darüberhinaus auch zur Transformation von Bakterien, Cyanobakterien, Hefen, filamen- tösen Pilzen und Algen mit dem Ziel der Herstellung von ausreichenden Mengen des Enzyms GMP-Synthetase eingesetzt werden.
Weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Protein aus Tabak gekennzeichnet durch die Aminosäuresequenz SEQ-ID NO: 2 bzw. Derivate oder Teile dieses Proteins mit GMP-Synthetase Aktivität .
Gegenstand der Erfindung sind auch pflanzliche Proteine mit GMP- Synthetase Aktivität mit einer Aminosäuresequenzhomologie zu der Tabak GMP-Synthetase von 20 - 100 % Identität. Bevorzugt sind pflanzliche Proteine mit GMP-Synthetase Aktivität mit einer Aminosäuresequenzhomologie zu der Tabak GMP-Synthetase von 50 - 100 % Identität.
Besonders bevorzugt sind pflanzliche Proteine mit GMP-Synthetase Aktivität mit einer Aminosäuresequenzhomologie zu der Tabak GMP- Synthetase von 80 - 100 % Identität.
Gegenstand der Erfindung sind auch pflanzliche Proteine mit GMP- Synthetase Aktivität mit einer Aminosäuresequenzhomologie zu der Physcomitrella patens GMP-Synthetase von 20 - 100 % Identität.
Bevorzugt sind pflanzliche Proteine mit GMP-Synthetase Aktivität mit einer Aminosäuresequenzhomologie zu der Physcomitrella patens GMP-Synthetase von 50 - 100 % Identität.
Besonders bevorzugt sind pflanzliche Proteine mit GMP-Synthetase Aktivität mit einer Aminosäuresequenzhomologie zu der Physcomitrella patens GMP-Synthetase von 80 - 100 % Identität.
Weitere Aufgabe der Erfindung war die Überexpression des GMP- Synthetase Gens in Pflanzen zur Herstellung von Pflanzen, die tolerant gegenüber Inhibitoren der GMP-Synthetase sind.
Durch Überexpression der für eine GMP-Synthetase kodierenden Gensequenz SEQ-ID NO: 1 in einer Pflanze wird eine erhöhte Resistenz gegenüber Inhibitoren der GMP-Synthetase erreicht. Die derart hergestellten transgenen Pflanzen sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung.
Die Wirksamkeit der Expression des transgen exprimierten GMP- Synthetase-Gens kann beispielsweise in vitro durch Sproßmeristemvermehrung oder durch einen Keimungstest ermittelt werden. Zudem kann eine in Art und Höhe veränderte Expression des GMP- Synthetase-Gens und deren Auswirkung auf die Resistenz gegenüber Hemmstoffen der GMP-Synthetase an Testpflanzen in Gewächshausversuchen getestet werden.
Gegenstand der Erfindung sind außerdem transgene Pflanzen, trans- formiert mit einer erfindungsgemäßen Expressionskassette, enthaltend die DNA-Sequenz SEQ-ID No . 1, die durch zusätzliche Expression der DNA-Sequenz SEQ-ID No . 1 tolerant gegenüber Inhibitoren der GMP-Synthetase geworden sind, sowie transgene Zellen, Gewebe, Teile und Vermehrungsgut solcher Pflanzen. Besonders bevorzugt sind dabei transgene Kulturpflanzen, wie z.B. Gerste, Weizen,
Roggen, Mais, Soja, Reis, Baumwolle, Zuckerrübe, Canola, Sonnenblume, Flachs, Hanf, Kartoffel, Tabak, Tomate, Raps, Alfalfa, Sa- lat und die verschiedenen Baum-, Nuß- und Weinspezies, sowie Leguminosen.
Eine Veränderung des Nukleotidgehaltes in Pflanzen kann in ver- schiedenen Fällen von Nutzen sein. Säuglingsnahrungsprodukten auf pflanzlicher Basis werden beispielsweise Nukleotide zugesetzt, um eine der Muttermilch entsprechende NährstoffZusammensetzung zu erreichen. Weiterhin wäre ein optimierter Nukleotidgehalt im Falle der enteralen Ernährung von Patienten sinnvoll. Ein redu- zierter Purin-Nukleotidgehalt in ernährungsrelevanten Pflanzen ist für die diätetische Ernährung Gicht-kranker Patienten relevant. Nukleotide wirken ferner geschmacksbildend und geschmacksverstärkend, so daß sich ein veränderter Nukleotidgehalt auf geschmackliche Eigenschaften von Pflanzen auswirkt.
Weiterer Gegenstand der Erfindung sind daher Pflanzen, die nach Expression der DNA-Sequenz SEQ-ID NO: 1 oder SEQ-ID No: 3 in der Pflanze einen modifizierten Gehalt an Guanosinnukleotiden aufweisen.
Eine Pflanze mit modifiziertem Gehalt an Guanosinnukleotiden wird beispielsweise durch Expression einer zusätzlichen DNA-Sequenz SEQ-ID No. 1 oder 3 in sense- oder antisense-Orientierung in der Pflanze hergestellt. Modifizierter Gehalt an Guanosinnukleotiden bedeutet, daß sowohl Pflanzen mit erhöhtem Gehalt an Guanosinnukleotiden bei sense-Orientierung als auch Pflanzen mit erniedrigtem Gehalt an Guanosinnukleotiden bei sense-Orientierung (Cosup- pression) oder antisense-Orientierung hergestellt werden können.
Erhöhung des Gehaltes an Guanosinnukleotiden bedeutet beispielsweise im Rahmen der vorliegenden Erfindung die künstlich erworbene Fähigkeit einer erhöhten Biosyntheseleistung für Guanosinnu- kleotide durch funktionelle Überexpression des GMP-Synthetase- Gens in der Pflanze gegenüber der nicht gentechnisch modifizierten Pflanze für die Dauer mindestens einer Pflanzengeneration.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung pflanzlicher GMP-Synthetasen zur Veränderung der Konzentrationen von Methylxanthinen in Pflanzen.
Insbesondere bevorzugt sind Sequenzen, die ein Targeting in den Apoplasten, in Piastiden, die Vakuole, das Mitochondrium, das En- doplasmatische Retikulum (ER) oder durch ein Fehlen entsprechen- der operativer Sequenzen einen Verbleib im Kompartiment des Ent- Stehens, dem Zytosol, gewährleisten (Kermode, Crit. Rev. Plant Sei. 15, 4 (1996) , 285-423) .
Beispielhaft kann die pflanzliche Expressionskassette in den Ta- 5 bak-Transformationsvektor pBinAR eingebaut werden, siehe Beispiel 6.
Als Promotoren der erfindungsgemäßen Expressionskassette ist grundsätzlich jeder Promotor geeignet, der die Expression von
10 Fremdgenen in Pflanzen steuern kann. Vorzugsweise verwendet man insbesondere einen pflanzlichen Promotor oder einen Promotor, der einem Pflanzenvirus entstammt. Insbesondere bevorzugt ist der CaMV 35S-Promotor aus dem Blumenkohl-Mosaik-Virus (Franck et al . , Cell 21(1980), 285-294). Dieser Promotor enthält unterschiedliche
15 ErkennungsSequenzen für transkriptionale Effektoren, die in ihrer Gesamtheit zu einer permanenten und konstitutiven Expression des eingeführten Gens führen (Benfey et al . , EMBO J. 8 (1989), 2195-2202) .
20 Die erfindungsgemäße Expressionskassette kann auch einen chemisch induzierbaren Promotor enthalten, durch den die Expression des exogenen GMP-Synthetase-Gens in der Pflanze zu einem bestimmten Zeitpunkt gesteuert werden kann. Derartige Promotoren wie z.B. der PRPl-Promotor (Ward et al . , Plant.Mol. Biol . (1993) 22,
25 361-366) , ein durch Salizylsäure induzierbarer Promotor (WO 95/19443), ein durch Benzenesulfonamid-induzierbarer (EP 388186), ein durch Tetrazyklin-induzierbarer (Gatz et al . , Plant J. (1992) 2, 397-404), ein durch Abscisinsäure-induzier- barer (EP0335528) bzw. ein durch Ethanol- oder Cyclohexanon-indu-
30 zierbarer (WO 93/21334) Promotor sind in der Literatur beschrieben und können u.a. verwendet werden.
Weiterhin sind insbesonders solche Promotoren bevorzugt, die die Expression in Geweben oder Pflanzenteilen sicherstellen, in denen
35 die Biosynthese von Purinen bzw. dessen Vorstufen stattfindet.
Insbesondere zu nennen sind Promotoren, die eine blattspezifische Expression gewährleisten. Zu nennen sind der Promotor der cyto- solischen FBPase aus Kartoffel oder der ST-LSI Promotor aus Kartoffel (Stockhaus et al . , EMBO J., (1989) 8, 2445-2451).
40
Mit Hilfe eines samenspezifischen Promotors kann ein Fremdprotein stabil bis zu einem Anteil von 0,67% des gesamten löslichen Samenproteins in den Samen transgener Tabakpflanzen exprimiert werden (Fiedler und Conrad, Bio/Technology (1995) 10, 1090-1094) .
45 Die erfindungsgemäße Expressionskassette kann daher beispielsweise einen samenspezifischen Promotor (bevorzugt den Phaseolin- Promotor, den USP- oder LEB4-Promotor) , das LEB4-Signalpeptid, das zu exprimierende Gen und ein ER-Retentionssignal enthalten.
Die inserierte Nukleotid-Sequenz kodierend für eine GMP-Synthe- tase kann synthetisch hergestellt oder natürlich gewonnen sein oder eine Mischung aus synthetischen und natürlichen DNA-Bestandteilen enthalten. Im allgemeinen werden synthetische Nukleotid- Sequenzen mit Kodons erzeugt, die von Pflanzen bevorzugt werden. Diese von Pflanzen bevorzugten Kodons können aus Kodons mit der höchsten Proteinhäufigkeit bestimmt werden, die in den meisten interessanten Pflanzenspezies exprimiert werden. Bei der Präparation einer Expressionskassette können verschiedene DNA-Fragmente manipuliert werden, um eine Nukleotid-Sequenz zu erhalten, die zweckmäßigerweise in der korrekten Richtung liest und die mit einem korrekten Leseraster ausgestattet ist. Für die Verbindung der DNA-Fragmente miteinander können an die Fragmente Adaptoren oder Linker angesetzt werden.
Außerdem sind artifizielle DNA-Sequenzen geeignet, solange sie, wie oben beispielsweise beschrieben, die gewünschte Eigenschaft der Erhöhung des Gehaltes an Guanosinnukleotiden in der Pflanze durch Überexpression des GMP-Synthetase-Gens in Kulturpflanzen vermitteln. Solche artifiziellen DNA-Sequenzen können beispielsweise durch Rückübersetzung mittels Molecular Modelling kon- struierter Proteine, die GMP-Synthetase-Aktivität aufweisen oder durch in vitro-Selektion ermittelt werden. Besonders geeignet sind kodierende DNA-Sequenzen, die durch Rückübersetzung einer Polypeptidsequenz gemäß der für die Wirtspflanze spezifischen Ko- don-Nutzung erhalten wurden. Die spezifische Kodon-Nutzung kann ein mit pflanzengenetischen Methoden vertrauter Fachmann durch Computerauswertungen anderer, bekannter Gene der zu transformierenden Pflanze leicht ermitteln.
Als weitere erfindungsgemäße geeignete äquivalente Nukleinsäure- Sequenzen sind zu nennen Sequenzen, welche für Fusionsproteine kodieren, wobei Bestandteil des Fusionsproteins ein pflanzliches GMP-Synthetase-Polypeptid oder ein funktionell äquivalenter Teil davon ist. Der zweite Teil des Fusionsproteins kann z.B. ein weiteres Polypeptid mit enzymatischer Aktivität sein oder eine anti- gene Polypeptidsequenz mit deren Hilfe ein Nachweis auf GMP- Synthetase-Expression möglich ist (z.B. myc-tag oder his-tag) . Bevorzugt handelt es sich dabei jedoch um eine regulative Proteinsequenz, wie z.B. ein Signal- oder Transitpeptid, das das GMP-Synthetase-Protein an den gewünschten Wirkort leitet. Zweckmäßigerweise sollten die erfindungsgemäßen Promotor- und die Terminator-Regionen in Transkriptionsrichtung mit einem Linker oder Polylinker, der eine oder mehrere Restriktionsstellen für die Insertion dieser Sequenz enthält, versehen werden. In der Re- gel hat der Linker 1 bis 10, meistens 1 bis 8, vorzugsweise 2 bis 6 Restriktionsstellen. Im allgemeinen hat der Linker innerhalb der regulatorischen Bereiche eine Größe von weniger als 100 bp, häufig weniger als 60 bp, mindestens jedoch 5 bp. Der erfindungsgemäße Promotor kann sowohl nativ bzw. homolog als auch fremdar- tig bzw. heterolog zur Wirtspflanze sein. Die erfindungsgemäße Expressionskassette beinhaltet in der 5 ' -3 ' -Transkriptionsrichtung den erfindungsgemäßen Promotor, eine beliebige Sequenz und eine Region für die transkriptionale Termination. Verschiedene Terminationsbereiche sind gegeneinander beliebig austauschbar.
Ferner können Manipulationen, die passende Restriktionsschnittstellen bereitstellen oder die überflüssige DNA oder Restriktionsschnittstellen entfernen, eingesetzt werden. Wo Insertionen, Deletionen oder Substitutionen wie z.B. Transitionen und Trans- Versionen in Frage kommen, können in vitro-Mutagenese, "primerre- pair", Restriktion oder Ligation verwendet werden. Bei geeigneten Manipulationen, wie z.B. Restriktion, "chewing-back" oder Auffüllen von Überhängen für "bluntends", können komplementäre Enden der Fragmente für die Ligation zur Verfügung gestellt werden.
Bevorzugte Polyadenylierungssignale sind pflanzliche Polyadeny- lierungssignale, vorzugsweise solche, die im wesentlichen T-DNA- Polyadenylierungssignale aus Agrobacterium tumefaciens, insbesondere des Gens 3 der T-DNA (Oc opin Synthase) des Ti-Plasmids pTiACH5 entsprechen (Gielen et al., EMBO J. 3 (1984) 835 ff) oder funktioneile Äquivalente.
Zur Transformation einer Wirtspflanze mit einer für eine GMP- Synthetase kodierenden DNA wird eine erfindungsgemäße Expres- sionskassette als Insertion in einen rekombinanten Vektor eingebaut, dessen Vektor-DNA zusätzliche funktionelle Regulationssignale, beispielsweise Sequenzen für Replikation oder Integration enthält. Geeignete Vektoren sind unter anderem in "Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology" (CRC Press), Kap. 6/7, S.71-119 beschrieben.
Die Übertragung von Fremdgenen in das Genom einer Pflanze wird als Transformation bezeichnet. Es werden dabei die beschriebenen Methoden zur Transformation und Regeneration von Pflanzen aus Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen zur transienten oder stabilen Transformation genutzt. Geeignete Methoden sind die Protoplasten- transformation durch Polyethylenglykol-induzierte DNA-Aufnahme, der biolistische Ansatz mit der Genkanone, die Elektroporation, die Inkubation trockener Embryonen in DNA-haltiger Lösung, die Mikroinjektion und der durch Agrobacterium vermittelte Gentransfer. Die genannten Verfahren sind beispielsweise in B. Jenes et al . , Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, herausgegeben von S.D. Kung und R. Wu, Academic Press (1993) 128-143 sowie in Potrykus Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec.Biol. 42 (1991) 205-225) beschrieben. Vorzugsweise wird das zu exprimierende Konstrukt in einen Vektor kloniert, der geeignet ist, Agrobacterium tumefaciens zu transformieren, beispielsweise pBinl9 (Bevan et al . , Nucl. Acids Res . 12 (1984) 8711).
Mit einer erfindungsgemäßen Expressionskassette transformierte Agrobakterien können ebenfalls in bekannter Weise zur Transformation von Pflanzen, insbesondere von Kulturpflanzen, wie Getreide, Mais, Soja, Reis, Baumwolle, Zuckerrübe, Canola, Sonnenblume, Flachs, Hanf, Kartoffel, Tabak, Tomate, Raps, Alfalfa, Salat und den verschiedenen Baum-, Nuß- und Weinspezies sowie Leguminosen verwendet werden, z.B. indem verwundete Blätter oder Blattstücke in einer Agrobakterienlösung gebadet und anschließend in geeigneten Medien kultiviert werden.
Der Biosytheseort von Pyrimidinen ist im allgemeinen das Blattge- webe, so daß eine blattspezifische Expression des GMP-Synthetase- Gens sinnvoll ist. Es ist jedoch naheliegend, daß die Pyrimidin - Biosynthese nicht auf das Blattgewebe beschränkt sein muß, sondern auch in allen übrigen Teilen der Pflanze beispielsweise in fetthaltigen Samen - gewebespezifisch erfolgen kann.
Darüberhinaus ist eine konstitutive Expression des exogenen GMP- Synthetase-Gens von Vorteil. Andererseits kann aber auch eine induzierbare Expression wünschenswert erscheinen.
Unter Verwendung der oben zitierten Rekombinations- und
Klonierungstechniken können die erfindungsgemäßen Expressionskas- setten in geeignete Vektoren kloniert werden, die ihre Vermehrung, beispielsweise in E. coli, ermöglichen. Geeignete Klonie- rungsvektoren sind u.a. pBR322, pUC-Serien, Ml3mp-Serien und pA- CYC184. Besonders geeignet sind binäre Vektoren, die sowohl in E. coli als auch in Agrobakterien replizieren können.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung einer erfindungsgemäßen Expressionskassette zur Transformation von Pflanzen, Pflanzenzellen, -geweben oder Pflanzenteilen. Vorzugsweise ist Ziel der Verwendung die Erhöhung des GMP- Synthetase Gehaltes in der Pflanze.
Dabei kann je nach Wahl des Promotors die Expression spezifisch in den Blättern, in den Samen oder anderen Teilen der Pflanze erfolgen. Solche transgenen Pflanzen, deren Vermehrungsgut sowie deren Pflanzenzellen, -gewebe oder -teile sind ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Die Erfindung wird durch die nun folgenden Beispiele erläutert, ist aber nicht auf diese beschränkt:
Beispiele
Gentechnische Verfahren, die den Ausführungsbeispielen zugrunde liegen:
Allgemeine Klonierungsverfahren
Klonierungsverfahren wie z.B. Restriktionsspaltungen, Agarose- Gelelektrophorese, Reinigung von DNA-Fragmenten, Transfer von Nukleinsäuren auf Nitrozellulose und Nylon Membranen, Verknüpfen von DNA-Fragmenten, Transformation von Escherichia coli Zellen, Anzucht von Bakterien und Sequenzanalyse rekombinanter DNA wurden wie bei Sambrook et al . (1989) (Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-309-6) beschrieben durchgeführt.
Sequenzanalyse rekombinanter DNA
Die Sequenzierung rekombinanter DNA-Moleküle erfolgte mit einem Laserfluoreszenz-DNA-Sequenzierer der Firma ABI nach der Methode von Sanger (Sanger et al . (1977), Proc . Natl. Acad. Sei. USA74, 5463-5467). Fragmente resultierend aus einer Polymerase Kettenreaktion wurden zur Vermeidung von Polymerasefehlern in zu expri- mierenden Konstrukten sequenziert und überprüft.
Die verwendeten Chemikalien wurden, sofern nicht anders erwähnt, in p.a. Qualität von den Firmen Fluka (Neu-Ulm) , Merck (Darmstadt) , Roth (Karlsruhe) , Serva (Heidelberg) sowie Sigma (Deisen- hofen) bezogen. Lösungen wurden mit aufbereitetem, pyrogenfreiem Wasser, im weiteren Text als H0 bezeichnet, aus einer Milli-Q Water System Wasseraufbereitungsanlage (Millipore, Eschborn) angesetzt. Restriktionsendonucleasen, DNA-modifizierende Enzyme und molekularbiologische Kits wurden von den Firmen AGS (Heidelberg) , Amersham (Braunschweig) , Biometra (Göttingen) , Röche (Mannheim) , Genomed (Bad Oeynhausen) , New England Biolabs (Schwalbach/Taunus) , Novagen (Madison, Wisconsin, USA) , Perkin-Elmer (Weiter- Stadt) , Pharmacia (Freiburg) Qiagen (Hilden) und Stratagene (Heidelberg) bezogen. Sie wurden, soweit nicht anders erwähnt, nach Herstellerangaben verwendet .
Die im folgenden verwendeten Bakterienstämme (E. coli, XL-1 Blue) wurden von Stratagene bezogen. E. coli AT 2465 wurde bei dem coli genetic stock center (Yale University, New Haven) bezogen. Der zur Pflanzentransformation verwendete Agrobakterienstamm (Agrobacterium tumefaciens, C58C1 mit dem Plasmid pGV2260 oder pGV3850kan) wurde von Deblaere et al . beschrieben (Nucl. Acids Res. 13 (1985) 4777). Alternativ können auch der Agrobakterienstamm LBA4404 (Clontech) oder andere geeignete Stämme eingesetzt werden. Zur Klonierung können die Vektoren pUC19 (Yanish-Perron, Gene 33(1985), 103-119) pBluescript SK- (Stratagene), pGEM-T (Promega) , pZerO (Invitrogen) , pBinl9 (Bevan et al . , Nucl. Acids Res. 12(1984) 8711-8720) und pBinAR (Höfgen und Willmitzer, Plant Science 66 (1990) 221-230) benutzt werden.
Beispiel 1
Isolierung einer cDNA des guaA Gens, codierend für eine GMP- Synthetase aus Tabak.
Ein "expressed sequence tag" (EST) aus Arabidopsis thaliana (EST F14426) , der auf einem partiellen Leseraster ein Polypeptid von 68 Aminosäuren mit 60 % Ähnlichkeit zu einer GMP-Synthetase aus Helicobacter pylori codiert, wurde 5'-terminal ansequenziert. Von den 5'- und 3 ' -terminalen Sequenzen wurden die Oligonukleotide 5'-aag gat cca agc tct aag acc cta tcc-3 x und 5v-tta gat ctt tat tcc cat tcg atg g-3 λ für die Amplifikation durch Polymerase Kettenreaktion (PCR) eines 1000 bp cDNA-Frag ents mit EST F14426 als Matrize in einem DNA-Thermal Cycler der Firma Perkin Eimer verwendet. Die Reaktionsgemische enthielten 0,1 ng/μl cDNA aus Tabak, 0,5 μM der entsprechenden Oligonukleotide, 200 |1M Nukleotide (Pharmacia), 50 mM KC1, 10 mM Tris-HCl (pH 8,3 bei 25°C, 1,5 mM MgCl2) und 0.02 U/μl Taq Polymerase (Perkin Eimer) .
Die Amplifikationsbedingungen wurden wie folgt eingestellt:
Anlagerungstemperatur : 52 °C, 1 min
Denaturierungstemperatur : 92 °C, 1 min
Elongationstemperatur : 72 °C, 1,5 min
Anzahl der Zyklen: 30
Das Fragment wurde zur Durchmusterung einer cDNA-Bibliothek aus Kallusgewebe von Nicotiana tabacum (Varietät Samsun NN) im Vektor ZAP Express eingesetzt. Dazu wurden 2,5 x 105 Lambda Phagen der cDNA-Bibliothek auf Agarplatten mit E. coli XLl-Blue als Bakterienstamm ausplattiert. Die Phagen-DNA wurde mittels Standardverfahren (Sambrook et al. (1989); Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0=87969-309-6) auf Nitrocellulosefilter (Gelman Sciences) überführt und auf den Filtern fixiert. Als Hybridisie- rungssonde diente das oben beschriebene PCR-Fragment , das mit Hilfe eines "Multiprime DNA labelling Systems" (Amersham Buchler) in Anwesenheit von α-32P-dCTP (spezifische Aktivität 3000 Ci/mmol) nach Herstellerangaben radioaktiv markiert wurde. Die Hybridisie- rung der Membranen erfolgte nach Prähybridisierung bei 60 °C in 3 x SSPE, 0,1 % Natriumdodecylsulfat (w/v) , 0,02 % Polyvinylpyrro- lidon (w/v), 0,02 % Ficoll 400 (w/v) und 50 mg/ml Kalbsthymus DNA für 12-16 Stunden (Sambrook et al . (1989); Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-309-6). Anschließend wurden die Fil- ter 60 Minuten in 2 x SSPE, 0,1 % Natriumdodecylsulfat (w/v) bei 60 °C gewaschen. Positiv hybridisierende Phagen wurden durch Auto- radiographie sichtbar gemacht und durch Standardtechniken gereinigt und vereinzelt.
Es konnten 13 hybridisierende Signale identifiziert und gereinigt werden. Nach Restriktionsanalyse wurden die Klone GMP-6 und GMP-7M zur doppelsträngigen Sequenzierung ausgewählt. Die Auswertung der Sequenzdaten zeigte, daß der Klon GMP-7M mit einer Länge von 1973 bp einen vollständigen Leserahmen von 1614 bp enthielt, der für ein Protein von 538 Aminosäuren mit einem errechneten Molekulargewicht von 60,1 KDa kodiert (SEQ-ID No . 1). Vor dem anzunehmenden Start-Codon findet sich im gleichen Leserahmen ein Stop-Codon, was den Schluß zuläßt, daß es sich mit GMP-7M um eine cDNA voller Länge handelt. GMP-7M stellt somit die erste pflanz- liehe Vollängen-cDNA einer GMP-Synthetase dar. GMP-6 stellt einen partiellen Klon dar, der 5'-seitig um 217 Nukleotide gegenüber GMP-7M verkürzt ist. GMP-7M weist Ähnlichkeiten zu GMP-Syntheta- sen aus Mikroorganismen und Tieren auf. Neben der auf EST F14426 codierten partiellen Aminosäuresequenz finden sich keine weiteren Sequenzen aus Pflanzen mit Homologie zu GMP-Synthetasen in den Datenbanken. Die größte Ähnlichkeit (62 %) besteht zu einer GMP- Synthetase aus Helicobacter pylori . Es fällt zudem auf, daß die Ähnlichkeiten zischen den C-Termini der GMP-Synthetasen größer sind als jene im Bereich der N-Termini . Der N-Terminus der GMP-7M Aminosäuresequenz korrespondiert mit den N-termini von GMP-Synthetasen aus anderen Organismen, wie E. coli und Synechocystis sp . (Tabelle 1) . GMP-7M weist keine ausgeprägten Signalsequenzen auf (ermittelt durch Programm PSORT, Nakai, K. , Institute for Molecular and Cellular Biology, Osaka University, Japan) was auf eine cytosolische Lokalisation des Proteins hinweisen könnte. Tabelle 1
Sequenzgegenüberstellung von GMP-Synthetasen aus Nicotiana tabacum (guaA_N.t = GMP-7M) , Arabidopsis thaliana (gua_A_est_A. t , Genbank Nr. F14426), E.coli (guaA_e.c, Genbank Nr . 146276), Syn- echocystis sp. (guaA_syn, Genbank Nr. 1001583), Helieobacter py- lori (guaA_h.p, Genbank Nr. 3122166), Homo sapiens (guaA_human, Genbank Nr. 1708072).
1 50 guaA_N.t MEPQ TQAKKSNLVL ILDYGSQYTH LITRRIRSLS guaA_est_A.t guaA_e.c m tenihkhril ildfgsqytq lvarrvrelg guaA_syn mttgipvppv vsdqalpdri sdrlkgqiiv ildfgsqyse liarrirete guaA_h.p il vldfgsqytq liarrlrerg guaA_human -malcngdsk lenaggdlkd ghhhyegaw ildagaqygk vidrrvrelf
51 100 guaA_N.t IFSLTINGTS SLDSIKELDP RVIILSGGPH SVHADGAPCF PPGFIEYVES guaA_est_A.t guaA_e.c vycelwa dv teaqirdfnp sgiilsggpe stteenspra pq....yvfe guaA_syn vysevlsyrt taqqlreikp kgiilsggpn svydqgapec dp....eifq guaA_h.p iyteivpffe sieniqkkap kglilsggpa svyakdaykp sg....kifd guaA_human vqseifplet pafaikeqgf raiiisggpn svyaedapwf dpa....ift
101 150 guaA_N.t RGIHVLGICY GLQLIVQKLG GWKIGEKHE YGR EIEVGK NW....GGL guaA_est_A.t guaA_e.c agvpvfgvcy gmqtmamqlg ghveasnere fgyaqvewn dsalvrgied guaA_syn lgvpvlgvcy gmqlmvkqlg grverakrge ygkaslhidd ptdlltnven guaA_h.p lnvpilgicy gmqylvdffg gvwganeqe fgkavleitq nsvifegv.. guaA_human igkpvlgicy gmqmmnkvfg gtvhkksvre dgvfnisvdn tcslfrglqk
151 200 guaA_N.t FGNTEIGDKQ WWMSHGDEA VKLPEGFEW ARSSQGAVAA IENRERRFYG guaA_est_A.t — guaA_e.c altadgkpll dvwmshgdkv taipsdfitv astesepfai maneekrfyg guaA_syn dst mwmshgdsc vdlptgfeil ahtdntpcaa iadhqkalfg guaA_h.p kiks lvwmshmdkv ielpkgfttl akspnsphca iengk..ifg guaA_human ee wllthgdsv dkvadgfkw arsgni.vag ianeskklyg 201 250 guaA_N.t LQYHPEVTHS TEGMRTLRHF LFDVCGVTAG KMEDVLEEE IKVI GMVGP guaA_est_A.t guaA_e.c vqfhpevtht rqgmrmlerf vrdicqceal tpakiidda varireqvg. guaA_syn vqfhpewhs vggialirnf vyhicheept wttaafiees irevrsqvg. guaA_h.p lqfhpewqs eeggkilenf allvcgcekt wgmqhfaqre iarlkekia. guaA_human aqfhpevglt engkvilknf lydiagesgt ftvqnrelec ireikervgt
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701 716 guaA_N.t guaA_est_A.t guaA_e.c
•*-° guaA_syn guaA_h.p guaA_human imydltskpp gttewe
Beispiel 2
15
Isolierung einer cDNA des guaA Gens, codierend für eine GMP- Synthetase aus dem Moos Physcomitrella patens
Aus mRNA verschieden alter Protonemata von Physcomitrella patens wurde doppelsträngige cDNA erzeugt und zur Herstellung einer
20 cDNA-Bank im Vektor pBluescript SKII verwendet ( lambda ZAP II RI Library construction Kit, Stratagene) . Einzelne Klone dieser Bank wurden ansequenziert. Die Sequenz des Klons 093-dll wies deutliche Homologie zur GMP-Synthetase aus Aquifex aeolicus auf. Die vollständige Sequenz von 093-dll wurde bestimmt, siehe SEQ-ID No .
25 3. 093_dll weist eine Länge von 1232 Nukleotiden auf und codiert auf einem durchgehenden Leseraster für 382 Aminosäuren. Aus dem Vergleich mit GMP-7M geht hervor, daß es sich bei 093_dll um eine partielle cDNA handelt. Die Homologie zu GMP-7M beträgt 66,7 % auf Nucleotidebene bzw. 74,6 % auf Aminosäureebene.
30
Beispiel 3
Funktionsnachweis für GMP-7M durch Komplementation von E. coli
35
Die GMP-7M cDNA wurde als Matrize für eine PCR mit den Oligonu- cleotiden 5 x -CCTAGCCATGGAACCTCAAAC-3 und 5 x -TATAGGATCCTACTTTG- GTCACC-3 x eingesetzt. Die Reaktionsgemische enthielten ca. 0,1 ng GMP-7M DNA, 0,5 μ der entsprechenden Oligonukleotide, 200 |XM Nukleotide (Pharmacia), 50 mM KC1, 10 mM Tris-HCl (pH 8,3 bei
40 25 °C, 1,5 mM MgCl2) und 0.02 U/μl Pfu-Polymerase (Stratagene).
Die Amplifikationsbedingungen wurden wie folgt eingestellt:
45 Anlagerungstemperatur : 50 °C, 30 sec Denaturierungstemperatur : 92 °C, 30 sec Elongationstemperatur : 72 °C, 3 min Anzahl der Zyklen: 25
Das erhaltene Fragment von ca. 1670 bp wurde über die durch die Oligonukleotide eingefügten Ncol- und BamHI-Schnittstellen in den Vektor pTrc99A (Pharmacia) ligiert. Das erhaltene Konstrukt GMP-7Trc wurde in den E.coli Stamm AT2465 (genetische Marker: thi-1, guaA21, relAl, λ, spoTl) transformiert und auf M9-Minimal- medien (Sambrook et al . (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-309-6) mit und ohne 100 μg/ml Guanosin plattiert. Die Minimalmedien enthielten 0,4 % Glucose, 0,2% Casa i- noacids, 100 μg/ml Thiamin, 100 μg/ml Inosin, 100 μg/ml Biotin, 100 μg/ml Histidin, 100 μg/ml Arginin, 100 μg/ml 2 '-Deoxyuridin, 100 μM IPTG und 25 μg/ml Ampicillin. Im Parallelexperiment wurde der Klonierungsvector pTrc99A in AT2465 transformiert. Es zeigte sich, daß nur die transformierten Bakterien zu einem Wachstum auf Minimalmedien ohne Guanosin fähig waren, die eine GMP-7M cDNA aus Tabak im Expressionsvektor pTrc 99 A enthielten (siehe Tab. 2) , was stark darauf hinweist, daß die GMP-7M cDNA für eine aktive GMP-Synthetase codiert . Das durch GMP-7M codierte Enzym stellt damit die erste aus Pflanzen isolierte funktionelle GMP- Synthetase dar.
Tabelle 2
Wachstum von E. coli AT2465 transformiert mit verschiedenen Plas- miden nach 2 Tagen bei 37°C
Beispiel 4
Überexpression der GMP-Synthetase aus Tabak in E.coli und Erzeugung von Antikörpern
Zur Überexpression in E.coli wurden durch PCR mit GMP-7M als Matrize und den Oligonukleotiden GMPA: 5 ' -GCAATGGATCCTCAAACA- CAGGCG-3 λ und GMPB: 5 λ -AAAAGGATCCTACTTTGGTCACC-3 λ BamHI-Schnittstellen eingeführt, über welche das Fragment in den Vector pETl5b (Novagen) kloniert werden konnte. Auf diese Weise wurde ein GMP-7M-Leseraster mit Hexahistidin-Anker am N-Terminus erzeugt . Nach Kontrolle der korrekten Orientierung durch Restriktionsver- dau und Ausschluß von Polymerasefehlern durch Sequenzierung, wurde das erhaltene Konstrukt GMP-7E in E. coli BL21(DE3) (Stra- tagene) transformiert. IPTG-induzierte Tageskulturen wurden durch Zentrifugation geerntet und die Zellpellets nach Herstellerangaben zur Nickel-Affinitätschromatographie aufgeschlossen und weiterbehandelt ( "Qia-Express-Kit" , Qiagen) . Auf diese Weise konnte die GMP-Synthetase auf mehr als 95 % Reinheit aufgereinigt werden. Das Protein wurde nach üblichen Protokollen zur Erzeugung von Antiseren in Kaninchen verwendet (im Auftrag durchgeführt durch die Firma Eurogentec, Herstal, Belgien).
Beispiel 5
Expression der GMP-Synthetase aus Tabak in Baculovirus-infizier- ten Insektenzellen
Um genügend aktive GMP-Synthetase für die Massentestung von Che- mikalien zu erhalten, wurde aus GMP-7E mit BamHI ein 1,65 kb Fragment excisiert und in den Transfervector pFastBacHTa (Gib- coBRL) kloniert. Das erhaltene Konstrukt GMP-7I wurde nach Herstellerangaben (GibcoBRL) zur Erzeugung von rekombinantem Ba- culovirus verwendet. Dieses Virus wurde nach Herstellerangaben (GibcoBRL) zur Infektion von Sf21 Insektenzellen genutzt, um aktive GMP-Synthetase zu erzeugen, deren Aktivität nach Aufschluß der Zellen in 50 mM Tris-HCl, pH 7 , 6 , 10 mM KC1, 1 mM EDTA, 10 mM PMSF und Entsalzung des Extraktes über eine Sephadex G-25-Säule (Pharmacia, Schweden) gemessen werden konnte.
Beispiel 6
Erzeugung pflanzlicher Expressionskassetten
Mit dem Ziel die GMP-Synthetase-Aktivität in transgenen Tabakpflanzen zu reduzieren, wurde die Antisense- und die Cosuppres- sionstechnik angewendet. Dazu wurden Plasmid-Konstrukte im Vektor pBinAR (Höfgen und Will itzer, Plant Science (1990) 66, 221-230) erzeugt. Ein mit .BamHI und Bglll aus GMP-7M erhaltenes Fragment von 1599 bp wurde in den mit BamHI geschnittenen Vector pBinAR ligiert. Das 1599 bp Fragment codiert den 5 ' -terminalen Teil der GMP-Synthetase cDNA. Nach Transformation in E.coli XLl-blue erhaltene Klone wurden durch Kontrollschnitt mit HindiII auf die Orientierung der 1599-Kassette untersucht. Auf diese Weise wurden die Plasmide pGMP7AS (antisense-Konstukt) und pGMP7EX (sense-Kon- strukt) identifiziert, siehe Abbildung 2. Beispiel 7
Erzeugung und Analyse transgener Pflanzen
Die Plasmide pGMP7AS und pGMP7EX - siehe Abbildung 2 - wurden in Agrobacterium tumefaciens C58Cl:pGV2260 transformiert (Deblaere et al., Nucl. Acids. Res. 13(1984), 4777-4788). Zur Transformation von Tabakpflanzen (Nicotiana tabacum cv. Samsun NN) wurde eine 1:50 Verdünnung einer Übernachtkultur einer positiv trans- formierten Agrobakterienkolonie in Murashige-Skoog Medium (Phy- siol. Plant. 15(1962), 473) mit 2 % Saccharose (2MS-Medium) benutzt. Blattscheiben steriler Pflanzen (zu je ca. 1 cm2) wurden in einer Petrischale mit einer 1:50 Agrobakterienverdünnung für 5-10 Minuten inkubiert. Es folgte eine 2-tägige Inkubation in Dunkel- heit bei 25 °C auf 2MS-Medium mit 0,8 % Bacto-Agar. Die Kultivierung wurde nach 2 Tagen mit 16 Stunden Licht/8 Stunden Dunkelheit weitergeführt und in wöchentlichem Rhythmus auf MS-Medium mit 500 mg/1 Claforan (Cefotaxime-Natrium) , 50 mg/1 Kanamycin, 1 mg/1 Benzylaminopurin (BAP) , 0,2 mg/1 Naphthylessigsäure und 1,6 g/1 Glukose weitergeführt. Wachsende Sprosse wurden auf MS-Medium mit 2 % Saccharose, 250 mg/1 Claforan und 0,8 % Bacto-Agar überführt. Regenerierte Sprosse werden auf 2MS-Medium mit Kanamycin und Claforan erhalten, nach Bewurzelung in Erde überführt und nach Kultivierung für zwei Wochen in einer Klimakammer im 16 Stunden hell/8 Stunden dunkel-Rhythmus bei 60 % Luftfeuchte auf Fremdgenexpression bzw. veränderte Metabolitgehalte und phänotypische Wachstumsmerkmale untersucht. Veränderte Nukleotidgehalte können z.B. nach der Methode von Stitt et al . (FEBS Letters, 145 (1982), 217-222) bestimmt werden.
Die transgenen GMP-Synthase Antisense-Pflanzen und ihre Folgegeneration waren durch ein vermindertes Wachstum im Vergleich zu WT-Kontrollpflanzen und durch ein Ausbleichen der Sink-Blätter gekennzeichnet. Diese phänotypischen Veränderungen traten in einem frühen WachstumsStadium auf (s. Abb.3). In Pflanzen mit verringertem Wachstum konnte eine im Vergleich zum Wildtyp reduzierte GMP-7M RNA-Menge in der Northern-Hydridisierung detektiert werden. Dazu wurden je 40 μg Gesamt-RNA aus Sink-Blättern eingesetzt. Gesamt-RNA aus pflanzlichen Geweben wurde wie bei Logemann et al . (Anal. Biochem. 163 (1987), 21) isoliert. Für die Analyse wurden jeweils 40 μg RNA in einem Formaldehyd-haltigen 1,5 %igen Agarosegel aufgetrennt und auf Nylon Membranen (Hybond, Amersham) überführt. Der Nachweis spezifischer Transkripte wurde wie bei Amasino beschrieben durchgeführt (Anal. Biochem. 152(1986), 304). Es wurde eine spezifische c-DNA-Sonde des Antisense-Stranges erzeugt. Hierzu wurde das Plasmid GMP-7M mit BamHI und Bglll gespalten und ein 1600 bp umfassendes Fragment isoliert. Für die Markierungsreaktion wurde das Oligonukleotid; 5 ' -GAT ACG TCG TCA AGG AAC TTG-3' eingesetzt. Die Sonde wurde nach Standardmethoden hybridisiert, siehe Hybond-Benutzerhinweise, Amersham. Hydridi- sierungssignale wurden durch Autoradiographie mithilfe von X-OMAT AR Filmen der Fa. Kodak sichtbar gemacht. Es zeigte sich eine deutliche Korellation zwischen der Ausprägung des Wachstumsphäno- typs und einer Verringerung des GMP-7M RNA-Menge (Abb. 3) .
Ferner konnte im Western-blot Experiment eine im Vergleich mit Wildtyppflanzen verringerte Menge der GMP-Synthetase in den transgenen Linien detektiert werden. Dazu wurden Gesamtproteinextrakte aus Sink-Blättern hergestellt, nach Standardmethoden in dern SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese separiert und auf Nitro- cellulose-Membranen transferiert. Die Detektion erfolgte mit einem IgG-alkalische Phosphatase-Konjugat und dem BCIP/NBT-System (Sigma) .
Desweiteren konnte durch den in Beispiel 8 beschriebenen in vitro Assay eine verringerte GMP-Synthetase-Aktivität in transgenen Linien mit verringertem Wachstum festgestellt werden.
Der korrelative Zusammenhang zwischen Expressionsniveau sowie der Aktivität der GMP-Synthetase und dem Wachstumsphänotyp läßt auf die Eignung der GMP-Synthetase als Target für Herbizide schlie- ßen.
Beispiel 8
Testsysteme zur Messung der GMP-Synthetase-Aktivität
Zur Messung der pflanzlichen GMP-Synthetase-Aktivität können die nach Spector (Methods in Enzymology LI, 1978, 219-224) für tierische Enzyme entwickelten Systeme verwendet werden. Im ersten System wird die AMP-Bildung durch Kopplung der Reaktion mit AMP-Ki- nase, Pyruvat Kinase, Lactat-Dehydrogenase und Messung bei 340 nm ermöglicht. Das zweite System basiert auf dem direkten Nachweis des GMP (Guanosinmonophosphat) durch Einsatz des radioaktiv markierten Substrats XMP (Xanthinmonophosphat) und Auftrennung in der Dünnschichtchromatographie.
Alternativ kann die GMP-Synthetase-Aktivität auch über ein neues System, nämlich den gekoppelten Nachweis des entstehenden Gluta- mats gemessen werden. Dieses System bietet den Vorteil einer geringeren Anzahl gekoppelter Reaktionsschritte und liefert größere Signalstärken. XMP + ATP + L-Glutamin + H20 GMP ^ GMP + AMP + L-Glutamat + PPi
GluDH
5 L-Glutamat + APAD + H20 Oxoglutarat + APADH + NH4
(GMP-S = GMP-Synthetase, GluDH = Glutamat-Dehydrogenase, APAD = 3-Acetylpyridin-Adenin-Dinucleotid)
10 Dazu wurde der Reaktionsansatz (s.u.) für 60 Minuten bei 37°C inkubiert und die Reaktion durch 5-minütige Inkubation bei 95°C gestoppt . Der Nachweis des gebildeten Glutamats erfolgte im Nachweisansatz (s.u.) durch photometrische Messung der APADH-Zunahme bei 363 nm.
15
Reaktionsansatz :
100 μL 750 mM Tris/HCl-Puffer pH 7, 100 μL 100 mM MgCl2
20 100 μL 80 mM KC1 100 μL 20 mM XMP 100 μL 200 mM L-Glutamin 400 μL H20 100 μL Proteinextrakt
25 1000 μL
Nachweisansatz :
375 μL 100 mM Tris-HCl-Puffer pH 8.0
30 75 μL 500 mM KC1
125 μL H20
75 μL 3 mM APAD
100 μL des Reaktionsansatzes
750 μL
35
Beispiel 9
Suche nach Inhibitoren der GMP-Synthetase Aktivität
40 Zur Suche nach Inhibitoren der GMP-Synthetase Aktivität kann der in Beispiel 8 beschriebene in vi tro Assay mit Hochdurchsatzmethoden verwendet werden. Die GMP-Synthetase Aktivität kann dazu aus Pflanzengeweben präpariert werden. Bevorzugt kann eine pflanzliche GMP-Synthetase in E.coli, Insektenzellen oder einem anderen
45 geeigneten Expressionssystem exprimiert und anschließend angereichert oder isoliert werden. Auf diese Weise konnten bekannte Inhibitoren, wie 6-thio-XMP identifiziert werden.

Claims

Patentansprüche
1. DNA-Sequenz, enthaltend die Kodierregion einer pflanzlichen
5 GMP-Synthetase, dadurch gekennzeichnet, daß diese DNA-Sequenz die Nukleotidabfolge SEQ-ID No : 1 oder SEQ-ID No : 3 aufweist.
2. DNA-Sequenzen, die mit der DNA-Sequenz SEQ-ID NO: 1 oder SEQ-ID No: 3 gemäß Anspruch 1 oder Teilen davon oder Deriva-
10 ten, die durch Insertion, Deletion oder Substitution von diesen Sequenzen abgeleitet sind, hybridisieren und für ein Protein kodieren, das die biologische Aktiviät einer GMP- Synthetase besitzt.
15 3. Protein mit GMP-Synthetase-Aktivität, enthaltend eine Aminosäuresequenz, die eine Teilsequenz von mindestens 100 Aminosäuren aus SEQ-ID NO: 2 oder 4 darstellt.
4. Protein nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß es als 20 Aminosäuresequenz die Teilsequenz 50 - 300 aus SEQ-ID NO: 2 oder SEQ-ID No: 4 enthält.
5. Protein nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß es als Aminosäuresequenz die in SEQ-ID NO: 2 oder SEQ-ID No : 4 dar-
25 gestellte Sequenz enthält.
6. Verwendung einer DNA-Sequenz nach Anspruch 1 oder 2 zur Einführung in pro- oder eukaryontische Zellen, wobei diese Sequenz gegebenenfalls mit Steuerelementen, die die Transkrip-
30 tion und Translation in den Zellen gewährleisten, verknüpft ist und zur Expression einer translatierbaren RNA, die die Synthese einer pflanzlichen GMP-Synthetase bewirkt, führt.
7. Verwendung einer DNA-Sequenz nach Anspruch 1 oder 2 zur Her- 35 Stellung eines Testsystems zur Identifizierung von
Inhibitoren der pflanzlichen GMP-Synthetase mit herbizider Wirkung.
8. Verfahren zum Auffinden von Substanzen, die die Aktivität der 40 pflanzlichen GMP-Synthetase inhibieren, dadurch gekennzeichnet, daß in einem ersten Schritt unter Verwendung einer DNA- Sequenz nach Anspruch 1 oder 2 GMP-Synthetase hergestellt wird und in einem zweiten Schritt die Aktivität der pflanzlichen GMP-Synthetase in Anwesenheit einer Testsubstanz gemes-
45 sen wird.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Messung der pflanzlichen GMP-Synthetase in einem High- Throughput-Screening (HTS) ausgeführt wird.
10. Verfahren zur Identifizierung von Substanzen mit herbizider
Wirkung, die die GMP-Synthetase Aktivität in Pflanzen hemmen, bestehend aus
a) der Herstellung von transgenen Pflanzen, Pflanzengeweben, oder Pflanzenzellen, die eine zusätzliche DNA-Sequenz codierend für ein Enzym mit GMP-Synthetase Aktivität enthalten und in der Lage sind eine enzymatisch aktive GMP- Synthetase überzuexprimieren;
b) das Aufbringen einer Substanz auf transgene Pflanzen,
Pflanzenzellen, Pflanzengewebe oder Pflanzenteile sowie auf nicht-transformierte Pflanzen, Pflanzenzellen, Pflanzengewebe oder Pflanzenteile;
c) das Bestimmen des Wachstums oder der Überlebensfähigkeit der transgenen und der nicht-transformierten Pflanzen, Pflanzenzellen, Pflanzengewebe oder Pflanzenteile nach der Aufbringung der chemischen Substanz; und
d) dem Vergleich des Wachstums oder der Überlebensfähigkeit der transgenen und der nicht-transformierten Pflanzen, Pflanzenzellen, Pflanzengewebe oder Pflanzenteile nach der Aufbringung der chemischen Substanz;
wobei die Unterdrückung des Wachstums oder der Überlebensfähigkeit der nicht-transformierten Pflanzen, Pflanzenzellen, Pflanzengewebe oder Pflanzenteile ohne jedoch das Wachstum oder die Überlebensfähigkeit der transgenen Pflanzen, Pflanzenzellen, Pflanzengewebe oder Pflanzenteile stark zu unter- drücken, belegt, daß die Substanz aus b) herbizide Aktivität zeigt und die Enzymaktivität in Pflanzen inhibiert.
11. Testsystem basierend auf der Expression einer DNA-Sequenz SEQ-ID No. 1 oder SEQ-ID No . 3 nach Anspruch 1 oder 2 zur Identifizierung von Inhibitoren der pflanzlichen GMP- Synthetase mit herbizider Wirkung.
12. Testsystem gemäß Anspruch 11 zur Identifizierung von
Inhibitoren pflanzlicher GMP-Synthetase, dadurch gekennzeich- net, daß das Enzym mit einem zu untersuchenden Testsubstrat inkubiert und nach einer geeigneten Reaktionszeit die enzyma- tische Aktivität des Enzyms im Vergleich zur Aktivität des nicht gehemmten Enzyms ermittelt wird.
13. Inhibitoren pflanzlicher GMP-Synthetase.
14. Inhibitoren pflanzlicher GMP-Synthetase, identifiziert unter Verwendung eines Testsystems nach Anspruch 11 oder 12.
15. Inhibitoren nach einem der Ansprüche 13 oder 14 zur Verwendung als Herbizid.
16. Verfahren zur Beseitigung von unerwünschtem Pflanzenwuchs, dadurch gekennzeichnet, daß die zu beseitigenden Pflanzen mit einer Verbindung behandelt werden, die spezifisch an GMP- Synthetase, codiert durch eine DNA-Sequenz nach Anspruch 1 oder 2, bindet und deren Funktion inhibiert.
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