DE10125537A1

DE10125537A1 - Verfahren zur Identifizierung von Substanzen mit herbizider Wirkung

Info

Publication number: DE10125537A1
Application number: DE10125537A
Authority: DE
Inventors: Astrid Blau; Mathieu Klein; Gunnar Plesch; Klaus Daeschner
Original assignee: Metanomics GmbH
Current assignee: BASF Metabolome Solutions GmbH
Priority date: 2001-05-23
Filing date: 2001-05-23
Publication date: 2003-04-24

Abstract

Naßfestausrüstungsmittel für Papier, die Mischungen aus DOLLAR A (a) 1 bis 99,9 Gew.-% eines wasserlöslichen, mit einem Epihalohydrin vernetzten Polyamidoamin und DOLLAR A (b) 0,1 bis 20 Gew.-% mindestens eines anderen kationischen Polymers enthalten, DOLLAR A Verfahren zur Herstellung von Papier mit verbesserter Naßfestigkeit und Verwendung der Naßfestausrüstungsmittel als Zusatz zum Papierstoff bei der Herstellung von Papier.

Description

Eine moderne Landwirtschaft ist ohne den Einsatz von Herbiziden nicht denkbar. Gegenwärtig wird der Wert der auf der gesamten Welt eingesetzten Herbizide auf ca. 30 Mrd. DM geschätzt. Obwohl bereits eine ganze Reihe von hoch wirksamen und ökologisch unbedenklichen Herbiziden auf dem Markt sind, ergibt sich die Notwendigkeit für neue Herbizide zum einen aus der Tatsache, dass immer wieder Unkräuter eine Resistenz gegen bereits eingesetzte Herbizide entwickeln und diese somit zum Teil nicht mehr eingesetzt werden können, zum anderen aus der Tatsache, dass ein Teil der Herbizide ökologische Nachteile aufweist. Zum heutigen Zeitpunkt werden in vielen Fällen noch Herbizide als Mischungen eingesetzt werden, die mehrere aktive Wirkstoffkomponenten enthalten, was ökologisch wenig vorteilhaft ist und zudem besondere Anforderungen an die Formulierung stellt.
Neue Herbizide sollten sich durch einen möglichst breitem Wirkungsbereich, ökologische und toxikologische Unbedenklichkeit sowie geringe Aufwandmengen auszeichnen.
Das bisherige Vorgehen bei der Identifizierung und Entwicklung neuer Herbizide ist durch die Applikation von potentiellen Wirkstoffen direkt auf geeignete Testpflanzen gekennzeichnet. Dieses Verfahren weist den Nachteil auf, dass für die Tests relativ große Substanzmengen erforderlich sind. Dies ist im Zeitalter der kombinatorischen Chemie mit seiner in einer äußerst großen Vielfalt, aber nur in geringen Mengen herstellbaren Substanzen jedoch selten gegeben und stellt von daher eine wichtige Limitierung bei der Entwicklung neuer Herbizide dar. Zum anderen werden bei der direkten Applikation auf die zu testenden Pflanzen bereits im ersten Screeningschritt äußerst hohe Anforderungen an die Substanz gestellt, da nicht nur die Inhibierung oder sonstige Modulation der Aktivität eines zellulären Zieles (in der Regel ein Protein oder Enzym) erforderlich sind, sondern die Substanz dieses Ziel zunächst überhaupt erreichen muss, was bereits in diesem ersten Schritt Anforderungen an die Testsubstanz in Bezug auf Aufnahme durch die Pflanze; Permeabilität durch die verschiedenen Zellwände und Membranen, Persistenz zur Erreichung des gewünschten Effektes, und schließlich Inhibierung/Veränderung der Aktivität des gewünschten Zielenzyms erfordert.
Es ist angesichts dieser Erfordernisse daher nicht überraschend, dass zum einen die Identifizierung neuer Wirkstoffe immer höhere Kosten verursacht, zum anderen immer weniger Wirkstoffe entdeckt werden.
Es war deshalb Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Targets für die Identifizierung neuer Herbizide, sowie neue Herbizide und deren Verwendung zur Verfügung zu stellen. Diese Aufgabe wurde durch ein Verfahren zur Identifizierung von Substanzen mit herbizider Wirkung gelöst, dadurch gekennzeichnet, dass

a) die Expression oder die Aktivität des Genprodukts einer Nukleinsäure oder eines Gens umfassend:
- a) Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38 oder SEQ ID NO: 40 dargestellten Sequenz;
- b) Nukleinsäuresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes aus den durch Rückübersetzung der in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39 oder SEQ ID NO: 41 dargestellten Aminosäuresequenzen ableiten lässt;
- c) Nukleinsäuresequenz, die ein Derivat oder ein Fragment der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38 oder SEQ ID NO: 40 dargestellten Nukleinsäuresequenzen ist, und mindestens 60% Homologie auf Nukleinsäureebene aufweist;
- d) Nukleinsäuresequenz, die für Derivate oder Fragmente der Polypeptide mit den in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39 oder SEQ ID NO: 41 dargestellten Aminosäuresequenzen codiert, die mindestens 50% Homologie auf Aminosäureebene aufweisen;
- e) Nukleinsäuresequenz, die für ein Fragment oder ein Epitope eines Polypeptides codiert, das spezifisch an einem Antikörper bindet, wobei der Antikörper spezifisch an ein Polypeptid bindet, das von der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38 oder SEQ ID NO: 40 dargestellten Sequenz codiert wird;
- f) Nukleinsäuresequenz, die für ein Fragment einer in aa) dargestellten Nukleinsäure codiert und das eine m6A-Methyltransferase-Aktivität, eine DNA-bindende- Aktivität oder "DNA-repair"-Aktivität, z. B. wie bei RAD 54, eine Thioredoxin-Aktivität, eine VAV2-Aktivität, eine Fructokinase-Aktivität, eine Zinkfingerprotein- Aktivität, eine LYTB-Aktivität, eine Crepopin-Aktivität, eine Leucin-Protein-Aktivität, eine DNAJ-Aktivität, ein CRS1-Aktivität, eine Alanyl-tRNA-Synthetase- Aktivität, eine OEP86-Aktivität, eine FMRF-Amid- Propeptid-Isolog-Aktivität, eine 26S Proteosom subunit S5B-Aktivität oder eine Geranylgeranylpyrophosphatsynthase-Aktivität hat; und/oder
- g) Nukleinsäuresequenz, die für Derivate der Polypeptide mit den in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39 oder SEQ ID NO: 41 dargestellten Aminosäuresequenzen codiert, die mindestens 20% Homologie auf Aminosäureebene aufweist und eine äquivalente biologische Aktivität besitzt; oder
b) die Expression oder Aktivität einer Aminosäuresequenz, die von einer Nukleinsäuresequenz nach aa) bis gg) kodiert wird,

Unter "Expression" wird die Neusynthese in vitro und in vivo von Nukleinsäuren und durch Nukleinsäuren codierten Proteinen verstanden, insbesondere die der obengenannten Nukleinsäure- und Aminosäuresequenzen. Der Begriff "Expression" umfasst alle bis zum reifen Protein oder dessen Abbau führenden Biosyntheseschritte, z. B. Transkription, Translation, Modifizierung oder Prozessierung von Nukleinsäuren und Proteinen, z. B. prae- oder posttranskriptionelle Prozessierungsschritte oder posttranslationale Modifikationen, z. B. Splicing, Editing, Polyadenylierung, Capping, Modifikationen von Aminosäuren, z. B. Glykosilierung, Methylierung, Acetylierung, Bindung von Coenzymen, Phosphorylierung, Ubiquitation, Bindung von Fettsäuren, Signalpeptidprozessierung, etc.
Wobei im Sinne der Erfindung unter "Transkription" die RNA- Synthese mithilfe einer RNA-Polymerase in 5'→ 3'-Richtung anhand einer DNA-Matrize zu verstehen ist. Unter "Translation" ist die Biosynthese von Proteinen in vitro und in vivo zu verstehen. Unter Genprodukt ist jedes Molekül und jede Substanz zu verstehen, die aufgrund der Expression, z. B. der Transkription oder Translation einer Nukleinsäure, z. B. einer DNA oder RNA, z. B. eines Gens, entsteht, wobei der Begriff auch die folgenden Prozessierungsprodukte, wie z. B. nach Splicing oder Modifizierung, umfasst. So wird unter Genprodukt z. B. eine prozessierte RNA, z. B. eine katalytische RNA, eine funktionelle RNA, wie tRNAs oder rRNAs, oder eine codierende RNA, wie mRNA, verstanden. Als Folge der Translation einer mRNA wird ein Protein synthetisiert, das ebenfalls als "Genprodukt" verstanden wird. Proteine können während und nach der Translation verschiedenen Prozessierungsschritten unterworfen sein, wie oben beispielhaft aufgezählt. Unter "Aktivität des Genprodukts" ist die biologische Aktivität bzw. Funktion einer RNA oder eines Proteins, wie beispielsweise die enzymatische Aktivität, die Rezeptorbindungseigenschaft, die Fähigkeit, bestimmte Proteine, Nukleinsäuren oder Metaboliten zu binden, z. B. in Proteinkomplexen, das heißt z. B. die regulative Eigenschaft oder die Transporterfunktion des Proteins oder der RNA, zu verstehen, wie sie im Organismus natürlicherweise vorkommt. Unter "Reduktion der Aktivität des Genprodukts" ist eine Verringerung der biologischen Aktivität im Vergleich zur natürlichen Aktivität des Genprodukts von mindestens 10%, vorteilhaft mindestens 20%, bevorzugt mindestens 30%, besonders bevorzugt um mindestens 50% und ganz besonders bevorzugt um mindestens 70% zu verstehen. Blockierung der Aktivität des Genprodukts bedeutet die gänzliche, das heißt 100%ige Inhibierung der Aktivität oder die teilweise Blockierung der Aktivität, bevorzugt eine mindestens 80%ige, besonders bevorzugt mindestens 90%ige, ganz besonders bevorzugt mindestens 95%ige Blockierung der biologischen Aktivität.
Eine Reduktion der Aktivität des Genprodukts kann auch indirekt erfolgen, z. B. in dem die Bildung oder Aktivität von Interaktionspartnern gehemmt wird, z. B. in dem die Stoffwechselkette, in die das Genprodukt eingebunden ist, beeinflusst wird. Z. B. kann eine Hemmung nicht nur des fraglichen Enzyms, sondein auch eines in derselben Stoffwechselkette stehenden Enzyms oder Proteins erfolgen, die zu einer Blockierung des folgenden, vorhergehenden oder eines anderen involvierten Enzyms führt und somit des hierin beschriebenen Genproduktes, z. B. durch Substrat- oder Produkthemmung. Solche Reduktionen durch indirekte Beeinflussung der Aktivität eines Enzyms ist z. B. für die Wechselwirkung der Glykolyseproteine und -metaboliten ausführlich beschrieben worden und leicht übertragbar auf andere Stoffwechselwege, in denen die hierin beschriebenen Genprodukte eine Rolle spielen. Genauso kann ein erfindungsgemäß verwendetes Genprodukt in seiner Aktivität reduziert oder gehemmt werden, in dem die Aktivität von Interaktionspartnern, z. B. anderen Proteinen in einem Proteinkomplex mit dem hierin beschriebenen Genprodukt reduziert oder gehemmt wird. Das kann dazu führen, dass der gesamte Komplex nicht mehr aktiviert oder nicht oder nur teilweise entsteht oder nicht mehr regulierbar ist. Beispiele für solche Beeinflussung der Aktivität sind z. B. für Spleißosomen, Polymerasen, Ribosomen etc. beschrieben.
Unter "Fragment" wird eine Teilsequenz einer hierin beschriebenen Sequenz verstanden, die weniger Nukleotide oder Aminosäuren umfasst, als die hierin beschriebenen Sequenzen. Ein Fragment kann z. B. 1%, 5%, 10%, 30%, 50%, 70%, 90% der ursprünglichen Sequenz umfassen. Vorzugsweise umfasst ein Fragment 100, mehr bevorzugt 50, noch mehr bevorzugt weniger als 20 Aminosäuren der entsprechenden Nukleinsäuren.
Die Bedeutung der einzelnen Biosyntheseschritte ist dem Fachmann bekannt und kann z. B. in "Molecular Biology of the cell", Alberts, New York, 1998, °Biochemie" Stryer, 1988, New York, "Biochemieatlas", Michal, Heidelberg, 1999 oder in "Dictionary of Biotechnology", Coombs, 1992, nachgelesen werden.
Eine Ausführungsform betrifft somit ein erfindungsgemäßes Verfahren, wobei die Expression oder die Aktivität der genannten Nukleinsäuren oder Aminosäuren dadurch reduziert oder blockiert wird, dass die Transkription, Translation, Prozessierung und/oder Modifikation der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz oder Aminosäuresequenz reduziert oder blockiert wird.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann in einzelnen getrennten Verfahrensansätzen oder vorteilhaft in einem High-Throughput- Screening (HTS) durchgeführt werden und zur Identifizierung von Substanzen mit herbizider Wirkung oder von Antagonisten verwendet werden. Im vorgenannten Verfahren können vorteilhaft auch Substanzen identifiziert werden, die mit den oben genannten Nukleinsäuren bzw. mit deren Genprodukten interagieren, diese SLbstanzen sind potentielle Herbizide, die über die klassische chemische Synthese in ihrer Wirkung weiter verbessert werden könner.
Nach dem Verfahren identifizierte bzw. ausgewählte Substenzen können vorteilhaft auf eine Pflanze verbracht werden, um die herbizide Aktivität der Substanzen zu testen. Es werden solche Substanzen auswählt, die eine herbizide Aktivität zeigen. In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform des Verfahrens können die Substanzen auch neben dem vorgenannten in vivo-Testverfahren auch in einem in vitro Test identifiziert werden. Ein derartiger in vitro Test mit den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren bzw. deren Genprodukten hat den Vorteil, dass die Substanzen rasch und einfach auf ihre biologische Wirkung hin gescreent werden können. Derartige Test eignen sich auch vorteilhaft für das sog. HTS.
Das Verfahren kann mit freien Nukleinsäure wie DNA oder RNA, freien Genprodukten oder vorteilhaft in einem Organismus durchgeführt werden, wobei als Organismus Bakterien, Hefen, Pilze oder vorteilhaft Pflanzen verwendet werden. Als Organismen werden vorteilhaft konditionale oder natürliche Mutanten verwendet, die die Sequenzen SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38 oder SEQ ID NO: 40 betreffen. Unter konditionalen Mutanten sind Mutanten zu verstehen, die erst nach Induktion eine Reduktion der Expression, z. B. der Transkription oder der Translation der vorher genannten Nukleinsäuren oder der durch sie kodierten Genprodukte, aufweisen. Ein Beispiel derartiger konditionaler Mutanten sind Mutanten, in denen die Nukleinsäuren hinter einem temperatursensitiven Promotor liegen, der bei höheren Temperaturen nicht funktionell ist, das heißt der die Transkription bei höheren Temperaturen beispielsweise oberhalb 37°C verhindert. Ebenfalls möglich ist eine Expressionsregulation durch ein Effektor-Molekül, z. B. bei Kontrolle der Expression durch einen regulierbaren Promotor, wie z. B. die Tet-Systeme.
Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform ist ein Verfahren zur Identifikation eines Antagonisten von Proteinen, die durch eine Nukleinsäuresequenz wie sie in dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt wird, insbesondere ausgewählt aus der Gruppe:

a) einer Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38 oder SEQ ID NO: 40 dargestellten Sequenz,
b) einer Nukleinsäuresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes aus den durch Rückübersetzung der in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID:NO : 37, SEQ ID NO: 39 oder SEQ ID NO: 41 dargestellten Aminosäuresequenzen ableiten lässt,
c) Nukleinsäuresequenz, die ein Derivat oder ein Fragment der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38 oder SEQ ID NO: 40 dargestellten Nukleinsäuresequenzen ist, und mindestens 60% Homologie auf Nukleinsäureebene aufweist;
d) Nukleinsäuresequenz, die für Derivate oder Fragmente der Polypeptide mit den in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39 oder SEQ ID NO: 41 dargestellten Aminosäuresequenzen codiert, die mindestens 50% Homologie auf Aminosäureebene aufweisen;
e) Nukleinsäuresequenz, die für ein Fragment oder ein Epitope eines Polypeptides codiert, das spezifisch an einem Antikörper bindet, wobei der Antikörper spezifisch an ein Polypeptid bindet, das der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38 oder SEQ ID NO: 40 dargestellten Sequenz codiert wird;
f) Nukleinsäuresequenz, die für ein Fragment einer in aa) dargestellten Nukleinsäure codiert wird und das eine m6A-Methyltransferase-Aktivität, eine DNA-bindende-Aktivität oder "DNA- repair"-Aktivität, z. B. wie bei RAD 54, eine Thioredoxin- Aktivität, eine VAV2-Aktivität, eine Fructokinase-Aktivität, eine Zinkfingerprotein-Aktivität, eine LYTB-Aktivität, eine Crepopin-Aktivität, eine Leucin-Protein-Aktivität, eine DNAJ- Aktivität, ein CRS1-Aktivität, eine Alanyl-tRNA-Synthetase- Aktivität, eine OEP86-Aktivität, eine FMRF-Amid-Propeptid- Isolog-Aktivität, eine 26S Proteosom subunit S5B-Aktivität oder eine Geranylgeranylpyrophosphatsynthase-Aktivität hat; und/oder
g) Nukleinsäuresequenz, die für Derivate der Polypeptide mit den in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39 oder SEQ ID NO: 41 dargestellten Aminosäuresequenzer codiert, die mindestens 20% Homologie auf Aminosäureebene aufweist und eine äquivalente biologische Aktivität besitzt; oder

a) Inkontaktbringen von Zellen, die das Protein exprimieren, oder des Proteins mit einem Kandidatenstoff;
b) Testen der biologischen Aktivität des Protein;
c) Vergleichen der biologischen Aktivität des Proteins mit einer Standardaktivität in Abwesenheit des Kandidatenstoffs, wobei eine Verringerung der biologischen Aktivität des Proteins anzeigt, dass der Kandidatenstoff ein Antagonist ist.

Unter ii) wird das Testen einer der oben beschriebenen biologischen Aktivitäten beschrieben, z. B. eine Enzymaktivität wie sie in den Beispielen angegeben ist oder eine Bindung, vorzugsweise eine starke Bindung zwischen Protein- und Kandidatenstoff.
In einer vorteilhaften Ausführungsform des oben beschriebenen Verfahrens wird/werden der/die unter Buchstabe iii) identifizierten) Antagonist(en) auf eine Pflanze verbracht, um seine /ihre herbizide Aktivität zu testen und der/die Antagonisten) ausgewählt, die eine herbizide Aktivität zeigen.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann in einzelnen getrennten Verfahrensansätzen in vivo oder in vitro und/oder vorteilhaft gemeinsam oder besonders vorteilhaft in einem High-Throughput- Screening durchgeführt werden und zur Identifizierung von Substanzen mit herbizider Wirkung oder von Antagonisten verwendet werden.
Die im erfindungsgemäßen Verfahren identifizierten bzw. selektierten Nukleinsäuresequenzen sind für das Wachstum und die Entwicklung von höheren Pflanzen essentiell. Die Unterdrückung der Bildung der Genprodukte, d. h. der Expression, z. B. durch die spezifische Beeinflussung von z. B. Translation, Transkription oder Prozessierung und/oder der Unterdrückung der von den kodierten Genprodukten ausgeübten Funktion bzw. biologischen Aktivität in intakten Pflanzen durch Substanzen vorteilhaft niedermolekularen Substanzen mit einem Molekulargewicht von kleiner 1000 Dalton, vorteilhaft kleiner 900 Dalton, bevorzugt kleiner 800, besonders bevorzugt kleiner 700, ganz besonders bevorzugt kleiner 600 Dalton, vorteilhaft mit einem Ki-Wert kleiner 1 mM und vorteilhaft mit weniger als drei Hydroxylgruppen an einem Kohlenstoffatom-enthaltenden Ring oder proteinoffenen Substanzen oder einer Sense- oder Antisense-RNA oder einem Antikörper oder Antikörperfragment führt daher zu vorteilhafterweise massiven Veränderungen des Wachstums und der Entwicklung der betroffenen Pflanzen. Die im erfindungsgemäßen Verfahren identifizierten Substanzen sind deshalb in der Landwirtschaft als Herbizide geeignet.
Die in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuren SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38 oder SEQ ID NO: 40 sind essentiell für Organismen, bevorzugt für Pflanzen. Einige Genprodukte der genannten Sequenzen sind z. B. den Polypeptiden der Sequenzen SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39 oder SEQ ID NO; 41 zu entnehmen.
Die genomische DNA der Sequenzen wird jeweils in SEQ ID NO: 19 (genomische DNA von Linie P95), SEQ ID NO: 20 (genomische DNA von Linie P9), SEQ ID NO: 21 (genomische DNA von Linie P28), SEQ ID NO: 22 (genomische DNA von Linie P44), SEQ ID NO: 23 (genomische DNA von Linie P77), SEQ ID NO: 24 (genomische DNA von Linie P102), SEQ ID NO: 43 (genomische DNA von Linie A 301034) und SEQ ID NO: 42 (genomische DNA von Linie A 300857) wiedergegeben. Für Linie A 300841 und A 300367 ist die genomische Sequenz identisch zu SEQ ID NO: 32 und SEQ ID NO: 40, da kein Intron gefunden wurde.
SEQ ID NO: 1 ( = Klon P95) codiert für ein Protein (PID: g2460037), das Ähnlichkeiten zu verschiedenen m6A-Methyltransferasen unter anderem aus Maus (NP_062695) und Mensch (AAB71850) aufweist.
SEQ ID NO: 3 ( = Klon P9) codiert für ein "DNA repair protein RAD54-like" Protein-Homolog, das auf Chromosom 3 (EMBL/A)P000419) von Arabidopsis liegt. Es hat Ähnlichkeiten im Blast-Vergleich zu einer Reihe von DNA-bindenden Proteinen wie Helicasen Transactivatoren etc. (Emery et al., Gene 104 (1), 103-106, 1991). Eine besonders hohe Ähnlichkeit liegt zu dem DNA-Repair-Protein RHP 54 aus Schizosaccharomyces pombe vor (Muris et al.,,T. Cell. Sci. 109 (Pt 1), 73-81, 1996).
SEQ ID NO: 5 ( = Klon P38) codiert für einen ORF auf Chromosom 3 (EMBLNEW/AC023912), der möglicherweise für ein ThioredoxLn codiert. Im Blast-Vergleich zeigen sich Ähnlichkeiten zu Thioredoxinen verschiedener Herkunft (Fraser et al., Nature 390 (6660), 580-586, 1997; Reith et al., Plant Mol. Biol. Rep., 13, 333-335, 1995).
Der Klon P44 ( = SEQ ID NO: 7) kodiert für ein Protein des TAC Klons K15C23 (EMBLALERT/AB024024) ohne eindeutige Homologie in der Blast-Suche. Sequenzvergleiche auf Aminosäureebene zeigen schwache Homologien zu VAV2-Proteinen (kleines ras-ähnliches GTP- bindende Protein, Swissprot Q60992, Schuebel et al., Oncogene 13 (2), 363-371, 1996; Henske et al., Ann. Huam. Genet. 59 (Pt 1), 25-37, 1995).
SEQ ID NO: 9 ( = Klon P77) codiert wahrscheinlich für eine Fructokinase des BAC Klons F24B22 des Chromosoms 3 (ENBL/ATF24B22). Blast-Vergleiche bestätigen diese Homologie (swissprot F37829, Smith et al., Plant Physiol., 102 (3), 1043, 1993; Blatch et al., Gene, 95 (1), 17-23, 1990).
Von SEQ ID NO: 11 wird ein Protein (Accesscion number BAB09578.1) codiert, das schwache Homologien zu verschiedenen Zinkfinger- Proteinen hat. Es zeigt schwache Homologien zu Zinkfingerproteinen und DNA-bindendenen Proteinen, wie bspw. dem Zinkfingerprotein 265 aus Ratte (Karginova, E. A., Am. J. Physiol. 273 (5 Pt 2), F731-F738 (1997)) für welches eine Funktion für die Regulation der Transkription und/oder des Splicings angenommen wird. In vitro Transkriptions- oder Splicing-Assays sind vielfach beschrieben und dem Fachmann bekannt.
Das durch SEQ ID NO: 13 codierte Protein (AB36712.1) hat Ähnlichkeiten zu LYTB-Proteinen speziell zu LYTB SYNY3 aus Synechocystis (Q55643). Das Gen bzw. das durch das Gen codierte Protein liegt auf Chromosom V (Accession number AB006706). Innerhalb der Sequenz von SEQ ID NO: 13 sind einige ESTs (gb:Z34640, Z30476, AA605545, Z34228, H76883, Z26425) bekannt.
SEQ ID NO: 15 codiert für ein hypothetisches Protein (CAB81447,1), das die Crepropin-Familien-Signatur enthält; und schwache Homologien zu myc-Protoonkogenen aufweist.
Das von SEQ ID NO: 17 (siehe auch ESTAV528166) codierte Protein (AAF23295), hat eine gewisse Homologie zu einem Leucin-reichen Protein aus dem Mensch (Acession number P42704, Wang et al., In vitro Cell Dev. Biol. Amin. 1994, 30A(2): 111-114). Es zeigt eine substanzielle Homologie zu einem leucinreichen Protein (LRP130) aus Mensch dessen Funktion unbekannt ist, aber auf Aminosäureebene schwache Homologien zu den Consensusequenzen der ATP- Bindungstellen in ATP-abhängigen Kinasen und der Proteinkinase C-Phosphorylierungsstelle des epidermal growth factor Rezeptors.
SEQ ID NO: 26 kodiert für ein Protein, das für einen Bereich von 40 Aminosäuren Homologie zu verschiedenen DNAJ Chaperon-Proteinen (Heat Shock Protein 40) hat, z. B. zu DNAJ Protein (Q9UXR9) aus Methanosarcina thermophila (Hoffmann-Bang, Gene 238 (2), 387-395, 1999).
SEQ ID NO: 28 kodiert für ein hypothetisches Protein (CAC01859.1). Die abgeleitete Proteinsequenz zeigt deutliche Homologien zum CRS1 Genprodukt aus Mais (AAG00595), welches für das Splicen des Gruppe II Introns des Chloroplastengens atpF benötigt wird.
SEQ ID NO: 30 kodiert vermutlich für eine Alanyl-tRNA-Syntethase (BAB10601.1)
SEQ ID NO: 32 kodiert für ein Protein, das eine starke Homologie zum "chloroplast outer envelope 86 protein" OEP86 aus Erbse P. sativurn, GenBank Accessionnumber Z31581 und besitzt ein ATP/GTP-Bindungsstellenmotiv (P-100p). Für diesen ORF (CAB80744.1) sind bereits ESTs (EST gb:AI998804.1, R90258, AA651438) bekannt.
SEQ ID NO: 34 kodiert für ein Protein, dessen abgeleitete Aminosäuresequenz (AAF25967.1) deutliche Ähnlichkeit zu einem "FMRF- Amid Propeptid-Isolog (gi|1871179) aus Arabidopsis zeigt
SEQ ID NO: 36 kodiert für ein unbekanntes Protein (BAB02572.1) mit schwacher Homologie zu Proteosomenprotein 26S PROTEASOM SUBUNIT SSB, (Deveraux, 1995, J. Biol. Chem. 270 (40), 23726.
SEQ ID NO: 38 codiert für ein unbekanntes Protein.
SEQ ID NO: 40 codiert für eine Geranylgeranylpyrophosphatsynthase (Bartley, Plant Physiol. 104, 1469-1470, 1994)
Die genannten Sequenzen wurden alle in Arabidopsis identifiziert.
Die Unterdrückung der Bildung der Genprodukte bzw. Unterdrückung der von den kodierten Genprodukten ausgeübten Funktion oder Aktivität in intakten Pflanzen durch eine niedermolekulare Substanz führt zur Reduzierung, bevorzugt zur Unterdrücking des Wachstums; die Entwicklung der Pflanze wird massiv verändert und unterdrückt.
Weitere Klone, die das Wachstum und die Entwicklung der Pflanze massiv verändern, sind die Klone P95 und P99a, auch sie sind zur Identifizierung von Herbiziden vorteilhaft geeignet. Der genomische Bereich, in dem die Insertion der T-DNA bei KLon P91 stattfand, liegt in einem Bereich, für den kein Open Reading Frame ( = ORF) vorhergesagt werden konnte. Die Insertion der T-DNA erfolgte bei Klon P91 in Position 6632 des P1-Klons MUJ8 (AB028621) des Chromosoms III von Arabidopsis. Die Sequenz ist AB028621 zu entnehmen. Auch im Falle des Klons P99a erfolgte die Insertion des T-DNA (Position 96710 des BACs F10K1 [AC067971] des Chromosoms I von Arabidopsis) an einer Stelle im Genom, für die kein ORF vorhergesagt wurde. Dem Klon AC067971 kann die genomische Sequenz entnommen werden.
Die vorgenannten Sequenzen oder funktionale Teile davon ermöglichen die Identifizierung von in der Landwirtschaft nutzbaren Herbiziden beispielsweise über ein Verfahren, das die folgenden Schritte umfasst:

a) Bereitstellung zweier Linien eines Organismus, die die Genprodukte, die durch eine für das erfindungsgemäße Verfahren beschriebenen Sequenzen, insbesondere SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38 oder SEQ ID NO: 40, codiert werden oder den beschriebenen Derivaten oder Fragementen davon, die die biologische Aktivität dieser Sequenzen aufweisen, funktional exprimieren, wobei die Expression der Linien unterschiedlich hoch ist, z. B. durch Mutagenese einer Linie und Identifizierung einer Mutante mit erhöhter oder erniedrigter Expression und/oder Aktivität des genannten Genprodukts im Vergleich zur Ausgangslinie oder, z. B. durch Erzeugung von rekombinanten Organismen, vorteilhaft transgenen Pflanzen, Pflanzengeweben wie Geweben von beispielsweise Blatt, Wurzel, Spross oder Stamm, Pflanzensamen, Pflanzenkalli oder Pflanzenzellen, die die erfindungsgemäß beschriebenen Sequenzen, insbesondere SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38 oder SEQ ID NO: 40 oder Derivate oder Fragmente davon, die die biologische Aktivität dieser Sequenzen besitzen, funktional exprimieren;
b) Zugabe von chemischen Verbindungen (die auf ihre Herbizidaktivität getestet werden sollen) zu den Linien mit den unterschiedlichen Expressions- oder Aktivitätsleveln des Genprodukts, z. B. zu den unter a) genannten rekombinanten Organismen und nicht rekombinanten Ausgangsorganisnum mit einem anderen, vorzugsweise geringeren Expressions- oder Aktivitätslevel des Genprodukts;
c) Bestimmung der biologischen Aktivität, beispielsweise der enzymatischen Aktivität, des Wachstums oder der Vitalität der beiden Linien, z. B. der rekombinanten Organismen, in Vergleich zu den nicht rekombinanten Ausgangsorganismea, nach Zugabe von chemischen Verbindungen gemäß Punkt b); und
d) Selektion der chemischen Verbindungen, die die biologische Aktivität, beispielsweise die enzymatische Aktivität, das Wachstum oder die Vitalität der Linie mit der geringeren Aktivität reduziert oder vollständig hemmt bzw. blockiert, z. B. die die biologische Aktivität, das Wachstum oder die Vitalität der nicht rekombinanten Organismen, der gemäß Punkt c) bestimmten chemischen Verbindungen, im Vergleich zu den behandelten rekombinanten Organismen reduzieren oder vollständig hemmen bzw. blockieren.

Ein in der Landwirtschaft nutzbares Herbizid kann auch identifiziert werden, wenn die oben in a) erzeugten rekombinanten Organismen in einem Verfahren getestet werden, das folgende Schritte umfasst:

a) Zugabe von chemischen Verbindungen, die auf ihre Herbizidaktivität getestet werden sollen, zu den unter (a) genannten rekombinanten Organismen; und
b) Bestimmung der biologischen Aktivität, beispiel Weise der enzymatischen Aktivität, des Wachstums oder der Vitalität der rekombinanten Organismen nach Zugabe von chemischen Verbindungen gemäß (b) im Vergleich zu denselben nicht behandelten rekombinanten Organismen; und
c) Selektion der chemischen Verbindung, die die biologische Aktivität, z. B. die enzymatische Aktivität, das Wachstum oder die Vitalität der behandelten Organismen im Vergleich zu den unbehandelten Organismen reduziert oder vollständig hemmt oder blockiert.

Unter chemischen Verbindungen, die die biologische Aktivität, das Wachstum oder die Vitalität der Organismen reduzieren, sind Verbindungen zu verstehen, die die biologische Aktivität, tLas Wachstum oder die Vitalität der Organismen mindestens um 10%, vorteilhaft um mindestens 30%, bevorzugt um mindestens 50%, besonders bevorzugt um mindestens 70%, ganz besonders bevorzugt um mindestens 90% hemmen, d. h. reduzieren oder blockieren.
Vorteilhaft ist insbesondere eine Substanz, die die Zelllinien mit geringer Aktivität schädigen oder, vorzugsweise, die letal ist, jedoch nicht Zelllinien, die eine höhere Aktivität des Genproduktes aufweisen, schädigt oder für diese letal ist.
Allgemein können in dem genannten Verfahren Linien von Organismen eingesetzt werden, die die erfindungsgemäßen Sequenzen und insbesondere die Genprodukte, die durch erfindungsgemäße Nukleinsäuren codiert werden, exprimieren, die jedoch nicht rekombinant sind, solange eine Linie eine höhere Genexpression oder Aktivität des Genprodukts aufweist als eine andere Linie. Solche Linien können natürlich auftreten oder durch Mutagenesen erzeugt werden.
Assaysysteme, die die Identifizierung von Substanzen, die die Bildung der Genprodukte und/oder die von den Genprodukten ausgeübten Funktionen oder die Aktivität der Genprodukte in intakten Pflanzen, Pflanzenteilen, -geweben oder Pflanzenzellen unterdrücken, sind dem Fachmann bekannt. Beispielhaft sei hier auf Testsysteme für die Inhibierung von Enzymen wie der Fructokinaseaktivität wie von Tangney et al. (J. Mol. Microbiol. Biotechnol., 2 (1), 2000: 71-80), Martinez-Barajas et al. (Frotein Expr. Purif., 1997, 11 (1), 41-46), Kanayama et al. (Plart Physiol., 1997, 113 (4), 1379-1384) oder von Veiga-da-Cunha et al. (Protein Expr. Purif., 19 (1), 2000: 48-52) beschrieben, verwiesen. Diese Testsysteme können beispielsweise vorteilhaft für sog. Inhibierungsassays für beispielsweise den Klon 177 verwenden.
Weitere vorteilhafte Assaysysteme sind beispielsweise die Fluoreszenz Korrelationsspectroskopie ( = FCS). Mit Hilfe der FCS (Brock et al., PNAS, 1999, 96, 10123-10128; Lamb et al., J. Phys. Org. Chem., 2000, 13654-658) ist es möglich die zeitliche Diffusion von Molekülen zu messen bzw. die Differenz der gebundenen gegenüber den freien Molekülen zu ermitteln. Hierzu werden die zu untersuchenden Moleküle fluoreszenzmarkiert und beispielsweise ein definiertes Volumen in Mikrotiterplatten gegeben. Die Fluktuation der Moleküle wird in den Proben dabei von der Braunschen Molekularbewegung getrieben. Durch einen in der Probe fokusierten Laser lassen sich die translateralen bzw. rotationale Diffusion und Konformationsänderungen der Moleküle verfolgen und über eine Korrelation analysieren. Durch Bindung an andere Substanzen ändert sich der Diffusionskoeffizient der Moleküle. Mit Hilfe verschiedener Algorithmen lässt sich die Bindung der Moleküle über die Änderung des Diffusionskoeffizienten ermitteln bzw. quantifizieren. Mit dieser Methode kann in einem breiten Konzentrationsbereich vorteilhaft gemessen werden. Die Methode eignet sich vorteilhaft für die Messung von rekombinanten Proteinen, die vorteilhaft mit einem sog. His-Tag zur leichteren Aufreinigung über handelsübliche Chromatographie-Säulen (Porath et al., Nature 1975, 258, 598-599) versehen sind. Das so gereinigte Protein wird schließlich mit einem Fluoreszenzmarker wie z. B. Carboxytetramethylrhodamin oder BODIPY® (z. B. BODIPY 576/589 Angiotensin II, NEN® Life Science Products, Boston, MA, USA) versehen. Die zu untersuchende Verbindung bzw. Substanz wird zu dem Protein anschließend in einem Überschuss zugegeben. Die Diffusion des so markierten Proteins wird schließlich mit einem FCS-System (z. B. ConfoCor2 mit LSM 510, Carl Zeiss Mikroskop, Jena, Deutschland) ermittelt.
Eine weitere vorteilhafte Detektions-Methode für das erfindungsgemäße Verfahren ist die sog. "Surface Enhanced Laser Desorption Ionisation"-Methode ( = SELDI ProteinChip®). Diese Methode wurde von Hutchens und Yip (1980) erstmals beschrieben. Mit dieser Methode, die für die reproduzierbare, gleichzeitige Identifizierung von Biomarkern oder Antigenen entwickelt wurden (Hutchens und Yip, Rapid Commun. Mass Spectrom, 1993, 7, 576-580), kann die Ligand-Protein-Bindung über Massenspektrometrie analysiert werden. Dabei erfolgt die Detektion über normale TOF-Detektion ( = time of flight). Auch bei dieser Methode können rekombinant exprimierte Proteine wie oben beschrieben exprimiert und gereinigt werden. Zur Messung wird das Protein auf den SELDI Protein- Chips® immobilisiert, beispielsweise über die schon zur Reinigung verwendeten His-Tags oder über Ionen- oder hydrophobe Wechselwirkungen mit dem Chip. Auf diesen so vorbereiteten Chip werden anschließend die Liganden mit beispielsweise einem Autosampler gegeben. Nach einem oder mehreren Waschschritten mit Puffern verschiedener Ionenstärke werden die gebundenen Liganden mit dem LDI-Laser analysiert. Dabei wird die Bindungsstärke der Liganden nach jedem Waschschritt ermittelt.
Als weitere vorteilhafte Dektionsmethode sei die sog. Biacore- Methode genannt, bei der der Refraktionsindex an der Oberfläche bei Bindung von Liganden an das an der Oberfläche gebundene Protein analysiert wird. Bei dieser Methode wird eine Kollektion von kleinen Liganden sequentiell in eine Messzelle mit dar gebundenen Protein gegeben. Die Bindung an der Oberfläche wird über eine erhöhte sog. "Plasmon-Resonanz" ( = SPR) über die Aufzeichnung der Laserrefraktion von der Oberfläche ermittelt. Im allgemeinen ist die Refraktionsindexänderung, die für eine Änderung der Massenkonzentration an der Oberfläche, ermittelt wird für alle Proteine oder Polypeptide gleich, das heißt diese Methode kann vorteilhaft für die verschiedensten Proteine verwendet werden. (Liedberg et al., Sens. Actuators, 1984, 4, 299-304). Wie oben beschrieben werden auch hier vorteilhaft rekombinant exprimierte Proteine verwendet, die an den Biacore Chip (Upsala, Schweden) beispielsweise über Histidin-Reste (z. B. His-Tag) gebunden werden. Der so hergestellte Chip wird wieder mit den Liganden in Verbindung gebracht z. B. mit einem Autosampler und die Bindung über ein von Biacore vertriebenes Detektionssystem mit Hilfe des SPR-Signals d. h. über die Änderung des Refraktionsindex gemessen.
Die erfindungsgemäßen Verfahren haben eine Reihe von Vorteilen wie beispielsweise:

- neue potentielle Angriffsorte für herbizide Wirkstoffe können identifiziert werden,
- Identifizierung von Herbiziden, die eine möglichst umfassende Pflanzenspezies unabhängige Wirkung haben,
- Substanzen, die mittels der kombinatorischen Chemie erzeugte wurden, und die sich durch eine hohe Vielfalt, aber geringe zur Verfügung stehende Mengen auszeichnen können effizient auf Inhibitoren der neu identifizierten Angriffsorte geprüft werden
- sie erlauben, landwirtschaftlichen Nutzpflanzen im Fall von z. B. sehr breite Wirksamkeit aufweisenden Herbiziden (Totalherbiziden oder auch selektiven Herbiziden) Resistenz gegenüber diesen zu vermitteln (siehe Beschreibung im folgenden)

Z. B. können Substanzen, die besonders spezifisch mit z. B. einem Protein oder Proteinfragment binden, das von einer Nukleinsäure kodiert wird, deren Expression essentiell für das Wachstum der Pflanzen ist, mit den genannten Verfahren isoliert werden. Dies ermöglicht eine vereinfachte Identifikation möglicher Inhibitoren, die Proteine, z. B. in ihren Enzymeigenschaften, Bindeeigenschaften oder sonstigen Aktivitäten hemmen, z. B. auch durch die Inhibierung ihrer Prozessierung, wie oben beschrieben, oder ihren Transport innerhalb der Zelle oder Im- und Export aus Organellen oder Zellen verhindern. Die so identifiziarten Substanzen können auch in einem weiteren Schritt in Screaning- Verfahren, wie sie dem Fachmann bekannt sind, auf Pflanzen aufgebracht werden und auf ihre Beeinflussung des Wachstums und der Entwicklung hin untersucht werden. Somit wird eine Auswahl aus der unendlichen Zahl chemischen Verbindungen, die sich für ein Screeningverfahren eignen würden, getroffen, die es dem Fachmann wesentlich erleichtert, herbizide Substanzen zu identifizieren.
Unter "spezifische Bindung" versteht man die Spezifität von Interaktionen zwischen zwei Partnern, z. B. Proteinen untereinander oder von Protein (Enzym) und Substrat (Substratspezifität). Sie beruht auf einer bestimmten molekularen räumlichen Struktur. Wird sie zerstört, spricht man von Denaturierung, die oftmals irreversibel ist und wodurch die Spezifität meistens verloren gehen kann. Diese biologische Aktivität ist stark abhängig von den Umgebungsbedingungen (Puffer, Temperatur, Kontakte zu unphysiologische Oberflächen wie Glas oder fehlende Cofaktoren).
Bei Enzym-Substrat oder Cofaktor, bei Rezeptor-Ligand oder bei Antikörper-Antigen Bindungen spricht man von spezifischen Bindungen. Die Enzym-Substrat Wechselwirkung wird thermodynamisch im einfachsten Fall mit der Michaelis-Menten-Gleichung beschrieben. Sie beschreibt die Enzymaktivität über die sog. Michaelis-Menten-Konstante, die wiederum die Kinetik wiederspiegelt. Diese Konstante ist auch die Maßeinheit für dis Enzymaktivität, die wiederum die Spezifität wiederspiegelt. Definition der Enzymaktivitätseinheit (nach IUB): Eine Einheit U entspricht derjenigen Enzymmenge, welche die Umsetzung von einem Mikromol Substrat pro Minute unter genau festgelegten Versuchsbedingungen katalysiert. Die spezifische Aktivität wird meist in U/mg angegeben.
In einem weiteren Schritt können dann die identifizierten Substanzen auf Pflanzen, Microorganismen oder Zellen aufgebracht werden, z. B. auf Pflanzenzellen, und dann die Beeinflussung des Stoffwechsels dieser Pflanzen beobachtet werden, z. B. Enzymaktivitäten, Photosyntheseaktivitäten, Stoffwechselaktivität, Fixierungsrate, Gasaustausch, DNA-Synthese, Wachstumsraten. Diese und viele andere dem Fachmann bekannte Methoden eignen sich, um die Viabilität von Zellen zu untersuchen. Substanzen, die das Wachstum, z. B. von Zellen, insbesondere Pflanzenzellen, reduzieren, insbesondere blockieren, eignen sich dann bevorzugt als Auswahl für herbizide Mittel.
Weiterhin können schon in einem sehr frühen Stadium Untersuchungen zu den Aufwandmengen der gefundenen Herbizide gemacht werden. Außerdem kann die hohe Spezifität und Effizienz gegenüber Unkräutern leicht ermittelt werden.
Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens kann eine Vielzahl von chemischen Verbindungen schnell und einfach auf herbizide Eigenschaften überprüft werden. Das Verfahren gestattet es, reproduzierbar aus einer großen Anzahl von Substanzen gezielt solche mit großer Wirkstärke auszuwählen, um mit diesen Substanzen anschließend weitere, dem Fachmann geläufige vertiefte Prüfungen durchzuführen.
Weiterer Gegenstand der Erfindung ist eins Verfahren zur Identifizierung von Inhibitoren pflanzlicher Proteine, die durch die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenzen codiert werden, mit potentiell herbizider Wirkung indem man die Genprodukte kloniert, in einer geeigneten Expressionskassette - beispielsweise in Insektenzellen - zur Überexpression bringt, die Zellen öffnet und den Zellextrakt direkt bzw. nach Anreicherung oder Isolierung des Proteins in einem Testsystem zur Messung der biologischen Aktivität in Gegenwart von niedermolekularen chemischen Verbindungen einsetzt.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind deshalb Substanzen identifiziert nach den erfindungsgemäßen Verfahren, wobei die Substanz ein Molekulargewicht von kleiner 1000 Dalton, vorteilhaft kleiner 900 Dalton, bevorzugt kleiner 800, besonders bevorzugt kleiner 700, ganz besonders bevorzugt kleiner 600 Dalton, einem Ki-Wert kleiner 1 M, und vorzugsweise weniger als drei Hydroxylgruppen an einem Kohlenstoffatom-enthaltenden Ring hat bzw. wobei es sich bei der Substanz um eine proteinogene Substanz, um eine Antisense-RNA, eine inhibierende oder eine interferierende RNA (RNAi) handelt.
Der Bergiff "sense" bezieht sich auf den Strang einer doppelsträngigen DNA der homolog zu dem mRNA-Transkript ist. Der "Antisense"-Strang enthält eine invertierte Sequenz, die komplementär zu der des "Sense"-Strangs ist. Ein Antisense-Nukleinsäuremolekül umfasst z. B. eine Nukletidsequenz, die komplementär zu dem "Sense"-Nukleinsäuremolekül ist, das ein Protein oder eine aktive RNA kodiert, z. B. komplementär zu dem kodierenden Strang eines doppelsträngigen cDNA-Moleküls oder komplementär zu einer mRNA- Sequenz. Folglich kann ein Antisense-Nukleinsäuremolekül Wasserstoffbrückenbindungen zu einem Sense-Nukleinsäuremolekül ausbilden. Das Antisense-Nukleinsäuremolekül kann komplementär zu jedem hier gezeigten kodierenden Strang sein, oder nur zu einem Teil davon. Der Begriff "kodierende Region" bezieht sich auf die Region einer Nukleinsäuresequenz, deren Codone in Aminosäuren translatiert werden. Auch kann das Antisense-Nukleinsäuramolekül komplementär zu "nicht-kodierenden Regionen" des kodierenden Strangs der gezeigten Nukleinsäuremoleküle sein. Der Begriff "nicht-kodierende Region" bezieht sich auf 5'- und 3'-Sequenzen, die die kodierende Region flankieren und die nicht in ein Polypeptid translatiert werden (z. B. auch bezeichnet als 5'- und 3'-nicht-translatierte Regionen). Das Nukleinsäuremolekül, das eine Antisensesequenz umfasst, kann auch weitere für die Expression und Stabilität des Moleküls wichtige Elemente umfassen, z. B. Capping-Strukturen, poly A-tails etc.
Das Antisense-Nukleinsäuremolekül kann komplementär zu der gesamten kodierenden Region einer mRNA sein, aber kann auch ein Oligonukleotid sein, welches komplementär zu nur einem Teil der kodierenden oder nicht-kodierenden Region der mRNA ist. Z. B. kann ein Antisense-Oligonukleotid komplementär zu der Region sein, die den Translationsstart der mRNA umfasst oder umgibt. Ein Antisense-Oligonukleotid kann z. B. 10-, 15-, 20-, 25-, 30-, 35-, 40-, 45- oder 50-Nukleotide lang sein. Ein Antisense-Nukleinsäuremolekül kann durch chemische Synthese und enzymatische Ligation nach dem Fachmann bekannten Verfahren hergestellt werden. Ein Antisense-Nukleinsäuremolekül kann chemisch synthetisiert werden unter Verwendung von natürlich vorkommenden Nukleotiden oder auf verschiedene Arten modifizierten Nukleotiden, so daß die biologische Stabilität der Moleküle erhöht ist oder die physikalische Stabilität des Duplex, die sich zwischen der Antisense- und Sense-Nukleinsäure bildet, verstärkt ist, z. B. können Phosphorothioatderivate und Acridin-substituierte Nukleotide verwendet werden. Beispiele für modifizierte Nukleotide, die für die Herstellung von Antisense-Nukleinsäuren verwendet werden können, umfassen 5-Fluorouracil, 5-Bromouracil, 5-Chlorouracil, 5-Iodouracil, Hypoxanthine, Xanthine, 4-Acetylcytosine, 5-(Carboxyhydroxylmethyl)uracil, 5-Carboxymethylaminomethyl-2 -thiouridine, 5-Carboxymethylaminomethyluracil, Dihydrouracil, Beta-D-galactosylqueosine, Inosine, N6-Isopentenyladenine, 1-Methylguanine, 1-Methylinosine, 2,2-Dimethylguanine, 2-Methyladenine, 2-Methylguanine, 3-Methylcytosine, 5-Methylcytosine, N6-Adenine, 7-Methylguanine, 5-Methylaminomethyluracil, 5-Methoxyaminomethyl-2-thiouracil, Beta-D-mannosylqueosine, 5'-Methoxycarboxymethyluracil, 5-Methoxyuracil, 2-Methylthio- N6-isopentenyladenine, Uracil-5-oxyacetic acid (v), Wybutoxosine, Pseudouracil, Queosine, 2-Thiocytosine, 5-Methyl-2-thiouracil, 2-Thiouracil, 4-Thiouracil, 5-Methyluracil, Uracil-5-oxyaceticacidmethylester, Uracil-5-oxyacetic acid (v), 5-Methyl-2-thiouracil, 3-(3-Amino-3-N-2-carboxypropyl)uracil, (acp3)w, und 2,6-Diaminopurine.
Alternativ können Antisense-Nukleinsäuremoleküle biologisch hergestellt werden unter Verwendung von Expressionsvektoren, in welche Polynukleotide kloniert wurden, deren Orientation gegenläufig ist (so daß RNA, transkribiert von dem inserierten Polynukleotid, in einer Antisenseorientierung zu einem Zielpolynukleotid wie es weiter oben beschrieben wurde, ist).
Das Antisense-Nukleinsäuremolekül kann auch ein "α-Anomeric" Nukleinsäuremolekül sein. Ein "α-Anomeric" Nukleinsäuremolekül formt spezifische Doppelstranghybride mit komplementären RNAs, in denen, im Gegensatz zu gewöhnlichen β-Einheiten, die Stränge parallel zueinander laufen. Das Antisense-Nukleinsäuremolekül kann 2-0-Methylribonukleotide oder chimäre RNA-DNA-Analoge umfassen.
Weiterhin kann das Antisense-Nukleinsäuremolekül ein Ribozym sein. Ribozyme sind katalytische RNA-Moleküle mit einer Ribonukleaseaktivität, die dazu fähig sind, einzelsträngige Nukleinsäuren, wie z. B. mRNA, zu denen sie eine komplementäre Region haben, zu schneiden. Ribozyme (z. B. Hammerheadribozyme) können dazu verwendet werden katalytisch oder nichtkatalytisch mRNA der hierin beschriebenen Sequenzen zu schneiden und somit die Translation der mRNA zu verhindern. Ein Ribozym, das zu einer der hierin genannten Nukleinsäuresequenzen spezifisch ist, kann aufgrund der hier gezeigten cDNA-Sequenzen konstruiert werden oder auf Basis von heterologen Sequenzen, die nach den hierin beschriebenen Methoden identifiziert werden können. Z. B. kann ein Derivat der Tetrahymena L-19 IVSRNA hergestellt werden, indem die Nukletidsequenz der aktiven Region komplementär zu der Nixkleotidsequenz ist, die in einer kodierenden mRNA geschnitten wird. Alternativ kann auch eine der hierin beschriebenen kodierenden oder nichtkodierenden Sequenzen oder einer mRNA davon verwendet werden, um eine katalytische RNA aus einem Pool von RNAs auszuwählen (s. z. B. Bartel, 1993, Science, 261, 1411). Alternativ kann die Expression auch inhibiert werden, indem Nukleotidsequenzen, die komplementär zu einer regulatorischen Region der hierin beschriebenen Nukleinsäuresequenzen ist (z. B. ein Promotor oder Enhancer) eine triple-helikale Struktur bildet, die die Transkription des folgenden Gens verhindert (z. B. Helene, 1931, Anticance-Drug Des. 6, 596; Helene, 1992, Ann. NY Acad. Sci. 660, 27, oder Maher, 1992, Bioassays, 14, 807.
Unter "Antikörpern" sind beispielsweise polyklonale, monoklonale, humane oder humanisierte oder rekombinante Antikörper odar Fragmente davon, single chain Antikörper oder auch synthetische Antikörper zu verstehen. Unter erfindungsgemäßen Antikörpern oder deren Fragmente sind prinzipiell alle Immunoglobulinklassen wie IgM, IgG, IgD, IgE, IgA oder ihre Subklassen wie die Subklassen des IgG oder deren Mischungen zu verstehen. Bevorzugt sind IgG und seine Subklassen wie beispielsweise hgG₁, IgG₂, IgG_2a, IgG_2b, IgG₃ oder IgG_M. Besonders bevorzugt sind die IgG Subtypen IgG₁ oder IgG_2b. Als Fragmente seien alle verkürzten oder veränderten Antikörperfragmente mit einer oder zwei dem Antigen komplementären Bindungsstellen, wie Antikörperteile mit einer der Antikörper entsprechenden von leichter und schwerer Kette gebildeten Bindungsstelle wie Fv-, Fab- oder F(ab')₂-Fragmente oder Einzelstrangfragmente, genannt. Bevorzugt sind verkürzte Doppelstrangfragmente wie Fv-, Fab- oder F(ab')₂. Diese Fragmente können beispielsweise auf enzymatischem Wege durch Abspaltung des Fc- Teils der Antikörper mit Enzymen wie Papain oder Pepsin durch chemische Oxidation oder durch gentechnische Manipulation der Antikörpergene erhalten werden. Auch genmanipulierte nichtverkürzte Fragmente können vorteilhaft verwendet werden. Die Antikörper oder Fragmente können allein oder in Mischungen verwendet werden. Antikörper können auch Teil eines Fusionsproteins sein.
Die identifizierten Substanzen können chemisch synthetisierte oder mikrobiologisch produzierte Stoffe sein und z. B. in Zellextrakten von z. B. Pflanzen, Tieren oder Mikroorganismen auftreten. Weiterhin können die genannten Stoffe zwar im Stand der Technik bekannt sein, aber bisher nicht bekannt sein als Herbizid. Das Reaktionsgemisch kann ein zellfreier Extrakt sein oder eine Zelle oder Zellkultur umfassen. Geeignete Methoden sind dem Fachmann bekannt und werden z. B. allgemein beschrieben in Alberts, Molecular Biology the cell, 3^rd Edition (1994), z. B. Kapitel 17. Die genannten Stoffe können z. B. zu dem Reaktionsgemisch oder dem Kulturmedium zugegeben werden oder den Zellen injiziert werden oder auf eine Pflanze gesprüht werden.
Wenn eine Probe, die ein nach der erfindungsgemäßen Methode aktive Substanz beinhaltet, identifiziert wurde, dann ist es entweder möglich, den Stoff direkt von der ursprünglichen Probe zu isolieren oder man kann die Probe in verschiedene Gruppen teilen, z. B. wenn sie aus einer Vielzahl von verschiedenen Komponenten besteht, um so die Zahl der verschiedenen Substanzen pro Probe zu reduzieren und dann das erfindungsgemäße Verfahren mit einer solchen "Unterprobe" der ursprünglichen Probe zu wiederholen. Abhängig von der Komplexität der Probe können die oben beschriebenen Schritte mehrmals wiederholt werden, vorzugsweise bis die gemäß der erfindungsgemäßen Methode identifizierte Probe nur noch eine geringe Anzahl von Substanzen oder nur noch eine Substanz umfasst. Vorzugsweise wird der gemäß der erfindungsgemäßen Methode identifizierte Stoff oder Derivate davon weiter formuliert, so, dass er für die Anwendung in der Pflanzenzüchtung oder Pflanzenzell- oder Gewebekultur geeignet ist.
Die Stoffe, die gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren getestet und identifiziert wurden, können beispielsweise sein:
Expressionsbibliotheken, z. B. cDNA-Expressionsbibliotheken, Peptide, Proteine, Nukleinsäuren, Antikörper, kleine organische Stoffe, Hormone, PNAs oder ähnliches (Milner, Nature Medicin 1 (1995), 879-880; Hupp, Cell. 83 (1995), 237-245; Gibbs, Cell. 79 (1994), 193-198 und darin zitierte Referenzen). Diese Stoffe könne auch funktionelle Derivate oder Analogon der bekannten Inhibitoren oder Aktivatoren sein. Verfahren zur Herstellung von chemischen Derivaten oder Analogon sind dem Fachmann bekannt. Die genannten Derivate und Analogon können gemäß Verfahren nach dem Stand der Technik getestet werden. Weiterhin kann ccmputergestütztes Design oder Peptidomimetics zur Herstellung geeigneter Derivate und Analogon verwendet werden. Die Zelle oder das Gewebe, die/das für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden kann, ist vorzugsweise eine erfindungsgemäße Wirtszelle, Pflanzenzelle oder ein Pflanzengewebe, wie in den oben genannten Ausführungsformen beschrieben.
Unter Derivate(n) (der Plural und der Singular seien für diese Anmeldung und deren Definitionen äquivalent) der in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuren sind beispielsweise funktionelle Homologe der von SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34 oder SEQ ID NO: 36 kodierten Proteine oder deren biologischer Aktivität, das heißt Proteine, die dieselben biologischen Reaktionen wie die von SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34 oder SEQ ID NO: 36 kodierten Proteine ausführen, zu verstehen. Diese Derivate bzw. Gene sind ebenfalls als herbizide Targets geeignet.
Die hierin erfindungsgemäß beschriebenen Sequenzen kodieren für Homologe zu den in den Beispielen beschriebenen Proteinen und haben vorzugsweise die für die Homologe angegebenen Aktivitäten.
SEQ ID NO: 1 kodiert für ein Protein, das zu einer m6A-Methyltransferase Ähnlichkeiten aufweist. Die Proteinsequenz ist in SEQ ID NO: 2 wiedergegeben ist. SEQ ID NO: 3 kodiert für ein sog. "DNA repair protein RAD 54 like Protein-Homolog", dessen Proteinsequenz SEQ ID NO: 4 zu entnehmen ist. SEQ ID NO: 5 kann für ein Thioredoxin kodieren, die Proteinsequenz ist in SEQ ID NO: 6 dargestellt. SEQ ID NO: 7 kodiert für ein unbekanntes Protein, dessen Sequenz in SEQ ID NO: 2 wiedergegeben ist. SEQ ID NO: 9 kodiert für vorzugsweise eine Fructokinase, deren Proteinsequenz SEQ ID NO: 10 zu entnehmen ist, SEQ ID NO: 11 codiert für ein Protein, das schwache Homologien zu verschiedenen Zinkfinger- Proteinen aufweist. Die Proteinsequenz ist SEQ ID NO: 12 zu entnehmen. Von SEQ ID NO: 13 wird ein Protein codiert, das Ähnlichkeiten mit LYTB-Proteinen hat. SEQ ID NO: 14 gibt die Proteinsequenz wieder. Für ein Protein, mit der in SEQ ID NO: 16 gezeigten Sequenz, codiert die Sequenz SEQ ID NO: 15. Dieses durch SEQ ID NO: 15 codierte hypothetische Protein enthält ein sog. Crepropin-Familien-Signatur und hat schwache Homologien zu myc- Protoonkogenen. SEQ ID NO: 17 codiert für ein Protein, das eine gewisse Homologie zu einem Leucin-reichen Protein aus Mensch hat. SEQ ID NO: 18 ist die Proteinsequenz zu entnehmen. Die Homologie der von SEQ ID NO: 26 bis 40 kodierten Proteinen ist in den Beispielen unten wiedergegeben, auf die hier ausdrücklich Bezug genommen wird.
Unter Derivaten werden auch solche Peptide verstanden, die eine Homologie zu den Polypeptiden mit den in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38 oder SEQ ID NO: 40 gezeigten Sequenzen von mindestens 20%, vorzugsweise 30%, mehr bevorzugt 50%, noch mehr bevorzugt 70%, mehr bevorzugt 80%, am meisten bevorzugt 90% oder mehr haben, und der eine äquvalente biologische Aktivität in anderen Organismen besitzen und somit als funktionelle Homologe anzusehen sind. Diese funktionelle Homologie oder Äquivalenz lässt sich z. B. durch die mögliche Komplementation von Mutanten in diesen Funktionen demonstrieren.
Die oben genannten Nukleinsäuresequenz(en) oder Fragmente davon können vorteilhaft zur Isolierung weiterer Sequenzen wie z. B. genomische, cDNA oder sonstige Sequenzen, die als Herbizidtarget geeigenet sind, über Homologiescreening verwendet werden.
Die genannten Derivate lassen sich beispielsweise aus anderen Organismen, insbesondere eukaryontischen Organismen wie Pflanzen, wie speziell Algen, Moosen, Dinoflagellaten oder Pilze, isolieren.
Weiterhin sind unter Derivaten bzw. funktionellen Derivaten der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38 oder SEQ ID NO: 40 genannten Sequenzen beispielsweise Allelvarianten zu verstehen, die mindestens 60% Homologie auf der abgeleiteten Aminosäureebene, vorteilhaft mindestens 70% Homologie, bevorzugt mindestens 80% Homologie, besonders bevorzugt mindestens 85% Homologie, ganz besonders bevorzugt 90% Homologie aufweisen. Die Homologie wurde über den gesamten Aminosäurebereich berechnet. Es wurde das Programm PileUp, BESTFIT, GAP, TRANSLATE bzw. BACKTRANSLATE ( = Bestandteil des Programmpaketes UWGCG, Wisconsin Package, Version 10.0-UNIX, January 1999, Genetics Computer Group, Inc., Deverux et al., Nucleic. Acid Res., 12, 1984: 387-395) verwendet (J. Mol. Evolution., 25, 351-360, 1937, Higgins et al., CABIOS, 5 1989: 151-153). Die von den genannten Nukleinsäuren abgeleitete Aminosäuresequenzen sind Sequenz SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39 oder SEQ ID NO:41 zu entnehmen. Unter Homologie ist Identität zu verstehen, das heißt die Aminosäuresequenzen sind zu mindestens 40, 50, 60 oder 70%, mehr bevorzugt 80%, noch mehr bevorzugt 90%, am meisten bevorzugt 95% oder mehr identisch. Die erfindungsgemäßen Sequenzen sind auf Nukleinsäureebene mindestens 45 oder 55% homolog, bevorzugt mindestens 60 oder 65%, besonders bevorzugt 75%, ganz besonders bevorzugt mindesten 80% noch mehr bevorzugt 90 oder 95% oder mehr homolog.
Weiterhin umfasst der Begriff Derivate sowie der Begriff "Fragmente" auch Teilbereiche oder Fragmente der aufgeführten Sequenzen oder deren homologen Sequenzen von mindestens 50 Aminosäuren, vorteilhaft von mindestens 40 Aminosäuren, bevorzugt von mindestens 30 Aminosäuren, besonders bevorzugt von mindestens 20 Aminosäuren, ganz besonders bevorzugt von mindestens 10 Aminosäuren, die es ermöglichen, selektiv interagierende Substanzen zu identifizieren. Der Begriff "Fragment", "Sequenzfragment" oder "Teilsequenz" bedeutet eine verkürzte Sequenz der Originalsequenz. Die verkürzte Sequenz (Nukleinsäure oder Protein) kann unterschiedliche Längen haben, die minimale Sequenzlänge ist eine Sequenzlänge, die wenigstens eine vergleichbare Funktion, z. B. Bindungseigenschaften, oder Aktivität der Originalsequenz hat. Entsprechende Verfahren sind z. B. wie oben beschrieben SELDI, FCS oder Biocore und sind dem Fachmann bekannt.
Ebenfalls umfasst sind somit Nukleinsäuren, die ein Fragment oder ein Epitope eines Polypeptides codieren, das spezifisch an einem Antikörper bindet, der spezifisch an eine, als erfindungsgemäß beschriebenes Polypeptid bindet, insbesondere das von einer der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38 oder SEQ ID NO: 40 dargestellten Sequenz codiert wird. Fragment oder Epitope eines Polypeptides, die mit einem solchen Antikörper spezifisch interagieren, weisen eine signifikante Homologie in der räumlichen Struktur zu den hierin beschriebenen Polypeptiden, zumindest in Teilbereichen, auf. Vorzugsweise besitzen sie ebenfalls eine hohe Homologie auf Aminosäureebene zu den genannten Sequenzen, vorzugsweise 20%, mehr bevorzugt sind 40%, mehr bevorzugt 60%, noch mehr 80%, am meisten bevorzugt sind 90% oder mehr. Die räumliche Struktur eines Polypeptides ist jedoch im wesentlichen mitverantwortlich für die Interaktionen des Polypeptides mit anderen Verbindungen sowie ggf. für seine enzymatische Aktivität. Folglich können in den erfindungsgemäßen Verfahren oder Fragmenten eingesetzt werden, deren Sequenz nur eine geringe Homologie zu den beschriebenen Polypeptiden aufweist, deren räumliche Struktur jedoch eine hohe Homologie zu den beschriebenen Polypeptiden aufweist, also solche, die Epitope der hierin beschriebenen Sequenzen enthalten, um Interaktionspartner zu finden, die dann die hierin beschriebenen Polypeptide inhibieren oder inaktivieren. Fragmente, die Epitope der erfindungsgemäßen Polypeptide umfassen, können auch verwendet werden, um die Interaktionspartner der erfindungsgemäßen Polypeptide zu "besetzen", d. h. ihre Interaktion mit den erfindungsgemäßen Polypeptiden zu verhindern. Hierzu ist es dann vorteilhaft, wenn die Fragmente eine höhere Affinität zu einem Bindungspartner haben als das natürlich vorkommende Polypeptid. Ebenfalls umfasst sind Fragmente, die von erfindungsgemäßen Nukleinsäuren codiert werden und eine der oben genannten biologischen Aktivitäten umfassen.
Allelvarianten umfassen insbesondere funktionelle Varianten, die durch Deletion, Insertion oder Substitution von Nukleotiden aus der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38 oder SEQ ID NO: 40 dargestellten Sequenz erhältlich sind, wobei die biologische, z. B. enzymatische Aktivität oder Bindungseigenschaften der abgeleiteten synthetisierten Proteine erhalten bleibt.
Solche DNA-Sequenzen lassen sich mit Hilfe der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen, z. B. ausgehend von den in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38 oder SEQ ID NO: 4D beschriebenen DNA-Sequenzen oder Teilen dieser Sequenzen, beispielsweise mit üblichen Hybridisierungsverfahren oder der PCR-Technik aus anderen Eukaryonten wie beispielsweise Mikroorganismen wie Hefen, Pilzen, Ciliaten, Pflanzen wie Algen, Moosen oder sonstigen Pflanzen, isolieren. Diese DNA-Sequenzen hybridisieren unter Standardbedingungen mit den genannten Sequenzen. Zur Hybridisierung werden vorteilhaft kurze Oligonukleotide, beispielsweise der konservierten oder sonstigen Bereiche, die über Vergleiche mit anderen verwandten Genen in dem Fachmann bekannter Weise ermittelt werden können, verwendet. Es können aber auch längere Fragmente der erfindungsgemäßexi Nukleinsäuren oder die vollständigen Sequenzen für die Hybridisierung verwendet werden. Je nach der verwendeten. Nukleinsäure: Oligonukleotid, längeres Fragment oder vollständige Sequenz oder je nachdem welche Nukleinsäureart DNA oder RNA für die Hybridisierung verwendet werden, variieren diese Standardbedingungen. So liegen beispielsweise die Schmelztemperaturen für DNA : DNA- Hybride ca 10°C niedriger als die von DNA : RNA-Hybriden gleicher Länge.
Unter Standardbedingungen sind beispielsweise je nach Nukleinsäure Temperaturen zwischen 42 und 58°C in einer wässrigen Pufferlösung mit einer Konzentration zwischen 0,1 bis 5 × SSC (1 × SSC = 0,15 M NaCl, 15 mM Natriumcitrat, pH 7,2) oder zusätzlich in Gegenwart von 50% Formamid wie beispielsweise 42°C in 5 × SSC, 50% Formamid zu verstehen. Vorteilhafterweise liegen die Hybridisierungsbedingungen für DNA : DNA-Hybride bei 0,1 × SSC und Temperaturen zwischen etwa 20°C bis 45°C, bevorzugt zwischen etwa 30°C bis 45°C. Für DNA : RNA-Hybride liegen die Hybridisierungsbedingungen vorteilhaft bei 0,1 × SSC und Temperaturen zwischen etwa 30°C bis 55°C, bevorzugt zwischen etwa 45°C bis 55°C. Diese angegebenen Temperaturen für die Hybridisierung sind beispielhaft kalkulierte Schmelztemperaturwerte für eine Nukleinsäure mit einer Länge von ca. 100 Nukleotiden und einem G + C-Gehalt von 50% in Abwesenheit von Formamid. Die experimentellen Bedingungen für die DNA-Hybridisierung sind in einschlägigen Lehrbüchern der Genetik wie beispielsweise Sambrook et al., "Molecular CLoning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989, beschrieben und lassen sich nach dem Fachmann bekannten Formeln beispielsweise abhängig von der Länge der Nukleinsäuren, der Art der Hybride oder dem G + C- Gehalt berechnen. Weitere Informationen zur Hybridisierung kann der Fachmann folgenden Lehrbüchern entnehmen: Ausubel et al. (eds), 1985, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York; Hames and Higgins (eds), 1985, Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown (ed), 1991, Essential Molecular Biology: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford.
Weiterhin sind unter Derivaten Homologe der Sequenz SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38 oder SEQ ID NO: 40 beispielsweise eukaryontische Homologe, verkürzte Sequenzen, Einzelstrang-DNA der codierenden und nichtcodierenden DNA-Sequenz oder RNA der codierenden und nichtcodierenden DNA-Sequenz zu verstehen.
Außerdem sind unter Homologen der Sequenzen SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38 oder SEQ ID NO: 40 Derivate wie beispielsweise Varianten aus anderen Organismen beispielsweise anderen Pflanzen zu verstehen. Diese Varianten können durch ein oder mehrere Nukleotidaustausche, durch Insertion(en) und/oder Deletion(en) verändert sein, ohne dass aber die Funktionalität bzw. die biologische Aktivität der Varianten beeinträchtigt wird. Vorzugsweise haben sie eine Homologie von mindestens 20% und eine äquivalente biologische Aktivität.
Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuren, insbesondere SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38 oder SEQ ID NO: 40 und deren Fragmente und Derivate sind deshalb vorteilhaft dafür geeignet um weitere essentielle, neue Gene aus anderen Organismen bevorzugt. Pflanzen zu isolieren.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen, insbesondere SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38 oder SEQ ID NO: 40 deren durch sie kodierte Genprodukte im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten werden, können synthetish hergestellt oder natürlich gewonnen sein oder eine Mischung aus synthetischen und natürlichen DNA-Bestandteilen enthalten, sowie aus verschiedenen heterologen Genabschnitten verschiedener Organismen bestehen. Im allgemeinen werden synthetische Nukleotid-Sequenzen mit Codons erzeugt, die von den entsprechenden Wirtsorganismen beispielsweise Pflanzen bevorzugt werden. Dies führt in der Regel zu einer optimalen Expression der heterologen Gene. Diese von Pflanzen bevorzugten Codons können aus Codons mit der höchsten Proteinhäufigkeit bestimmt werden, die in den meisten interessanten Pflanzenspezies exprimiert werden. Ein Beispiel für Corynebacterium glutamicum ist gegeben in: Wada et al. (2992) Nucleic Acids Res. 20: 2111-2118). Die Durchführung solcher Experimente sind mit Hilfe von Standardmethoden durchführbar und sind dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt.
Funktionell äquivalente Sequenzen, die für die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuren kodieren, sind solche Derivate der erfindungsgemäßen Sequenzen, welche trotz abweichender Nukleotidsequenz noch die gewünschten Funktionen, das heißt die biologische Aktivität der Proteine besitzen. Funktionelle Äquivalente umfassen somit natürlich vorkommende Varianten der hierin beschriebenen Sequenzen sowie künstliche, z. B. durch chemische Synthese erhaltene, insbesondere an den Codon-Gebrauch einer Pflanze angepasste, künstliche Nukleotid-Sequenzen.
Außerdem sind artifizielle DNA-Sequenzen geeignet, solange sie, wie oben beschrieben, zu Produkten führen, die die oben genannten Aktivitäten oder die gewünschte Eigenschaft, beispielsweise die Bindung an einen Rezoptor oder die enzymatische Aktivität vermitteln. Solche artifiziellen DNA-Sequenzen können beispielsweise durch Rückübersetzung mittels Molecular Modelling konstruierter Proteine oder durch in vitro-Selektion ermittelt werden. Mögliche Techniken zur in vitro-Evolution von DNA zur Veränderung bzw. Verbesserung der DNA-Sequenzen sind beschrieben bei Patten, P. A. et al., Current Opinion in Biotechnology 8, 724-733(1997) oder bei Moore, J. C. et al., Journal of Molecular Biology 272, 336-347(1997). Besonders geeignet sind codierende DNA-Sequenzen, die durch Rückübersetzung einer Polypeptidsequenz gemäß der für die Wirtspflanze spezifischen Kodon-Nutzung erhalten werden. Die spezifische Kodon-Nutzung kann ein mit pflanzengenetischen Methoden vertrauter Fachmann durch Computerauswertungen anderer, bekannter Gene der zu transformierenden Pflanze leicht ermitteln.
Für das erfindungsgemäße Verfahren sind vorteilhaft Aminosäuresequenzen zu verstehen, die eine in den Sequenzen SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39 oder SEQ ID NO: 41 dargestellte Aminosäuresequenz oder eine daraus durch Substitution, Inversion, Insertion oder Deletion von einem oder mehreren Aminosäureresten erhältliche Sequenz enthalten, wobei die biologische Aktivität des in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39 oder SEQ ID NO: 41 dargestellten Proteins erhalten bleibt bzw. nicht wesentlich reduziert wird. Unter nicht wesentlich reduziert sind alle Proteine zu verstehen, die noch mindestens 10%, bevorzugt 20%, besonders bevorzugt 30%, 50%, 70%, 90% oder mehr, der biologischen Aktivität des Ausgangsproteins aufweisen. Dabei können beispielsweise bestimmte Aminosäuren durch solche mit ähnlichen physikochemischen Eigenschaften (Raumerfüllung, Basizität, Hydrophobizität etc.) ersetzt werden. Beispielsweise werden Argininreste gegen Lysinreste, Valinreste gegen Isoleucinreste oder Asparaginsäurereste gegen Glutaminsäurereste ausgetauscht. Es können aber auch ein oder mehrere Aminosäuren in ihrer Reihenfolge vertauscht, hinzugefügt oder entfernt werden, oder es können mehrere dieser Maßnahmen miteinander kombiniert werden.
Unter Derivaten sind auch funktionelle Äquivalente zu verstehen, die insbesondere auch natürliche oder künstliche Mutationen der verwendeten Nukleinsäuresequenzen SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38 oder SEQ ID NO: 40 beinhalten, welche weiterhin die gewünschte Funktion, das heißt derer biologische Aktivität nicht wesentlich reduziert ist, zeigen. Mutationen umfassen Substitutionen, Additionen, Deletionen, Vertauschungen oder Insertionen eines oder mehrerer Nukleotidreste. Somit werden beispielsweise auch solche Nukleotidsequenzen durch die vorliegende Erfindung mit umfasst, welche man durch Modifikation der genannten Nukleotidsequenzen erhält. Ziel einer solchen Modifikation kann z. B. die weitere Eingrenzung der darin enthaltenen codierenden Sequenz oder z. B. auch die Einfügung weiterer Restriktionsenzym-Schnittstellen sein.
Funktionelle Äquivalente sind auch solche Varianten, deren Funktion, verglichen mit dem Ausgangsgen bzw. Genfragment, abgeschwächt ( = nicht wesentlich reduziert) oder verstärkt ist ( = Enzymaktivität stärker als die Aktivität des Ausgangsmzyms, das heißt Aktivität ist höher als 100%, bevorzugt höher als 150%, besonders bevorzugt höher als 180%).
Die Nukleinsäuresequenz kann dabei vorteilhaft beispielsweise eine DNA- oder cDNA-Sequenz sein. Zur Insertion in eine erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukt ( = Expressionskassette oder Nukleinsäurefragment) geeignete codierende Sequenzen sind beispielsweise solche, die für ein Protein mit den oben beschriebenen Sequenzen kodieren und die dem Wirt die Fähigkeit zur Überproduktion des Proteins und damit seiner biologischen Funktion verleihen. Diese Sequenzen können homologen oder heterologen Ursprungs sein.
Daher ist ein weiterer erfindungsgemäßer Gegenstand ein Nukleinsäurekonstrukt enthaltend eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz, z. B. ausgewählt aus der Gruppe:

a) einer Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38 oder SEQ ID NO: 40 dargestellten Sequenz, oder
b) einer Nukleinsäuresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes aus den durch Rückübersetzung der in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39 oder SEQ ID NO: 41 dargestellten Aminosäuresequenzen ableiten lässt,
c) Nukleinsäuresequenz, die ein Derivat oder ein Fragment der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38 oder SEQ ID NO: 40 dargestellten Nukleinsäuresequenzen ist, und mindestens 60% Homologie auf Nukleinsäureebene aufweisen; oder
d) Nukleinsäuresequenz, die für Derivate oder Fragmente der Polypeptide mit den in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39 oder SEQ ID NO: 41 dargestellten Aminosäuresequenzen codiert, die mindestens 50% Homologie auf Aminosäureebene aufweisen;
e) Nukleinsäuresequenz, die für ein Fragment oder ein Epitope eines Polypeptides codiert, das spezifisch an einem Antikörper bindet, wobei der Antikörper spezifisch an ein Polypeptid bindet, das der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38 oder SEQ ID NO: 40 dargestellten Sequenz codiert wird;
f) Nukleinsäuresequenz, die ein Fragment einer in a) dargestellten Nukleinsäure codiert und das eine m6A-Methyltransferase-Aktivität, eine DNA-bindende-Aktivität oder "DNA- repair"-Aktivität, z. B. wie bei RAD 54, eine Thioredoxin- Aktivität, eine VAV2-Aktivität, eine Fructokinase-Aktivität, eine Zinkfingerprotein-Aktivität, eine LYTB-Aktivität, eine Crepopin-Aktivität, eine Leucin-Protein-Aktivität, eine DNAJ- Aktivität, ein CRS1-Aktivität, eine Alanyl-tRNA-Synthetase- Aktivität, eine OEP86-Aktivität, eine FMRF-Amid-Propeptid- Isolog-Aktivität, eine 26S Proteosom subunit S5B-Aktivität oder eine Geranylgeranylpyrophosphatsynthase-Aktivität hat; und/oder
g) Nukleinsäuresequenz, die für Derivate der Polypeptide mit den in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39 oder SEQ ID NO: 41 dargestellten Aminosäuresequenzen codiert, die mindestens 20% Homologie auf Aminosäureebene aufweist und eine äquivalente biologische Aktivität besitzt;

Unter dem erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukt sind die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, z. B. die in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38 oder SEQ ID NO: 40 genannten Sequenzen, die sich als Ergebnis des genetischan Codes und/oder deren funktionellen oder nicht funktionellen Derivate zu verstehen, die mit einem oder mehreren Regulationssignalen vorteilhafterweise zur Regulation, insbesondere Erhöhung, der Genexpression funktionell verknüpft wurden und welche die Expression der codierenden Sequenz in der Wirtszelle steuern. Diese regulatorischen Sequenzen sollen die gezielte Expression der Gene bzw. der Proteine ermöglichen. Dies kann beispielsweise je nach Wirtsorganismus bedeuten, dass das Gen erst nach Induktion exprimiert und/oder überexprimiert wird, oder dass es konstitutiv exprimiert und/oder überexprimiert wird. Beispielsweise handelt es sich bei diesen regulatorischen Sequenzen um Sequenzen an die Induktoren oder Repressoren binden und so die Expression der Nukleinsäure regulieren. Zusätzlich zu diesen neuen Regulationssequenzen oder anstelle dieser Sequenzen kann die natürliche Regulation dieser Sequenzen vor den eigentlichen Strukturgenen noch vorhanden sein und gegebenenfalls genetisch verändert worden sein, so dass die natürliche Regulation ausgeschaltet und die Expression der Gene erhöht wurde. Das erfindungsgemäße Nukleinsäurekonstrukt kann auch vorteilhaft nur aus der natürlichen gentechnologisch veränderten Regulationsregion am 5'- und/oder 3'-Ende bestehen. Das Genkonstrukt kann aber auch einfacher aufgebaut sein, das heißt es wurden keine zusätzlichen Regulationssignale vor die Nukleinsäuresequenz oder dessen Derivate inseriert und der natürliche Promotor mit seiner Regulation wurde nicht entfernt. Stattdessen wurde die natürliche Regulationssequenz so mutiert, dass keine Regulation mehr erfolgt und/oder die Genexpression gesteigert wird. Diese veränderten Promotoren können in Form von Teilsequenzen ( = Promotor mit Teilen der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen) auch allein vor das natürliche Gen zur Steigerung der Aktivität gebracht werden. Das Genkonstrukt kann außerdem vorteilhafterweise auch eine oder mehrere sogenannte "enhancer Sequenzen" funktionell verknüpft mit dem Promotor enthalten, die eine erhöhte Epression der Nukleinsäuresequenz ermöglichen. Auch am 3'-Ende der DNA- Sequenzen können zusätzliche vorteilhafte Sequenzen inseriert werden wie weitere regulatorische Elemente oder Terminatoren. Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenzen können in einer oder mehreren Kopien in der Expressionskassette ( = Genkonstrukt) enthalten sein.
Die regulatorischen Sequenzen bzw. Faktoren können dabei wie oben beschrieben vorzugsweise die Genexpression der eingeführten Gene positiv beeinflussen und dadurch erhöhen. So kann eine Verstärkung der regulatorischen Elemente vorteilhafterweise auf der Transkriptionsebene erfolgen, indem starke Transkriptionssignale wie Promotoren und/oder "Enhancer" verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der mRNA verbessert wird. In einer anderen vorteilhaften Ausführungsform kann die Expression jedoch auch gezielt reduziert oder blockiert werden.
Als Promotoren in der Expressionskassette sind grundsätzlich alle Promotoren geeignet, die die Expression von Fremdgenen in Organismen vorteilhaft in Pflanzen oder Pilzen steuern können. Vorzugsweise verwendet man insbesondere pflanzliche Promotoren oder Promotoren, die aus einem Pflanzenvirus entstammen. Vorteilhafte Regulationssequenzen für das erfindungsgemäße Verfahren sind beispielsweise in Promotoren wie cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet-, lpp-, lac-, lpp-lac-, lacI^q- T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, SP6-, λ-P_R- oder im λ-P_L-Promotor enthalten, die vorteilhafterweise in gram-negativen Bakterien Anwendung finden. Weitere vorteilhafte Regulationssequenzen sind beispielsweise in den gram-positiven Promotoren amy und SPO2, in den Hefe- oder Pilzpromotoren ADC1, MFα, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH oder in den Pflanzenpromotoren wie CaMV/35S [Franck et al., (ell 21(1980) 285-294], SSU, OCS, lib4, STLS1, B33, nos ( = Nopalin Synthase Promotor) oder im Ubiquitin-Promotor enthalten. Die Expressionskassette kann auch einen chemisch induzierbaren Promotor enthalten, durch den die Expression der Nukleitsäuresequenzen im erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukt in den Organismen vorteilhaft in den Pflanzen zu einem bestimmten Zeitpunkt gesteuert werden kann. Derartige vorteilhafte Pflanzenpromotoren sind beispielsweise der PRP1-Promotor [Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22(1993), 361-366], ein durch Benzensulfonamid- induzierbarer (EP 388186), ein durch Tetrazyklin-induzierbarer (Gatz et al., (1992) Plant J. 2, 397-404), ein durch Salizylsäure- induzierbarer Promotor (WO 95/19443), ein durch Abscisinsäure- induzierbarer (EP335528) bzw. ein durch Ethanol- oder Cyclohexanon-induzierbarer (WO93/21334) Promotor. Weitere Pflanzenpromotoren sind beispielsweise der Promotor der cytosolischen FBPase aus Kartoffel, der ST-LSI Promotor aus Kartoffel (Stockhaus et al., EMBO J. 8 (1989) 2445-245), der Promotor der Phosphoribosylpyrophosphat Amidotransferase aus Glycine max (siehe auch Genbank Accession Nummer U87999) oder ein Nodienspezifischen Promotor wie in EP 249676 können vorteilhaft verwandt werden.
In der Expressionskassette ( = Genkonstrukt, Nukleinsäurekonstrukt) können wie oben beschrieben noch weitere Gene, die in die Organismen eingebracht werden sollen, enthalten sein. Diese Gene können unter getrennter Regulation oder unter der gleichen Regulationsregion wie die im Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenzen liegen. Bei diesen Genen handelt es sich beispielsweise um Biosynthesegene des Stoffwechsels wie der Fettsäure-, der Aminosäure- oder der Vitaminbiosynthese oder Regulationsgene um nur einige zu nennen.
Prinzipiell können alle natürlichen Promotoren mit ihren Regulationssequenzen wie die oben genannten für die erfindungsgemäße Expressionskassette und das erfindungsgemäße Verfahren, wie unten beschrieben, verwendet werden. Darüberhinaus können auch synthetische Promotoren vorteilhaft verwendet werden.
Bei der Präparation einer Expressionskassette können verschiedene DNA-Fragmente manipuliert werden, um eine Nukleotid-Sequenz zu erhalten, die zweckmäßigerweise in der korrekten Richtung liest und die mit einem korrekten Leseraster ausgestattet ist. Für die Verbindung der DNA-Fragmente ( = erfindungsgemäße Nukleinsäuren) miteinander können an die Fragmente Adaptoren oder Linker angesetzt werden.
Zweckmäßigerweise können die Promotor- und die Terminator- Regionen in Transkriptionsrichtung mit einem Linker oder Polylinker, der eine oder mehrere Restriktionsstellen für die Insertion dieser Sequenz enthält, versehen werden. In der Regel hat der Linker 1 bis 10, meistens 1 bis 8, vorzugsweise 2 bis 6 Restriktionsstellen. Im allgemeinen hat der Linker innerhalb der regulatorischen Bereiche eine Größe von, weniger als 100 bp, häufig weniger als 60 bp, mindestens jedoch 5 bp. Der Promotor kann sowohl nativ bzw. homolog als auch fremdartig bzw. heterolog zum Wirtsorganismus beispielsweise zur Wirtspflanze sein. Die Expressionskassette beinhaltet in der 5'-3'-Transkriptionsrichtung den Promotor, eine DNA-Sequenz, die für die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Proteine kodiert und eine Region für die transkriptionale Termination. Verschiedene Terminationsbereiche können vorteilhaft gegeneinander ausgetauscht werden.
Ferner können Manipulationen, die passende Restriktionsschnittstellen bereitstellen oder die überflüssige DNA ocker Restriktionsschnittstellen entfernen, eingesetzt werden. Wo Insertionen, Deletionen oder Substitutionen wie z. B. Transitionen und Transversionen in Frage kommen, können in vitro-Mutagenese, -primerrepair-, Restriktion oder Ligation verwendet werden. Bei geeigneten Manipulationen, wie z. B. Restriktion, -chewing-back- oder Auffüllen von Überhängen für -bluntends-, können komplementäre Enden der Fragmente für die Ligation zur Verfügung gestellt werden.
Von Bedeutung für eine vorteilhafte hohe Expression kann u. a. das Anhängen des spezifischen ER-Retentionssignals SEKDEL sein (Schouten, A. et al., Plant Mol. Biol. 30 (1996), 781-792), die durchschnittliche Expressionshöhe wird damit verdreifacht bis vervierfacht. Es können auch andere Retentionssignale, die natürlicherweise bei im ER lokalisierten pflanzlichen und tierischen Proteinen vorkommen, für den Aufbau der Kassette eingesetzt werden.
Bevorzugte Polyadenylierungssignale sind pflanzliche Polyadenylierungssignale, vorzugsweise solche, die im wesentlichen T-DNA-Polyadenylierungssignale aus Agrobacterium tumefaciens, insbesondere des Gens 3 der T-DNA (Octopin Synthase) des Ti- Plasmids pTiACH5 entsprechen (Gielen et al., EMBO J. 3 (1984), 835 ff) oder entsprechende funktionelle Äquivalente.
Die Herstellung einer Expressionskassette erfolgt durch Fusion eines geeigneten Promotors mit einer geeigneten Nukleinsäuresequenz sowie einem Polyadenylierungssignal nach gängigem Rekombinations- und Klonierungstechniken, wie sie beispielsweise in T. Maniatis, E. F. Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) sowie in T. J. Silhavy, M. L. Berman und L. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Sprins; Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) und in Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience (1987) beschrieben werden.
Bei der Präparation einer Expressionskassette können verschiedene DNA-Fragmente manipuliert werden, um eine Nukleotid-Sequenz zu erhalten, die zweckmäßigerweise in der korrekten Richtung liest und die mit einem korrekten Leseraster ausgestattet ist. Für die Verbindung der DNA-Fragmente miteinander können an die Fragmente Adaptoren oder Linker angesetzt werden.
Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenzen beinhalten alle Sequenzmerkmale, die notwendig sind, um eine für den Ort der biologischen Wirkungr bzw. Aktivität korrekte Lokalisation zu erreichen. Daher sind keine weiteren Targetingsequenzen per se notwendig. Allerdings kann eine solche Lokalisation wünschenswert und vorteilhaft sein und daher künstlich verändert oder verstärkt werden, sodass auch solche Fusionskonstrukte eine bevorzugte vorteilhafte Ausführungsform der Erfindung sind.
Vorteilhaft sind dafür beispielsweise Sequenzen, die ein Targeting in Plastiden gewährleisten. Unter bestimmten Umständen kann auch ein Targeting in andere Kompartimente (referiert: Kermode, Crit. Rev. Plant Sci. 15, 4 (1996), 285-423) z. B. in in die Vakuole, in das Mitochondrium, in das Endoplasmatische Retikulum (ER), Peroxisomen, Lipidkörper oder durch ein Fehlen entsprechender operativer Sequenzen ein Verbleib im Kompartiment des Entstehens, dem Zytosol, wünschenswert sein.
Vorteilhafterweise werden die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen zusammen mit mindestens einem Reportergen in eine Expressionskassette kloniert, die in den Organismus über einen Vektor oder direkt in das Genom eingebracht wird. Dieses Reportergen sollte eine leichte Detektierbarkeit über einen Wachstums-, Fluoreszenz-, Chemo-, Biolumineszenz- oder Resistenzassay oder über eine photometrische Messung ermöglichen. Beispielhaft seien als Reportergene Antibiotika oder Herbizidresistenzgene, Hydrolasegene, Fluoreszenzproteingene, Biolumineszenzgene, Zucker- oder Nukleotidstoffwechselgene oder Biosynthesegene wie das Ura3-Gen, das Ilv2-Gen, das Luciferasegen, das β-Galactosidasegen, das gfp- Gen, das 2-Desoxyglucose- 6-phosphat-Phosphatasegen, das β-Glucuronidase-Gen, β-Lactamasegen, das Neomycinphosphotransferasegen, das Hygromycinphosphotransferasegen oder das BASTA ( = Gluphosinatresistenz)-Gen genannt. Diese Gene ermöglichen eine leichte Messbarkeit und Quantifizierbarkeit der Transcriptionsaktivität und damit der Expression der Gene. Damit lassen sich Genomstellen identifizieren, die eine unterschiedliche Produktivität zeigen.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfasst eine Expressionskassette stromaufwärts, d. h. am 5'-Ende der codierenden Sequenz, einen Promotor und stromabwärts, d. h. am 3'-Ende, ein Polyadenylierungssignal und gegebenenfalls weitere regulatorische Elemente, welche mit der dazwischenliegenden codierenden Sequenz für die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Proteinen operativ verknüpft sind. Unter einer operativen Verknüpfung versteht man die sequenzielle Anordnung von Promotor, codierender Sequenz, Terminator und ggf. weiterer regulativer Elemente derart, dass jedes der regulativen Elemente seine Funktion bei der Expression der codierenden Sequenz bestimmungsgemäß erfüllen kann. Die zur operativen Verknüpfung bevorzugten Sequenzen sind Targeting-Sequenzen zur Gewährleistung der subzellulären Lokalisation in Plastiden. Aber auch Targeting-Sequenzen zur Gewährleistung der subzellulären Lokalisation im Mitochondrium, im Endoplasmatischen Retikulum ( = ER), im Zellkern, in Ölkörperchen oder anderen Kompartimenten sind bei Bedarf einsetzbar sowie Translationsverstärker wie die 5'-Führungasequenz aus den Tabak- Mosaik-Virus (Gallie et al., Nucl. Acids Res. 15 (1987), 8693-8711).
Eine Expressionskassette kann beispielsweise einen konstitutiven Promotor beispielsweise den 35S-Promotor, das zu exprimierende Gen und das ER-Retentionssignal enthalten. Als ER-Retentionssignal wird bevorzugt die Aminosäuresequenz KDEL (Lysin, Asparaginsäure, Glutaminsäure, Leucin) verwendet.
Die Expressionskassette wird zur Expression in einem prekaryontischen oder eukaryontischen Wirtsorganismus beispielsweise einem Mikroorganismus wie einem Pilz oder einer Pflanze vorteilhafterweise in einen Vektor wie beispielsweise einem Plasmid, einem Phagen oder sonstiger DNA inseriert, der eine optimale Expression der Gene im Wirtsorganismus ermöglicht. Geeignete Plasmide sind beispielsweise in E. coli pLG338, pACYC184, pBR-Serie wie z. B. pBR322, pUC-Serie wie pUC18 oder pUC19, M113mp-Serie, pKC30, pRep4, pHS1, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-III¹¹³-B1, λgt11 oder pBdCI, in Streptomyces pIJ101, pIJ364, pIJ702 oder pIJ361, in Bacillus pUB110, pC194 oder pBD214, in Corynebacterium pSA77 oder pAJ667, in Pilzen pALS1, pIL2 oder pBB116, weitere vorteilhafte Pilzvektoren werden von Romanos, M. A. et al., [(1992) "Foreign gene expression in yeast: a review", Yeast 8: 423-488] und von von den Hondel, C. A. M. J. J. et al. [(1991) "Heterologous gene expression in filamentous fungi] sowie in More Gene Manipulations in Fungi [J. W. Bennet & L. L. Lasure, eds., p. 396-428: Academic Press: San Diego] und in "Gene transfer Systems and vector development for filamentous fungi" [van den Hondel, C. A. M. J. J. & Punt, P. J. (1991) in: Applied Molecular Genetics of Fungi, Peberdy, J. F. et al., eds., p. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge] beschrieben. Vorteilhafte Hefepromotoren sind beispielsweise 2µM, pAG-1, YEp6, YEp13 oder pEMBLYe23. Beispiele für Algen- oder Pflanzenpromotoren sind pLGV23, pGHlac⁺, pBIN19, pAK2004, pVKH oder pDH51 (siehe Schmidt, R. and Willmitzer, L., 1988). Die oben genannten Vektoren oder Derivate der vorstehend genannten Vektoren stellen eine kleine Auswahl der möglichen Plasmide dar. Weitere Plasmide sind dem Fachmann wohl bekannt und können beispielsweise aus dem Buch Cloning Vectors (Eds. Pouwels P. H. et al. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018) entnommen werden. Geeignete pflanzliche Vektoren werden unter anderem in "Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology" (CRC Press), Kap. 6/7, S.71-119 beschrieben. Vorteilhafte Vektoren sind sog. shuttle-Vektoren oder binäre Vektoren, die in E. coli und Agrobacterium replizieren.
Unter Vektoren sind außer Plasmiden auch alle anderen dem Fachmann bekannten Vektoren wie beispielsweise Phagen, Viren wie SV40, CMV, Baculovirus, Adenovirus, Transposons, IS-Elemmte, Phasmide, Phagemide, Cosmide, lineare oder zirkuläre DNA zu verstehen. Diese Vektoren können autonom im Wirtsorganismus repliziert oder chromosomal repliziert werden bevorzugt ist eine chromosomale Replikation. Umfasst sind funktionelle und nichtfunktionelle Vektoren.
In einer weiteren Ausgestaltungsform des Vektors kann die erfindungsgemäße Nukleinsäurekonstrukt auch vorteilhafterweise in Form einer linearen DNA in die Organismen eingeführt werden und über heterologe oder homologe Rekombination in das Genom des Wirtsorganismus integriert werden. Diese lineare DNA kann aus einem linearisierten Plasmid oder nur aus dem Nukleinsäurekonstrukt als Vektor oder den verwendeten Nukleinsäuresequenzen bestehen.
In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform können die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenzen auch alleine in einen Organismus eingebracht werden.
Sollen neben den Nukleinsäuresequenzen weitere Gene in den Organismus eingeführt werden, so können alle zusammen mit einem Reportergen in einem einzigen Vektor oder jedes einzelne Gen mit oder ohne einem Reportergen in je einem Vektor in den Organismus eingebracht werden, wobei die verschiedenen Vektoren gleichzeitig oder sukzessive eingebracht werden können.
Der Vektor enthält vorteilhaft mindestens eine Kopie der verwendeten Nukleinsäuresequenzen und/oder des erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukts.
Beispielhaft kann das Nukleinsäurekonstrukt in den Tabak-Transformationsvektor pBinAR eingebaut werden und unter der Kontrolle des 35S-Promotor oder des USP-Promotor stehen.
Alternativ kann ein rekombinanter Vektor ( = Expressionsvektor) auch in-vitro transkribiert und translatiert werden, z. B. durch Nutzung des T7 Promotors und der T7 RNA Polymerase.
Weitere vorteilhafte Vektoren enthalten in Pflanzen oder Pflanzenkulturen nutzbare Resistenzen wie die Phosphinotricin- ( = bar-Resistenz), die Methioninsulfoximin-, die Sulfonylharnstoff- ( = ilv-Resistenz, ind S. cerevisiae ilv2), die Phenoxyphenoxyherbizid- ( = ACCase-Resistenz), die Glyphosate- oder Clearfieldresistenz (AHAS-Resistenz) bzw. die Gene, die für diese Resistenzen codieren. Diese Resistenzen sind in ganzen Pflanzen zur Selektion von transgenen Pflanzen nutzbar. Nur Pflanzen, die über eine Transformation, diese Resistenzen erhalten haben, können in Gegenwart der selektierenden Substanz wachsen. In Zellkulturen auf Agarplatten können nach Transformation in planta - beispielsweise Infiltration der Samenvorläuferzellen - auch beispielsweise Kanamycin oder Hygromycin als selektierendes Agenz verwendet werden. Darüberhinaus können vorteilhafte Vektoren Sequenzen für die Integration in das Genom der Organismen bevorzugt der Pflanzen enthalten. Beispiele für derartige Sequenzen sind die sog. T-DNA-Borders. Außerdem können vorteilhafte Vektoren noch Promotoren und Terminatoren, wie beispielsweise die oben beschriebenen, enthalten. Auch sogenannte PolyA-Sequenzen können im Vektor enthalten sein. Vorteilhafte Vektoren sind beispielsweise Fig. 1, 2 und 3 zu entnehmen. SEQ ID NO: 25 gibt die vorteilhafte Sequenz des Vektors pMTX 1a300 wieder. Dieser enthält eine Kanamycin-Resistenz (Nukleotid 4922-5713), eine Phosphimotricin- Resistenz (Nukleotid 6722-7288), das LacZalpha-Fragment (Nukleotid 7630-7864), einen Teil von pVS1sta (Nukleotid 945-1945), einen Teil von pBR322bom (Nukleotid 3948-4208), eine T-Border-Sequenz (links, Nukleotid 6138-6163), eine T-Border-Sequenz (rechts, Nukleotid 7924-7949), ein PolyA-Teil (Nukleotil 7292-7503), den mas2'1'-Promotor (Nukleotid 6241-6718) und zwei Replikations-Origins pVS1rep (Nukleotid 6241-6718) sowie BR322ori (Nukleotid 43-4628).
In Prokaryoten verwendete Expressionsvektoren nutzen häufig induzierbare Systeme mit und ohne Fusionsproteinen bzw Fusionsoligopeptiden, wobei diese Fusionen sowohl N-terminal als auch C- terminal oder anderen nutzbaren Domänen eines Proteins erfolgen können. Solche Fusionsvektoren dienen in der Regel dazu: i.) die Expressionsrate der RNA zu erhöhen ii.) die erzielbare Proteinsytheserate zu erhöhen, iii.) die Löslichkeit des Proteins zu erhöhen, iv.) oder die Reinigung durch einen für die Affinitätschromatographie nutzbare Bindesequenz zu vereinfachen. Häufig werden auch proteolytische Spaltstellen über Fusionsproteine eingeführt, was die Abspaltung eines Teils des Fusionsproteins auch der Reinigung ermöglicht. Solche Erkennungssequenzen für Proteasen erkennen sind z. B. Faktor Xa, Thrombin und Enterokinase.
Typische vorteilhafte Fusions- und Expressionsvektoren sind pGEX [Pharmacia Biotech Inc. Smith, D. B. and Johnson, K. S. (1988) Gene 67: 31-40], pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) and pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ) welches Glutathion S-transferase beinhaltet (GST), Maltose Bindeprotein, oder Protein A.
Weitere Beispiele für E. coli Expressionsvektoren sind pTrc [Mann et al., (1988) Gene 69: 301-315] und pET Vektoren [Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymolocy 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 60-89; Stratagene, Amsterdam, Niederlande].
Weitere vorteilhafte Vektoren zur Verwendung in Hefe sind pYep- Sec1 (Baldari, et al., (1987) Embo J. 6: 229-234), pMFa Kurjan and Herskowitz, (1982) Cell 30: 933-943), pJRY88 (Schultz et al., (1987) Gene 54: 113-123), and pYES-Derivate (Invitrogen Corporation, San Diego, CA). Vektoren für die Nutzung in filamentösen Pilzen sind beschrieben in: von den Hondel, C. A. M. J. J. & Punt, P. J. (1991) "Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi, in: Applied Molecular Genetics of Fungi, J. F. Peberdy, et al., eds., p. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge.
Alternativ können auch vorteilhaft Insektenzellexpressionsvektoren genutzt werden z. B. für die Expression in Sf 9 Zellen. Dies sind z. B. die Vektoren der pAc Serie (Smith et al. (1983) Mol. Cell Biol. 3: 2156-2165) und der pVL series (Lucklow and Summers (1989) Virology 170: 31-39).
Des weiteren können zur Genexpression vorteilhaft Pflanzenzellen oder Algenzellen genutzt werden. Beispiele für Pflanzenexpressionsvektoren finden sich in Becker, D., et al. 1992) "New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border", Plant MoZ. Biol. 20: 1195-1197 oder in Bevan, M. W. (1984) "Binary Agrobacterium vectors for plant transformation", Nucl. Acid. Res. 12: 8711-8721.
Weiterhin können die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequerzen in Säugerzellen exprimiert werden. Beispiel für entsprechende Expressionsvektoren sind pCDM8 und pMT2PC genannt in; Seed, B. (1987) Nature 329 : 840 oder Kaufman et al. (1987) EMBO J. 6: 187-195). Dabei sind vorzugsweise zu nutzende Promotoren viralen Ursprungs wie z. B. Promotoren des Polyoma, Adenovirus 2, Cytomegalovirus oder Simian Virus 40. Weitere prokaryotische und eukaryotische Expressionssysteme sind genannt in Kapitel 16 und 17 in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989. Weitere vorteilhafte Vektoren werden in Hellens et al. (Trends in plant science, 5, 2000) beschrieben.
Das Einbringen der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, der Expressionskassette oder des Vektors in Organismen beispielsweise in Pflanzen kann prinzipiell nach allen dem Fachmann bekannten Methoden erfolgen.
Für Mikroorganismen kann der Fachmann entsprechende Methoden den Lehrbüchern von Sambrook, J. et al. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, von F. M. Ausubel et al. (1994) Current protocols in molecular biology, John Wiley and Sons, von D. M. Glover et al., DNA CLoning Vol. 1, (1995), IRL Press (ISBN 019-963476-9), von Kaiser et al. (1994) Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Habor Laboratory Press oder Guthrie et al. Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, 1994, Academic Press entnehmen.
Die Übertragung von Fremdgenen in das Genom einer Pflanze wird als Transformation bezeichnet. Es werden dabei die beschriebenen Methoden zur Transformation und Regeneration von Pflanzen aus Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen zur transienten oder stabilen Transformation genutzt. Geeignete Methoden sind die Protoplastentransformation durch Polyethylenglykol-induzierte DNA-Aufnahme, das biolistische Verfahren mit der Genkanone - die sogenannte particle bombardment Methode, die Elektroporation, die Inkubation trockener Embryonen in DNA-haltiger Lösung, die Mikroinfektion und der durch Agrobacterium vermittelte Gentransfer vorteilhaft erfolgt der Gentransfer in der vorliegenden Erfindung mit beispielsweise dem Agrobacterium tumefaciens Stamm GV 3101 pMP90. Die genannten Verfahren sind beispielsweise in B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, herausgegeben von S. D. Kung und R. Wu, Academic Press (1993) 128-143 sowie in Potrykus Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec.Biol. 42 (1991) 205-225) beschrieben. Vorzugsweise wird das zu exprimierende Konstrukt in einen Vektor kloniert, der geeignet ist, Agrobacterium tumefaciens zu transformieren, beispielsweise pBin19 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711). Mit einem solchen Vektor transformierte Agrobakterien können dann in bekannter Weise zur Transformation von Pflanzen, insbesondere von Kulturpflanzen, wie z. B. von Tabakpflanzen, verwendet werden, indem beispielsweise verwundete Blätter oder Blattstücke in einer Agrobakterienlösung gebadet und anschließend in geeigneten Medien kultiviert werden. Die Transformation von Pflanzen mit Agrobacterium tumefaciens wird beispielsweise von Höfgen und Willmitzer in Nucl. Acid Res. (1988) 16, 9877 beschrieben oder ist unter anderem bekannt aus F. F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, herausgegeben von S. D. Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15-38.
Im folgenden ist eine vorteilhafte Ausführungsform wiedergegeben. Werden für die Transformation Agrobakterien verwendet, wird die einzuführende Nukleinsäure bzw. DNA in spezielle Plasmide cloniert werden, und zwar entweder in einen intermediären Vektor oder in einen binären Vektor. Die intermediären Vektoren können aufgrund von Sequenzen, die homolog zu Sequenzen in der T-DNA sind, durch homologe Rekombination in das Ti- oder Ri-Plasmid der Agrobakterien integriert werden. Dieses enthält außerdem die für den Transfer der T-DNA notwendige vir-Region. Intermediäre Vektoren können nicht in Agrobakterien replizieren. Mittels eines Helferplasmids kann der intermediäre Vektor auf Agrobacterium tumefaciens übertragen werden (Konjugation). Binäre Vektoren können sowohl in E.coli als auch in Agrobakterien replizieren. Sie enthalten ein Selektionsmarker-Gen und einen Linker oder Polylinker, welche von der rechten und linken T-DNA Grenzregion eingerahmt werden. Sie können direkt in die Agrobakterien transformiert werden (Holsters et al. Mol. Gen. Genet. 163 (1978), 181-187). Das als Wirtszelle dienende Agrobakterium soll ein Plasmid, das eine vir-Region trägt, enthalten. Die vir-Region ist für den Transfer der T-DNA in die Pflanzenzelle notwendig. Zusätzliche T-DNA kann vorhanden sein. Das derartig transformierte Agrobakterium wird zur Transformation von Pflanzenzellen verwendet.
Die Verwendung von T-DNA für die Transformation von Pflanzenzellen ist intensiv untersucht und ausreichend in EPA-0 120 516; Hoekema, In: The Binary Plant Vector System Offsetdrukkerij Kanters B. V., Alblasserdam (1985), Chapter V; Fraley et al., Crit. Rev. Plant. Sci., 4: 1-46 und An et al. EMBO J. 4 (1985), 277-287 beschrieben worden.
Für den Transfer der DNA in die Pflanzenzelle können Pflanzen- Explantate zweckmäßigerweise mit Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes kokultiviert werden. Aus dem infizierten Pflanzenmaterial (z. B. Blattstücke, Stengelsegmente, Wurzeln, aber auch Protoplasten oder Suspensions-kultivierte Pflanzenzellen) können dann in einem geeigneten Medium, welches Antibiotika oder Biozide zur Selektion transformierter Zellen enthalten kann, wieder ganze Pflanzen regeneriert werden. Die so erhaltenen Pflanzen können dann auf Anwesenheit der eingeführten DNA untersucht werden. Andere Möglichkeiten der Einführung fremder DNA unter Verwendung des biolistischen Verfahrens oder durch Protoplastentransformation sind bekannt (vergl. z. B. Willmitzer, L., 1993 Transgenic plants. In: Biotechnology, A Multi-Volume Comprehensive Treatise (H. J. Rehm, G. Reed, A. Pühler, P. Stadler, eds.), Vol. 2, 627-659, VCH Weinheim- New York-Basel-Cambridge).)
Auch die Transformation monokotyler Pflanzen mittels Agiobacterium basierender Vektoren wurde beschrieben (Chan et al. Plant Mol. Biol. 22(1993), 491-506; Hiei et al. Plant J. 6 (1994) 271-282; Deng et al. Science in China 33 (1990), 28-34; Wilmink et al. Plant Cell Reports 11,(1992) 76-80; May et al. Biotechnology 13 (1995) 486-492; Conner und Domisse; Int. Cr. Plant Sci. 153 (1992) 550-555; Ritchie et al. Transgenic Res. (1993) 252-265). Alternative Systeme zur Transformation von monokotylen Pflanzen sind die Transformation mittels des biolistischen Ansatzes (Wan und Lemaux; Plant Physiol. 104 (1994), 37-48; Vasil et al. Biotechnology 11 (1992), 667-674; Ritala et al. Plant Mol. Biol 24, (1994) 317-325; Spenc er et al. Theor. Appl. Genet. 79 (1990), 625-631) die Protoplastentransformation, die Elektroporation von partiell permeabilisierten Zellen; die Einbringung von DNA mittels Glasfasern. Insbesondere die Transformation von Mais wurde in der Literatur mehrfach beschrieben (vgl. z. B. WO 95/06128; EP 0513849 A1; EP 0465875 A1; EP 0292435 A1; Fromm et al. Biotechnology 8 (1990), 833-844; Gordon-Kamm et al. Plant Cell 2 (1990), 603-618; Koziel et al. Biotechnology 11(1993) 194-200; Moroc et al. Theor Applied Genetics 80 (190) 721-726).
Auch die erfolgreiche Transformation anderer Getreidearten wurde bereits beschrieben z. B. für Gerste (Wan und Lemaux, s. o.; Ritala et al. s. o.; Weizen (Nehra et al. Plant J. 5(1994) 285-297).
Mit einem erfindungsgemäßen Vektor transformierte Agrobakterien können ebenfalls in bekannter Weise zur Transformation von Pflanzen wie Testpflanzen wie Arabidopsis oder Kulturpflanzen wie Getreide, Mais, Hafer, Roggen, Gerste, Weizen, Soja, Reis, Baumwolle, Zuckerrübe, Canola, Sonnenblume, Flachs, Hanf, Kartoffel, Tabak, Tomate, Karotte, Paprika, Raps, Tapioka, Maniok, Pfeilwurz, Tagetes, Alfalfa, Salat und den verschiedenen Baum-, Nuss- und Weinspezies verwendet werden, z. B. indem verwundete Blätter oder Blattstücke in einer Agrobakterienlösung gebadet und anschließend in geeigneten Medien kultiviert werden.
Die genetisch veränderten Pflanzenzellen können über alle dem Fachmann bekannten Methoden regeneriert werden. Entsprechende Methoden können den oben genannten Schriften von S. D. Kung und R. Wu, Potrykus oder Höfgen und Willmitzer entnommen werden.
Unter Pflanzen im Sinne der Erfindung sind Pflanzenzellen, -gewebe, -organe oder ganzen Pflanzen wie Samen, Knollen, Blüten, Pollen, Früchte, Sämlinge, Wurzeln, Blätter, Stengel oder sonstige Pflanzenteile zu verstehen. Außerdem ist unter Pflanzen Vermehrungsmaterial wie Samen, Früchte, Sämlinge, Stecklinge, Knollen, Schnitte oder Wurzelstöcke zu verstehen.
Als Organismen bzw. Wirtsorganismen für die erfindungsgemäße Nukleinsäure, die Expressionskassette oder den Vektor eignen sich prinzipiell vorteilhaft alle Organismen, die in der Lage sind die erfindungsgemäß verwendeten Nukleinsäuren zu exprimieren bzw. für die Expression rekombinanter Gene geeignet sind. Beispielhaft seien Pflanzen wie Arabidopsis, Astezaceae wie Calendula oder Kulturpflanzen wie Soja, Erdnuss, Rizinus, Sonnenblume, Mais, Baumwolle, Flachs, Raps, Kokosnuss, Ölpalme, Färbersaflor (Carthamus tinctorius) oder Kakaobohne, Mikroorganismen wie Pilze beispielsweise die Gattung Mortierella, Saprolegnia oder Pythium, Bakterien wie die Gattung Escherichia, Hefen wie die Gattung Saccharomyces, Cyanobakterien, Ciliaten, Algen oder Protozoen wie Dinoflagellaten wie Crypthecodinium genannt. Beispielsweise seien Organismen, die natürlicherweise Öle in größeren Mengen synthetisieren wie Soja, Raps, Kokosnuss, Ölpalme, Färbersaflor, Rizinus, Calendula, Erdnuss, Kakaobohne oder Sonnenblume genannt. Prinzipiell sind als Wirtsorganismen auch transgene Tiere geeignet beispielsweise C. elegans.
Bevorzugt sind transgene Pflanzen, die ein erfindungsgemäßes funktionelles oder nicht funktionelles Nukleinsäurekonstrukt oder einen erfindungsgemäßen funktionellen oder nicht funktionellen Vektor enthalten. Unter funktionell ist im Sinne der Erfindung zu verstehen, dass die im Verfahren verwendeten Nukleinsäuren allein oder im Nukleinsäurekonstrukt oder im Vektor exprimiert werden und ein biologisch aktives Genprodukt hergestellt wird. Unter nicht funktionell ist im Sinne der Erfindung zu verstehen, dass die im Verfahren verwendeten Nukleinsäuren allein oder im Nukleinsäurekonstrukt oder im Vektor nicht transcribiert, nicht exprimiert werden und/oder ein biologisch inaktives Genprodukt hergestellt wird. In diesem Sinne handelt es sich bei den sogenannten Antisense-RNAs auch um nicht funktionelle Nukleinsäuren bzw. bei Insertion in das Nukleinsäurekonstrukt oder den Vektor um ein nicht funktionelles Nukleinsäurekonstrukt oder nicht funktionellen Vektor. Sowohl das erfindungsgemäße Nukleinsäurekonstrukt als auch der erfindungsgemäße Vektor kann zur Herstellung von transgenen Organismen bevorzugt Pflanzen vorteilhaft verwendet werden.
Unter transgen im Sinne der Erfindung ist zu verstehen, dass die im Verfahren verwendeten Nukleinsäuren nicht an ihrer natürlichen Stelle im Genom eines Organismus sind, dabei können die Nukleinsäuren homolog oder heterolog exprimiert werden. Tansgen bedeutet aber auch, dass die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren an ihrem natürlichen Platz im Genom eines Organismus sind, dass jedoch die Sequenz gegenüber der natürlichen Sequenz verändert wurde und/oder das die Regulationssequenzen, der natürlichen Sequenzen verändert wurden. Bevorzugt ist unter transgen die Expression der Nukleinsäuren an nicht natürlicher Stelle im Genom zu verstehen, das heißt eine homologe oder bevorzugt heterologe Expression der Nukleinsäuren liegt vor. Gleiches gilt für das erfindungsgemäße Nukleinsäurekonstrukt oder den Vektor.
Nutzbare Wirtszellen sind weiterhin genannt in: Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990).
Verwendbare Expressionsstämme z. B. solche, die eine geringere Proteaseaktivität aufweisen sind beschrieben in: Gottesman, S., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 119-128.
Weiterhin umfasst die Erfindung auch die: Verwendung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, z. B. der unter den SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38 oder SEQ ID NO : 40 dargelegten Nukleotidsequenzen zur Erstellung von genetisch veränderten Pflanzen, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie veränderte Proteine, der von den SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38 oder SEQ ID NO: 40 kodierten Proteine enthalten, die dadurch gekennzeichnet sind dass sie eine sehr viele geringere Interaktion mit dem Herbizid aufweisen bzw. in ihrer Aktivität nicht durch das Herbizid beeinträchtigt werden.
Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuren, insbesondere SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38 oder SEQ ID NO: 40, deren aufgrund des degenerierten genetischen Codes abgeleiteten Sequenzen sowie deren Derivate wurden aus einer Populationen transgener Pflanzen identifiziert, die zum einen dadurch gekennzeichnet war, dass sie mittels des Agrobacterium transformiert worden sind und im Rahmen dieses Prozesses neue DNA im Chromosomen an zufälliger Stelle integriert worden war. Durch Rückkreuzungen wurden schließlich Pflanzen isoliert, die die identifizierten Nukleinsäuren auf beiden homologen Chromosomen enthalten. Darüberhinaus sind diese Pflanzen dadurch gekennzeichnet, dass sie im Verlauf des Screenings als für lethale Mutationen segregierende Linien identifiziert worden sind. Diese Pflanzen weisen als Ergebnis der Integration der neuen DNA starke Behinderungen im Wachstum und oder Entwicklung auf. Es ist davon auszugehen, dass diese Wachstums- und Entwicklungsbehinderungen darauf zurückzuführen sind, dass die neu inserierte DNA in für Wachstum und Entwicklung wichtige Gene integriert hat, wodurch deren biologische Funktion eingeschränkt oder blockiert wird. Dieses bedeutet, dass diese Gene sowie deren aufgrund des degenerierten genetischen Codes abgeleiteten Sequenzen sowie deren Derivate für Proteine kodieren, welche in analoger Weise wie für die in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38 oder SEQ ID NO: 40 beschrieben, geeignete Zielproteine für neu zu entwickelnde Herbizide darstellen.
Zur Erzeugung derartiger veränderter Proteine werden in einer vorteilhaften Ausführungsform die genannten Nukleinsäuren überexprimiert und folgende Prozessschritte werden vorteilhaft durchlaufen:

a) Expression der von den SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO : 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38 oder SEQ ID NO: 40 oder von einer Nukleinsäuresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes aus den durch Rückübersetzung der in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39 oder SEQ ID NO: 41 dargestellten Aminosäuresequenzen ableiten lässt, oder von Derivaten oder Fragmenten der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38 oder SEQ ID NO: 40 dargestellten Nukleinsäuresequenzen, die für Polypeptide mit den in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39 oder SEQ ID NO: 41 dargestellten Aminosäuresequenzen codieren und mindestens 50%, 60%, vorzugsweise 70%, 80%, 90% oder mehr Homologie auf Aminosäureebene aufweisen, kodierten Proteine in einem heterologen System beispielsweise einem Mikroorganismus wie einem Bakterium der Gattung Escherichia wie E. coli XL1-Red oder in einem Zellfreiensystem
b) Randomisierte oder gerichtete Mutagenese des Proteins durch Modifikation der Nukleinsäure,
c) Messung der Interaktion oder der biologischen Aktivität des veränderten Proteins mit dem Herbizid bzw. in Gegenwart des Herbizids,
d) Identifizierung von Derivaten des Proteins die eine geringere Interaktion oder eine wenig beeinflusste biologische Aktivität aufweisen,
e) Testung der biologischen Aktivität des Proteins nach Applikation des Herbizides.

Vorteilhaft erfolgt die Überführung des so erhaltenen veränderten Proteins bzw. der veränderten Nukleinsäure, z. B. der unter SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38 oder SEQ ID NO: 40 aufgeführten Sequenzen sowie der weiteren oben beschriebenen Sequenzen, z. B. Derivate und Fragmente, in einen Organismus vorteilhaft in eine Pflanze, bevorzugt pflanzliche Zellen.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist ein Verfahren zur Erzeugung veränderter Genprodukte, die von den Nukleinsäuresequenzen SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38 oder SEQ ID NO: 40 codiert werden, dadurch gekennzeichnet, dass es folgende Prozessschritte umfasst:

a) Expression der von den SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38 oder SEQ ID NO: 40 kodierten Proteine oder Derivate oder Fragmente davon in einem heterologen System oder in einem Zellfreiensystem
b) Randomisierte oder gerichtete Mutagenese des Proteins durch Modifikation der Nukleinsäure,
c) Messung der Interaktion des veränderten Genprodukts mit dem Herbizid oder der biologischen Aktivität des veränderten Genprodukts in Gegenwart des Herbizide,
d) Identifizierung von Derivaten des Proteins die eine geringere Interaktion aufweisen oder in ihrer Aktivität weniger beeinflusst sind,
e) Testung der biologischen Aktivität des Proteins nach Applikation des Herbizides,
f) Auswahl der Nukleinsäuresequenzen, die oder deren Genprodukte eine veränderte biologische Aktivität gegenüber dem Herbizid, vorzugsweise eine verringerte Hemmung durch das Herbizid oder geringere Interaktion mit dem Herbizid, aufweisen.

Die nach dem oben beschriebenen Verfahren nach ausgewählten Sequenzen können vorteilhaft in einen Organismus eingebracht werden. Deshalb ist ein weiterer Erfindungsgegenstand ein nach diesem Verfahren hergestellter Organismus, bevorzugt ist der Organismus eine Pflanze. Das Verfahren eignet sich auch für die Genexpression der oben genannten biologisch aktiven Derivate und Fragmente.
Anschließend erfolgt die Regeneration ganzer Pflanzen und Überprüfung der Resistenz gegenüber dem Herbizid in intakten Pflanzen.
Veränderte Proteine und/oder Nukleinsäuren, die in Pflanzen Resistenz gegen Herbizide vermitteln können, können aus den Sequenzen SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38 oder SEQ ID NO: 40 auch über die sogenannte "site directed mutagenesis" hergestellt werden, durch diese Mutagenese kann beispielsweise die Stabilität und/oder enzymatische Aktivität von Enzymen oder die Eigenschaften wie Bindung von niedermolekularen Verbindungen mit kleiner 1000 Dalton, vorteilhaft kleiner 900 Dalton, bevorzugt kleiner 800, besonders bevorzugt kleiner 700, ganz besonders bevorzugt kleiner 600 Dalton, von Proteinen oder Antisense-RNA sehr gezielt verbessern bzw. verändert werden.
Weiterhin können Veränderungen über die von Spee et al. (Nucleic Acids Research, Vol. 21, No. 3, 1993: 777-78) beschriebenen PCR-Methode unter Verwendung von dITP zur zufälligen Mtitagenese erzielt werden oder durch die von Rellos et al. (Protein Expr. Purif., 5, 1994: 270-277) weiter verbessert Methode.
Eine weitere Möglichkeit zur Herstellung dieser veränderten Proteine und/oder von Nukleinsäuren ist eine von Stemmar et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 91, 1994: 10747-10751) beschriebene "in vitro" Rekombinationstechnik für die nolekulare Evolution oder die von Moore et al. (Nature Biotechnology Vol. 14, 1996: 458-467) beschriebene Kombination der PCR- und Rekombinationsmethode.
Ein weiterer Weg zur Mutagenese von Nukleinsäuren bzw. Proteinen wird von Greener et al. in Methods in Molecular Biology (Vol. 57, 1996: 375-385) beschrieben. In EP-A-O 909 821 wird eine Methode zur Veränderung von Proteinen unter Verwendung des Mikroorganismus E. coli XL-1 Red beschrieben. Dieser Mikroorganismus erzeugt bei der Replikation Mutantionen in den eingeführten Nukleinsäuren und führt so zu einer Veränderung der genetischen Information. Über Isolierung der veränderten Nukleinsäuren bzw. der veränderten Proteine und Testung auf Resistenz lassen sich leicht vorteilhafte Nukleinsäuren und die durch sie kodierten Protoine und umgekehrt identifizieren. Diese können dann nach Einbringen in Pflanzen dort die Resistenz ausprägen und so zur Resistenz gegen die Herbizide führen.
Weitere Methoden der Mutagenese und Selektion sind beispielsweise Methoden wie die in vivo Mutagenese von Samen oder Pollen und Selektion resistenter Allele in Anwesenheit der erfindungsgemäßen Inhibitoren, gefolgt von genetischer und molekularer Identifizierung des veränderten, resistenten Allels. Weiterhin die Mutagenese und Selektion von Resistenzen in der Zellkultur durch Vermehrung der Kultur in Anwesenheit von sukzessiv steigenden Konzentrationen der erfindungsgemäßen Inhibitoren. Dabei kann die Erhöhung der spontanten Mutationsrate durch chemische/physikalische mutagene Behandlung ausgenutzt werden. Wie vorgehend beschrieben lassen sich auch mit Mikroorganismen, die eine endogene oder rekombinante Aktivität der durch die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuren codierten Proteine haben, und die gegenüber den erfindungsgemäß identifizierten Inhibitoren sensitiv sind, veränderte Gene isolieren. Die Anzucht der Mikroorgansimen auf Medien mit steigendem Konzentrationen von erfindungsgemäßen Inhibitoren erlaubt die Selektion und Evolution von resistenten Varianten der erfindungsgemäßen Targets. Die Frequenz der Mutationen kann wiederum durch mutagenen Behandlungen erhöht werden.
Daneben stehen Verfahren zur gezielten Veränderungen von Nukleinsäuren zur Verfügung (Zhu et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 96, 8768-8773 und Beethem et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, Vol 96, 8774-8778). Diese Methoden ermöglichen es, in den Proteinen solche Aminosäuren, die für die Bindung von Inhibitoren von Bedeutung sind, durch funktionell äquivalente Aminosäuren zu ersetzen, die jedoch die Bindung des Inhibitors verhindern.
Ein weiterer Erfindungsgegenstand ist weiterhin ein Verfahren zur Erstellung von Nukleotidsequenzen welche für Genprodukte kodieren, die eine veränderte biologische Aktivität aufweisen, wobei die biologische Aktivität dahingegen verändert wurde, dass eine erhöhte Aktivität vorliegt. Unter erhöhter Aktivität ist eine gegenüber dem Ausgangsorganismus bzw. gegenüber dem Ausgangsgenprodukt um mindestens 10%, bevorzugt um mindestens 30%, besonders bevorzugt um mindestens 50% oder 70%, ganze besonders bevorzugt um mindestens 100% höhere Aktivität zu verstehen. Weiterhin kann die biologische Aktivität dahingegen verändert worden sein, dass die erfindungsgemäßen Substanzen und/oder Mittel nicht mehr oder nicht mehr richtig an die Nukleinsäuresequenzen und/oder die durch sie kodierten Genprodukte binden. Unter nicht mehr oder nicht mehr richtig ist im Sinne der Erfindung zu verstehen, dass die Substanzen um mindestens 30%, bevorzugt mindestens 50%, besonders bevorzugt um mindestens 70%, ganz besonders bevorzugt um mindestens 80% oder gar nicht mehr an die veränderten Nukleinsäuren und/oder Genprodukte in Vergleich zum Ausgangsgenprodukt oder den Ausgangsnukleinsäuren binden.
Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft deshalb eine nach dem oben beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren genetisch veränderte transgene Pflanze.
Genetisch veränderten transgene Pflanzen, die gegen die nach den erfindungsgemäßen Verfahren gefundenen Substanzen und/oder Mittel enthaltend diese Substanzen resistent sind, können auch durch Überexpression der in den erfindungsgemäße Verfahren verwendeten Nukleinsäuren, insbesonder SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38 oder SEQ ID NO: 40 erzeugt werden. Deshalb ist ein weiterer Erfindungsgegenstand ein Verfahren zur Erzeugung transgener Pflanzen, die gegen Substanzen, die nach einem erfindungsgemäßen Verfahren gefunden wurden, resistent sind, dadurch gekennzeichnet, dass in diesen Pflanzen erfindungsgemäße Nukleinsäuren mit einer der beschriebenen biologischen Aktivität, insbesondere mit den Sequenzen SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38 oder SEQ ID NO: 40 überexprimiert werden. Ein ähnliches Verfahren wird beispielhaft in Lermantova et al., Plant Physiol., 122, 2000: 75-83 beschrieben. Natürlich können auch die hierin genannten Derivate und Fragmente verwendet werden, die die gewünschte Aktivität aufweisen.
Die oben beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren zur Erzeugung resistenter Pflanzen ermöglichen die Entwicklung neuer Herbizide, die eine möglichst umfassende Pflanzenspezies unabhängige Wirkung aufweisen (sog. Totalherbizide), in Kombination mit der Entwicklung von gegenüber dem Totalherbizid resistenten Nutzpflanzen. Gegenüber Totalherbiziden resistente Nutzpflanzen sind bereits verschiedentlich beschrieben worden. Dabei können mehrere Prinzipien zur Erzielung einer Resistenz unterschieden werden:

a) Resistenzerzeugung in einer Pflanze über Mutationsverfahren oder gentechnische Verfahren, indem das als Zielort für das Herbizid dienende Protein deutlich überproduziert wird und indem auf Grund des großen Überschusses des als Zielort für das Herbizid dienende Protein, die von diesem Protein in der Zelle ausgeübte Funktion auch nach Applikation des Herbizides beibehalten wird.
b) Veränderung der Pflanze dahingehend, dass eine modifizierte Version des als Zielort des Herbizid fungierenden Proteins eingeführt wird und dass das neu einoreführte modifizierte Protein vom Herbizid nicht in seiner Funktion beeinträchtigt wird.
c) Veränderung der Pflanze dahingehend, dass ein neues Protein/eine neue RNA eingeführt wird, welche(s) dadurch gekennzeichnet ist, dass die für die herbizide Wirkung der niedermolekularen Substanz verantwortliche chemische Struktur des Proteins oder der Nukleinsäure, wie der RNA oder der ENA, so verändert wird, dass durch die veränderte Struktur keine herbizide Wirkung mehr entfaltet werden kann, oder das Herbizid in der veränderten Pflanze inaktiviert oder modifiziert wird, z. B. abgebaut wird, nicht aufgenommen oder nicht transportiert wird oder in die Vakuole transportiert wird, etc., d. h. die Interaktion des Herbizids mit dem Zielort nicht mehr erfolgen kann.
d) dass die Funktion des Targets durch eine neue in die Pflanze eingebrachte Nukleinsäure, z. B. ein Gen ersetzt wird, wobei die Nukleinsäure für ein Genprodukt codiert, das geringer oder gar nicht von der herbiziden Substanz in seiner Funktion getrennt wird. So kann z. B. ein sogenannter "alternativer Pathway" geschaffen werden.
e) dass die Funktion des Targets durch ein anderes in der Pflanze vorhandenes oder in die Pflanze eingebrachtes Gen bzw. dessen Genprodukt übernommen wird.

Die vorliegende Erfindung umfasst daher weiterhin die Verwendung von Pflanzen, die durch die T-DNA Insertion getroffene Gene mit den Nukleinsäuresequenzen SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38 oder SEQ ID NO: 40 oder die weiteren genannten Sequenzen, z. B. Fragmente und Derivate enthalten, zur Entwicklung von neuen Herbiziden. Dem Fachmann sind alternative Verfahren zur Identifizierung von homologen Nukleinsäuren beispielsweise in anderen Pflanzen mit ähnlichen Sequenzen wie unter Verwendung von Transposons, bekannt. Gegenstand dieser Erfindung ist daher auch die Verwendung von alternativen Insertionsmutageneseverfahren zur Insertion von fremder Nukleinsäure in die Nukleinsäuresequenzen SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38 oder SEQ ID NO: 40 in von diesen Sequenzen aufgrund des genetischen Codes abgeleitete Sequenzen und/oder deren Derivate oder Fragmente in anderen Pflanzen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind deshalb wie oben beschrieben Substanzen identifiziert nach den erfindungsgemäßen Verfahren, wobei die Substanz ein Molekulargewicht von kleiner 1000 Dalton, vorteilhaft kleiner 900 Dalton, bevorzugt kleiner 800, besonders bevorzugt kleiner 700, ganz besonders bevorzugt kleiner 600 Dalton, einem Ki-Wert kleiner 1 mM und weniger als drei Hydroxylgruppen an einem Kohlenstoffatom-enthaltenden Ring hat bzw. wobei es sich bei der Substanz um eine proteinogene Substanz oder um eine Antisense-RNA handelt.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung sind Substanzen, die nach den erfindungsgemäßen oben beschriebenen Verfahren identifiziert wurden und wobei es sich bei den Substanzen um einen Antikörper gegen das durch die Sequenzen SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38 oder SEQ ID NO: 40 kodierte Protein oder Derivate oder Fragmente davon handelt.
Diese Substanzen zeichnen sich vorteilhaft durch ihre herbizide Wirkung, die mit den oben beschriebenen Verfahren identifizierbar sind.
Ein weiterer Erfindungsgegenstand sind Mittel, enthaltend eine herbizid wirksame Menge mindestens einer Substanz identifiziert nach einem der erfindungsgemäßen Verfahren oder eines Antagonisten identifiziert nach einem erfindungsgemäßen Verfahren und mindestens einen inerten flüssigen und/oder festen Trägerstoff sowie gegebenenfalls mindestens einen oberflächenaktiven Stoff.
Eine weitere Ausführungsform sind Mittel, enthaltend eine das Wachstum regulierende Menge mindestens einer Substanz identifiziert nach den erfindungsgemäßen Verfahren oder eines Antagonisten identifiziert nach einem erfindungsgemäßen Verfahren und mindestens einen inerten flüssigen und/oder festen Trägerstoff sowie gegebenenfalls mindestens einen oberflächenaktiven Stoff.
Diese erfindungsgemäßen Substanzen oder Mittel mit ihrer herbiziden Wirkung können als Defoliants, Desiccants, Krautabtötungsmittel und insbesondere als Unkrautvernichtungsmittel verwendet werden. Unter Unkraut im weitesten Sinne sind alle Pflanzen zu verstehen, die an Orten aufwachsen, an denen sie unerwünscht sind. Ob die mit Hilfe der erfindungsgemäßen Verfahren gefundenen Substanzen bzw. Wirkstoffe als totale oder selektive Herbizide wirken, hängt unter anderem von der angewandten Menge, ihrer Selektivität und weiteren Faktoren ab. Die Substanzen können beispielsweise gegen folgende Unkräuter verwendet werden:
Dikotyle Unkräuter der Gattungen:
Sinapis, Lepidium, Galium, Stellaria, Matricaria, Anthenis, Galinsoga, Chenopodium, Urtica, Senecio, Amaranthus, Portulaca, Xanthium, Convolvulus, Ipomoea, Polygonum, Sesbania, Ambrosia, Cirsium, Carduus, Sonchus, Solanum, Rorippa, Rotala, Lindernia, Lamium, Veronica, Abutilon, Emex, Datura, Viola, Galeopsis, Papaver, Centaurea, Trifolium, Ranunculus, Taraxacum.
Monokotyle Unkräuter der Gattungen:
Echinochloa, Setaria, Panicum, Digitaria., Phleum, Poa, Festuca, Eleusine, Brachiaria, Lolium, Bromus, Avena, Cyperus, Sorghum, Agropyron, Cynodon, Monochoria, Fimbristyslis, Sagittaria, Eleocharis, Scirpus, Paspalum, Ischaemum, Sphenoclea, Dactyloctenium, Agrostis, Alopecurus, Apera.
In Abhängigkeit von der jeweiligen Applikationsmethode können die im erfindungsgemäßen Verfahren identifizierten Substanzen bzw. sie enthaltende Mittel vorteilhaft noch in einer weiteren Zahl von Kulturpflanzen zur Beseitigung unerwünschter Pflanzen eingesetzt werden. In Betracht kommen beispielsweise folgende Kulturen:
Allium cepa, Ananas comosus, Arachis hypogaea, Asparagus officinalis, Beta vulgaris spec, altissima, Beta vulgaris spec. rapa, Brassica napus var. napus, Brassica napus var. napobrassica, Brassica rapa var. silvestris, Camellia sinensis, Carthamus tinctorius, Carya illinoinensis, Citrus limon, Citrus sinensis, Coffea arabica (Coffea canephora, Coffea liberica), Cucumis sativus, Cynodon dactylon, Daucus carota, Elaeis guineensis, Fragaria vesca, Glycine max, Gossypium hirsutum, (Gossypium arboreum, Gossypium herbaceum, Gossypium vitifolium), Helianthus annuus, Hevea brasiliensis, Hordeum vulgare, Humulus lupulus, Ipomoea batatas, Juglans regia, Lens culinaris, Linum usitatissimum, Lycopersicon lycopersicum, Malus spec., Manihot esculenta, Medicago sativa, Musa spec., Nicotiana tabacum (N.rustica), Olea europaea, Oryza sativa, Phaseolus lunatus, Phaseolus vulgaris, Picea abies, Pinus spec., Pisum sativum, Prunus avium, Prunus persica, Pyrus communis, Ribes sylestre, Ricinus communis, Saccharum officinarum, Secale cereale, Solanum tuberosum, Sorghum bicolor (s. vulgare), Theobroma cacao, Trifolium pratense, Triticum aestivum, Triticum durum, Vicia faba, Vitis vinifera, Zea mays.
Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren gefundenen Substanzen können vorteilhaft auch in Kulturen verwandt werden, die durch Züchtung einschließlich gentechnischer Methoden gegen die Wirkung von Herbiziden tolerant sind.
Die erfindungsgemäßen Substanzen bzw. die sie enthaltenden herbiziden Mittel können beispielsweise in Form von direkt versprühbaren wässrigen Lösungen, Pulvern, Suspensionen, auch hochprozentigen wässrigen, öligen oder sonstigen Suspensionen oder Dispersionen, Emulsionen, Öldispersionen, Pasten, Stäubemitteln, Streumitteln oder Granulaten durch Versprühen, Vernebeln, Verstäuben, Verstreuen oder Gießen angewendet werden. Die Anwendungsformen richten sich nach den Verwendungszwecken; sie sollten in jedem Fall möglichst die feinste Verteilung der erfindungsgemäßen Wirkstoffe gewährleisten.
Als inerte flüssige und/oder feste Trägerstoffe kommen flüssige Zusatzstoffe wie Mineralölfraktionen von mittlerem bis hohem Siedepunkt, wie Kerosin oder Dieselöl, ferner Kohlenteeröle sowie Öle pflanzlichen oder tierischen Ursprungs, aliphatische, cyclische und aromatische Kohlenwasserstoffe, z. B. Paraffin, Tetrahydronaphthalin, alkylierte Naphthaline oder deren Derivate, alkylierte Benzole oder deren Derivate, Alkohole wie Methanol, Ethanol, Propanol, Butanol, Cyclohexanol, Ketone wie Cyclohexanon oder stark polare Lösungsmittel, z. B. Amine wie N-Methylpyrrolidon oder Wasser in Frage.
Weitere vorteilhafte Anwendungsformen der erfindungsgemäßen Substanzen und/oder Mittel sind wässrige Anwendungsformen wie Emulsionskonzentrate, Suspensionen, Pasten, netzbaren Pulvern oder wasserdispergierbaren Granulaten, die beispielsweise durch Zusatz von Wasser bereitet werden können. Zur Herstellung von Emulsionen, Pasten oder Öldispersionen können die Substanzen und/oder Mittel die sog. Substrate als solche oder in einem Öl oder Lösungsmittel gelöst, mittels Netz-, Haft-, Dispergier- oder Emulgiermittel in Wasser homogenisiert werden. Es können aber auch aus wirksamer Substanz, Netz-, Haft-, Dispergier- oder Emulgiermittel und eventuell Lösungsmittel oder Öl bestehende Konzentrate hergestellt werden, die zur Verdünnung mit Wasser geeignet sind.
Als oberflächenaktive Stoffe kommen die Alkali-, Erdalkali-, Ammoniumsalze von aromatischen Sulfonsäuren, z. B. Lignin-, Phenol-, Naphthalin- und Dibutylnaphthalinsulfonsäure, sowie von Fettsäuren, Alkyl- und Alkylarylsulfonaten, Alkyl-, Laurylether- und Fettalkoholsulfaten, sowie Salze sulfatierte: Hexa-, Hepta- und Octadecanolen sowie von Fettalkoholglykolether, Kondensationsprodukte von sulfoniertem Naphthalin und seiner Derivate mit Formaldehyd, Kondensationsprodukte des Naphthalins bzw. der Naphthalinsulfonsäuren mit Phenol und Formaldehyd, Polyoxyethylenoctylphenolether, ethoxyliertes Isooctyl-, Octyl- oder Nonylphenol, Alkylphenyl-, Tributylphenylpolyglykolether, Alkylarylpolyetheralkohole, Isotridecylalkohol, Fettalkoholethylenoxid-Kondensate, ethoxyliertes Rizinusöl, Polyoxyethylenalkylether oder Polyoxypropylenalkylether, Laurylalkoholpolyglykoletheracetat, Sorbitester, Lignin-Sulfitablaugen oder Methylcellulose in Betracht.
Pulver-, Streu- und Stäubemittel können als feste Trägerstoffe vorteilhaft durch Mischen oder gemeinsames Vermahlen der wirksamen Substanzen mit einem festen Trägerstoff hergestellt werden.
Granulate, z. B. Umhüllungs-, Imprägnierungs- und Homogengranulate können durch Bindung der Wirkstoffe an feste Trägerstoffe hergestellt werden. Feste Trägerstoffe sind beispielsweise Mineralerden wie Kieselsäuren, Kieselgele, Silikate, Talkum, Kaolin, Kalkstein, Kalk, Kreide, Bolus, Löß, Ton, Dolomit, Diatomeenerde, Calcium- und Magnesiumsulfat, Magnesiumoxid, gemahlene Kunststoffe, Düngemittel, wie Ammoniumsulfat, Ammoniumphosphat, Ammoniumnitrat, Harnstoffe und pflanzliche Produkte wie Getreidemehl, Baumrinden-, Holz- und Nussschalenmehl, Cellulosepulver oder andere feste Trägerstoffe.
Die Konzentrationen der erfindungsgemäßen Substanzen und/oder Mittel in den anwendungsfertigen Zubereitungen können in weiten Bereichen variiert werden. Die Formulierungen enthalten im allgemeinen 0,001 bis 98 Gew.-%, vorzugsweise 0,01 bis 95 Gew.-%, mindestens eines Wirkstoffs. Die Wirkstoffe werden dabei in einer Reinheit von 90% bis 100%, vorzugsweise 95% bis 100% (nach NMR-Spektrum) eingesetzt.
Die Applikation der herbiziden Mittel bzw. der Substanzen kann im Vorauflauf- oder im Nachauflaufverfahren erfolgen. Sind die Wirkstoffe für gewisse Kulturpflanzen weniger verträglich, so können Ausbringungstechniken angewandt werden, bei welchen die herbiziden Mittel oder Substanzen mit Hilfe der Spritzgeräte so gespritzt werden, dass die Blätter der empfindlichen Kulturpflanzen nach Möglichkeit nicht getroffen werden, während die Wirkstoffe auf die Blätter darunter wachsender unerwünschter Pflanzen oder die unbedeckte Bodenfläche gelangen (post-directed, lay-by).
Zur Verbreiterung des Wirkungsspektrums und zur Erzielung synergistischer Effekte können die erfindungsgemäßen Substanzen und/oder Mittel mit zahlreichen Vertretern anderer herbizider oder wachstumsregulierender Wirkstoffgruppen gemischt und gemeinsam ausgebracht werden. Beispielsweise kommen als Mischungspartner 1,2,4-Thiadiazole, 1,3,4-Thiadiazole, Amide, Aminophosphorsäure und deren Derivate, Aminotriazole, Anilide, (Het)-Aryloxyalkansäure und deren Derivate, Benzoesäure und deren Derivate, Benzothiadiazinone, 2-Aroyl-1,3-cyclohexandione, Hetaryl-Aryl-Ketone, Benzylisoxazolidinone, Meta-CF3-phenylderivate, Carbamate, Chinolinsäure und deren Derivate, Chloracetanilide, Cyclohexan-1,3-dionderivate, Diazine, Dichlorpropionsäure und deren Derivate, Dihydrobenzofurane, Dihydrofuran-3-one, Dinitroaniline, Dinitrophenole, Diphenylether, Dipyridyle, Halogencarbonsäuren und deren Derivate, Harnstoffe, 3-Phenyluracile, Imidazole, Imidazolinone, N-Phenyl-3,4,5,6- tetrahydrophthalimide, Oxadiazole, Oxirane, Phenole, Aryloxy- oder Heteroaryloxyphenoxypropionsäureester, Phenylessigsäure und deren Derivate, Phenylpropionsäure und deren Derivate, Pyrazole, Phenylpyrazole, Pyridazine, Pyridincarbonsäure und deren Derivate, Pyrimidylether, Sulfonamide, Sulfonylharnstoffe, Triazine, Triazinone, Triazolinone, Triazolcarboxamide, Uracile in Betracht.
Außerdem kann es von Nutzen sein, die erfindungsgemäßen Substanzen und/oder Mittel allein oder in Kombination mit anderen Herbiziden auch noch mit weiteren Pflanzenschutzmitteln gemischt, gemeinsam auszubringen, beispielsweise mit. Mitteln zur Bekämpfung von Schädlingen oder phytopathogenen Pilzen bzw. Bakterien. Von Interesse ist ferner die Mischbarkeit mit Mineralsalzlösungen, welche zur Behebung von Ernährungs- und Spurenelementmängeln eingesetzt werden. Es können auch nichtphytotoxische Öle und Ölkonzentrate zugesetzt werden.
Die Aufwandmengen an Wirkstoff ( = Substanze und/oder Mittel) betragen je nach Bekämpfungsziel, Jahreszeit, Zielpflanzen und Wachstumsstadium 0,001 bis 3,0, vorzugsweise 0,01 bis 1,0 kg/ha aktive Substanz.
Ein weiterer erfindungsgemäßer Gegenstand ist die Verwendung einer Substanz identifiziert nach einem der erfindungsgemäßen Verfahren oder Mittel enthaltend diese Substanzen als Herbizid oder zur Wachstumsregulierung von Pflanzen.
Außerdem betrifft die Erfindung ein Kit, umfassend das erfindungsgemäße Nukleinsäurekonstrukt, der erfindungsgemäßen Substanzen, z. B. den erfindungsgemäßen Antikörper, das erfindungsgemäße Antisense-Nukleinsäuremolekül und/oder einen Antagonisten und/oder eine herbizide Substanz identifiziert gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren sowie die unten beschriebene Zusammensetzung.
Ein weiterer erfindungsgemäßer Gegenstand ist eine Zusanmensetzung, enthaltend die erfindungsgemäße Substanz, den erfindungsgemäßen Antikörper, das erfindungsgemäße Antisense- Nukleinsäurekonstrukt und/oder einen erfindungsgemäßen Antagonisten und/oder eine erfindungsgemäße Substanz identifiziert nach einem erfindungsgemäßen Verfahren.
Die Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele weiter veranschaulicht, die nicht als beschränkend aufgefasst werden sollten.

Beispiele

a) Molekularbiologische Methoden

Molekularbiologische Methoden wie sie hier eingesetzt wurden entsprechen dem Stand der Technik und sind an verschiedenen Stellen, wie bspw. Sambrock et al., Molecular Cloning, eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989), Reiter et al., Methods in Arabidopsis Research, World Sientific Press (1992), Schultz et al., Plant Molecular Biology Manual, Kluwer Academic Publishers (1998) und Martinez- Zapater und Salinas, Methods in Molecular Biology, Vol. 82: Arabidopsis Protocols eds., Humana Press Inc., Totowa, NJ. Diese Referenzen beschreiben die gängigen Standardmethoden für die Produktion, Identifizierung und Klonierung von durch T-DNA-Insertionen hervorgerufenen Mutanten. Zusätzlich wurde für die Identifizierung von Insertionsstellen auf eine weitere gängige Methode, wie sie u. a. von Spertini et al., Biotechniques 27: 308-314 (1999) beschrieben wurde, zurückgegriffen. Die Sequenzierungen erfolgten durch die Firma AGOWA (Berlin).

b) Material

Die verwendeten Chemikalien wurden, wenn im Text nicht gesondert angegeben, in p.A.-Qualität von den Firmen Fluka (Neu-Ulm), Merck (Darmstadt), Roth (Karlsruhe), Serva (Heidelberg) und Sigma (Deideshofen) bezogen. Lösungen wurden unter Verwendung von reinem pyrogenfreiem Wasser, im Text als 1110 bezeichnet, aus einer Ionenaustauschanlage der Firma (TKA, Niederelbert) hergestellt. Restriktionsnukleasen, DNA-modifizierende Enzyme und molekularbiologische Kits und Oligonukleotide wurden bezogen von den Firmen Amersham Pharmacia (Freiburg), Biometra (Göttingen), Dynal (Hamburg), Gibco-BRL (Gaithersburg, MD., USA), Invitrogen (Groningen, Niederlande), MBI Fermentas (St. Leon Rot), New England Biolabs (Schwalbach, Taunus), Novagen (Madison, Wisconsin, USA), Qiagen (Hilden), Roche Diagnostics (Mannheim), Stratagene (Amsterdam, Niederlande), TTB-Molbiol (Berlin). Falls nicht anders beschrieben wurden die Produkte nach den Angaben der Hersteller eingesetzt.

c) Herstellung und Identifizierung von Linien, die für lethale Mutationen segregieren

Wildtypische Arabidopsis-Pflanzen des Ökotyps C24 wurden mittels eines modifizierten "in planta" Transformationsprotokoll transformiert (Bechthold et al., 1992; Clough and Bent, 1998) und transgene F1 Pflanzen mittels Antibiotika- oder Herbizidresistenzen (u. a. Clearfield) selektioniert. T2-Samen dieser Linien wurden auf Sterilmedium und auf Erde ausgelegt und nach 7 Tagen Wachstum unter Standardbedingungen auf das Vorkommen von absterbenden Keimlingen visuell hin untersucht. Insbesondere wurden Veränderungen der Pigmentierung his hin zu derem völligen Fehlen sowie morphologische Anomalien beobachtet. Es wurden nur solche Linien weiter untersucht, für die in einer Paralleluntersuchung eine Segregationsverhältnis von ca. 2 : 1-3 : 1, daher die zwei bis dreifache Menge resistenter Pflanzen gegenüber sensitiven Pflanzen bestimmt wurden. Dieses Verhältnis ist indikativ für einen einzelnen Integrationsort, der die Resistenz bewirkt.

Beispiel 1

Identifizierung und Analyse der Linie P9, die für eine letale Mutation segregiert

Die Linie P9 (siehe SEQ ID NO: 3) wurde wie oben beschrieben als Linie, die für eine keimlingslethale Mutation segregiert, identifiziert. Die genaue Auszählung der Spaltung ergab, dass 25% der Nachkommen den Albinophänotyp, 25% der Nachkommen Sensitivität gegenüber der Selektion und 50% der Nachkommen Resistenz gegenüber der Selektion zeigten. Dieses Spaltungsverhältnis wird erwartet, wenn ausschließlich die homozygot resistenten Keimlinge homozygot für die Mutation sind somit den recessiven Phänotyp zeigen, daher die T-DNA-Insertion mit der lethalen Mutation sehr eng gekoppelt ist. Die Kopplung wurde weiterhin in einer Cosegregationsanalyse überprüft. Dazu wurden von 34 wildtypischen, resistenten Pflanzen der Linie P9 die Nachkommen analysiert. In allen Fällen konnten wiederum Albinos in der Nachkommenschaft gefunden werden. Dieser Umstand lässt den Schluss zu, dass die Resistenz-vermittelnde T-DNA-Insertion und die Mutation immer zusammen vererbt werden und damit (mit sehr hoher Wahrscheinlichkeit) übereinstimmen. Daraufhin wurde die Linie molakularbiologisch untersucht, um den T-DNA-Integrationsort genau zu bestimmen. Dazu wurde aus ca. 50 mg Gewebe dieser Pflanren genomische DNA mittels Standardprodukten und Methoden (Säulen der Firma Qiagen, Hilden, Germany, oder Phytopure-Kit dar Firma Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany) isoliert und anhand gelelektrophoretischer Auftrennung auf Integrität und Menge hin untersucht. Die Amplifikation der zu der T-DNA benachbarten genomischen Sequenzen erfolgte mittels eines modifizierten Adaptor-PCR-Protokolls (Spertini et al., 1999). Etwa 50 bis 100 ng der DNA wurden jeweils für eine kombinierte Restriktion und Adaptorligation mit den Restriktionsenzymen, BglII, MunI, Spel, PspI406I/BspI991, AflII und dem aus den annealten Oligos 5'CTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAGCGGCCGGGCAGGT-3' und 5'NN (_2-4) AC- CTGCCCAA-3' bestehenden Adaptor', wobei 5'NN(_2-4), den zur jeweiligen Enzym passenden Überhang repräsentieren, unterworfen. Ein µl dieser mit Adaptoren versehenen genomischen DNA wurde für eine Amplifikation der zu den T-DNAs flankierend liegenden Sequenzen unter Verwendung eines adaptorspezifischen (5'GGATC- CTAATACGACTCACTATAGGGC-3' und eines genspezifischen Primers (LB1: 5'TGACGCCATTTCGCCTTTTCA-3' für die "Left border" und RB 1: 5'CAACTTAATCGCCTTGCAGCACA-3' für die "Right bordet') eingesetzt. Die PCR wurde unter Standardbedingungen für 7 Zyklen bei einer Annealingtemperatur von 72°C und für 32 bei einer Annealingtemperatur von 65°C in 25 µl Reaktionsvolumen durchgeführt. Das erhaltene Amplifikat wurde 1 : 50 in H₂O verdünnt und ein µl dieser Verdünnung für eine Zweite Amplifikationsrunde (5' Zyklen bei einer Annealing-Temperatur von 67°C und 28 Zyklen bei einer Annealingtemperatur von 60°C ansonsten Standard-PCR-Bedingungen) eingesetzt: Hierzu werden "eingerückte" daher auf dem PCR-Produkt weiter innenliegende Primer (5'-TATAGGGCTCGAGCGGC-3' für den Adaptor, LB2: 5'CAGAAATGGATAAATAGCCTTGCTTCC-3' für die "Left border" und RH2: 5'AGCTGGCGTAATAGCGAAGAG-3' für die "Right border") eingesetzt, wodurch die Spezifität und Selektivität der Amplifikation erhöht wird. Von dem in 50 µl Reaktionsvolumen erhaltenen Amplifikaten wurde ein Aliquot einer gelelektrophoretischen Analyse unterzogen. Für die Linie P9 wurde für die Enzymkombination Pspl406I/BspII9I ein 1350 bp-großes Fragment für die linke T-DNABorder und ein 750 bp-großes Fragment für die rechte Border identifiziert. Die Produkte wurden mittels der Primer RBseq und Lbseq (5'-CAATACATTACACTAGCATCTG-3') sequenziert. Beide Produkte identifizierten den identischen Bereich im Genom von Arabidopsis. Die erfolgreiche Identifizierung wurde durch eine PCR-Reaktion mit einem für die abgeleitete flankierenden Sequenz und einem für die T-DNA-spezifischen Primer, RBl verifiziert. Der Erhalt des PCR-Produkts der vorhergesagten Größe spezifisch für diese Linie bestätigte die erfolgreiche Identifi- zierung der Insertionsstelle der T-DNA. Die Blast-Analyse der isolierten Sequenzen (BLASTN, Altschul et al., 1990) Mol. Biol. 215: 403-410) demonstrierte die Insertion der linken Borier in Position 53498 und der rechten Border in Position 54283 das Klons MVII1 des Chromosoms 111 (EMBL|AP000419). In diesem Bereich ist ein ORF (MVI11.13) annotiert, der für ein "DNA Repair protein RAD-54-like"-Protein kodiert. Dieser durch die Insertion unterbrochene ORF zeigt eine hohe Homologie zu dem DNA Repair Protein RHP54 aus Hefe (Muris et al., J. Cell. Bei., 1996) sowie Ähnlichkeiten zu einer Reihe weiterer DNA-bindender Proteine.

Beispiel 2

Identifizierung und Analyse der Linie P38, die für eine letale Mutation segregiert

Die Linie P38 wurde wie oben beschrieben als Linie, die für eine keimlingslethale Mutation segregiert, identifiziert. Die genaue Auszählung der Spaltung ergab, dass 25% der Nachkommen den Albinophänotyp, 25% der Nachkommen Sensitivität gegenüber der Selektion und 50% der Nachkommen Resistenz gegenüber der Selektion zeigten. Dieses Spaltungsverhältnis wird erwartet, wenn ausschließlich die homozygot resistenten Keimlinge den Phänotyp zeigen, daher die T-DNA-Insertion mit der lethalen Mutation sehr eng gekoppelt ist. Mit der Cosegregationsanalyse soll die Kopplung weiterhin überprüft werden. Dazu wurden von 34 wildtypischen, resistenten Pflanzen der Linie P38 die Nachkommen analysiert. In allen Fällen konnten wiederum Albinos in der Nachkommenschaft gefunden werden. Dieser Umstand lässt den Schluss zu, dass die Resistenz-vermittelnde T-DNA-Insertion und die Mutation immer zusammen vererbt werden und damit (mit sehr hoher Wahrscheinlichkeit) übereinstimmen. Die molekularbiologische Analyse wurde wie für Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Für die Linie P38 wurde für das Enzym MunI ein 350 bp-großes Fragment für die linke T-DNA-Border identifiziert. Das Produkt wurde mittels der Primer Lbseq sequenziert und zeigte die erwartete Identität zu einem Bereich des Arabidopsis-Genoms. Die erfolgreiche Identifizierung wurde durch eine PCR-Reaktion mit einem für die abgeleitete flankierenden Sequenz und einem für die T-DNA-spezifischen Primer, LB1, verifiziert. Der Erhalt des PCR- Produkts der vorhergesagten Größe spezifisch für diese Linie bestätigte die erfolgreiche Identifizierung der Insertionsstelle der T-DNA. Die Blast-Analyse der isolierten Sequenz (BLASTN, Altschul et al., 1990) J Mol. Biol. 215: 403-410) demonstrierte die Insertion der T-DNA in Position 42163 des BAC-Klons F3E22 des Chromosoms 111 (EMBLNEW|AC023912). Nach der Annotation dieses Bereichs ist die Integration in einen vorhergesagten ORF (F3E22.13), der signifikante Ähnlichkeit zu verschiedenen Thioredoxinen neigt, erfolgt. Daraufhin wurden Primer für das vorhergesagte 5'- und 3'-Ende synthetisiert und für eine Standard-PCR mit cDNA von Arabidopsis eingesetzt. Die mRNA wurde mittels Oligo-dT Dynabeads von Dynal aus Keimlingen isoliert, dia cDNA daraus unter Verwendung eines cDNA-Synthese-Kits der Firma Gibco-BRL und einem Oligo-dT-Primen hergestellt. Das erhaltene PCR-Produkt wurde in einen TA-Vektor (pCRScriptll, Invitrogen) ligiert und sequenziert. Die Sequenz zeigte vollständige Übereinstimmung mit der vorhergesagten Sequenz und Genstruktur für diesen ORF. Demnach dokumentieren die Erfinder hiermit erstmals die experimentelle Bestätigung für die Existenz dieses ORFs in der vorhergesagten Struktur.

Beispiel 3

Identifizierung und Analyse der Linie P44 die für eine letale Mutation segregiert

Die Linie P44 wurde wie oben beschrieben als Linie, die für eine keimlingslethale Mutation segregiert, identifiziert. Die genaue Auszählung der Spaltung ergab, dass 25% der Nachkommen den Albinophänotyp, 25% der Nachkommen Sensitivität gegenüber der Selektion und 50% der Nachkommen Resistenz gegenüber der Selektion zeigten. Dieses Spaltungsverhältnis wird erwartet, wenn ausschließlich die homozygot resistenten Keimlinge den Phänotyp zeigen, daher die T-DNA-Insertion mit der lethalen Mutation sehr eng gekoppelt ist. Die Kopplung wurde weiterhin in einer Cosegregationsanalyse überprüft. Dazu wurden von 34 wildtypischen, resistenten Pflanzen der Linie P44 die Nachkommen analysiert. In allen Fällen konnten wiederum Albinos in der Nachkommenschaft gefunden werden. Dieser Umstand lässt den Schluss zu, dass die Resistenz-vermittelnde T-DNA-Insertion und die Mutation immer zusammen vererbt werden und damit (mit sehr hoher Wahrscheinlichkeit) übereinstimmen. Die molekularbiologische Analyse wurde wie für Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Für die Linie F44 wurde tUr das Enzym MunI ein 350 bp-großes und für das Enzym EglII ein 500 bp-großes Fragment jeweils für die linke T-DNA-Borden identifiziert. Die Produkte wurden mittels des Primers Lbseq sequenziert und definierten die identische Position im Arabidopsis- Genom. Die erfolgreiche Identifizierung wurde durch eine PCR-Reaktion reit einem für die abgeleitete flankierenden Sequenz und einem für die T-DNA-spezifischen Primen, LB1, verifiziert. Der Erhalt des PCR-Produkts der vorhergesagten Grölte spezifisch für diese Linie bestätigte die erfolgreiche Identifizierung der Insertionsstelle der T-DNA. Die Blast-Analyse der isolierten Sequenz (BLASTN, Altschul et al., 1990) J Ntol. Biol. 215: 403-410) demonstrierte die Insertion der T-DNA in Position 66762 des TAC- Klons K15C23 (EMBLALERT|AB024024). Nach der Annotation dieses Bereichs ist die Integration in einen vorhergesagten ORF (K15C23.10) erfolgt, dessen abgeleitete Aminosäuresequenz keine signifikanten Homologien zeigt. Schwache Homologien findet man dagegen zu VAV2 Proteine aus Maus (Accesssion Q60992) und Mensch (Accession: P52735). Daraufhin wurden Primer für das vorhergesagte 5'- und 3'- Ende des ORFs synthetisiert und für eine Standard-PCR mit cDNA von Arabidopsis eingesetzt. Die cDNA wurde wie in Beispiel 3 beschrieben hergestellt. Die Sequenz zeigte vollständige Übereinstimmung mit der vorhergesagten Sequenz und Genstruktur für diesen ORF. Demnach dokumentieren die Erfinder hiermit erstmals die experimentelle Bestätigung für die Existenz dieses ORFs in der vorhergesagten Struktur.

Beispiel 4

Identifizierung und Analyse der Linie P77, die für eine letale Mutation segregiert

Die Linie P77 wurde wie oben beschrieben als Linie, die für eine keimlingslethale Mutation segregiert, identifiziert. Die genaue Auszählung der Spaltung ergab, dass 25% der Nachkommen den Albinophänotyp, 25% der Nachkommen Sensitivität gegenüber der Selektion und 50% der Nachkommen Resistenz gegenüber der Selektion zeigten. Dieses Spaltungsverhältnis wird erwartet, wenn ausschließlich die homozygot resistenten Keimlinge den Phänotyp zeigen, daher die T-DNA-Insertion mit der lethalen Mutation sehr eng gekoppelt ist. Die Kopplung wurde weiterhin in einer Cosegregationsanalyse überprüft. Dazu wurden von 34 wildtypischen, resistenten Pflanzen der Linie P77 die Nachkommen analysiert. In allen Fällen konnten wiederum Albinos in der Nachkommenschaft gefunden werden. Dieser Umstand lässt den Schluss zu, dass die Resistenz-vermittelnde T-DNA-Insertion und die Mutation immer zusammen vererbt werden und damit (mit sehr hoher Wahrscheinlichkeit) übereinstimmen. Die molekularbiologische Analyse wurde wie für Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Für die Linie P77 wurde für die Enzymkombination Psp14061/Bsp119I ein 650 bp-großes und für die linke T-DNA-Border identifiziert. Die Produkte wurden mittels des Primers Lbseq sequenziert. Die erfolgreiche Identifizierung wurde durch eine PCR-Reaktion mit einem für die abgeleitete flankierenden Sequenz und einem für die T-DNA-spezifischen Primer, LBI, verifiziert. Der Erhalt des PCR- Produkts der vorhergesagten Größe spezifisch für diese Linie bestätigte die erfolgreiche Identifizierung der Insertionsstelle der T-DNA. Die Blast-Analyse der isolierten Sequenz (BLASTN, Altschul et al., 1990) J Mol. Biol. 215: 403-410) zeigte eine absolute Übereinstimmung der Sequenz mit einem Abschnitt auf dem Chromosom III von Arabidopsis und demonstrierte die Insertion der T-DNA in Position 13436 des BAC-Klons F24B22 (EMBLATF24B22) und unterbricht ein vorhergesagtes offenes Lesesraster (F24B22.50), welches für ein Protein mit hoher Ähnlichkeit zu verschiedenen Fructokinases bspw. aus Kartoffel (Solanun tuberosum, Acession: P37829) oder aus dem Bakterium Vibrio alginolyticus (Acession: P22824) kodiert. Daraufhin wurden Primer für das vorhergesagte 5'- und 3'- Ende des ORFs synthetisiert und für eine Standard-PCR mit cDNA von Arabidopsis eingesetzt. Die cDNA wurde wie in Beispiel 3 beschrieben hergestellt. Die Sequenz zeigte vollständige Übereinstimmung mit der vorhergesagten Sequenz und Genstruktur für diesen ORF. Demnach dokumentieren die Erfinder hiermit erstmals die experimentelle Bestätigung für die Existenz dieses ORFs in der vorhergesagten Struktur.

Beispiel 5

Identifizierung und Analyse der Linien P95, P98, P99b, P102 und P103, die für eine letale Mutation segregieren

Analog den vorgenannten Beispielen 1 bis 4 wurden die Klone P95, P98, P99b, P102 und P103 als Linien identifiziert, die für keimlingslethale Mutationen segregieren. Die molekularbiologischen Arbeiten bzw. Analysen wurden wie unter Beispiel 1 bis 4 beschrieben durchgeführt.
Bei der Linie P95 erfolgte die Insertion der T-DNA in Position 35442 des BACT5L19 (Accession number AL049481) des Chrornosoms IV von Arabidopsis. Die Insertion der T-DNA erfolgte bei der Linie P98 in Position 54861 des P1-Klons MVA3 (Accession number: AB006706) des Chromosoms V. Die Insertion der T-DNA wurde bei der Linie P99b in Position 66042 des BACs F10M10 (AL035521) auf Chromosom IV lokalisiert. Bei Klon P102 wurde die Insertion der T-DNA auf Chromosom IV im Bereich des Contigfragments 69 in Position 46342-46355 (AL 161573) lokalisiert. Die Linie P103 wies eine Insertion der T-DNA in Position 57314 des BACs F11F8 (AC016661) des Chromosoms I auf.

Beispiel 6

Identifizierung und Analyse der Linien P91 und P99a, die für eine letale Mutation segregieren

Analog den vorgenannten Beispielen wurden die Klone P91 und P99a als Linien identifiziert, die für keimlingslethale Mutationen segregieren. Die molekularbiologischen Analysen wurden wie unter den Beispielen 1 bis 4 beschrieben, durchgeführt.

Beispiel 7

Analog zu den vorgenannten Beispielen wurde die Linie; 300364 (Seq ID NO.: 26 und 27) identifiziert. Linie A300364 spaltet für eine embroyletale Mutation. Es wurde eine 2 : 1 Spaltung beobachtet. Bei der Untersuchung von 35 Linien wurde eine absolute Cosegregation zwischen der T-DNA und der zum Albinophänotyp führenden Mutation beobachtet. In dieser Linien ist die T-DNA in Position 39517 des Chromosoms II (EMBL|AC004238) inseriert. Dort unterbricht und damit inaktiviert die Insertion einen ORF (At2g34860), der für ein unbekanntes Protein (AAC12826.1) kodiert. In Blastp-Vergleichen mit Standardeinstellungen zeigt das Protein über einen Bereich von 40 Aminosäuren Homologie zu verschiedenen DNAJ Chaperon-Protein (Heat Shock Protein 40) bspw. dem DNAJ Protein (Q9UXR9) aus Methanosarcina thermophila (Hoffmann-Bang et al., Gene 238 (2), 387-395 (1999)).

Beispiel 8

Analog zu den vorgenannten Beispielen wurden die Linie A301034 (Seq ID NO.: 28 und 29) identifiziert. Linie A301034 spaltet für eine embroyletale Mutation. Es wurde eine 2 : 1 Spaltung beobachtet. Bei der Untersuchung von 35 Linien wurde eine absolute Cosegregation zwischen der T-DNA und der zum Albinophänotyp führenden Mutation beobachtet. Die T-DNA ist auf Chromosom V in Position 25928 des BACs T21H19 (EMBL|ATT21H19) inseriert. Die Insertion an dieser Stelle unterbricht ein Gen (T21H19_100), welches für ein putatives Protein (CAC01859.1) koderiert. Dieses zeigt Homologie zu anderen putativen Proteinen aus Arabiaopsis. Die abgeleitete Proteinsequenz zeigt deutliche Homologien zum CRS1 Genprodukt aus Mais (AAG00595), welches für das Splicen des Gruppe II Introns des Chloroplastengens atpF benötigt wird. Seq ID NO.: 43 zeigt die genomische Sequenz der Linie A301034 vom Start- bis Stopcodon, inklusive Introns.
Die Aktivität kann z. B. in Assays, wie sie in Bock, Nucleic Acids Res., 1995, 23, 2544-7 beschrieben sind, getestet werden.

Beispiel 9

Analog zu den vorgenannten Beispielen wurden die Linie A300377 (Seq ID. NO: 30 und 31) identifiziert. Linie A300377 spaltet für eine embroyletale Mutation. Es wurde eine 2 : 1 Spaltung beobachtet. Bei der Untersuchung von 35 Linien wurde eine absolute Cosegregation zwischen der T-DNA und der zum Albinophänotyp führenden Mutation beobachtet. Die T-DNA ist in Position 14509 des P1 Klons MRN17 (AB005243) und damit sehr wahrscheinlich im 3'-nicht translatierten Bereich einer Alanyl-tRNA-Syntethase (BAB10601.1) inseriert.

Beispiel 10

Analog zu den vorgenannten Beispielen wurden die Linie 1300841 (Seq ID. NO: 32 und 33) identifiziert. Linie A300841 spaltet für eine embryoletale Mutation. Es wurde eine 2 : 1 Spaltung beobachtet. Bei der Untersuchung von 35 Linien wurde eine absolute Cosegregation zwischen der T-DNA und der zum Albinophänotyp führenden Mutation beobachtet. Die T-DNA ist in dieser Linie in Position 3183 des BACs T14P8 inseriert, was der Position 143432 in Contigfragment 6 des Chromosoms IV entspricht. Durch die Insertion in dieser Position wird ein offenes Leseraster für ein putatives "chloroplast outer envelope 86-like" Protein zerstört. Für diesen ORF (CAB80744.1) sind bereits ESTs in den Datenbanken vorhanden (EST gb:AI998804.1, R90258, AA651438). Das kodierte Protein zeigt eine stark Homologie zu dem "chloroplast outer envelope 86 protein" OEP86 aus Erbse P. sativum, GenBank Accessionnummer Z31581 und besitzt ein ATP/GTP-Bindungsstellenmotiv (P-loop).
Die Aktivität eines OEP86 kann z. B. wie in Muckel, J. Biol. Chem., 1996, 271, 23846-52, Young, Plant Physiol., 1999, 121, 237-44, oder in dem Review Keegstra, Curr. Opin. Plant Biol., 1999, 2, 471-6, beschriebenen oder zitierten Assays getestet werden.

Beispiel 11

Analog zu den vorgenannten Beispielen wurden die Linie 2266c (Seq. ID. NO: 34 und 35) identifiziert. Linie 2266c spaltet für eine embryoletale Mutation. Es kann eine 2 : 1 Spaltung beobachtet werden. Die T-DNA ist in Position 26501 des BAC F6N18 (AC017118) des Chromosoms I inseriert. Dort unterbricht die Insertion einen ORF, dessen abgeleitete Aminosäuresequenz (AAF25967.1) deutliche Ähnlichkeit zu einem "FMRF-Amid Propeptid-Isolog (gi|1871179) aus Arabidopsis zeigt.

Beispiel 12

Analog zu den vorgenannten Beispielen wurden die Linie P61 (Seq. ID. NO: 36 und 37) identifiziert. Linie P61 spaltet für eine embryoletale Mutation. Es wurde eine 2 : 1 Spaltung beobachtet. Bei der Untersuchung von 35 Linien wurde eine absolute Cosegregation zwischen der T-DNA und der zum Albinophänotyp führenden Mutation beobachtet. Die T-DNA ist in Position 28640 des BACs F4B12 (EMBLNEW|AP001299) auf Chromosom III inseriert. Die Insertion unterbindet die Expression eines ORFs, der in Position 28705 beginnt und für ein unbekanntes Protein (BAB02572.1) mit schwacher Homologie zu Proteosomenprotein 26S PROTEASOME SUBUNIT S5B, (Deveraux,Q., Jensen, C, and Rechsteiner, M., Molecular cloning and expression of a 26 S protease subunit enriched in dileucine repeats, J. Biol. Chem. 270 (40), 23726-23729 (1995) kodiert.

Beispiel 13

Analog zu den vorgenannten Beispielen wurde die Linie A300857 (Seq. ID. NO: 38 und 39) identifiziert. A300857 spaltet für eine embroyletale Mutation. Bei der Untersuchung von 35 Linien wurde eine absolute Cosegregation zwischen der T-DNA und der zum Albinophänotyp führenden Mutation beobachtet. In dieser Linie ist die T-DNA in Position 51122 des BACs T10024 des Chromosoms I (EMBL:AC007067) inseriert. Dort unterbricht und damit inaktiviert die Insertion einen ORF (T10O24,14) der für ein unbekanntes Protein (AAD39574.1) kodiert. Seq. ID. NO: 42 zeigt die zugehörige genomische Sequenz.

Beispiel 14

Analog zu den vorgenannten Beispielen wurde die Linie A300367 (Seq. ID. NO. 40 und 41) identifiziert. A300367 spaltet für eine embroyletale Mutation. Bei der Untersuchung von 35 Linien wurde eine absolute Cosegregation zwischen der T-DNA und der zum Albinophänotyp führenden Mutation beobachtet. In dieser Linie ist die T-DNA in Position 31058 "Contig fragments" 86 (EMBL:AT- CHRIV86) des Chromosoms IV inseriert. Durch die Insertion wenige Basenpaare stromaufwärts des Startcodons (51073) einer Geranylgeranylpyrophosphatsynthase (Bartley and Scolnik, 1994) (Plant Physiol. 104, 1469-1470, 1994), Accession L25813 wird mit sehr hoher Wahrscheinlichkeit die Funktionalität des Gens durch Störung der Transkription, der Transkriptstabilität oder zumindest der Translation zerstört. So beschreibt Okada, Plant Physiol., 2000, 122, 1045-56, in Arabidopsis fünf verschiedene GGPPs, die in drei verschiedenen Kompartimenten lokalisiert sind. Überraschenderweise ist die hier gezeigte GGPP essentiell.
Die Aktivität einer Geranylgeranylpyrophosphatsynthase kann z. B. wie in Zhu et al., Plant Cell Physiol., 1997, 38, 337-61, oder Okada, Plant Physiol., 2000, 122, 1045-56, beschriebenen Testsystemen getestet werden. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. Verfahren zur Identifizierung von Substanzen mit herbizider Wirkung, dadurch gekennzeichnet, dass:

a) die Expression oder die Aktivität des Genprodukts einer Nukleinsäure oder eines Gens umfassend:

a) Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38 oder SEQ ID NO: 40 dargestellten Sequenz; oder

b) Nukleinsäuresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes aus den durch Rückübersetzung der in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39 oder SEQ ID NO: 41 dargestellten Aminosäuresequenzen ableiten lässt;

c) Nukleinsäuresequenz, die ein Derivat oder ein Fragment der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38 oder SEQ ID NO: 40 dargestellten Nukleinsäuresequenzen ist, und mindestens 60% Homologie auf Nukleinsäureebene aufweist;

d) Nukleinsäuresequenz, die für Derivate oder Fragmente der Polypeptide mit den in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39 oder SEQ ID NO: 41 dargestellten Aminosäuresequenzen codiert, die mindestens 50% Homologie auf Aminosäureebene aufweisen;

e) Nukleinsäuresequenz, die für ein Fragment oder ein Epitope eines Polypeptides codiert, das spezifisch an einem Antikörper bindet, wobei der Antikörper spezifisch an ein Polypeptid bindet, das von der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38 oder SEQ ID NO: 40 dargestellten Sequenz codiert wird;

f) Nukleinsäuresequenz, die für ein Fragment einer in aa) dargestellten Nukleinsäure codiert und das eine m6A-Methyltransferase-Aktivität, eine DNA- bindende-Aktivität oder "DNA-repair"-Aktivität, z. B. wie bei RAD 54, eine Thioredoxin-Aktivität, eine VAV2-Aktivität, eine Fructokinase-Aktivität, eine Zinkfingerprotein-Aktivität, eine LYTB-Aktivität, eine Crepopin-Aktivität, eine Leucin-Protein- Aktivität, eine DNAJ-Aktivität, ein CRS1-Aktivität, eine Alanyl-tRNA-Synthetase-Aktivität, eine OEP86-Aktivität, eine FMRF-Amid-Propeptid-Isolog- Aktivität, eine 26S Proteosom subunit S5B-Aktivität oder eine Geranylgeranylpyrophosphatsynthase- Aktivität hat; und/oder

g) Nukleinsäuresequenz, die für Derivate der Polypeptide mit den in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39 oder SEQ ID NO: 41 dargestellten Aminosäuresequenzen codiert, die mindestens 20% Homologie auf Aminosäureebene aufweist und eine äquivalente biologische Aktivität besitzt; oder

b) die Expression oder Aktivität einer Aminosäuresequenz, die von einer Nukleinsäuresequenz nach aa) bis gg) kodiert wird,

beeinflusst wird und solche Substanzen ausgewählt werden, die die Expression oder die Aktivität reduzieren oder blockieren.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Expression oder die Aktivität der Nukleinsäure oder Aminosäure dadurch reduziert oder blockiert wird, dass die

a) Transcription,

b) Translation,

c) Prozessierung und/oder

d) Modifikation

der Nukleinsäuresequenz oder Aminosäuresequenz in Anspruch 1 reduziert oder blockiert wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Identifizierung der Substanzen in einem High- Throughput-Screening (HTS) durchgeführt wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass man die ausgewählten Substanzen auf eine Pflanze verbringt, um die herbizide Aktivität der Substanzen zu testen und die Substanzen auswählt, die eine herbizide Aktivität zeigen.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren in einem Organismus durchgeführt wird.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass als Organismus Bakterien, Hefen, Pilze oder Pflanzen verwendet werden.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass ein Organismus verwendet wird, der eine konditionale oder natürliche Mutante einer der in Anspruch 1 beschriebenen Sequenzen ist.

8. Nukleinsäurekonstrukt enthaltend eine Nukleinsäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe:

a) Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38 oder SEQ ID NO: 40 dargestellten Sequenz, oder

b) Nukleinsäuresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes aus den durch Rückübersetzung der in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39 oder SEQ ID NO: 41 dargestellten Aminosäuresequenzen ableiten lässt,

c) Nukleinsäuresequenz, die ein Derivate der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38 oder SEQ ID NO: 40 dargestellten Nukleinsäuresequenzen ist, und mindestens 60% Homologie auf Nukleinsäureebene aufweist;

d) Nukleinsäuresequenz, die für Derivate der Polypeptide mit den in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39 oder SEQ ID NO: 41 dargestellten Aminosäuresequenzen codiert, die mindestens 50% Homologie auf Aminosäureebene aufweisen;

e) Nukleinsäuresequenz, die für ein Fragment oder ein Epitope eines Polypeptides codiert, das spezifisch an einem Antikörper bindet, wobei der Antikörper spezifisch an ein Polypeptid bindet, das der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38 oder SEQ ID NO: 40 dargestellten Sequenz codiert wird; und/oder

f) Nukleinsäuresequenz, die für ein Fragment einer in aa) dargestellten Nukleinsäure codiert, und das eine m6A-Methyltransferase-Aktivität, eine DNA-bindende- Aktivität oder "DNA-repair"-Aktivität, z. B. wie bei RAD 54, eine Thioredoxin-Aktivität, eine VAV2-Aktivität, eine Fructokinase-Aktivität, eine Zinkfingerprotein- Aktivität, eine LYTB-Aktivität, eine Crepopin-Aktivität, eine Leucin-Protein-Aktivität, eine DNAJ-Aktivität, ein CRS1-Aktivität, eine Alanyl-tRNA-Synthetase- Aktivität, eine OEP86-Aktivität, eine FMRF-Amid- Propeptid-Isolog-Aktivität, eine 26S Proteosom subunit S5B-Aktivität oder eine Geranylgeranylpyrophosphatsynthase-Aktivität hat; und/oder

wobei die Nukleinsäuresequenz mit einem oder mehreren Regulationssignalen verknüpft ist.

9. Substanz identifiziert nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Substanz ein Molekulargewicht von kleiner 1000 Dalton, einem Ki-Wert kleiner 1 mM und weniger als drei Hydroxylgruppen an einem Kohlenstoffatom- enthaltenden Ring hat.

10. Substanz identifiziert nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei es sich bei der Substanz um eine proteinogene Substanz oder um eine Antisense-RNA handelt.

11. Substanz nach Anspruch 10, wobei es sich um einen Antikörper gegen das durch eine der in Anspruch 8 dargestellten Sequenz kodiertes Protein handelt.

12. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 8, wobei im Nukleinsäurekonstrukt zusätzliche weitere Nukleinsäuresequenzen enthalten sind.

13. Vektor enthaltend ein Nukleinsäurekonstrukt gemäß Anspruch 8 oder 12.

14. Organismus enthaltend mindestens ein Nukleinsäurekonstrukt gemäß Anspruch 8 oder 12 oder mindestens einen Vektor gemäß Anspruch 13.

15. Organismus nach Anspruch 14, wobei es sich bei dem Organismus um eine Pflanze, einen Mikroorganismus oder ein Tier handelt.

16. Transgene Pflanze enthaltend ein funktionelles oder nicht funktionelles Nukleinsäurekonstrukt gemäß Anspruch 8 oder 12 oder einen Vektor gemäß Anspruch 13.

17. Verwendung eines Nukleinsäurekonstrukt gemäß Anspruch 8 oder 12 oder eines Vektors gemäß Anspruche 13 zur Herstellung von transgenen Pflanzen.

18. Verfahren zur Identifikation eines Antagonisten von Proteinen, die durch eine Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 8 oder 12 kodiert werden indem folgende Verfahrensschritte durchlaufen werden

a) Inkontaktbringen von Zellen, die das Protein exprimieren, oder des Proteins mit einem Kandidatenstoff;

b) Testen der biologischen Aktivität des Proteins;

c) Vergleichen der biologischen Aktivität des Proteins mit einer Standardaktivität in Abwesenheit des Kandidatenstoffs, wobei eine Verringerung der biologischen Aktivität des Proteins anzeigt, dass der Kandidatenstoff ein Antagonist ist.

19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass man den nach Anspruch 18 Buchstabe iii) identifizierten Antagonisten auf eine Pflanze verbringt, um seine herbizide Aktivität zu testen und die Antagonisten auswählt, die eine herbizide Aktivität zeigen.

20. Verfahren zur Bekämpfung unerwünschten Pflanzenwuchses, dadurch gekennzeichnet, dass man eine herbizid wirksame Menge einer Substanz identifiziert nach einem Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 7 oder eines Antagonisten identifiziert nach einem Verfahren gemäß Anspruch 18 oder 19 auf Pflanzen oder deren Lebensraum oder auf Pflanzen und deren Lebensraum einwirken lässt.

21. Verwendung einer Substanz identifiziert nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7 oder eines Antagonisten identifiziert nach einem Verfahren gemäß Anspruch 18 oder 19 als Herbizid oder zur Wachstumsregulierung von Pflanzen.

22. Verfahren zur Erzeugung veränderter Genprodukte, die von den Nukleinsäuresequenzen SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38 oder SEQ ID NO: 40 codiert werden, dadurch gekennzeichnet, dass es folgende Prozessschritte umfasst:

a) Expression der von den SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38 oder SEQ ID NO: 40 kodierten Proteine in einem heterologen System oder in einem Zellfreien System

b) Randomisierte oder gerichtete Mutagenese des Proteins durch Modifikation der Nukleinsäure,

c) Messung der Interaktion des veränderten Genprodukts mit dem Herbizid oder der biologischen Aktivität des veränderten Genproduktes in Gegenwart des Herbizids,

d) Identifizierung von Derivaten des Proteins die eine geringere Interaktion aufweisen oder in ihrer Aktivität weniger beeinflusst sind,

e) Testung der biologischen Aktivität des Proteins nach Applikation des Herbizides,

f) Auswahl der Nukleinsäuresequenzen, die oder deren Genprodukte eine veränderte biologische Aktivität gegenüber dem Herbizid aufweisen.

23. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass die gemäß Anspruch 22f) ausgewählten Sequenzen in einen Organismus eingebracht werden.

24. Verfahren zur Erzeugung transgener Pflanzen, die gegen Substanzen gefunden nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7 oder einem Verfahren gemäß Anspruch 18 oder 19 resistent sind, dadurch gekennzeichnet, dass in diesen Pflanzen Nukleinsäuren mit den in Anspruch 1 beschriebenen Sequenzen überexprimiert werden.

25. Organismus hergestellt nach einem Verfahren gemäß Anspruch 22 oder 23 oder einem Verfahren gemäß Anspruch 24.

26. Mittel, enthaltend eine herbizid wirksame Menge mindestens einer Substanz identifiziert nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7 oder eines Antagonisten identifiziert nach einem Verfahren gemäß Anspruch 18 oder 19 und mindestens einen inerten flüssigen und/oder festen Trägerstoff sowie gegebenenfalls mindestens einen oberflächenaktiven Stoff.

27. Mittel, enthaltend eine das Wachstum regulierende Menge mindestens einer Substanz identifiziert nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7 oder eines Antagonisten identifiziert nach einem Verfahren gemäß Anspruch 18 oder 19 und mindestens einen inerten flüssigen und/oder festen Trägerstoff sowie gegebenenfalls mindestens einen oberflächenaktiven Stoff.

28. Zusammensetzung, enthaltend die Substanz nach einem der Ansprüche 9 bis 11 oder einen Antagonisten identifiziert gemäß Anspruch 18.

29. Kit, umfassend das Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 8 oder 12, die Substanz nach einem der Ansprüche 9 bis 11, einen Antagonisten identifiziert gemäß Anspruch 18 oder die Zusammensetzung nach Anspruch 28.