CN104411157A - 植物中有关硝酸盐水平的转录因子及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本公开涉及植物氮源应答。实施方案涉及有助于对植物中的氮源和/或它们的代谢物的应答的调节因子。

Description

植物中有关硝酸盐水平的转录因子及其使用方法

优先权声明

本申请要求获得于2012年3月5日提交的“植物中有关硝酸盐水平的转录因子及其使用方法”的美国临时专利申请系列号61/606,852的申请日的利益。

技术领域

本公开涉及氮水平对植物中基因表达的影响。实施方案涉及有助于植物对环境中的含氮分子的应答的基因和由它们编码的调节因子。

背景

氮(N)是植物必需的大量营养素，其可得性是植物生长和作物产量的主要限制因素。硝酸盐(NO₃)是有氧土壤植物无机氮的主要来源。见，例如Crawford和Glass(1998)Trends Plant Sci.3:389-95；Hirsch和Sussman(1999)Trends Biotechnol.17:356-61。通过特异性转运蛋白，例如AtNRT1.1(Tsay et al.(1993)Cell 72:705-13)；AtNRT1.2(Huang et al.(1999)Plant Cell 11:1381-92)；AtNRT2.1(Little et al.(2005)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102:13693-8)；和AtNRT2.2(Li et al.(2007)Plant Physiol.143:425-33)，利用植物根系吸收硝酸盐。一旦进入根细胞，硝酸盐可分别通过硝酸盐还原酶(NR)和亚硝酸盐还原酶(NIR)的作用而被还原为亚硝酸盐(NO₂-),进而还原成铵盐(NH₄ ⁺)。Crawford和Glass(1998),同上。然后，通过谷氨酰胺合成酶(GS)和谷氨酸合成酶(GOGAT)循环，生成的铵盐被同化为谷氨酸和谷氨酰胺。Stitt(1999)Curr.Opin.Plant Biol.2:178-86。

在拟南芥中，硝酸盐用作营养素，还用作控制基因表达和发育应答的有力信号。Vidal和Gutierrez(2008)Curr.Opin.Plant Biol.11:521-9；Krouk etal.(2010a)Curr.Opin.Plant Biol.13:266-73；Tsay et al.(2011)Annu.Rev.PlantBiol.62:207-26。在拟南芥中，硝酸盐和亚硝酸盐可用作调节全局基因表达的信号。Wang et al.(2007)Plant Physiol.145:1735-45。关于亚硝酸盐的信号效应知之甚少，且特异性功能不与亚硝酸盐-应答基因相关联。然而已经提出，拟南芥根系中的硝酸盐-感测系统能识别亚硝酸盐和硝酸盐，因为这两种信号具有广泛的重叠应答。见上文.

拟南芥中的硝酸盐应答基因有数量繁多且种类多样，包括硝酸盐转运蛋白NR和NIR、转录因子、胁迫应答基因、涉及N/C平衡的碳(C)同化酶、以及其产物参与信号转导途径的基因。Vidal和Gutierrez(2008),同上；Krouk etal.(2010a),同上；Tsay et al.(2010)，同上。转录组学分析已经鉴定出许多拟南芥硝酸盐应答基因。Wang et al.(2003)Plant Physiol.132:556-7；Scheible etal.(2004)Plant Physiol.136:2483-99；Wang et al.(2004)Plant Physiol.136:2512-22；Gutierrez et al.(2007)Genome Biol.8:R7.然而，仅有少数涉及引起硝酸盐应答的调节因子已鉴定。

已经提出硝酸盐转运蛋白NRT1.1为拟南芥中的硝酸盐传感器。Ho et al.(2009)Cell 138:1184-94。另外，已经描述NIN样蛋白7转录因子涉及硝酸盐同化作用的调节(Castaings et al.(2009)Plant J.57:426-35)，而ANR1MADS盒基因已被鉴定为应答于外部硝酸盐的侧根生长的调节子(Zhang和Forde(1998)Science 279:407-9)。此外,发现一种类钙调磷酸酶B亚基(CBL)-互作蛋白激酶(CIPK)基因，CIPK8，涉及硝酸盐感测。Hu et al.(2009)Plant J.57:264-78。还有，发现抑制N应答基因的LBD37/38/39转录因子是硝酸盐摄取和同化所需要的。Rubin et al.(2009)Plant Cell 21:3567-84。更近来发现，硝酸盐应答性iR393/AFB3模块应答于拟南芥外部和内部N可得性而控制根系结构(Vidal etal.(2010b)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 107:4477-82)，并且有一种负责侧根结构控制的、由根中的谷氨酰胺导致的细胞特异性调节被归因于miR167/ARF8模块(Gifford et al.(2008)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 105:803-8)。

发明公开

本文中描述了新的氮应答调节因子TGA1和TGA4。TGA1和TGA4介导涉及氮摄取和还原的基因的表达的氮调节。在实施方案中，这些转录因子可以用来改变氮的吸收和同化，影响根组织的生长，和/或影响植物的生长和生产力。

在tga1/tga4双突变体中观察到初生根和侧根生长受到影响，表明在硝酸盐存在下促进根生长的积极作用。因此，在一些实施方案中，例如，在氮受到限制的条件下，可利用TGA1和/或TGA4来促进植物初生根和/或侧根的生长。

在tga1/tga4双突变体植物中，几乎所有(97％)被鉴定为在TGA1和TGA4的调节控制之下的基因都是被氮调节。因此，在一些实施方案中，可利用TGA1和/或TGA4应答于氮而基因(例如，在图5中鉴定的基因)的表达。例如，在特定的实施方案中，可利用TGA1和/或TGA4来影响硝酸盐转运蛋白NRT2.1、NRT2.2，和/或亚硝酸盐还原酶NIR的表达。在特定的实施方案中，可利用TGA1和/或TGA4来与TGA1或TGA4结合基序可操作连接的基因的表达。

在一些实施方案中，在本文中描述的方法中使用的TGA1多肽可包含选自SEQ ID NO:1-10的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1-10中的一者或多者享有序列同一性的同源物。在一些实施方案中，在本文中描述的方法中使用的TGA4多肽可包含选自SEQ ID NO:11-14的氨基酸序列或与SEQ ID NO:11-14中的一者或多者享有序列同一性的同源物。在一些实施方案中，在本文中描述的方法中使用的核酸可包含编码TGA1或TGA4多肽的核苷酸。

一些实施方案包括转基因植物或其后代，所述转基因植物或其后代包含异源TGA1多肽和/或TGA1编码核酸、和/或异源TGA4多肽和/或TGA4编码核酸。在特定的实施方案中,异源TGA1-和/或TGA4-编码核酸在转基因植物或其后代中表达。在某些实施方案中，其中该异源TGA1-和/或TGA4-编码核酸被表达的组织是根。根据一些实施方案的方法包括，使前述转基因植物或其子代在具有有限氮源的环境条件下生长。在一些实例中，包含异源TGA1和/或TGA4多肽和/或异源TGA1-和/或TGA4-编码核酸的转基因植物或后代在氮受限条件(例如，低氮条件)下展示出增强的生长和/或耐受。

一些实施方案包括用于产生其中初生根和/或侧根生长被促进的植物的方法。这种方法可以包括，例如但不限于，将TGA1-和/或TGA4-编码核酸(例如在载体中)导入植物、或其细胞或组织中；任选地培养所述细胞或组织以产生植物；和选择初生根和/或侧根生长被促进的植物。在一些实例中，选择的植物在氮受限条件下培养。

在一些实施方案中，在本文所述方法中使用的植物可以是拟南芥种类。在一些实施方案中，该植物可以选自下组：十字花科(Brassicaceae)；豆科(Fabaceae)；禾本科(Poaceae)；茄科(Solanaceae)；葡萄科(Vitaceae)；大戟科(Euphorbiaceae)；杨柳科(Salicaceae)；和桃金娘科(Myrtaceae)。通过任何上述方法获得的植物、植物材料、植物细胞、和种子也是特定实施方案的特征。

附图简要说明

图1包括TGA1和TGA4对硝酸盐和硝酸盐还原下游信号的应答的图解。图1A包括野生型“Col-0”植物中的TGA1的硝酸盐应答。图1B包括“Col-0”植物中的TGA4的硝酸盐应答。图1C包括NR缺失突变植物中的TGA1的硝酸盐应答。图1D包括NR缺失突变植物中的TGA4的硝酸盐应答。TGA1(E)和TGA4(F)基因的硝酸盐应答。TGA1(G)和TGA4(H)基因的铵应答。星号(*)指示在对照条件和处理条件之间显著不同的均值(P<0.05)。

图2包括与铵比较的TGA1和TGA4的亚硝酸盐应答的图解。图2A包括TGA1的亚硝酸盐应答。图2B包括TGA4的亚硝酸盐应答。图2C显示TGA1的铵应答的缺乏。图2D显示TGA4的铵应答的缺乏。星号(*)表示在对照条件和处理条件之间显著不同的均值(P<0.05)。

图3包括TGA1和TGA4应答于硝酸盐对初生根和侧根生长的影响的图解。图3A包括tga1/tga4植物和Col-0植物的初始(initiating)和萌发(emerging)侧根的数量。图3B包括Col-0、tga1、tga4、和tga1/tga4植物当用KNO₃或KCl处理时在第15天测量的初生根长度。条形代表标准差。不同的字母指示统计学差异均值(P<0.05)。

图4包括在中柱鞘细胞中TGA1和TGA4的硝酸盐调节的图解。图4A包括通过RT-qPCR测定的来自用KNO₃或KCl处理2小时的幼苗的中柱鞘细胞中TGA1mRNA的相对量。图4B包括通过RT-qPCR测定的来自用KNO₃或KCl处理2小时的幼苗的中柱鞘细胞中TGA4mRNA的相对量。所标绘的值为三个重复的均值±标准差。星号(*)指示在处理之间显著不同的均值(P<0.05)。

图5包括由TGA1/TGA4控制的硝酸盐应答基因网络的表示，包括在N代谢中涉及的基因。个体基因显示为三角形(转录因子)和正方形(靶基因)。绿色线条指示预测的转录激活，而红色线条指示预测的转录抑制。细线条指示在相应基因上游区域中的一个转录因子结合部位，而粗线条指示该结合部位的过度表现(over-representation)。箭头指示正调节，而在末端具有垂直线的边缘指示负调节。基于功能将节点进行颜色编码：发信号(紫色)；未知基因(白色)；胁迫应答(青色)；氮代谢(黄色)；和其他功能(灰色)。

图6包括TGA1和TGA4对NIR、NRT2.1和NRT2.2基因的硝酸盐依赖性上调的影响的图解。图6A包括在用KNO₃或KCl处理所指示的时间的Col-0和tga1/tga4植物中的NRT2.1mRNA转录物水平。图6B包括在用KNO₃或KCl处理所指示的时间的Col-0和tga1/tga4植物中的NRT2.2mRNA转录物水平。图6C包括在用KNO₃或KCl处理所指示的时间的Col-0和tga1/tga4植物中的NIRmRNA转录物水平。

图7包括TGA1以硝酸盐依赖方式与NRT2.1和NRT2.2启动子区结合的图解。使用抗TGA1免疫沉淀包含NRT2.1和NRT2.2启动子的DNA。使用非特异性IgG作为阴性对照。使用针对NRT2.1和NRT2.2启动子区设计的引物，通过定量PCR将免疫沉淀的启动子DNA定量。

图8展示，在chl1-5和chl1-9突变体中，应答于硝酸盐的TGA1和TGA4的表达受到影响。以1mM铵作为唯一氮源，以水培方式培养Col-0、chl1-5、chl1-9和T101D植物。在第15天的光周期开始时，用5mM KNO3或作为对照的5mM KCl处理植物所示的时间。分离RNA并通过RT-qPCR测量mRNA水平。使用网格蛋白基因(At4g24550)作为标准化参考。(A)TGA1转录物水平，(B)TGA4转录物水平。所标绘的值相应于三个独立生物重复的均值±标准差。星号指示在突变植物与野生型植物之间显著不同的均值(P<0.05)。

图9展示了在初生根的维管组织和侧根中表达的TGA1和TGA4。以1mM铵作为唯一氮源，以水培的方式培养pTGA1:GUS和pTGA4:GUS品系两周，用5mM KNO3或KCl处理两个小时，进行染色以测定GUS活性。5mM KNO3处理的pTGA1:GUS(A)、5mM KCl处理的pTGA1:GUS(B)、5mM KNO3处理的pTGA4:GUS(C)、以及5mM KCl处理的pTGA4:GUS(D)。用硝酸盐处理的pTGA1:GUS植物的初生根的成熟部分的横截面(E)以及从初生根萌发的侧根的纵截面(G)。来自用硝酸盐处理的pTGA4:GUS植物的初生根的成熟部分的横截面(F)以及侧根和初生根的纵截面(H)。(比例尺：0.1mm.)。在(E)和(F)上的数字表示：1为中柱，2为内皮层。在每种基因型的八个独立转基因品系中观察到相似的定位模式。

图10展示了以1mM铵作为唯一N源，以水培方式培养两周的表皮(Epi)、皮层、内皮层(Endo)、中柱鞘(Peri)和中柱GFP标记品系的TGA1和TGA4转录物水平，其中在第15天用5mM KNO3或5mM KCl处理幼苗2小时。

图11展示了NTR2.1、NRT2.2和NIR基因的由硝酸盐所致的细胞特异性调节。以1mM铵作为唯一N源，以水培方式培养表皮(Epi)、皮层、内皮层(Endo)、中柱鞘(Peri)和中柱GFP标记品系两周。在第15天的黎明，用5mM KNO₃或5mM KCl处理幼苗2小时。分离总RNA并利用RT-qPCR测量NRT2.1、NRT2.2和NIR的mRNA水平。展示了：(A)NRT2.1转录物水平；(B)NRT2.2转录物水平；和(C)NIR转录物水平。

图12展示在低硝酸盐浓度处理下，TGA1和TGA4对NRT2.1和NRT2.2表达的调节。以1mM铵作为唯一氮源，以水培方式培养Col-0和ga1/tga4植物。在第15天的光周期开始时，用250μM KNO₃或作为对照的5μM KCl处理植物2小时。分离RNA并通过RT-qPCR测量mRNA水平。展示了：(A)NRT2.1转录物水平；(B)NRT2.2转录物水平；和(C)Col-0和tga1/tga4植物的净硝酸盐摄取。

图13展示了暴露于5mM KNO₃或5mM KCl指示的时间的TGA家族成员的硝酸盐应答。

图14展示了对暴露于5mM NH₄Cl或5mM KCl指示的时间的植物上的GDH2的影响。

图15展示了在暴露于5mM KNO₃或5mM KCl指示的时间的chl1-5和T101D突变体中NRT2.1应答于硝酸盐的表达。

图16展示了用5mM KNO₃或5mM KCl处理的Col-0和ga1/tga4植物的NIA1基因的mRNA水平的硝酸盐依赖性上调。

实施本发明的模式

I.若干实施方案概述

硝酸盐摄取和同化基因的转录调节对于植物是非常重要的，因为硝酸盐同化是一种能量需求过程，必须与其他代谢和生理过程适当协调，以便使植物在变化的环境中最优地生长。本文中披露了转录因子TGA1和TGA4在植物应答于硝酸盐的情况下的新作用。

利用一种整合生物信息学方法，将TGA1和TGA4鉴定为在拟南芥根中介导氮应答的调节因子。在根器官中进行硝酸盐和亚硝酸盐处理之后，TGA1mRNA和TGA4mRNA迅速积累。TGA1和TGA4涉及受硝酸盐调节的初生根和侧根生长，并且通常硝酸盐处理对NRT2.1、NRT2.2和NIR基因的诱导需要TGA1和TGA4。tga1/tga4双突变体植物的表型分析表明，TGA1和TGA4对于硝酸盐依赖性初生根生长和硝酸盐依赖性侧根生长都是必需的。全局基因表达分析揭示，97％的在tga1/tga4双突变体中具有表达改变的基因受硝酸盐处理调节，表明TGA1和TGA4转录因子在根的硝酸盐应答中具有特殊作用。

在依赖于TGA1和TGA4来进行基因表达的正常氮调节的硝酸盐应答基因中，鉴定了硝酸盐转运蛋白基因NRT2.1、NRT2.2，和亚硝酸盐还原酶(NIR)基因。通过染色质免疫沉淀测定，验证了TGA1与这些靶基因的启动子上的相关DNA序列特异性结合。

TGA因子牵涉针对病原体攻击的植物防御、胁迫应答(Kesarwani et al.(2007)Plant Physiol.144:336-46)和花药发育(Murmu et al.(2010)Plant Physiol.154:1492-1504)。然而，TGA转录因子以前未曾与硝酸盐应答或任何营养素应答相关联。因此，本公开阐明了氮与涉及TGA1和TGA4转录因子的防御信号之间的一种新的、未被预见过的相互作用。

基于描述于本文实施例中的转录组学数据的网络分析可知，先前所述的涉及硝酸盐应答调节的基因都不会在TGA1和TGA4的下游。参见Vidal et al.(2010a)Wiley Interdiscip.Rev.Syst.Biol.Med.2:683-93。同样，根据先前的全局基因表达分析可知，CIPK8、NLP7和LDB37/38/39水平的改变对于应答于硝酸盐的TGA1或TGA4表达没有影响。见Castaings et al.(2009),同上；Hu etal.(2009),同上；Rubin et al.(2009),同上。由此可见，TGA1和TGA4可能在一种与业已表征的途径不同且独立于它们的途径中起作用来调节硝酸盐和/或亚硝酸盐应答。

II.缩写

ANOVA               方差分析

bZIP                碱性亮氨酸拉链结构域

         基本局部比对搜索工具

ChIP                染色质免疫沉淀

ELISA               酶联免疫吸附测定

EMSA                电泳迁移率变动分析

FACS                荧光激活细胞分选

FDR                 错误发现率

NCBI                美国国家生物技术信息中心

PCR                 聚合酶链反应

qPCR                定量聚合酶链反应

RMA                 稳健多阵列分析

RT-PCR              逆转录聚合酶链反应

III.术语

为了便于概述本公开的各种实施方案，提供了以下特殊术语解释：

内源的：如本文中使用的，术语“内源的”是指起源于特定生物、组织、或细胞之内的物质(例如核酸分子和多肽)。例如，在植物细胞中表达的“内源”多肽可以是指通常在与相同物种非基因工程植物相同的类型的细胞中表达的多肽。同样，在植物细胞中包含的“内源”核酸可以是指通常在与相同物种非基因工程植物相同的类型的细胞中发现的核酸(例如，基因组DNA)。例如，“天然”或“内源”核酸为不含这样一种核酸元件的核酸(例如基因)，所述核酸元件不同于通常在染色体或其他遗传物质(其上通常自然发现核酸)中存在的核酸元件。内源基因转录物由在其天然染色体基因座上的核苷酸序列编码，且并非人工供应给细胞。

相反，相对于多核苷酸的核苷酸序列和/或基因组定位、以及相对于多肽的氨基酸序列和/或细胞定位而言，“外源”或“异源”分子是对于一个指定的系统(例如种质、品种、优良品种、和/或植物)而言不是天然的分子。在实施方案中，外源或异源多核苷酸或多肽可以是已经被人工供应给某个生物系统(例如植物细胞、植物基因、特定的植物种类或品种、和/或植物染色体)中且对于该特定的生物系统而言不是天然的分子。因此，核酸被指定为“外源”可表示该核酸起源于天然存在的来源之外的来源，或可表示该核酸具有非天然的构型、基因定位或元件排列。

表达：如本文中使用的，编码序列(例如基因或转基因)的“表达”是指这样的过程，通过该过程，核酸转录单元(包括例如基因组DNA或cDNA)的编码信息被转化为细胞的运作性部分、非运作性部分、或结构部分(例如蛋白质)。基因表达可能受到外部信号的影响，例如细胞、组织、或生物暴露于某种增加或降低该细胞、组织、或生物中包含的基因的表达的因素。基因表达也可以在从DNA到RNA再到蛋白质的途径中的任何位置受到调节。例如，通过控制对转录、翻译、RNA运输和加工、中间分子比如mRNA的降解的作用，和/或通过在特异性蛋白分子以已经产生之后的活化、失活、区室化、或降解，或任何前述项的组合，由此发生基因表达的调节。通过本领域已知的方法，包括但不限于，Northern印迹、RT-PCR、Western印迹以及体外、原位或体内蛋白活性测定，可以在RNA水平或蛋白质水平测量基因表达。

增加表达：如本文中使用的，术语“增加表达”是指表达的起始、以及从模板构建体产生的表达产物的量的定量增加。在一些实施方案中，可以向细胞或生物提供至少一种异源基因，所述细胞或生物另外包含相同基因的内源拷贝，从而增加由该基因编码的多肽的表达。在这样的实施方案中，通过将在包含该异源基因和内源基因的细胞中产生的多肽的量与在仅仅包含该内源基因的细胞中产生的量进行比较，可以确定表达的增加。在一些实施方案中，可以向细胞或生物提供影响转录的第一多肽(例如TGA1和/或TGA4)，从而增加由在该第一多肽控制下的基因编码的第二多肽的表达。在这样的实施方案中，通过将在存在该第一多肽的情况下从该基因产生的多肽的量与在不存在该第一多肽的情况下从该基因产生的量进行比较，可以确定表达的增加。在一些实施方案中，可将调节序列与基因可操作连接，从而增加该基因的表达。在这样的实施方案中，通过将在该调节序列与基因可操作连接之后从该基因产生的多肽的量与在该调节序列可操作连接或导入之前从该基因产生的量进行比较，可以确定表达的增加。

异源的：如本文中使用的，术语“异源的”是指不是来源于特定生物、组织、或细胞之内的物质(例如核酸分子和多肽)。例如，在植物细胞中表达的“异源”多肽可以是指通常在相同物种的非基因工程植物的相同类型的细胞中不表达的多肽(例如，在相同生物的不同细胞中或者在不同生物的细胞中表达的多肽)。

分离的：“分离的”生物组分(例如，核酸或多肽)已经与该组分天然存在的生物细胞中的其它生物组分(例如，其它染色体或染色体外DNA和RNA，和蛋白质)实质上分离、与之分别产生、或从之纯化出来，在分离、产生和纯化的同时实现了该组分的化学或功能变化。例如，核酸可以通过断裂连接该核酸与染色体中其余DNA的化学键而从染色体分离。已经“分离的”核酸分子和蛋白可包括通过标准纯化方法纯化的核酸分子和蛋白。该术语包括通过在宿主细胞内重组表达制备的核酸和蛋白，以及化学合成的核酸分子、蛋白和肽。

氮限制条件：如本文中使用的，术语“氮限制条件”是指其中在土壤或培养基中具有受限量的氮源(例如硝酸盐和铵)的条件。在一些实例中，该量“限制”在从0.0到0.2mM的氮浓度范围；例如从0到0.1mM，从0到0.03mM，和从0到0.05mM的氮浓度范围。

核酸分子：如本文中使用的，术语“核酸分子”可以是指核苷酸的聚合物形式，可包括RNA、cDNA、基因组DNA的有义和反义链，以及上述者的合成形式和混合聚合物。核苷酸可以指核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、或这两种类型核苷酸的任一者的修饰形式。如本文中使用的“核酸分子”与“核酸”和“多核苷酸”是同义词。除非另外指明，核酸分子通常在长度上具有至少10个碱基。该术语包括DNA的单链和双链形式。核酸分子可以包括天然存在的核苷酸或/和通过天然存在和/或非天然存在的核苷酸联接而连接在一起的修饰核苷酸。正如本领域技术人员易于理解的，核酸分子可被化学修饰或生物化学修饰，或者可以含有非天然或衍生的碱基。

一些实施方案采用了特殊的核酸形式，即寡核苷酸(例如“引物”寡核苷酸)。寡核苷酸是相对较短的核酸分子，通常包含50个或更少的核碱基(nucleobases)(虽然一些寡核苷酸可包含50个以上)。该寡核苷酸可以通过切割(例如限制性消化)较长的包含该寡核苷酸序列的核酸而形成，或者可从单独的核苷亚磷酰胺以序列特异性方式化学合成。

可将寡核苷酸用作探针序列，以检测包含特定核苷酸序列的核酸分子。根据上文，可通过合成或克隆来制备寡核苷酸探针。适合的克隆载体是本领域技术人员已知的。寡核苷酸探针可以是标记的或未标记的。存在多种用于标记核酸分子的技术，包括例如，但不限于借助于切口平移的放射性标记术；随机引物法(random priming)；以及借助于末端脱氧转移酶的加尾法，其中所采用的核苷酸是标记的，例如，用放射性³²P标记。可以使用其他标记物，例如包括，但不限于：荧光团；酶；酶底物；辅酶；和酶抑制剂。或者，提供可检测信号的标记物的应用(单独地或与其他反应剂联合)可以用与受体结合的配体代替，其中所述受体被标记(例如，借助于以上指示的标记物)，以便通过它们自身或与其他试剂结合而提供可检测信号。见，例如Leary et al.(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:4045-9。

本发明的一些实施方案包括与核苷酸靶序列“能够特异性杂交”或“特异性互补”的多核苷酸。“能够特异性杂交”或“特异性互补”是这样的术语，它们表明足够程度的互补性，使得在该多核苷酸与包含该特定的核苷酸靶序列的核酸分子之间发生稳定且特异的结合。核酸分子与其能够特异性杂交的靶序列不需要是100％互补的。当存在足够的互补程度时，核酸分子可特异性地杂交，以便避免核酸在期望特异性结合的情况下(例如在严格杂交条件下)与非靶序列的非特异性结合。

产生特定严格程度的杂交条件将取决于所选择的杂交方法的性质以及杂交核酸序列的组成和长度而变化。通常，杂交温度和杂交缓冲液的离子强度(尤其是Na⁺和/或Mg⁺⁺浓度)有助于杂交的严格性，尽管洗涤时间也影响严格性。关于达到需要的特定严格性程度所需的杂交条件是本领域普通技术人员已知的，并且在例如Sambrook et al.(ed.)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2^nd ed.,vol.1-3,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,NY,1989,chapters 9and 11；以及Hames和Higgins(eds.)Nucleic Acid Hybridization,IRL Press,Oxford,1985中有论述。关于核酸杂交的进一步详细说明和指导例如可见于Tijssen,“Overview of principles of hybridization andthe strategy of nucleic acid probe assays,”in Laboratory Techniques inBiochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes,Part I,Chapter 2,Elsevier,NY,1993；和Ausubel et al.,Eds.,Current Protocols in Molecular Biology,Chapter 2,Greene Publishing and Wiley-Interscience,NY,1995。

如本文中使用的，“严格条件”涵盖这样的条件，在此类条件下，只有当杂交分子与DNA靶之间的错配小于25％时才发生杂交。“严格条件”包括其他的具体严格性水平。因此，如本文中使用的，“轻度严格性”条件为具有25％以上序列错配的分子不会杂交的条件；“中等严格性”条件为具有15％以上错配的分子不会杂交的条件；并且“高等严格性”条件为具有10％以上错配的序列不会杂交的条件。“非常高的严格性”条件为具有6％以上错配的序列不会杂交的条件。

在特定的实施方案中，严格条件为：在65℃在杂交缓冲液(例如6x盐水-柠檬酸钠(SSC)缓冲液、5x Denhardt溶液、0.5％SDS、和100μg剪切的鲑睾丸DNA)中杂交过夜，然后在65℃在0.1X SSC/0.1％SDS中40分钟顺序洗涤。

可操作连接的核苷酸序列：当第一核苷酸序列与第二核苷酸序列有功能关系时，该第一核苷酸序列与该第二核苷酸序列“可操作连接”。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则该启动子与该编码序列可操作连接。当以重组方式产生时，可操作连接的核苷酸序列之间通常是连续的，并且在有必要将两个蛋白质编码区连接在一起的情况下，处于相同的阅读框内。然而，可操作连接的核苷酸序列不一定必须是连续的。

在有关基因调节序列和编码序列的情况下使用时，术语“可操作连接”意味着该调节序列影响该连接的编码序列的表达。“调节序列”或“控制元件”是指影响转录的周期和水平/量、RNA加工或稳定性、或可操作连接的编码序列的翻译的核苷酸序列。常规的调节序列例如包括，但不限于，5’非翻译区；启动子；翻译前导序列；内含子；增强子；茎环结构；阻遏物结合蛋白；终止序列；和多腺苷酸化识别序列。特定的调节序列可位于与其可操作连接的编码序列的上游和/或下游。并且，与编码序列可操作连接的特定调节序列可位于双链核酸分子的相关互补链上。

与编码序列“可操作连接”的元件不限于启动子或其他常规的调节序列。例如，在一些实施方案中，转录因子多肽(例如TGA1或TGA4)可与位于编码序列的上游或下游的核苷酸序列结合，以影响该编码序列的转录。在这样的实例中，尽管在不存在转录因子的情况下该核苷酸序列可能完全不影响该编码序列的转录，与转录因子多肽结合的核苷酸序列仍然与该编码序列“可操作连接”。

调节元件：如本文中使用的，术语“调节元件”是指具有基因调节活性的核酸分子；即，具有影响可操作连接的可转录核酸分子的转录或翻译的能力的核酸分子。调节元件，例如启动子、前导序列、内含子、和转录终止区，为具有基因调节活性的非编码核酸分子，它们在活细胞的总体基因中扮演不可或缺的角色。因此，通过分子工程技术，在植物中起作用的分离的调节元件可用于修饰植物表型。因此，“调节元件”可以是决定特定基因是否表达、表达时间和表达水平一系列核苷酸。在一些实例中，调节元件是与调节蛋白例如TGA1和/或TGA4特异性地相互作用的DNA序列。

如本文中使用的，术语“基因调节活性”是指由核酸分子或多肽对可操作连接的核酸分子的转录或翻译所施加的作用。具有基因调节活性的分离的核酸分子可以提供可操作连接的核酸分子的时序表达或空间表达、和/或调节表达水平和速率。在本文中描述的一些实例中，TGA1和/或TGA4被提供为具有基因调节活性的多肽，其增加至少一种与特异性地结合TGA1和/或TGA4多肽的调节DNA元件可操作连接的核苷酸序列的表达。

启动子：如本文中使用的，术语“启动子”是指可以在转录起始上游的、且可能涉及RNA聚合酶与其他蛋白质的识别和结合而影响转录的DNA区域。启动子可与用于在细胞中表达的编码序列可操作连接，或者启动子可与编码信号序列的核苷酸序列可操作连接，所述核苷酸序列可与用于在细胞中表达的编码序列可操作连接。“植物启动子”可以是能够启动植物细胞转录的启动子。

在发育控制下的启动子的实例包括优先启动某些组织中的转录的启动子，所述组织例如但不限于，叶、根、种子、纤维、木质部导管、管胞、或厚壁组织。这样的启动子称为“组织优选性”启动子。仅启动某些组织中的转录的启动子被称为“组织特异性”启动子。“细胞类型特异性”启动子主要影响一个或多个器官中某些细胞类型(例如但不限于根或叶中的维管细胞)中的转录。组织特异性或组织优先启动子的实例，例如包括，但不限于，根优选性启动子(例如菜豆蛋白基因启动子)；叶特异性和光诱导启动子，例如来自cab或rubisco的启动子；花药特异性启动子，例如来自LAT52的启动子；花粉特异性启动子，例如来自Zm13的启动子；和花粉粒优选性启动子，例如来自apg的启动子。

“诱导型”启动子可以是在环境控制之下的启动子。见Ward et al.(1993)Plant Mol.Biol.22:361-366。可通过诱导型启动子启动转录的环境条件的实例，包括例如，但不限于，厌氧条件和光的存在。利用诱导型启动子，转录速率应答于诱导剂而增加。诱导型启动子的实例包括但不限于，来自应答于铜的ACEI系统的启动子；应答于苯磺酰胺除草剂安全剂的来自玉米的In2基因启动子；来自Tn10的Tet阻遏物；和来自甾体激素基因的诱导型启动子，其转录活性可被糖皮质激素诱导(Schena et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:0421)。

组织特异性启动子、组织优选性启动子、细胞类型特异性启动子、和诱导型启动子构成“非组成型”启动子类别。“组成型”启动子是可在大多数环境条件下具有活性的启动子。组成型启动子的实例例如包括，但不限于，植物病毒启动子(例如来自花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子)；来自水稻肌动蛋白基因的启动子；泛素启动子；pEMU；MAS；玉米H3组蛋白启动子；和ALS启动子，欧洲油菜ALS3结构基因的Xba1/NcoI片段5'(或与Xba1/NcoI片段相似的核苷酸序列)(PCT国际专利公开No.WO 96/30530)。

任何前述组成型和非组成型启动子均可在特定的实施方案中使用。例如，可以将要被植物细胞中的硝酸盐和/或亚硝酸盐调节的基因提供给该植物细胞，其中该基因与特异性结合TGA1和/或TGA4多肽和启动子的调节DNA元件可操作连接。作为进一步的实例，可向细胞提供TGA1或TGA4基因，其中该基因与组成型或非组成型启动子可操作连接，从而提供TGA1或TGA4基因的表达并赋予在该启动子控制的情形下的拟南芥硝酸盐应答属性。

序列同一性：在两个核酸或多肽序列的情况下，如本文中使用的术语“序列同一性”(或“同一性”)可以是指在指定比较窗口上以最大对应性对齐这两个序列时在这两个序列中相同的残基。

如本文中使用的，术语“序列同一性百分比”可以是指通过在比较窗口上比较两个最优比对序列(例如核酸序列、和氨基酸序列)而确定的值，其中为了实现两个序列的最优对齐，在该比较窗口中的序列部分可以包含相比于参考序列(不包含添加或缺失)的添加或缺失(即，空位)。通过确定相同核苷酸或氨基酸残基出现在两个序列中的位置的数目而产生匹配位置的数目，用该匹配位置的数目除以比较窗口中的位置的总数，将结果乘以100而产生序列同一性的百分比，从而计算出该百分比。

用于比较的序列比对方法是本领域技术人员熟知的。各种程序和比对算法例如描述于Smith和Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2:482；Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443；Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:2444；Higgins和Sharp(1988)Gene 73:237-44；Higgins和Sharp(1989)CABIOS 5:151-3；Corpet et al.(1988)Nucleic Acids Res.16:10881-90；Huang et al.(1992)Comp.Appl.Biosci.8:155-65；Pearson et al.(1994)MethodsMol.Biol.24:307-31；Tatiana et al.(1999)FEMS Microbiol.Lett.174:247-50。序列比对方法和同源性计算的详细描述可见于例如Altschul et al.(1990)J.Mol.Biol.215:403-10。

美国国家生物技术信息中心(NCBI)基本局部比对搜索工具(BLAST^TM；Altschul et al.(1990))可从几个来源获得，包括因特网，其与几种序列分析程序结合使用。怎样使用该程序确定序列同一性的描述可在因特网的BLAST^TM的“帮助”部分获得。为了比较核酸序列，可以采用利用默认参数的BLAST^TM(Blastn)程序的“Blast 2序列”函数。在用这种方法评估时，与参考序列具有较大相似性的核酸序列将显示出同一性百分比的增加。

如本文中关于核苷酸序列使用的，术语“基本上相同”可以是指85％以上相同的序列。例如，基本上相同的核苷酸序列可以与参考序列至少85.5％；至少86％；至少87％；至少88％；至少89％；至少90％；至少91％；至少92％；至少93％；至少94％；至少95％；至少96％；至少97％；至少98％；至少99％；或至少99.5％相同。

特异性结合：如本文中关于多肽和蛋白质结构域使用的术语“特异性结合”是指在多肽或蛋白质结构域与其结合伴侣(例如包含特异性核苷酸序列的核酸)之间的相互作用足够强，使其与结合伴侣而不与缺乏由特异性结合多肽识别的特定氨基酸序列或特定核苷酸序列的其他分子发生特异性结合。可通过对于本领域技术人员而言的常规技术例如“下拉(pulldown)”测定(例如GST下拉(pulldowns))、酵母-2-杂交测定、酵母-3-杂交测定、ELISA等来确定稳定且特异性的结合。彼此具有“特异性结合”属性可以被看作是与彼此“特异性地结合”。

转化：如本文中使用的，术语“转化”是指将一个或多个核酸分子转移到细胞中。当核酸分子通过核酸分子并入细胞基因组中、或通过附加型复制而由该细胞稳定复制时，细胞被转移到该细胞中的核酸分子“转化”。如本文中使用的，术语“转化”涵盖所有可将核酸分子导入这种细胞中的技术。实例包括但不限于：用病毒载体转染；用质粒载体转化；电穿孔(Fromm et al.(1986)Nature 319:791-3)；脂质体转染(Felgner et al.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:7413-7)；显微注射(Mueller et al.(1978)Cell 15:579-85)；土壤杆菌介导的转移(Fraley et al.(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:4803-7)；直接DNA摄取；和微粒轰击(Klein et al.(1987)Nature 327:70)。

转基因：外源核酸序列。在一些实例中，转基因可以是编码TGA1或TGA4多肽的序列。在一些实例中，转基因可编码与特异性结合TGA1和/或TGA4的调节DNA元件可操作连接的感兴趣基因(例如报告基因或对农业上重要的植物性状有贡献的基因)。在这些和其他实例中，转基因可含有一个或多个与该转基因编码序列可操作连接的调节序列。为了本公开的目的，当使用术语“转基因的”来指称一种生物时(例如植物)，是指包含外源核酸序列的生物。在一些实例中，包含外源核酸序列的生物可以是经由分子转化技术导入了该核酸序列的生物。在其他实例中，包含外源核酸序列的生物可以是通过例如基因渗入或异花受粉导入了该核酸序列的生物。

载体：如本文中使用的，术语“载体”是指可被导入细胞中(例如为了产生转化细胞)的核酸分子。载体可包括允许它在宿主细胞中复制(比如复制起点)的核酸序列。载体的实例包括但不限于：质粒；粘粒；细菌噬菌体；和携带外源DNA进入细胞中的病毒。载体还可包括一种或多种基因、反义分子、和/或选择标记基因和本领域已知的其他遗传元件。载体可以转导、转化或感染细胞，由此引起细胞表达核酸分子和/或由该载体编码的蛋白质。任选地，载体包括辅助核酸分子实现进入细胞中的物质(例如脂质体、蛋白质包衣等)。

除非特别指明或暗示，如本文中使用的术语“一个”、“一种”和“该”表示“至少一个/种”。

除非另外特别地解释，本文中使用的全部技术术语和科学术语具有与属于本公开的领域之内的普通技术人员通常所理解的相同的含义。在分子生物学中常用术语的定义可见于例如Lewin B.,Genes V,Oxford University Press,1994(ISBN 0-19-854287-9)；Kendrew et al.(eds.),The Encyclopedia of Molecular Biology,Blackwell Science Ltd.,1994(ISBN 0-632-02182-9)；和Meyers R.A.(ed.),Molecular Biology and Biotechnology:A Comprehensive Desk Reference,VCH Publishers,Inc.,1995(ISBN 1-56081-569-8)。

IV.氮应答调节因子TGA1和TGA4

本公开提供了应用转录因子TGA1和TGA4的预料不到的新用途的组合物和方法。如本文中公开的，TGA1和TGA4是应答于环境中某些氮源而影响许多特定的靶基因表达的转录因子。因此，例如，TGA1和/或TGA4可以用来调节植物细胞、植物材料、植物组织、或者植物的硝酸盐和/或亚硝酸盐应答。例如，可以利用本文中描述的TGA1和TGA4的特性，来提供具有改变的硝酸盐-和亚硝酸盐-应答表型的转基因植物，和提供其中感兴趣基因的表达被至少部分地被植物或植物细胞可利用的氮源(或其缺乏)所调节的转基因植物或植物细胞。例如，可在植物中表达或过表达TGA1和/或TGA4，以启动和/或增加植物中初生根和/或侧根的生长。

一些实施方案包括TGA1碱性亮氨酸拉链转录因子多肽。根据特定实施方案的TGA1多肽包含当与SEQ ID NO:1(拟南芥TGA1)比对时显示增加的百分比同一性的氨基酸序列。在这些和其他实施方案内的具体氨基酸序列可包含与SEQ ID NO:1具有例如至少约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一性的序列。例如，一些实施方案包括含有选自下组的氨基酸序列的TGA1多肽：SEQ ID NO:2(小盐芥(Thellungiella halophila))；SEQ ID NO:3(深山南芥(Arabidopsis lyrata))；SEQ ID NO:4(芜菁(Brassica rapa))；SEQ ID NO:5(Arabidopsis arenosa)；SEQ ID NO:6(葡萄(Vitis vinifera))；SEQ ID NO:7(菜豆(Phaseolus vulgaris))；SEQ ID NO:8(蒺藜苜蓿(Medicago truncatula))；SEQID NO:9(大豆)；和SEQ ID NO:10(蓖麻(Ricinus communis))。

一些实施方案包括TGA4碱性亮氨酸拉链转录因子多肽。根据特定实施方案的TGA4多肽包含当与SEQ ID NO:11(拟南芥TGA4)比对时显示增加的百分比同一性的氨基酸序列。在这些和其他实施方案内的具体氨基酸序列可包含与SEQ ID NO:11具有例如至少约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一性的序列。例如，一些实施方案包括含有选自下组的氨基酸序列的TGA4多肽：SEQ ID NO:12(蒺藜苜蓿)；SEQ ID NO:13(葡萄)；和SEQ ID NO:14(玉米)。

在许多实施方案中，包含当与SEQ ID NO:1(TGA1多肽)和/或SEQ IDNO:11(TGA4多肽)比对时具有上述序列同一性的多肽被包含在具有硝酸盐-和亚硝酸盐-应答调节活性的肽或这样的肽的一部分之内。例如，TGA1多肽可通过在序列数据库中搜索与SEQ ID NO:1具有阈值序列同一性的多肽序列来加以鉴定。例如，可以通过在序列数据库中搜索与SEQ ID NO:11具有一定序列同一性的多肽序列来鉴定TGA4多肽。可以通过本领域技术人员已知的许多方法的任何一种(例如，利用NCBI的工具)，来搜索有用的序列数据库。通过许多种公共的和私有的商业来源，其他数据库可用于许多植物和其他生物。本领域技术人员会理解，TGA1和TGA4是同源蛋白质，因此，被鉴定为包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:11共享序列同一性的氨基酸序列的特定多肽也可以与SEQ ID NOs:1和11的另一者共享序列同一性。

一些实施方案包括含有编码TGA1和/或TGA4多肽的核苷酸序列的核酸，例如上文所述。例如，在一些实施方案中的核酸序列当与SEQ ID NO:15(拟南芥TGA1)和/或SEQ ID NO:16(拟南芥TGA4)比对时显示出增加的百分比同一性。在这些和其他实施方案内的特异性核酸序列可包含与SEQ IDNO:15和/或SEQ ID NO:16具有例如但不限于至少约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一性的序列。

本领域的技术人员能够容易地鉴定大量的包含编码TGA1和/或TGA4多肽的核苷酸序列的核酸。例如，根据密码子简并性，借助于导入容许的核苷酸取代，可以例如修饰核酸分子而基本上不改变所编码的多肽的氨基酸序列。因此，应当理解的是，任何具有给定的氨基酸序列的TGA1或TGA4多肽均可以被迅速反向工程化为许多种冗余核苷酸序列的任何一种。作为进一步的实例，编码TGA1或TGA4多肽的基因可以选自许多可用的植物基因组文库、cDNA文库、EST文库等的任何一种(例如借助于与SEQ ID NO:14或SEQID NO:15的同源性、或借助于编码的多肽与SEQ ID NOs:1-14的一者或多者的序列相似性)，或可以根据在分子生物学领域中可靠且熟知的技术从生物中克隆这种基因。

对于TGA1多肽、TGA4多肽、以及编码两者之一的核酸分子，它们之中的任一者或全部都可用于本发明的某些实施方案中。

一些实施方案包括含有特异性结合TGA1和/或TGA4多肽的调节核苷酸序列的核酸，从而赋予与该调节核苷酸序列可操作连接的核苷酸序列以硝酸盐和/或亚硝酸盐控制。在一些实例中，特异性结合TGA1和/或TGA4多肽的调节核苷酸序列包含在内源拟南芥启动子中，所述启动子来自被TGA1和/或TGA4调节的基因，例如但不限于选自下组的基因：NRT2.1、NRT2.2、和NIR。可以通过本领域技术人员已知的任何技术，例如，染色质免疫沉淀或EMSA，来检测TGA1和/或TGA4多肽与调节核苷酸序列的特异性结合。

在一些实施方案中，本发明的核酸分子包含基因调节元件(例如启动子)。可以基于其中要插入载体构建体的细胞的类型来选择启动子。在细菌、酵母、和植物中起作用的启动子是本领域熟知的。也可以基于它们的调节特征来选择这些启动子。这种特征的实例包括：对转录活性、可诱导性、组织特异性、和发育阶段特异性的增强。在植物中，可诱导的、病毒或合成来源的、具有组成性活性、可时序调节的、和可空间调节的启动子已经有人描述。参见，例如Poszkowski et al.(1989)EMBO J.3:2719；Odell et al.(1985)Nature313:810；和Chau et al.(1989)Science 244:174-81)。

有用的诱导型启动子包括例如，通过应用安全剂(取代的苯磺酰胺除草剂)诱导的由水杨酸或聚丙烯酸诱导的启动子、热激启动子、源于菠菜硝酸盐还原酶可转录核酸分子序列的硝酸盐诱导型启动子、激素诱导型启动子、和与RuBP羧化酶小亚基和LHCP家族相关的光诱导型启动子。

其他有用的启动子包括：胭脂碱合酶启动子、甘露碱合酶启动子、和章鱼碱合酶启动子，这些启动子由根癌土壤杆菌的肿瘤诱导质粒携带；CaMV19S和35S启动子；增强的CaMV 35S启动子；玄参花叶病毒35S启动子；来自1,5-二磷酸核酮糖-羧化酶小亚基(ssRUBISCO)的光诱导型启动子；来自烟草的EIF-4A启动子(Mandel et al.(1995)Plant Mol.Biol.29:995-1004)；玉米蔗糖合成酶；玉米醇脱氢酶I；玉米捕光复合物；玉米热激蛋白；来自拟南芥的壳多糖酶启动子；LTP(脂质转移蛋白)启动子；矮牵牛查尔酮异构酶；大豆富甘氨酸蛋白(bean glycine rich protein)1；马铃薯块茎特异蛋白(patatin)；泛素启动子；和肌动蛋白启动子。有用的启动子尤其包括根特异性启动子。

为了获得更高的异源基因表达，优选的是将所述基因再工程化，使其在表达宿主细胞(例如植物细胞，例如加拿大油菜、水稻、烟草、玉米、棉花、和大豆)中更有效地表达。因此，在设计编码TGA1和/或TGA4多肽的用于植物表达的基因中，任选的额外步骤(即，除了提供一个或多个基因调节元件之外)是针对优化表达将异源基因蛋白质编码区再工程化。特定的实施方案包括重新设计的拟南芥基因，所述拟南芥基因已被优化，使得该优化的基因在来自第二植物种类的转基因植物细胞中的表达水平相比于在来自用原始(即，未修饰的)拟南芥基因序列转化的第二植物种类的植物细胞中的表达水平得以增加(即，产生更多的蛋白质)。

由于由遗传密码的冗余/简并性(即，一些氨基酸由一个以上的密码子指定)提供的可塑性，在不同生物或生物类别中的基因组的演化已导致同义密码子的使用频率差异。这种“密码子偏好”反映在蛋白质编码区的平均碱基组成中。例如，基因组中G+C含量相对较低的生物使用更多在同义密码子第三位中具有A或T的密码子，而G+C含量较高的生物则使用更多在第三位是G或C的密码子。此外，人们认为在mRNA中存在的“稀有”密码子可能会降低该mRNA的绝对翻译速度，特别是当相应于该稀有密码子的负载tRNA的相对丰度较低时。这个推理的一个推论是，对于多个稀有密码子而言，单个稀有密码子对翻译速度的减少可能至少是叠加性的。因此，在特定表达宿主中具有高相对含量的稀有密码子的mRNA的翻译速度会相应降低。该速度可能反映在所编码蛋白的相应低水平上。

在用于植物细胞(例如水稻、烟草、玉米、棉花、和大豆)中表达的编码TGA1和/或TGA4多肽的优化基因的工程化过程中，如果已经确定预期宿主植物的密码子偏好，将是有帮助的。有很多公众可访问的DNA序列数据库，在这些数据库中可以找到有关植物基因组的密码子分布或各种植物基因的蛋白质编码区的信息。

密码子偏好是表达宿主用于编码其蛋白质的氨基酸的密码子的统计分布。密码子偏好可以计算为单个密码子相对于所有氨基酸密码子的使用频率。或者，密码子偏好可以计算为单个密码子相对于特定氨基酸的所有其他密码子(同义密码子)被用来编码所述氨基酸的频率。

在设计用于植物表达的TGA1和/或TGA4多肽的优化编码区的过程中，当存在多种选择时，应当确定所述植物优选的主要(“第一选择”)密码子、以及优选密码子的第二、第三、第四等选择。然后，可设计编码TGA1和/或TGA4多肽的氨基酸序列的新的DNA序列，所述新的DNA序列与天然DNA序列(编码该多肽的)的差异在于换用了表达宿主优选的(第一优选的、第二优选的、第三优选的、或第四优选的等等)密码子来指定在所述氨基酸序列内的每个位置处的氨基酸。然后针对所述新的序列，分析可能已经通过修饰产生的限制性酶切位点。对于鉴定出的假定限制性位点，通过用次一级优选密码子代替这些密码子来加以修饰，以去除限制性位点。该序列中其它可能影响异源序列转录或翻译的位点为：外显子:内含子接点(5’或3’)、多聚-A添加信号、和/或RNA聚合酶终止信号。可以对序列进行进一步的分析和修饰，以减少TA或CG双联体(doublet)的频率。除了这些双联体之外，具有超过约6个相同的G或C核苷酸的序列区块也会对该序列的转录或翻译造成不利影响。因此，通过用次一级优选的密码子选择来替换密码子的第一或第二选择等，对这些区块进行有利的修饰。

如上所述的方法使得本领域的技术人员可以修饰对于特定植物而言为外源性的基因，使得所述基因在植物中最优地表达。这种方法在PCT国际专利公开No.WO 97/13402A1中有进一步说明。因此，可以利用在功能上等同于一些实施方案的TGA1和/或TGA4基因的优化的合成基因来转化宿主，包括植物和植物细胞。此外，也可以在计算机上从初始氨基酸序列产生TGA1-和TGA4-编码核苷酸序列。更多有关合成基因产生的指导可见于，例如，美国专利5,380,831。

一旦在纸上或计算机上设计了TGA1-和/或TGA4-编码核苷酸序列，可以在实验室中合成包含该序列的真实核酸分子，使之在序列上精确地与所设计的序列对应。可以对这些合成的DNA分子进行克隆和进行其他操作，完全如同它们来自自然或天然的来源一样。

V.TGA1和/或TGA4介导植物氮应答

一些实施方案利用如下发现：TGA1和TGA4对于正常的硝酸盐调节的基因表达(例如NRT2.1、NRT2.2和NIR的表达)、以及对于产生针对硝酸盐和亚硝酸盐的植物应答是必需的。在特定的实施方案中，可以在细胞或生物中表达或过表达TGA1和/或TGA4多肽，例如但不限于如下方式：将TGA1-或TGA4-编码核酸导入细胞或生物中；将TGA1和/或TGA4多肽导入细胞或生物中；和/或提供足以促进TGA1和/或TGA4多肽表达的正信号或负信号(通过这些信号在细胞或生物中与可操作连接于TGA1-或TGA4-编码核酸的调节元件的相互作用)。在另外的实施方案中，可以将TGA1和/或TGA4多肽敲除或使其在细胞或生物中低表达，例如但不限于通过下述方式：破坏、突变、或失活化TGA1-和/或TGA4-编码核酸(例如TGA1和/或TGA4基因)；将靶向编码TGA1和/或TGA4多肽的核酸的反义核酸导入到细胞或生物中；以物理方式将TGA1和/或TGA4多肽从细胞或生物的细胞机构中去除(通过用抗体或其他特异性结合蛋白结合TGA1和/或TGA4多肽)；和/或提供足以降低或消除TGA1和/或TGA4多肽的表达的正信号或负信号(通过这些信号与细胞或生物中可操作连接于TGA1-或TGA4-编码核酸的调节元件的相互作用)。

在一些实施方案中，TGA1和/或TGA4多肽可以在植物细胞或生物中表达或过表达，从而促进硝酸盐转运蛋白NRT2.1和NRT2.2之一或两者的表达。在另外的实施方案中，可以从植物细胞或生物中去除或在其中低表达TGA1和/或TGA4多肽，从而减少或消除硝酸盐转运蛋白NRT2.1和NRT2.2之一或两者的表达。

出于多种原因，可能希望增加NRT2.1和/或NRT2.2的表达。除了它的硝酸盐转运功能之外，NRT2.1转运蛋白起整合侧根发生和侧根生长的作用。Little et al.(2005)，同上；Remans et al.(2006)Plant Physiol.140:909-21。在补充有硝酸盐的培养基中，nrt2.1/nrt2.2拟南芥突变系显示出侧根伸长减弱。Li et al.(2007)，同上。因此，通过单独地改变TGA1和/或TGA4的表达，或者改变TGA1和/或TGA4的表达同时伴随植物营养状态变化，来控制NRT2.1和NRT2.2水平，可导致根生长和植物中发育程序的改变。

在一些实施方案中，TGA1和/或TGA4多肽可以在植物细胞或生物中表达或过表达，从而促进至少一种其他氮应答基因的表达。例如，TGA1和/或TGA4多肽可以在植物细胞或生物中表达或过表达，从而促进在图5中描述的某种基因的表达。在另外的实施方案中，可以从植物细胞或生物中去除或在其中低表达TGA1和/或TGA4多肽，从而减少或消除至少一种其他氮应答基因的表达。例如，可以从植物细胞或生物中去除或在其中低表达TGA1和/或TGA4多肽，从而减少或消除在图5中描述的某种基因的表达。

在一些实施方案中，可以控制TGA1和/或TGA4在植物细胞或植物中的表达，从而影响初生根和/或侧根生长(例如应答于硝酸盐)。例如，可以在植物细胞或生物中表达或过表达TGA1和/或TGA4多肽，从而刺激和/或增强初生根和/或侧根生长。相反，可以从植物细胞或生物中去除或在其中低表达TGA1和/或TGA4多肽，从而消除和/或减弱初生根和/或侧根生长(例如应答于硝酸盐减弱初生根和/或侧根生长)。

在一些实施方案中，可以控制TGA1和/或TGA4在植物细胞或植物中的表达，从而影响植物细胞或植物在氮受限条件下的生长。例如，可以在植物细胞或生物中表达或过表达TGA1和/或TGA4多肽，从而刺激和/或增强植物在氮受限条件下的生长。相反，可以从植物细胞或生物中去除或在其中低表达TGA1和/或TGA4多肽，从而消除和/或减弱植物在氮受限条件下的生长(例如应答于硝酸盐减弱植物生长)。

TGA1可以通过磷酸化(Popescu et al.(2009)Genes Dev.23:80-92)或S-亚硝基化(Lindermayr et al.(2010)Plant Cell 22:2894-907)翻译后修饰。这些和其他翻译后修饰可能在TGA1和/或TGA4的调节中起作用。例如，最近表明，在用S-亚硝基谷胱甘肽处理之后，TGA1可以被S23亚硝基化，S亚硝基谷胱甘肽是一种生理一氧化氮(NO)供体。Lindermayr et al.(2010)，同上。这种S23亚硝基化增强TGA1的DNA结合活性。见上文。由于NO产生与NR活性有关(Kolbert和Erdei(2008)Plant Signal Behav.3:972-3)，并且亚硝酸盐充当NO形成的基质(Yamasaki et al.(1999)Trends Plant Sci.4:128-9；Rockel et al.(2002)J.Exp.Bot.53:103-10；Lea et al.(2004)Planta 219:59-65；Meyer et al.(2005)Photosynth.Res.83:181-9；Planchet et al.(2005)Plant J.41:732-43)，硝酸盐衍生的代谢物(例如亚硝酸盐或NO)可能涉及激活TGA1和TGA4转录因子活性，从而执行硝酸盐/亚硝酸盐转录应答。

因此，特定的实施方案包括TGA1和/或TGA4的翻译后修饰的控制或模拟，从而影响TGA1和/或TGA4的活性。而且，可以与TGA1和/或TGA4表达一并提供或去除硝酸盐应答途径的上游信号分子，从而例如将这种作用调节到技术从业者考虑之内的期望水平。

不受任何特定理论的束缚，TGA1和TGA4可能是应答于硝酸盐处理而被激活的至少两种调节机制的一部分。首先，硝酸盐和/或硝酸盐衍生的信号(例如亚硝酸盐或NO)将激活TGA1和TGA4转录因子，使得TGA1和TGA4与它们的靶基因的启动子区结合。结果，这些硝酸盐应答靶基因的表达将增加，以使细胞(和包含该细胞的植物)适应富含硝酸盐的环境。其次，经过相对较长的时期，硝酸盐和/或硝酸盐衍生的信号也可能引起TGA1和TGA4基因表达的诱导。这种基因表达的诱导可以是独立调节功能的一部分。这些应答的时间性差异可涉及被调节过程的性质(例如代谢性与发育性)和/或涉及不同的空间功能(局部与系统)。因此，在特定的实施方案中，可以按照时间依赖性方式控制植物或细胞中的TGA1和/或TGA，以实现一种或多种特定的所希望的硝酸盐应答。

VI.包含TGA1和/或TGA4的植物、植物部分、和植物材料

一些实施方案涉及产生转化细胞的方法，所述转化细胞包含一个或多个TGA1和/或TGA4多肽(如上所述)、和/或一个或多个包含编码TGA1和/或TGA4多肽的核酸序列的核酸分子。这种核酸分子还可以包含例如非编码调节元件，例如启动子。还可以将其他序列与非编码调节元件和可转录核酸分子序列一起导入细胞中。这些其他的序列可包括3’转录终止子、3’多-腺苷酸化信号、其他非翻译序列、转运序列或靶序列、选择标记、增强子、和操纵基因。

转化方法通常包括以下步骤：选择适合的宿主细胞，用重组载体转化宿主细胞，和获得转化的宿主细胞。用于将DNA导入细胞中的技术是本领域技术人员熟知的。这些方法通常可被分为五类：(1)化学方法(Graham和Van derEb(1973)Virology 54(2):536-9；Zatloukal et al.(1992)Ann.N.Y.Acad.Sci.660:136-53)；(2)物理方法，例如显微注射(Capechi(1980)Cell 22(2):479-88)、电穿孔(Wong和Neumann(1982)Biochim.Biophys.Res.Commun.107(2):584-7；Fromm et al.(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82(17):5824-8；美国专利5,384,253)、和粒子加速(Johnston和Tang(1994)Methods Cell Biol.43(A):353-65；Fynan et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(24):11478-82；(3)病毒载体(Clapp(1993)Clin.Perinatol.20(1):155-68；Lu et al.(1993)J.Exp.Med.178(6):2089-96；Eglitis和Anderson(1988)Biotechniques 6(7):608-14)；(4)受体介导的机制(Curiel et al.(1992)Hum.Gen.Ther.3(2):147-54；Wagner et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89(13):6099-103)；和(5)细菌介导的机制，例如用土壤杆菌。或者，可通过直接注射植物的生殖器官将核酸直接导入花粉中。Zhou et al.(1983)Methods in Enzymology 101:433；Hess(1987)Intern.Rev.Cytol.107:367；Luo et al.(1988)Plant Mol.Biol.Reporter 6:165；Pena et al.(1987)Nature 325:274。其他的转化方法包括，例如，如在美国专利5,508,184中说明的原生质体转化。也可将核酸分子注射到未成熟胚中。Neuhaus et al.(1987)Theor.Appl.Genet.75:30。

最常用的植物细胞转化方法为：土壤杆菌介导的DNA转移过程(Fraley etal.(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:4803)(如美国专利5,824,877；美国专利5,591,616；美国专利5,981,840；和美国专利6,384,301中例示的)和基因枪或微粒轰击介导的过程(即，基因枪)(例如描述于美国专利5,550,318；美国专利5,538,880；美国专利6,160,208；美国专利6,399,861；和美国专利6,403,865)。一般而言，核转化是理想的，但是在期望特异性转化质体，例如叶绿体或造粉体的场合，可利用某些植物种类(例如拟南芥、烟草、马铃薯、和芸苔属类)中的期望的核酸分子的微粒介导的递送来转化植物质体。

通过使用属于土壤杆菌属的遗传工程化的土壤细菌，可实现土壤杆菌介导的转化。几种土壤杆菌种类介导一种被称为“T-DNA”的DNA的转移，可将这些土壤杆菌种类遗传工程化，以便携带期望的DNA片段进入许多植物种类中。标志着T-DNA介导的致病过程的主要事件为：毒力基因的诱导、和T-DNA的加工和转移。这个过程是许多综述的主题。见，例如Ream(1989)Ann.Rev.Phytopathol.27:583-618；Howard和Citovsky(1990)Bioassays 12:103-8；Kado(1991)Crit.Rev.Plant Sci.10:1-32；Zambryski(1992)Annual Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.43:465-90；Gelvin(1993)收录于Transgenic Plants,Kung和Wu编辑,Academic Press,San Diego,CA,pp.49-87；Binns和Howitz(1994)收录于Bacterical Pathogenesis of Plants and Animals,Dang编辑,Berlin:SpringerVerlag.,pp.119-38；Hooykaas和Beijersbergen(1994)Ann.Rev.Phytopathol.32:157-79；Lessl和Lanka(1994)Cell 77:321-4；以及Zupan和Zambryski(1995)Annual Rev.Phytopathol.27:583-618。

为了在不考虑转化方法的情况下对转化的植物细胞进行选择或评分，导入细胞中的DNA可以含有这样的基因，该基因在可再生植物组织中起作用而产生某种化合物，该化合物赋予该植物组织针对原本有毒性的化合物的抗性。用作选择标记、筛选标记、或评分标记的感兴趣基因包括但不限于，β-葡糖苷酸酶(GUS)、绿色荧光蛋白(GFP)、萤光素酶、和抗生素或除草剂耐受基因。抗生素抗性基因的实例包括赋予青霉素类、卡那霉素(和新霉素G418、博来霉素)；氨甲喋呤(和甲氧苄胺嘧啶)；氯霉素；和四环素抗性的基因。例如，草甘膦抗性可以由除草剂抗性基因赋予。Della-Cioppa et al.(1987)Bio/Technology 5:579-84。也可以应用其他选择策略，例如包括，但不限于，对草铵膦、双丙氨磷的耐受性，和阳性选择机制(Joersbro et al.(1998)Mol.Breed.4:111-7)，这些策略视为在本发明实施方案的范围之内。

经由选择或筛选鉴定出转化的细胞，在支持再生的适当培养基中培养，然后可以让其成熟为植物。

目前公开的方法可以用于任何可转化的植物细胞或组织。如本文中使用的，可转化的细胞和组织包括但不限于能够进一步繁殖产生植物的细胞或组织。本领域技术人员认识到，许多植物细胞或组织是可转化的，其中在插入外源DNA之后并且在适当培养条件下，所述植物细胞或组织能够形成分化的植物。适用于这些目的的组织可包括但不限于，未成熟胚、盾片组织、悬浮细胞培养物、未成熟花序、芽分生组织、节点外植体、愈伤组织、下胚轴组织、子叶、根、和叶。

从转化的植物原生质体或外植体再生、发育、和培养出植物是本领域已知的。Weissbach和Weissbach(1988)Methods for Plant Molecular Biology,(Eds.)Academic Press,Inc.,San Diego,CA；Horsch et al.(1985)Science227:1229-31。这种再生和生长过程通常包括以下步骤：选择转化的细胞，培养这些细胞，使其经历胚发育和生根苗期的常规阶段。转基因胚和种子以相似的方式再生。在这种方法中，通常在选择培养基的存在下培养转化体，该选择培养基选择成功转化的细胞并诱导植物芽的再生。Fraley et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:4803。通常在两个月或四个月之内获得这些芽。此后，将产生的转基因的生根芽种植在适当植物生长介质(例如土壤)中。暴露于选择剂后存活的细胞、或者在筛选测定中已被评分为阳性的细胞，可以在支持植物再生的介质中进行培养。然后，将芽转移到适当的含有选择剂和阻止细菌生长的抗生素的根诱导培养基中。许多芽将产生根。然后，将这些芽移栽到土壤中或其他介质中，使根继续发育。如上所述的方法通常取决于所采用的具体植物株系而变化，因此方法的细节在本领域技术人员的自由裁量之内。

再生的转基因植物可以自花授粉，以提供纯合的转基因植物。或者，从再生的转基因植物获得的花粉可以与非转基因植物杂交，优选地与农艺学重要的种类的近交系杂交。相反，可以用来自非转基因植物的花粉对再生的转基因植物授粉。

该转基因植物可将转化的核酸序列传递至其后代。该转基因植物优选地对于转化的核酸序列而言是纯合的，并且该转基因植物在有性繁殖时，作为有性繁殖的结果，将该序列传递到它的所有后代。后代可以从转基因植物产生的种子长出。然后，这些另外的植物可以自花授粉而产生植物纯育系。

此外，可以评估来自这些植物的后代的基因表达等。可通过几种常用的方法，例如Western印迹、Northern印迹、免疫沉淀、和ELISA，检测基因表达。对于转化的植物，还可以分析导入DNA的存在以及由本发明的核酸分子和氨基酸分子赋予的表达水平和/或脂肪酸谱。本领域的技术人员知晓众多的可用于分析转化的植物的方法。例如，用于植物分析的方法包括但不限于Southern印迹或Northern印迹、基于PCR的方法、生物化学测定、表型筛选方法、大田评估、和免疫诊断测定。

特异性转化双子叶植物的方法是本领域技术人员熟知的。已经针对许多作物描述了利用这些方法进行的转化和植物再生，这些作物包括但不限于，拟南芥属成员、棉花(陆地棉)、大豆(Glycine max)、花生(Arachis hypogaea)、和芸苔属成员。已经公开了主要通过使用根癌土壤杆菌转化双子叶植物并获得转基因植物的方法，这些植物为棉花(美国专利5,004,863；美国专利5,159,135；美国专利5,518,908)；大豆(美国专利5,569,834；美国专利5,416,011；McCabe et al.(1988)Biotechnology 6:923；Christou et al.(1988)Plant Physiol.87:671-4)；Brassica(美国专利5,463,174)；花生(Cheng et al.(1996)Plant CellRep.15:653-7；McKently et al.(1995)Plant Cell Rep.14:699-703)；番木瓜；和豌豆(Grant et al.(1995)Plant Cell Rep.15:254-8)。

用于转化单子叶植物的方法也是本领域技术人员熟知的。已经针对许多作物描述了使用这些方法进行的转化和植物再生，这些作物包括但不限于，大麦(Hordeum vulgarae)；玉米(Zea mays)；燕麦(Avena sativa)；果园草(鸭茅)；水稻(Oryza sativa，包括籼稻和粳稻品种)；高粱(Sorghum bicolor)；甘蔗(甘蔗属类)；高羊茅(Festuca arundinacea)；草坪草种类(例如匍匐翦股颖、草地早熟禾、偏序钝叶草)；小麦(Triticum aestivum)；和苜蓿(Medicago sativa)。对于本领域技术人员而言容易想到的是，可以使用和修改许多转化方法，以便产生稳定的针对任何数量的感兴趣目标作物的转基因植物。

可以选择任何植物用于这里描述的方法中。根据本发明，优选用于改良的植物例如包括，但不限于，油料种子植物、拟南芥种类(例如，拟南芥)、琉璃苣(琉璃苣属类)、加拿大油菜(芸苔属类)、蓖麻(Ricinus communis)、可可豆(Theobroma cacao)、玉米(Zea mays)、棉花(棉属类)、海甘蓝属类(Crambespp.)、萼距花属类(Cuphea spp.)、亚麻属类(Linum spp.)、Lesquerella和池花种类(Limnanthes spp.)、Linola、旱金莲属(Tropaeolum spp.)、月见草属类(Oenothera spp.)、橄榄(Olea spp.)、棕榈(Elaeis spp.)、花生(Arachis spp.)、油菜、红花(Carthamus spp.)、大豆(Glycine和Soja pp.)、向日葵(Helianthas spp.)、烟草(Nicotiana spp.)、斑鸠菊属类(Vernonia spp.)、小麦(Triticum spp.)、大麦(Hordeum spp.)、水稻(Oryza spp.)、燕麦(Avana spp.)、高粱(Sorghum spp.)、和黑麦(Secale spp.)或其他禾本科成员。

本领域技术人员容易想到可以使用和修改许多转化方法，以便从任何数量的感兴趣目标作物产生稳定的转基因植物。

提供了以下实例，以便展示某些特定的特征和/或实施方案。这些实例不应当解释为将本发明限制于所述特定的特征或实施方案。

实施例

实施例I：材料和方法

用于预测硝酸盐调节基因的生物信息学分析：使用植物基因相互作用的网络模型进行生物信息学分析，以便鉴定硝酸盐调节基因。为了富集模型预测，利用了相应于硝酸盐处理的可用微阵列表达数据。Wang et al.(2003)，同上；Scheible et al.(2004)，同上；Wang et al.(2004)，同上；Gutierrez et al.(2007)，同上。

首先，选择所有拟南芥转录因子基因。其次，选择被硝酸盐显著调节的基因。第三，根据在比较每个微阵列分析中的处理实验和对照实验时所观察到的幅度(倍数变化)，给这些基因分配一个等级分数。第四，根据在网络模型中观察到的连接的数量，给这些基因分配一个等级分数。Gutierrez et al.(2007)，同上。高度连接的基因可能是“调节中心(regulatory hubs)”。Barabasi和Oltvai(2004)Nat.Rev.Genet.5:101-13。第五，我们根据基因家族的大小给这些基因分配一个等级分数。基因家族大小利用Gutierrez et al.(2004)Genome Biol.5:R53的方法使用BLASTCLUST^TM来确定。最后一个标准用来降低由于功能冗余所致的相应突变体中表型缺乏的可能性。最后，将所有独立获得的评分等级的中位数进行计算和排序，从而提供最后的基因列表。

植物材料和生长条件：在所有实验中使用了野生型拟南芥哥伦比亚-0型(“Col-0”)。使用的所有突变体也在Col-0背景中。tga1、tga4单突变体和tga1/tga4双突变体植物由Dr.Xinnian Dong,Duke University,North Carolina,USA友情赞助。Kesarwani et al.(2007)，同上。硝酸盐还原酶(NR)缺失突变系由Nigel Crawford,University of California San Diego,La Jolla,CA友情提供。Wang et al.(2004)，同上。所使用的标识中柱鞘(E374)的GFP系来源可从Pennsylvania大学的GFP增强子捕获系(trap line)获得。

使用不含氮的MS31改良的基本盐培养基(Phytotechnology Laboratories)以水培方式培育植物。这种培养基补充有0.5mM琥珀酸铵和3mM的蔗糖。在22℃下(在Percival温箱中)，在长白昼(16/8小时光照/黑暗)条件下14天之后，在第15天光周期开始时用5mM KNO₃或作为对照的5mM KCl以所指示的时间处理植物。为了对应答于硝酸盐处理的根进行表型分析，如上所述使幼苗生长，然后用5mM KNO₃或5mM KCl(作为阴性对照)处理3天。为了初生根测量，使用EPSON^TMPerfection V700Photo扫描仪获取植物图像，使用IMAGEJ^TM程序进行根测量。使用NIKON^TMEclipse 80i显微镜上的DIC光学器件对侧根进行计数。

RNA分离和RT-qPCR：按照制造商(Invitrogen)的使用说明，用试剂从整根分离RNA。按照制造商(Promega)的使用说明，使用ImProm-II^TM反转录酶进行cDNA合成。使用Stratagene MX3000P qPCR系统上的BrilliantGreen QPCR试剂进行RT-qPCR。相对于网格蛋白(Atg4g24550)将RNA水平标准化。如在图13中所示，所标绘的值相应于三个生物重复的均值±标准差；未发现统计差异均值(p<0.05)。

中柱鞘细胞的原生质体生成和细胞分选：使标记中柱鞘的增强子捕获系E374幼苗在以上所述的相同实验条件下生长。在第15天开始时，将用0.5mM琥珀酸铵作为唯一氮源以水培方式培育的植物用5mM KNO₃或5mM KCl处理2小时。收集根，根据Birnhaum等人(2005)Nat.Methods 2:615-9；和Giffordet al.(2008)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 105:803-8的方法通过纤维素酶和果胶裂合酶处理产生原生质体。使用FACS分离GFP24表达系并直接收集在裂解缓冲液中，该裂解缓冲液来自mirVana^TM总RNA提取试剂盒(Ambion,1560M)。如上所述进行cDNA合成和基因表达分析。

基因表达和网络分析：依照由Affymetrix提供的使用说明，进行cDNA合成、阵列杂交、和信号强度标准化。使用稳健的多阵列分析(RMA)，在R软件(Affymetrix)中将数据标准化。Irizarry et al.(2003)Biostatistics 4:249-64。将标准化的数据进行双因素ANOVA分析(P<0.05)，其中错误发现率为5％。为了ANOVA分析，使用了模型，该模型将给定基因Y的表达视为：

Y_i＝β₀T+β₁G+β₂TG+ε，其中Eq.1

β₀为全局均值；β₁、β₂和β₃分别为处理的效果、表型、和这两个因素之间的相互作用；ε为未解释的方差。

使用可通过VirtualPlant^TM(virtualplant.org)访问的“基因网络”(Genenetworks)工具，建立了具有显著的处理:基因型相互作用因子的基因的分子网络。蛋白质-DNA相互作用被包括在内，考虑上游基因区中的至少一个转录因子结合位点以及对该转录因子结合位点的高于基因组中所有上游序列中的平均发生率的过度表现(两个标准差)。为了改进调节的相互作用预测，将蛋白质-DNA相互作用过滤，使其仅仅包括在我们的微阵列实验中其表达值显著关联(P<0.05)的转录因子/目标对。使用Cytoscape^TM软件使产生的网络可视化。Shannon et al.(2003)Genome Res.13:2498-504。

染色质免疫沉淀(ChIP)测定：根据Saleh et al.(2008)Nat.Protoc.3:1018-25的方法进行ChIP测定。简言之，在第15天黎明(光周期的开始)用5mM KNO₃或作为对照的5mM KCl处理以水培方式以0.5mM琥珀酸铵为唯一氮源培育两周的植物。收集根，立即在室温在真空下，在1％福尔马林中固定10分钟。通过加入终浓度为0.125M的甘氨酸终止交联。

制备用于染色质分离的细胞核：将分离的染色质以1个周期15秒和40％幅度用超声处理22次(Dr.Hielscher GmbH Bioruptor)。移出1小等份的剪切的染色质用作对照(Input)。稀释的染色质用于以抗TGA1抗体进行IP，用非特异性IgG作为阴性对照。免疫沉淀的DNA利用以下引物组，通过定量PCR加以扩增：AtNRT2.1(正向，5’-CTATCCTGTATCACTGTATGTAACCAG(SEQ IDNO:17)；反向，5’-GGATGGATAGTCAACAATATGGTTGTG(SEQ ID NO:18))和AtNRT2.2(正向，5’-CTCAACAGAGGGAACACCGG(SEQ ID NO:19)；反向，5’-CCCAAAATATATTACAATGTAGTTG(SEQ ID NO:20))。

开发了分级系统来整合多种多样的数据类型，该系统将TGA1和TGA4鉴定为可能重要的控制拟南芥中氮应答的调节因子。我们以实验证明了TGA1和TGA4作为重要的氮应答调节子的重要性，并进一步证明TGA1和TGA4介导了涉及硝酸盐摄取和还原的重要基因的氮调节。还确定了TGA1和TGA4对于应答于硝酸盐的初生根生长和侧根生长都是重要的调节因子。这些结果将TGA1和TGA4转录因子鉴定为植物根氮应答中的重要调节因子。

实施例II：拟南芥中硝酸盐应答调节子的确定

根据在实施例I中提出的方法，基于硝酸盐处理的绝对应答，在每个实验中将转录因子评级(应答(诱导性或抑制性)最强者评级最好)。取每个实验的等级的平均值，产生一个硝酸盐调节分数。该分析的最佳候选者为TGA1(At5g65210)，它是一种以前未曾证实与硝酸盐应答相关的bZIP转录因子。TGA4(At5g10030)(一种与之密切相关的bZIP家族成员)也在评级中被发现，其分数较前者为低。鉴于它们的已经被报道的功能冗余(Kesarwani et al.(2007)，同上)，选择了TGA1和TG4进行进一步分析。

实施例III：硝酸盐调节TGA1和TGA4的表达

作为分析这些转录因子在硝酸盐应答中的可能作用的第一步，在硝酸盐处理之后在时程实验中测定了TGA1和TGA4mRNA水平。用0.5mM琥珀酸铵作为唯一氮源以水培方式将野生型Col-0植物培育两周。在第15天的光周期开始时，使植物暴露于5mM KNO₃或KCl(对照)。在其后1、2、4、和8小时，收获根器官，用于RNA分离。使用定量RT-qPCR，测定TGA1和TGA4的转录物水平，并用网格蛋白基因作为参考标准。mRNA是相对于时间0而言的。图1(A-B)。如图1A和1B中所示，在KNO₃处理之后TGA1和TGA4mRNA迅速积累，但是在KCl处理之后则没有，表明这些基因的表达是由根中的硝酸盐处理调节的。为了评估TGA1和TGA4的硝酸盐调节是否对于所有TGA家族成员都是普遍的(Jakoby et al.(2002)Trends Plant Sci.7:106-11)，测定了TGA2、TGA3、TGA5、TGA6、TGA7、TGA9、TGA10和PAN的mRNA水平。在以上所述的相同实验条件下，硝酸盐处理不影响这些其他TGA转录因子的表达，如在图13中所示。在相同实验条件下，硝酸盐处理不影响其他TGA转录因子的表达。这些结果表明，硝酸盐处理特异性地影响根中的TGA1和TGA4表达。

实施例IV：硝酸盐代谢物调节TGA1和TGA4的表达

为了评估所观察的调节是直接由于硝酸盐所致、或是由于在硝酸盐还原之后产生的N代谢物所致，在NR缺失突变体中进行了类似的实验。Wang et al.(2004)，同上。在以铵作为唯一氮源的水培基质中培育植物。在第15天的光周期开始时，收获根(时间0)或使其暴露于250mM KNO3、250mM KCl、5mMNH₄Cl、或5mM KCl指定的时间。收获根，分离总RNA用于RT-qPCR分析，并使用网格蛋白基因将RNA水平标准化。图1C和1D。

在NR缺失突变体中NR活性的缺乏阻止硝酸盐的还原，从而阻断下游信号的产生。Wang et al.(2004)，同上。因而，在野生型和NR缺失突变体中应答于硝酸盐的基因是直接被硝酸盐调节的。在NR缺失突变体中，TGA1和TGA4mRNA水平都在硝酸盐处理1小时之后被诱导。图1C和1D。然而，与野生型植物比较，在NR缺失突变体中的TGA1和TGA4mRNA的积累在硝酸盐处理之后显著降低。在硝酸盐处理之后的NR缺失突变体植物中检测出的TGA1和TGA4mRNA的水平增长虽然严重减少，但仍表明这些基因的表达受到硝酸盐和其他N代谢物的调节。

为了鉴定其他对TGA1和TGA4调节有贡献的N代谢信号，我们评估了在亚硝酸盐或铵处理之后随着时间变化的TGA1和TGA4mRNA水平。以前的研究表明，250μM的亚硝酸盐是获得亚硝酸盐应答基因诱导峰值的最佳浓度(Wang et al.,2007)。250μM亚硝酸盐诱导了TGA1和TGA4转录物水平(图1E和1F)。观察到这些基因在铵处理(图1G和1H)之后在mRNA水平方面没有显著变化，其中铵处理使用报道的用来评估GDH2和其他铵应答基因(Pattersonet al.,2010)的铵调节的条件(图14)。这些结果表明，在拟南芥根中TGA1和TGA4被硝酸盐和亚硝酸盐诱导。

实施例V：亚硝酸盐调节TGA1和TGA4的表达

为了鉴定其他对TGA1和TGA4调节有贡献的氮代谢信号，评估了在亚硝酸盐或铵处理之后随着时间变化的TGA1和TGA4mRNA水平。亚硝酸盐处理既诱导了TGA1转录物水平，又诱导了TGA4转录物水平。图2(A-B)。但是，在铵处理之后TGA1和TGA4都没有观察到mRNA水平的显著变化。图2(C-D)。这些结果表明，TGA1和TGA4是由在根中的硝酸盐和亚硝酸盐诱导的，表明这些转录因子可能涉及硝酸盐摄取和还原的初始N代谢步骤的调节。

实施例VI：TGA1和TGA4促进初生根和侧根生长

为了评估TGA1和TGA4对根生长和发育的影响，分析了对tga1和tga4单突变体和tga1/tga4双突变体植物用KNO₃或KCl(对照)处理3天的应答(Kesarwani et al.(2007)，同上)。测量了在上文所述的相同实验条件下水培生长两周的植物的初生根长度，以及在用5mM KNO₃或KCl处理3天之后的初生根长度。确切地说，用0.5mM琥珀酸铵作为唯一氮源以水培方式将植物培育两周。在第15天的黎明，用5mM KNO₃或5mM KCl处理幼苗3天。如实施例I中所述，测量了在这些条件下Col-0、tga1、tga4和tga1/tga4植物的初生根长度。图3。

在KNO₃处理和KCl处理的情况下，与野生型植物相比，tga1和tga4单突变体都显示出正常的初生根长度。图3A。在单突变系中表型的缺乏与这两种基因之间的高序列相似性(Xiang et al.(1997)Plant Mol.Biol.34:403-15)和它们的先前报道的在病理应答调节背景下的功能冗余一致(Kesarwani et al.(2007)，同上)。

与单突变体相反，tga1/tga4双突变体相比于用KNO₃处理的野生型植物显示出初生根生长减弱，但在KCl对照处理下则不然。图3A。此外，评估了在相同实验条件下应答于硝酸盐的侧根密度，硝酸盐处理增加了包含TGA1和TGA4等位基因的野生型(Col-0)植物中的侧根密度。然而，在硝酸盐处理下，tga1/tga4双突变体植物显示出侧根应答的改变，与野生型植物相比展示出侧根密度降低。图3B。

中柱鞘是中柱的最外部分，侧根从中柱鞘组织发出。Dolan et al.(1993)Development 119:71-84；Malamy和Benfey(1997)Development 124:33-44。为了评估硝酸盐处理是否调节中柱鞘细胞层中TGA1和TGA4的表达，以0.5mM琥珀酸铵作为唯一氮源以水培方式将中柱鞘标记品系植物培养两周。在第15天的黎明，用5mM KNO₃或5mM KCl处理幼苗2小时。从根制备原生质体，并通过FACS分选表达GFP的中柱鞘细胞。从这些中柱鞘细胞分离总RNA，并使用RT-qPCR测定TGA1和TGA4的mRNA水平。在中柱鞘细胞中，发现TGA1和TGA4mRNA在KNO₃处理之后积累，但是在KCl处理之后不积累。图4。这个结果表明，在中柱鞘细胞中TGA1和TGA4表达受到硝酸盐处理的调节，而中柱鞘细胞是侧根发生出现之处。这些结果表明，TGA1和TGA4对于应答于硝酸盐而调节根系结构是重要的。

实施例VII：由TGA1和TGA4控制的硝酸盐应答性基因网络

为了鉴定TGA1和TGA4的靶基因，这些基因可能是这些转录因子在氮存在下的初生根和侧根生长中所起作用的基础，我们使用拟南芥基因芯片(ATH1；Affymetrix)进行了转录组学分析，以评估硝酸盐在野生型和tga1/tga4双突变体植物的根中的作用。在以琥珀酸铵为唯一氮源的MS培养基中培育植物，如上所述用5mM KNO₃或KCl处理两小时。如实施例I中所述，从根器官分离总RNA，并准备用于基因芯片杂交。使用RMA将基因表达数据标准化，并根据Krouk et al.(2009)PLoS Comput.Biol.5:e1000326的方法使用双因素ANOVA确定差异基因表达。对于ANOVA模型考虑的因素为：植物基因型(G)、处理(T)、以及基因型与处理之间的相互作用(TG)，使用5％FDR来定义在基因表达上的显著变化。结果表明，在我们的实验条件下有827种基因受到硝酸盐处理(T)的调节。在这些实验中受到硝酸盐调节的基因的数量和性质与先前已经报道的关于拟南芥硝酸盐应答的全基因组分析是可比较的。Wang et al.(2003)，同上；Scheible et al.(2004)，同上；Wang et al.(2004)，同上。

鉴定了其中TG因子显著的96种基因。这96种基因相应于在tga1/tga4双突变体中其硝酸盐应答相比于野生型TGA1/TGA4植物发生了改变的基因。在该模型中仅有四种基因显示基因型是唯一的显著因素，表明tga1/tga4突变的作用在硝酸盐应答的背景下最为突出。总的来说，在tga1/tga4双突变体中，15％的基因显示出应答于硝酸盐的表达调节的改变。此外，97％的在tga1/tga4双突变体中具有基因表达改变的基因也受到硝酸盐的调节。这个结果将TGA1和TGA4与硝酸盐应答的特定方面紧密联系起来。

为了揭示其硝酸盐应答依赖于TGA1和TGA4的基因的调节性相互作用，使用可通过VirtualPlant^TM网站访问的基因网络(Gene Networks)工具产生了呈现显著TG因子的基因的网络视图。Katari et al.(2010)Plant Physiol.152:500-15。使用Cytoscape^TM使产生的网络可视化，其中基因被呈现为由显示调节性相互作用的边连接的节点。图5。根据该网络，TGA1和TGA4两者都正向调节硝酸盐转运蛋白NRT2.2.的表达。NRT2.2在拟南芥中对于硝酸盐摄取是重要的。Li et al.(2007)，同上。此外，在该网路中观察了涉及其他信号途径的基因，例如，丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶2A(PP2A，At5g25510)；蛋白磷酸酶2C(PP2C，At4g38520)；CBL-相互作用蛋白激酶3(CIPK3，At2g26980)；和生长素/吲哚-3-乙酸7(IAA7，At3g23050)转录因子。一些参与胁迫应答的基因，例如过氧化物酶类，也被发现受到TGA1和TGA4的调节。

这些结果表明，TGA1和TGA4应答于硝酸盐处理而调节涉及硝酸盐摄取、以及细胞信号、和胁迫应答的靶基因的表达。在tga1/tga4双突变体中，这种应答于硝酸盐处理的靶基因的表达调节改变可以解释观察到的表型改变。

实施例VIII：TGA1和TGA4在硝酸盐应答中的调节作用

我们的数据预测到，直接参与硝酸盐摄取的基因是TGA1和TGA4在硝酸盐应答中的靶点。为了确定参与硝酸盐摄取和还原的基因的表达在tga1/tga4双突变体中是否受到影响，在野生型和tga1/tga4突变体植物中进行硝酸盐处理之后，使用RT-qPCR测定了已知的硝酸盐应答基因NRT2.1、NRT2.2、NIA1和NIR的mRNA水平。确切地说，以铵作为唯一氮源，在水培系统中培养Col-0和ga1/tga4植物。在第15天光周期开始时，用5mM KNO3或5mM KCl(对照)处理植物指示的时间。分离RNA，通过RT-qPCR测定mRNA水平，其中用网格蛋白基因标准化。

在野生型植物中，所有四种基因NRT2.1、NRT2.2、NIA1和NIR都被硝酸盐处理高度诱导。然而，NRT2.1、NRT2.2、和NIR基因的硝酸盐诱导在tga1/tga4突变体中显著较低。图6A-B(在处理2小时之后，NRT2.1和NRT2.2分别比野生型低25％和48％)；图6C(在处理1小时之后，NIR比野生型低41％)。没有观察到NIA1的表达在野生型和tga1/tga4突变体植物之间有差异。这些结果表明应答于硝酸盐处理，NRT2.1、NRT2.2、和NIR受到TGA1和TGA4的调节。

为了确定参与硝酸盐还原的基因的表达是否受到TGA1和TGA4的调节，我们评估了在相同实验条件下NIA1和NIR的表达。没有观察到NIA1的表达在野生型和tga1/tga4突变体植物之间有差异。(图16)。然而，在tga1/tga4突变体中在硝酸盐处理之后1小时NIR基因的硝酸盐诱导显著较低(41％)(图6C)。这些结果表明NRT2.1、NRT2.2和NIR是TGA1和TGA4的靶基因。

由于TGA1和TGA4以组织特异性方式受到调节，我们评估了应答于硝酸盐处理的TGA1/TGA4靶基因的根细胞特异性表达。图11A和11B表明，表皮、内皮层中柱鞘和中柱中NRT2.1和NRT2.2受到硝酸盐的调节。与之相对的是，所有细胞类型中NIR都受到硝酸盐的调节。虽然在TGA1/TGA4表达区域与它们的靶基因之间存在重叠，但仍需要另外的调节因子来调制NRT2.1、NRT2.2和NIR应答于硝酸盐的组织特异性模式。

实施例IX：TGA1对NRT2.1和NRT2.2表达的影响

该网络模型也预测了TGA1对NRT2.2的表达的直接影响。一项先前的报道显示，NRT2.1和NRT2.2在拟南芥基因组内定位非常靠近。Orsel et al.(2002)Plant Physiol.129:886-96。另一研究提出，在NRT2.1和NRT2.2的硝酸盐应答中涉及相似的转录机制。Girin et al.(2007)Plant Cell Environ.30:1366-80。为了确定NRT2.1是否为TGA1的直接靶点，人工检查了NRT2.1的启动子区域，并发现距离转录起始位点的位置-309与-304之间有一个TGA1结合基序(Schindler et al.(1992)Plant Cell 4:1309-19)。这些发现表明NRT2.1和NRT2.2的表达直接受到TGA1的调节。

为了验证NRT2.1和NRT2.2的表达直接受到TGA1调节，使用TGA1-特异性抗体进行了染色质免疫沉淀(ChIP)测定，用非特异性IgG作为阴性对照。在第15天的黎明，用5mM KNO₃或5mM KCl处理植物20、60、或120分钟。对经免疫沉淀的DNA，使用针对含有TGA1结合基序的NRT2.1或NRT2.2启动子区设计的特异性引物通过qPCR加以定量。TGA1以硝酸盐依赖方式结合NRT2.1和NRT2.2启动子。图7。在与非特异性IgG的免疫沉淀中、或在KCl处理的植物样品中，没有观察到这些特异性占用。由此可见，TGA1是一种应答于硝酸盐处理而直接调节NRT2.1和NRT2.2基因表达的转录因子。而且，一旦在硝酸盐处理20分钟之后，即在TGA1的靶基因的启动子区中检测到TGA1，表明TGA1和TGA4在硝酸盐/亚硝酸盐的早期应答中起作用。

实施例X：TGA1/TGA4表型不是由于硝酸盐摄取缺陷所致

NRT2.1和NRT2.2是高亲和力转运系统(HATS)的一部分，该系统对于在低硝酸盐浓度下的硝酸盐摄取是必需的(Li et al.,2007)。Hu等人证明，可诱导NRT2.1的硝酸盐浓度的范围很宽，而NRT2.1硝酸盐应答由低亲和相和高亲和相组成(Hu et al.,2009)。如在图6A和6B中所示，TGA1和TGA4对于NRT2.1和NRT2.2在5mM KNO3(在低亲和力范围内的浓度)处理下的硝酸盐诱导是必需的。为了探讨TGA1和TGA4是否涉及在高亲和相中NRT2.1和NRT2.2的硝酸盐诱导，我们评估了在250μM KNO3或250μM KCl处理2小时之后的NRT2.1和NRT2.2基因表达。图12A和12B显示，TGA1和TGA4对于在250μMKNO3处理下的NRT2.1和NRT2.2的硝酸盐诱导是必需的。这些结果表明TGA1和TGA4在低亲和相和高亲和相中都是NRT2.1和NRT2.2基因表达的正调节子。

为了确定NRT2.1和NRT2.2在tga1/tga4双突变体中的表达降低是否影响硝酸盐摄取，我们使用¹⁵NO₃ ^-同位素标记进行了净硝酸盐摄取实验。如上所述以水培方式培养植物，并用以10％¹⁵NO₃ ^-富集过的250M或5mM NO₃ ^-处理指示的时间。发现净硝酸盐摄取在野生型和tga1/tga4双突变体植物中是相似的(图12C)。由于我们没有观察到在野生型和tga1/tga4之间在长期¹⁵NO₃ ^-暴露(8小时)中在硝酸盐摄取上的差异(图12C)，在图3A和3B中显示的观察到的tga1/tga4表型很可能不是由于硝酸盐吸收缺陷所致。这些结果表明，在tga1/tga4中应答于硝酸盐的对基因表达的影响可能是由于信号传导途径缺陷所致。

实施例XI：TGA1以硝酸盐依赖方式结合NRT2.1和NRT2.2启动子

该网络模型(图5)预测了TGA1/TGA4对NRT2.2的表达的直接影响。为了确定NRT2.1是否也是TGA1/TGA4的直接靶点，我们人工检查了NRT2.1的启动子区，并在距离它的转录起始位点的位置-1338和-1333以及-371和-266之间发现两个前人描述的TGA1结合基序(Schindler et al.,1992)。有趣的是，Girin等人(2007)使NRT2.1启动子缺失，以鉴定控制硝酸盐诱导的区域，他们观察到当缺失-456和-245之间的区域时，应答于硝酸盐的基因表达剧烈减弱(Girin et al.,2007)。由此可见，TGA1结合位点包含在NRT2.1启动子的某个区域中，这个区域对于基因表达的硝酸盐诱导是重要的。我们使用TGA1特异性抗体和作为阴性对照的非特异性IgG，利用染色质免疫沉淀(ChIP)测定来评估NRT2.1和NRT2.2是否为TGA1的直接靶基因。如上所述，在第15天的黎明，用5mM KNO₃或作为阴性对照的5mM KCl处理植物20、60、和120分钟。

对于经免疫沉淀的DNA，使用针对下述区域设计的特异性引物，通过qPCR进行定量：含有位于位置-371和-366的TGA1结合基序的NRT2.1启动子区、或含有位于位置-1287和-1282以及-1194和-1189的两个TGA1结合基序的NRT2.2启动子区。如在图7A和7B中所示，TGA1以硝酸盐依赖方式与NRT2.1和NRT2.2启动子结合。这种结合对于NRT2.1和NRT2.2启动子区是特异性的，而对这些基因的其他区域不是特异性的，因为当我们使用针对NRT2.1和NRT2.2编码序列设计的引物时，没有观察到扩增(图7)。NRT2.1应答于硝酸盐的表达水平是NRT2.2的三倍(图6)，因此NRT2.1启动子区比NRT2启动子区募集更多的TGA1。当我们扩增不受TGA1和TGA4调节的硝酸盐应答基因NIA1的启动子区时，没有观察到占用(图7)。在用非特异性IgG进行的免疫沉淀中、或在用KCl的对照条件下，没有观察到TGA1占用。这个结果表明，在进行硝酸盐处理时，TGA1被募集到NRT2.1和NRT2.2的启动子区来调节它们的表达。

实施例XII：在chl1-5和T101D突变体中，NRT2.1应答于硝酸盐的表达受到影响

使用在“材料和方法”中描述的实验条件，以水培方式培养Col-0、chl1-5、chl1-9和T101D植物。在第15天的光周期开始时，用5mM KNO₃或作为对照的5mM KCl处理植物指示的时间。分离RNA并通过RT-qPCR测量NRT2.1mRNA水平。使用网格蛋白基因(At4g24550)作为标准化参考。所标绘的值对应于三个独立生物重复的均值±标准差。(图15)星号表示在突变系和col-0之间显著不同的均值(P<0.05)。

实施例XII：pTGA1:GUS和pTGA4:GUS基因融合物的构建以及GUS活性测定

为了嵌合pTGA1:GUS和pTGA4:GUS基因融合，从来自拟南芥生态型Col-0的基因组DNA扩增TGA1和TGA4翻译起始密码子上游的2000bp片段。以下引物用来扩增TGA1和TGA4启动子，并被设计为导入BamHI和NcoI位点：TGA1启动子(正向，5’-TTGGATCCTTACTACGTCACCAGAATC(SEQ IDNO:21)和反向5’-AACCATGGTTTTCCTCAACTGAAAACAAAG(SEQ IDNO:22))和TGA4启动子(正向，5’-TTGGATCCAGAAGTTGTGGTCACC(SEQID NO:23)和反向5’-AACCATGGATTTCTTCAACTAGCAAC(SEQ IDNO:24))。用BamHI和NcoI消化重组质粒，将DNA片段连接到pCAMBIA 1381(CAMBIA,Canberra,Australia)中。通过DNA测序证实这些构建体的结构。然后通过电穿孔将这些构建体导入根癌土壤杆菌GV3101中。使用花序浸渍法(floral dip)方案完成根癌土壤杆菌介导的拟南芥植物转化(Clough and Bent,1998)。选择T1代种子对潮霉素的抗性。对于每个构建体获得了至少8个独立的转基因系，并通过PCR证实了转基因的存在。为了GUS活性的组织化学分析，将幼苗温育在37℃在加有1mM 5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷酸(X-Gluc)的GUS反应缓冲液(100mM磷酸钠缓冲液，pH 7.0，0.5mM铁氰化钾、0.5mM亚铁氰化钾、0.1％(vol/vol)Triton X-100、0.1％(wt/vol)十二烷基肌氨酸钠)中。在染色之后，用含0.24N HCl的20％甲醇在57℃温育15分钟清洗样品。该溶液用含7％NaOH、7％羟胺-HCl的60％乙醇代替，并在室温下温育15分钟。然后，将幼苗分别在40％、20％和10％乙醇中复水5分钟，然后在5％乙醇、25％甘油中浸润15分钟。将样品在50％甘油中包埋在显微镜用盖玻片上，然后使用Nikon Eclipse 80i显微镜上的DIC光学器件成像。对于每个标记系和处理，分析了至少15株植物。

Claims (26)

1.一种用于提高植物中的养分效率的方法，该方法包括：

将至少一种异源多肽导入植物的根组织中，其中所述异源多肽选自下组：TGA1、TGA4和它们的组合。

2.根据权利要求1的方法，其中如果所述异源多肽是TGA1，则该异源多肽选自SEQ ID NO.1。

3.根据权利要求1的方法，其中如果所述异源多肽是TGA 4，则该异源多肽选自SEQ ID NO.11。

4.根据权利要求1的方法，其中所述提高的养分利用效率包括与相同物种的植物相比提高的调节硝酸盐的效率。

5.一种用于提高植物中的根生长的方法，该方法包括：

将异源TGA1和/或TGA4多肽导入植物的根组织中，由此产生包含该异源TGA1和/或TGA4多肽的修饰植物，其中相比于不含该异源TGA1和/或TGA4多肽的相同物种植物，该修饰植物包含提高的根生长。

6.根据权利要求5的方法，其中所述根生长是初生根生长或侧根生长。

7.根据权利要求5的方法，其中导入所述异源TGA1和/或TGA4多肽包括将核酸导入所述根组织中，其中该核酸包含编码该异源TGA1和/或TGA4多肽的核苷酸序列。

8.根据权利要求5的方法，其中该方法包括使所述修饰植物在氮限制条件下生长。

9.根据权利要求5的方法，其中所述异源多肽是TGA1转录因子。

10.根据权利要求9的方法，其中所述TGA1转录因子包含与SEQ IDNO:1至少90％相同的氨基酸序列。

11.根据权利要求5的方法，其中所述异源多肽是TGA4转录因子。

12.根据权利要求11的方法，其中所述TGA4转录因子包含与SEQ IDNO:11至少90％相同的氨基酸序列。

13.根据权利要求7的方法，其中所述TGA1转录因子核苷酸序列包含与SEQ ID NO:15至少90％相同的核苷酸序列或与由SEQ ID NO:15组成的核酸杂交的核酸序列。

14.根据权利要求7的方法，其中所述TGA4转录因子核苷酸序列包含与SEQ ID NO:16至少90％相同的核苷酸序列或与由SEQ ID NO:16组成的核酸杂交的核酸序列。

15.根据权利要求1的方法，其中所述根组织是根细胞。

16.根据权利要求7的方法，其中所述编码异源TGA1和/或TGA4多肽的核苷酸序列与根组织特异性启动子可操作连接。

17.通过根据权利要求1的方法产生的修饰植物。

18.从权利要求17的修饰植物产生的种子。

19.一种核酸分子，其包含具有农艺功能的核酸序列，其中该核酸序列选自下组：与SEQ ID NO:15至少90％相同的核苷酸序列、与由SEQ ID NO:15组成的核酸杂交的核酸序列、与SEQ ID NO:16至少90％相同的核苷酸序列、和与由SEQ ID NO:16组成的核酸杂交的核酸序列，其中所述核酸序列与异源可转录多核苷酸分子可操作连接。

20.用权利要求19的核酸分子稳定转化的转基因植物细胞。

21.一种用于产生转基因植物的方法，该方法包括：

将核酸导入植物的根组织，其中该核酸包含编码异源TGA1和/或TGA4多肽的核苷酸序列，由此产生转基因植物。

22.根据权利要求21的方法产生的转基因植物。

23.从权利要求22的转基因植物产生的种子。

24.权利要求22的转基因植物，其中，相比于相同物种的野生型植物，该植物包含在图5中示出的基因的提高的表达。

25.权利要求22的转基因植物，其中所述基因是硝酸盐转运蛋白NRT2.1、硝酸盐转运蛋白NRT2.2、或亚硝酸盐还原酶(NIR)。

26.权利要求22的转基因植物，其中，相比于相同物种的野生型植物，该转基因植物包含提高的初生根和/或侧根生长。