CN110468146A - 调控豆科植物根瘤固氮能力的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及调控豆科植物根瘤固氮能力的方法，通过改变NIT在根瘤植物中的表达，显著调节根瘤植物的根瘤形成或固氮能力性状，在植物品质的遗传改良上具有良好的应用前景。

Description

调控豆科植物根瘤固氮能力的方法

技术领域

本发明属于生物技术和植物学领域，更具体地，本发明涉及调控豆科植 物根瘤固氮能力的方法。

背景技术

氮是各类生物生长发育所必需的主要元素之一。植物缺氮会使其生长发 育受阻，因此为植物生长提供可吸收的氮，同时保持土壤中有充足的氮素储 备是农业生产的关键问题。豆科植物通过两种途径获得氮，其一是直接吸收 土壤中的硝酸盐，另一是通过与根瘤菌共生互作。豆科植物是如何响应硝酸 盐信号，及这两种氮素吸收过程是如何协调的，目前没有任何报道。

豆科植物与土壤中的根瘤菌相互作用在宿主植物的根部形成一个侧生 器官——根瘤。在根瘤中，分化的类菌体能将空气中的N₂还原为氨供植物生 长利用，植物则提供根瘤菌生存所需的空间及碳水化合物等养分。

根瘤的形成和固氮酶活的维持是一个十分耗能的过程。目前研究显示， 豆科植物除了通过局部性和系统性机制来严格调控根瘤数目外，土壤中过量 的氮素存在时，也严重抑制豆科植物的根瘤形成及固氮酶活性的发挥，这种 现象被称之为“氮阻遏”效应。在不同的豆科植物中都发现了“氮阻遏”效 应，但其分子机制一直没有得到阐明，因而无法通过杂交或现代生物学技术 解除该效应。

豆科植物能与土壤中的根瘤菌建立共生关系，在其根部形成根瘤，根瘤 菌在根瘤中利用植物的光合产物固定空气中的氮气。因此，共生固氮虽然能 为植物提供生长所需要的氮，但产生过多的根瘤会影响植物的发育。因此植 物结瘤的多少受到宿主结瘤自我调节和环境因子的严格调控。硝酸盐对结瘤 具有很强的抑制作用，比如减少根瘤数目，根瘤生物量，固氮酶活性减弱以 及加速根瘤的衰老。目前已有研究表明硝酸盐对结瘤的抑制作用是通过系统 的和局部的两方面进行调节，然而对于硝酸盐抑制结瘤的分子机制仍不清楚。

当前中国大豆主要是通过进口来满足国民生产的需要。因此，豆科植物 与根瘤菌间共生固氮对环境和作物产量来说都非常重要，研究共生固氮的机 制有助于解决两方面的问题，一方面可以提高豆科植物自身的固氮效率，另 一方面为探索非豆科植物共生固氮的潜能提供科学依据。当前为了提高农作 物产量，世界各国，包括中国在内，大量增施工业化肥。但这些工业氮肥的 施加对农作物的产量提高已经极为有限了。与此同时，对环境，包括空气、 水体、土壤都造成了极大的污染，而且这种高氮土壤中也极大地抑制了豆科 植物与根瘤菌间的共生固氮效率。

因此，本领域需要对根瘤植物的菌根共生作用进行深入研究，以使得借 助基因工程技术来提高菌根共生效率成为可能。

发明内容

本发明的目的在于提供调控豆科植物根瘤固氮能力的方法。

在本发明的第一方面，提供一种调节根瘤植物的根瘤形成或固氮能力的 方法，包括：调节根瘤植物中NIT多肽的表达。

在一个优选例中，所述方法包括：下调根瘤植物中NIT多肽的表达，从 而促进根瘤形成、增加根瘤数、提高植物的固氮能力。

在另一优选例中，所述的根瘤是有固氮能力的根瘤，包括红瘤、粉色根 瘤。

在另一优选例中，所述的下调植物中NIT多肽的表达包括：下调或敲除 植物(包括局部组织，如根系)中NIT基因，或下调植物(包括局部组织，如根 系)中NIT多肽的表达或活性。

在另一优选例中，以NIT基因的核苷酸序列中的保守性区域为靶点抑制 NIT基因的表达；或通过采用CRISPR/Cas9系统进行基因编辑，从而敲除NIT 基因。

在另一优选例中，所述方法包括：上调根瘤植物中NIT多肽的表达，从 而抑制根瘤形成、减少根瘤数、下调植物的固氮能力。

在另一优选例中，所述的根瘤植物是NIT多肽表达不足的植物。

在另一优选例中，所述的根瘤植物是豆科植物。

在另一优选例中，所述的NIT多肽是豆科植物来源的NIT多肽。

在另一优选例中，所述的NIT多肽是苜蓿的NIT多肽，选自NIT1、NIT2、 NIT3、NIT4、NIT5；或

所述的NIT多肽是大豆的NIT多肽，选自NIT1、NIT2、NIT3、NIT4、 NIT5、NIT6、NIT7、NIT8、NIT9、NIT10。

在另一优选例中，所述的NIT多肽选自下组：

(a)如SEQ ID NO:2、4、6、8或10氨基酸序列的蛋白；

(b)将SEQ ID NO:2、4、6、8或10氨基酸序列经过一个或多个(如1-20 个；较佳地1-15个；更佳地1-10个，如5个，3个)氨基酸残基的取代、缺 失或添加而形成的，且具有(a)蛋白功能的由(a)衍生的蛋白；或

(c)与(a)限定的蛋白序列有70％以上(较佳地80％以上；更佳地85％以上； 更佳地90％以上；更佳95％以上，如98％，99％)同源性且具有(a)蛋白功能的 由(a)衍生的蛋白。

在另一优选例中，所述的植物为苜蓿，下调根瘤植物中NIT多肽的表达 包括：将构建物或含有该构建物的载体转染到植物中，所述的构建物含有式(I) 所示的结构：

Seq_正向-X-Seq_反向 式(I)，

式(I)中，

Seq_正向具有SEQ ID NO:13～17所示核苷酸序列；

Seq_反向具有与Seq_正向互补的核苷酸序列；

X为位于Seq_正向和Seq_反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq_正向和 Seq_反向不互补。

在另一优选例中，所述的植物为大豆，下调根瘤植物中NIT多肽的表达 包括：以sgRNA来进行基因编辑；较佳地，该sgRNA具有SEQ ID NO:18所 示核苷酸序列。

在另一优选例中，所述的NIT多肽通过调节豆科植物的“氮阻遏”现象 发挥作用。

在本发明的另一方面，提供用于促进根瘤形成、增加根瘤数、提高植物 的固氮能力的构建物，含有式(I)所示的结构：

Seq_正向-X-Seq_反向 式(I)，

式(I)中，

Seq_正向具有SEQ ID NO:13～17所示核苷酸序列；

Seq_反向具有与Seq_正向互补的核苷酸序列；

X为位于Seq_正向和Seq_反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq_正向和 Seq_反向不互补。

在另一优选例中，式(I)所示的结构在转入植物细胞转录后，形成式(II)所 示的二级结构：

式(II)中，Seq_正向、Seq_反向和X的定义如上述，

||表示在Seq_正向和Seq_反向之间的互补的关系。

在另一优选例中，所述的间隔序列(内含子序列)本身不构成互补双链结 构。

在本发明的另一方面，提供一种载体，所述的载体含有所述的构建物。

在本发明的另一方面，提供所述的构建物或所述的载体的用途，用于导 入到植物中，从而调节根瘤植物的根瘤形成或固氮能力。

在本发明的另一方面，提供一种用于促进根瘤形成、增加根瘤数、提高 植物的固氮能力的sgRNA，其具有SEQ ID NO:18所示核苷酸序列。

在本发明的另一方面，提供所述的构建物或所述的sgRNA的用途，用于 促进根瘤形成、增加根瘤数、提高植物的固氮能力。

在本发明的另一方面，提供一种NIT多肽或其编码基因用途，用于制备 调节根瘤植物的根瘤形成、根瘤数、固氮能力的试剂。

在本发明的另一方面，提供一种NIT多肽或其编码基因用途，用于作为 鉴定根瘤植物的根瘤形成能力或固氮能力的分子标记。

在另一优选例中，所述的NIT多肽是根瘤植物，较佳地豆科植物(如苜 蓿，大豆等)来源的NIT多肽。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显 而易见的。

附图说明

图1、NIT1～5-RNAi根系的结瘤硝酸盐耐受性。

(A)上排为明场下转基因根系的结瘤情况，下排为同一根系荧光显微镜 GFP荧光情况(GFP表达表示根系为转基因)。Bar＝1mm。

(B，C)对照组和NIT1～5-RNAi的转基因根系在处理7.5mM KCl(B)和 KNO₃(C)接种根瘤菌Sm1021 3周后的结瘤统计结果。其中，white为白瘤(没 有固氮能力)，pink为粉瘤(具有固氮能力)。

(D)Q-RT-PCR检测转基因植物中各个NIT的相对表达量。

图2、NIT1突变体根瘤形成增强对硝酸盐的耐受性。

(A)不同浓度硝酸盐处理时野生型(WT)和nit1的结瘤表型。Bar＝1mm。

(B)不同浓度硝酸盐处理时野生型(R108)和nit1突变体的结瘤数。其中， Bumps为有根瘤器官形成但没有根瘤菌侵入的结构。

(C)乙炔还原法测定野生型(R108)和nit1浇KCl或不同浓度KNO₃时固 氮酶活性。

图3、NIT4和NIT1在硝酸盐抑制结瘤上表现出功能冗余。

图4、NIT1突变体在充足硝酸盐条件下表现出氮饥饿表型。

野生型(WT)和NIT1突变体在含丰富氮源的土壤中生长6周的植株表型。

图5、NIT参与硝酸盐信号转导。

(A～B)R108和NIT1突变体在处理20mM KCl或KNO₃ 15min，1小时 和5小时后NiR1(A)和NRT2.1(B)的表达量检测。

图6、GmNIT1/Cas9发根转化植株在高氮下仍结瘤；Scale Bar＝5mm。

(A和B)野生型Willmas82在处理10mM KCl或KNO₃后的结瘤表型；

(C)利用Crisp Cas9技术敲除根系中的GmNIT1，在处理10mM KNO₃后的结瘤表型。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，发现NIT多肽在“氮阻遏”过程中起着重要 的作用，豆科植物的NIT类蛋白不仅仅调控硝酸盐信号转导，还对硝态氮抑 制根瘤形成过程中起着重要的作用，在植物品质的遗传改良上具有良好的应 用前景。

根瘤植物，特别是豆科植物，与根瘤菌间共生固氮对环境和作物产量来 说都非常重要，研究共生固氮的机制有助于解决两方面的问题，一方面可以 提高豆科植物自身的固氮效率，另一方面为探索非豆科植物共生固氮的潜能 提供科学依据。目前本领域对豆科植物共生固氮的分子机理的了解还很有限， 如结瘤因子信号途径中各信号分子的作用机理，宿主植物是如何调控侵染线 的形成及根瘤器官的发育等。

如本文所用，本发明的“根瘤植物”，主要指具有可供食用块根或地下 茎的一类的陆生作物。包括但不限于：大戟科的块根植物如苜蓿、旋花科的 块根植物如甘薯，茄科的块茎植物如马铃薯，薯蓣科的块根植物如山药，天 南星科的块茎植物如芋头、魔芋，豆科块根植物如葛根，菊科块茎植物如洋 姜，雪莲果等。较佳地，所述的“根瘤植物”是“豆科植物”。

本发明还包括NIT多肽的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片 段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的NIT多肽相同的生 物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一 个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多 肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii) 在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)附加的氨基酸序列 融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类 似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

任何一种NIT多肽的生物活性片段都可以应用到本发明中。在这里，NIT 多肽的生物活性片段的含义是指作为一种多肽，其仍然能保持全长的NIT多 肽的全部或部分功能。通常情况下，所述的生物活性片段至少保持50％的全 长NIT多肽的活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持全长NIT多 肽的60％、70％、80％、90％、95％、99％、或100％的活性。

在本发明中，术语“NIT多肽”指具有NIT多肽活性的SEQ ID NO:2、 4、6、8或10序列的多肽。该术语还包括具有与NIT多肽相同功能的、SEQ ID NO:2、4、6、8或10序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)： 若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个， 还更佳如1-8个、1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/ 或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内， 更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸 进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端 添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括 NIT多肽的活性片段和活性衍生物。

多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突 变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与NIT多肽DNA杂交的DNA 所编码的蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含NIT多肽或其片段的融合 蛋白。

任何与所述的NIT多肽同源性高(比如与SEQ ID NO:2、4、6、8或10 所示的序列的同源性为70％或更高；优选的，同源性为80％或更高；更优选 的，同源性为90％或更高，如同源性95％，98％或99％)的、且具有NIT多肽 相同功能的蛋白也包括在本发明内。

发明还提供NIT多肽或多肽的类似物。这些类似物与天然NIT多肽的差 别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异， 或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通 过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定 点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L- 氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基 酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

应理解，虽然本发明的NIT多肽优选获自苜蓿，但是获自其它植物的与 苜蓿NIT多肽高度同源(如具有70％以上，如80％、90％、95％、甚至98％序 列相同性)的其它多肽也在本发明考虑的范围之内。比对序列相同性的方法和 工具也是本领域周知的，例如BLAST。

本发明还涉及编码本发明NIT多肽或其保守性变异多肽的多核苷酸序 列。所述的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、 基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可 以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO:1、 3、4、5或9所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简 并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO:2、4、6、8或10的蛋白 质，但与SEQID NO:1、3、4、5或9所示的编码区序列有差别的核酸序列。

编码SEQ ID NO:2、4、6、8或10的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码 成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽 的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码所述多肽的多核苷酸，也 可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地 至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。

本发明的NIT基因的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、 重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有 关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或 按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有 关序列。

本发明也涉及包含所述的多核苷酸的载体，以及用所述的载体或NIT基 因序列经基因工程产生的宿主细胞。

基于本发明人的新发现，本发明还提供了一种调节根瘤植物的根瘤形成 或固氮能力的方法，该方法包括调节所述根瘤植物中NIT多肽的表达。

更优选地，所述的方法包括：降低所述根瘤植物中NIT多肽的表达(包括 使NIT多肽不表达或低表达)，从而调节根瘤形成或固氮能力，包括：促进根 瘤形成、增加根瘤数、提高植物的固氮能力。

可以采用本领域人员熟知的多种方法来降低NIT多肽的表达或使之缺失 表达，比如将携带反义NIT基因的表达单位(比如表达载体或病毒等)递送到 靶点上，使得细胞或植物组织不表达或降低表达NIT多肽。

作为本发明的一种实施方式，提供了一种降低植物中NIT多肽的表达的 方法，所述的方法包括：

(1)将干扰NIT基因表达的干扰分子转入植物组织、器官或种子，获得 转化入所述干扰分子的植物组织、器官或种子；和

(2)将步骤(1)获得的转入了所述干扰分子的植物组织、器官或种子再生 成植物。

作为一种优选的实例，所述的方法包括步骤：

(i)提供携带可干扰基因表达的载体的农杆菌，所述的载体选自下组：

(a)含有反方向启动的NIT多肽的编码基因或基因片段(反义分子)的载 体；

(b)含有可在植物体内形成特异性干扰NIT多肽的编码基因表达(或转录) 的成分的干扰分子的载体；

(ii)将植物的组织或器官与步骤(i)中的农杆菌接触，从而使所述载体转 入植物组织或器官。

较佳地，所述方法还包括：

(iii)选择出转入了所述载体的植物织或器官；和

(iv)将步骤(iii)中的植物组织或器官再生成植物。

基于NIT基因的核苷酸序列，可以设计出在导入植物体后可形成特异性 干扰NIT基因表达的分子的多核苷酸。设计时要考虑到特异性以及干扰的效 率。本发明对干扰分子的制备方法没有特别的限制，包括但不限于：化学合 成法，体外转录法等。应理解，本领域技术人员在得知了NIT基因与植物性 状的相关性以后，可以以各种途径制备出所述的干扰分子，从而用于调节植 物性状。所述的干扰分子可通过转基因技术被输送到植物体内，或还可采用 本领域已知的多种技术被输送到植物体内。

作为本发明的特别优选的方式，提供了一种效果优异的干扰分子，所述 的干扰分子可特异性的干扰NIT基因的表达；并且经验证，其具有良好的干 扰NIT基因表达的效果。所述的干扰分子是含有SEQ ID NO:13～17所示的 核苷酸序列的分子。

本发明还提供了一种干扰分子，所述干扰分子含有以下结构：Seq_正向为 NIT基因片段，Seq_反向为与Seq_正向互补的多核苷酸；X为位于Seq_正向和Seq_反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq_正向和Seq_反向不互补。

所述的干扰分子在导入到植物体内后，可折叠成稳定的茎环结构，茎环 结构的茎部两侧包含基本上互补的两条序列。也即，形成如下所示的二级结 构：

其中，||表示在Seq_正向和Seq_反向之间的基本上互补的关系。所述的茎环 结构可被植物体内的各种物质进一步作用、加工或剪切，并且形成双链 RNA(dsRNA)。通常，所述的干扰分子位于表达载体上。

作为本发明的优选方式，通过敲除NIT基因，从而下调植物中NIT基因 的表达。较佳地，采用CRISPR/Cas9系统进行基因编辑，从而敲除NIT基因。 合适的sgRNA靶位点，会带来更高的基因编辑效率。

作为本发明的优选方式，敲除NIT基因的方法包括：将sgRNA或能形 成所述sgRNA的核酸、Cas9mRNA或能形成所述Cas9mRNA的核酸共转入 植物细胞中；获得转基因植物；其中，所述的sgRNA的靶序列是SEQ ID NO: 18所示的核苷酸序列。可以采用已知的方法来使得sgRNA及Cas9被引入到 细胞内。

本发明还包括利用前述任一种方法获得的植物，所述的植物包括：转入 了NIT基因或其同源基因的转基因植物；或者NIT多肽表达量(包括低表达 或不表达)降低的植物等。

可采用任何适当的常规手段，包括试剂、温度、压力条件等来实施所述 的方法。

此外，本发明还涉及利用NIT多肽或其编码基因作为一种基因转化植株 后代的追踪标记。本发明还涉及利用NIT多肽或其编码基因作为一种分子标 记，通过检测植物中NIT多肽的表达情况，鉴定植物的性状。还可利用NIT 基因相关的植物特性作为杂交制种过程中真杂种的指示标记。

本发明人发现，豆科植物中，NIT在硝酸盐信号转导和硝酸盐抑制结瘤 过程都扮演着重要角色。本发明通过改变NIT在根瘤植物中的表达，从而显 著调节根瘤植物的根瘤形成或固氮能力性状。本发明对氮素抑制共生固氮机 理的研究开辟了新的视角，也为利用分子育种，获得新品种提高豆科植物共 生固氮效率及作物产量提供了重要的基因资源，在植物品质的遗传改良上具 有良好的应用前景。

在当前土壤与水体中氮素含量较高，极大的限制了豆科植物发挥共生固 氮的潜能。本发明人的发现不仅对探索硝酸盐抑制结瘤机理的研究具有重要 作用，还对解除豆科植物根瘤形成过程中的“氮阻遏”现象提供了分子机理， 还为通过分子育种技术，获得根瘤形成的耐氮植物，从而提高豆科植物固氮 效率及产量，提供了重要的基因资源。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于 说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实 验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第 三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

材料和方法

RNA干扰及转基因植物的制备

分析NIT DNA序列，选取特异部分设计引物，以蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)A17根新鲜cDNA为模板PCR得到约150～200bp片段，再以PCR 产物为模板进行第二轮PCR后纯化后通过BP反应交换进入pDONR207并测 序。测序确保无误后通过LR反应将片段导入pUB-GWS-GFP载体测序，经 测序无误后将载体转化到农杆菌AR1193，通过发根转化在根系中组成型表 达，从而干扰相应NIT。

结瘤实验

处理种子，将吸涨种子置于4℃冰箱，2天后22℃黑暗倒置培养约12h， 种子下胚轴伸长至约1cm。将萌发种子转移到蛭石珍珠岩(1：1)中，同时均匀 施加相应浓度KCl或KNO₃，在种子萌发后5～7天，接种根瘤菌OD₆₀₀≈0.02。 在此期间每3天均匀施加一次相应浓度KCl或KNO₃，接菌后3周观察植物结 瘤表型。植物的生长条件为：温度22℃/18℃(昼/夜)，光照周期16h/8h(昼/夜)， 光照强度为250μmol·m^-2·s^-1，相对湿度为70％。

qRT-PCR

RNA的提取：

1.取150mg植物样品，用液氮研磨粉碎植物材料后，转移至RNAse-free 1.5 mL离心管中，加入1mL Tripure，涡旋震荡混匀，室温静置10min。

2.取出样品4℃12,000rpm，离心10min，吸取上清至新RNAse-free 1.5mL 离心管中。

3.加入0.2mL氯仿，上下剧烈震荡15s，室温静置15min。

4.取出样品4℃12,000rpm，离心10min。

5.取上清至新RNAse-free 1.5mL离心管中，加入等体积的酚：氯仿：异戊 醇(25：24：1)，震荡混匀。

6.取出样品4℃12,000rpm，离心10min。

7.取上清至新RNAse-free 1.5mL离心管中，加入等体积的氯仿，震荡混匀。

8.取出样品4℃12,000rpm，离心10min。

9.取上清至新RNAse-free 1.5mL离心管中，加入1/10体积2M醋酸钠 (PH＝4.0)和2倍体积无水乙醇，-20℃沉淀30min。

10.取出样品，4℃12,000rpm，离心10min。

11.倒去上清，加入1mL预冷75％乙醇轻轻上下颠倒洗涤沉淀，4℃7,500 rpm，离心5min。

12.倒去上清，4℃7,500rpm，离心5s，将管壁上液体离心至管底，用移 液器将管底液体吸干，置于超净工作台中晾干5min。

13加入RNAse-free H₂O，65℃水浴10min，立即冰浴2～3min让RNA充 分溶解。

14.取1～2μL RNA进行测定OD₂₆₀和OD₂₈₀数值，计算浓度和纯度。其余 RNA样品-70℃保存备用。

反转录

参照北京全式金生物技术有限术公司全式金反转录试剂盒进行，获得反转 录产物。

进行定量PCR：(1)配制反应液(10μL体系)：5μL SYBR Green，0.2μL GeneSpecific Forward Primer，0.2μL Gene Specific Reverse Primer，0.2μL Dye，0.4μLcDNA，4μL ddH₂O；(2)将反应液加入PCR板中，1,000rpm，离心5s；(3)用 ABI Step one Plus系统进行定量分析，程序为：1个循环(95℃，2min)；40个 循环(95℃，15s；55℃，15s；72℃，20s)。MtUB作为定量内参。

乙炔还原法测定

(1)将接种根瘤两周植物洗净，取根部用吸水纸将水分吸干，置于5mL玻 璃管中，盖上盖子，确保玻璃管密封完好。

(2)用注射器取500μL乙炔气体注射入玻璃管中，置于28℃反应30min。

(3)待30min后，立即取出样品，用送样针取30μL样品注射入气象色谱仪。

(4)读取所送样品的乙炔和乙烯含量，称量根部重量，计算固氮酶活性。

实施例1、豆科植物NIT多肽的分析：调节硝酸盐对根瘤形成的抑制作 用

本发明人在豆科植物中对NIT类的蛋白进行了分析，发现蒺藜苜蓿、百 脉根和菜豆基因组中各有5个NIT多肽，而大豆(Glycine max)中由于基因组 增倍，有10个NIT类蛋白。

蒺藜苜蓿NIT1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1，其编码的氨基酸序列如 SEQ ID NO:2。

蒺藜苜蓿NIT2的核苷酸序列如SEQ ID NO:3，其编码的氨基酸序列如 SEQ ID NO:4。

蒺藜苜蓿NIT3的核苷酸序列如SEQ ID NO:5，其编码的氨基酸序列如 SEQ ID NO:6。

蒺藜苜蓿NIT4的核苷酸序列如SEQ ID NO:7，其编码的氨基酸序列如 SEQ ID NO:8。

蒺藜苜蓿NIT4的氨基酸序列如SEQ ID NO:9，其编码的氨基酸序列如 SEQ ID NO:10。

蒺藜苜蓿NIT1的核苷酸序列如下(SEQ ID NO:1)：

atgggagatggtgctgcagtgacatcatctgcaaccaataccatgatggaagctccaccacaagatgaaaatttaatggattttgattacatgagtgaacttttgttggatggttgttggttggaagcttctgctgatggatctgagttcttgctgcaaagttctcctttttccaatccaatctttgacccttcattctcttggcctgtcttggagaacaacgagcaacccggcaatgatgttcggcatgagtctcaagatgttcctcttggtactgagcaggaaagccggattatagttaataatgctggtagtagcgacctgcagcagtgtgagtttaagactcatttgggtgaaggggttagtaggttgtggattccaccgacgcctaatccaggacctggtggatcttccataacagaaaagctgataagggccctcaagtggatcaaagatttcaataggaacaaagatatgcttatacaaatatgggtgccggttaatagaggggatgataggccaattctgagagctaatgatcttcctttttcacttgaatcaaggtctttaaaccttgcaaagtaccgagaaatctctgtgagatatcagttttctgcagaggtggaggactcaaaggagttggtggcgggtttgcctggtcgagtttatagggataagattcctgagtggacacctgatgttcgattcttcaggagtgatgagtatccacgagttgaccatgctcaagagtgtgatgtacacggaacattagcggttccagtgtttgaacaagggagcaggacatgtttgggagttattgaagtggtgatgacgacacaacagagcaactatggccgtgaacttgagactgtttgcaaagcgctagaggttgttgatctcagcagctctggacattcaagtcctcagaatgtgaaggcatgtgtcaagtcctatgaaaccgcactacccgagattcaagaggttttgagatctgcatgtgaaatgcacaaattacctttagctcagacgtgggtctcttgcatccaacagggaaaagatggctgccggcactctgatgataattacacacactgtatatctccggtggagtatgcttgctatgttggtgattcctcggtcaggtttttccatgaggcttgcatggagcatcacttattaataggtcaaggtgttgccgggggtgcttttatgacaaatcaaccgtgcttctcaaccgacataacttctttaagcaagacagactatccactgtctcatcatgccaggttgtttggattgcgtgctgcagttgccattcgactccgaagcatctatagtatctcagacgactatgttcttgagttcttcttgcctgtagattgcaatgacggtgaagaacagaaaaagatgctcacatcattgtccatgattattcaaagggtttgccgcagcttgcgagttataacagataaggaattggagaaaaataacttatcatctaatgaagtgatggccgttgctgatattggatttgctaccgatgcagttcagtcgggactccaacacaagaggatggctgtctcattggacggcgaagaaaagtttaatgaaacaatgtctagcaagttctcggaacaaaggcggcaacaagaaagtcttactttaagaggagatgctgactgtggtagggagtgttctccttctgtcgagggtaacttcttgtcaagtttgggagtaaatagaacaggagagaaaagacgggccaaggcagagaaaaccatcactcttcaagtccttagacaatatttcgctggaagtctaaaagatgctgcaaagaatattggcgtctgtactacaactctgaaaaggatatgcaggcaacatggtataaagcgttggccttctcggaagataaaaaaggttggtcattccttgcagaaacttcaactcgtcattgactcggttcaaggtgcctctgggtcatttcaaattgattccttctattcaaaattctcggatctatcgtctccaaatttatcaggaagcaccctaatctcaactctgaatcaagttgataatccagtctcattaagcatacagccagatcccgactcgttgagtccagaaggtgcatcgaaatcaccttcctcttcatgtagtcagagttcctattcaagccattcctgttccagcttgtcagagcaacaacaccacacaaacaatgttgctgctggcaacaaagattcattggttggtgaagactctgtcgatgttgtgttgaagagaatcagaagtgaagcagaacttaaaagcctgattccagataataaatcaaaactcatgccaagatcacaaagccaggaaacacttggtgaacacccgaaaaccgagtatcgcaagtccttattaaaaaccactcgcaaagcgtctcaaaaggaggatgctcatagagtaaaagttacatttggagatgagaaaacccggtttaggttgccaaagatctggtgttatgaagatcttgtgcaggaaattgctaggagatttaatgtaagtgaaatgagcaaatttgatatcaaatatttggacgatgattatgaatgggtattactaacttgtgatgcagatttagaggagtgcatcgatgtttctcaatcttctgagactagtaccatcaaactttgtctgcaaccctccagtaattttatcaggagttctttagaatttagatag

蒺藜苜蓿NIT1的氨基酸序列如下(SEQ ID NO:2)：

MGDGAAVTSSATNTMMEAPPQDENLMDFDYMSELLLDGCWLEASADGSEFLLQSSPFSNPIFDPSFSWPVLENNEQPGNDVRHESQDVPLGTEQESRIIVNNAGSSDLQQCEFKTHLGEGVSRLWIPPTPNPGPGGSSITEKLIRALKWIKDFNRNKDMLIQIWVPVNRGDDRPILRANDLPFSLESRSLNLAKYREISVRYQFSAEVEDSKELVAGLPGRVYRDKIPEWTPDVRFFRSDEYPRVDHAQECDVHGTLAVPVFEQGSRTCLGVIEVVMTTQQSNYGRELETVCKALEVVDLSSSGHSSPQNVKACVKSYETALPEIQEVLRSACEMHKLPLAQTWVSCIQQGKDGCRHSDDNYTHCISPVEYACYVGDSSVRFFHEACMEHHLLIGQGVAGGAFMTNQPCFSTDITSLSKTDYPLSHHARLFGLRAAVAIRLRSIYSISDDYVLEFFLPVDCNDGEEQKKMLTSLSMIIQRVCRSLRVITDKELEKNNLSSNEVMAVADIGFATDAVQSGLQHKRMAVSLDGEEKFNETMSSKFSEQRRQQESLTLRGDADCGRECSPSVEGNFLSSLGVNRTGEKRRAKAEKTITLQVLRQYFAGSLKDAAKNIGVCTTTLKRICRQHGIKRWPSRKIKKVGHSLQKLQLVIDSVQGASGSFQIDSFYSKFSDLSSPNLSGSTLISTLNQVDNPVSLSIQPDPDSLSPEGASKSPSSSCSQSSYSSHSCSSLSEQQHHTNNVAAGNKDSLVGEDSVDVVLKRIRSEAELKSLIPDNKSKLMPRSQSQETLGEHPKTEYRKSLLKTTRKASQKEDAHRVKVTFGDEKTRFRLPKIWCYEDLVQEIARRFNVSEMSKFDIKYLDDDYEWVLLTCDADLEECIDVSQSSETSTIKLCLQPSSNFIRSSLEFR-

蒺藜苜蓿NIT2的核苷酸序列如下(SEQ ID NO:3)：

atggaaggccaatattcgtcaaaggagaggggtggaatcagcctttggacaccatttgatagtggaatgaaaagttcattaaattcagatgacatgtttaacaacatctccgagcttatgaactttgatagctatgctggttggtgcaatggttcatcatcaataactgatcaaactttaactaatgatctttcatcatttgcatatgatggattgaatttatctgaacacataaatggtccattttttatgacagaaattggtggaaattacaatgttatggatagttatgatgaaaaagtgctattacaagaaatggaaactcaacttgagttcttagataataattcaaatgaaacaaataataatttagattcacaacaaaatggttcatatgatatgtgcaattacataatatcaaaatcacctagttggtcacttgatgagagaatgatgagtgctttatccttctttaaggaatcagctggtggaggaatactagcacaagtttgggcacctataaagtatggtgatgacttcatcctaactacaagtgatcaaccatatttgttagatcaaaagcttgcaggttaccgcgaagtttcgaggtcgtttacgttttctgcagaaatgaaaatgggatcttgttgtgctggacttcctggtcgcgtgtttaactcgcatgttcctgaatggacctctaatgttggttactaccataaatctgagtacttgagattagatcatgctattagtcacgaggttcggggatcaatcgctcttcctatatctgatatgaactctgaagtttcatgttgtgctgtacttgaacttgtcactacaaaggaaaagcctaattttgacaaagaattagaatttgtttctcatgcacttcagcgtgtgaatctaaggactattatgcctccacgacttcttcctcagtgtgtatcaagtaacaaaagagctgcattaacagagataactgatgtgttaagagctgtttgtcatgcacatagtctaccactagcactgacatggattccatgttgttatagtgaaggaaaaggtgaagaatctgagcgaatacgaattaaagaaggccatataacaagttctaatgaaaaatgtgtattatgtattgaagaatcagcttgctatatcaatgataaaatggtaggaggatttgttcatgcatgttctgaacatcatcttgaggaaggacaaggtatatctggaaaagctcttcaatcaaatcatccattcttctataccgatgtgaaggcttatgatgttagtgaatatccacttgttcatcacgcgagaaaatataacttgaatgctgccgttgcaattaggctaaggagtacttatactaatgatgatgattatgtgttagaattctttcttccgatcaatatgatagggagttcggaacaacaacttttattagacaatttgtcagatactatgagaagaatttgcaagagtttgaggacagtttcagaagctgaactaagagggatggaaggttctcaatatgagtttcaaaaggaaaatgtctcaggtttttttcctatgtctcgggggaactctcagatagcgttcagtagtggtgacaatgatttattccagatgtcattcaacgaaacgaacctaaaaaatagtggaaatcaagctgcttacagtcaggcaacaagtggatcaagaaagcaggctgagaaaaagaggagtgcagtggagaagaatgttagcttgagtgttctccaacaatacttttctggtagtctgaaggatgctgcaaaaaaaataggggtttgtccaacaactctgaagagaatatgcagacaacatggaatttcaagatggccatcgcgcaagataaataaagttaatcgttcattgaagaaaatacaaaccgtgcttgattctgtccaaggagttgaaggagttctgaaatttgaccctcacactggtggatttgttgcaggaggttcaatcatccaacaaattggtaagcataataaaactctcaagttccctgagaaagcctcggtacctaagttggaggatgaagatgttcttgtttctaactcatgcgaggtggaattggagaaagacaatgctatttctgttgactgtattgaagattcaacaacatggctttggacaaagactcaggattgtcctaaacaaaccactatagattatgttcttgaaaaagaacaagatcaatgtgggttggacaatagcagtttgcatgatattggctctcatagttctttttcaatgattgaacttggtttcgaagagggaaaaggagctgatgaacataacaaccctacttcttcaagcatgaccgattcatcaaatgcctctggctcaatggtgaatggaagttcatcaggatctcaaagcattgagaatcagaagcactcgaaagtcaaatcaatttgtgtcgatagtgagtcgaaattcgctgtcaaagctaactatagaggagacactattcgtttcaagttcgatccatctgtaggttgttgtcaactctatgaagaagttgcaaaaaggtttaagttacaaaatggttctttccaactcaagtatcttgatgatgaagaggaatgggtgatgttggtgaatgactcagatttgaaggaatgtgtagaggttttgagtgatattggtacacattgtgtgaagttgctcgttcgcaatatacatggcggcagtgacagttga

蒺藜苜蓿NIT2的氨基酸序列如下(SEQ ID NO:4)：

MEGQYSSKERGGISLWTPFDSGMKSSLNSDDMFNNISELMNFDSYAGWCNGSSSITDQTLTNDLSSFAYDGLNLSEHINGPFFMTEIGGNYNVMDSYDEKVLLQEMETQLEFLDNNSNETNNNLDSQQNGSYDMCNYIISKSPSWSLDERMMSALSFFKESAGGGILAQVWAPIKYGDDFILTTSDQPYLLDQKLAGYREVSRSFTFSAEMKMGSCCAGLPGRVFNSHVPEWTSNVGYYHKSEYLRLDHAISHEVRGSIALPISDMNSEVSCCAVLELVTTKEKPNFDKELEFVSHALQRVNLRTIMPPRLLPQCVSSNKRAALTEITDVLRAVCHAHSLPLALTWIPCCYSEGKGEESERIRIKEGHITSSNEKCVLCIEESACYINDKMVGGFVHACSEHHLEEGQGISGKALQSNHPFFYTDVKAYDVSEYPLVHHARKYNLNAAVAIRLRSTYTNDDDYVLEFFLPINMIGSSEQQLLLDNLSDTMRRICKSLRTVSEAELRGMEGSQYEFQKENVSGFFPMSRGNSQIAFSSGDNDLFQMSFNETNLKNSGNQAAYSQATSGSRKQAEKKRSAVEKNVSLSVLQQYFSGSLKDAAKKIGVCPTTLKRICRQHGISRWPSRKINKVNRSLKKIQTVLDSVQGVEGVLKFDPHTGGFVAGGSIIQQIGKHNKTLKFPEKASVPKLEDEDVLVSNSCEVELEKDNAISVDCIEDSTTWLWTKTQDCPKQTTIDYVLEKEQDQCGLDNSSLHDIGSHSSFSMIELGFEEGKGADEHNNPTSSSMTDSSNASGSMVNGSSSGSQSIENQKHSKVKSICVDSESKFAVKANYRGDTIRFKFDPSVGCCQLYEEVAKRFKLQNGSFQLKYLDDEEEWVMLVNDSDLKECVEVLSDIGTHCVKLLVRNIHGGSDS-

蒺藜苜蓿NIT3的核苷酸序列如下(SEQ ID NO:5)：

atggaatacccttattattctaagggaggaggaattgggtattggcagtctcctggaactcagttcgaagggccaacatcattagatggtggaatcaacaatttggtgtcagaagatatgcctaacagcttctccgagctcatgaactttgatacttatgctggtttgtgttctggcccatccacgaccgatcagattatgactaatgagcttccatctcttgcctcagcattgtatcaattgcctgatggattcaatccagtcgaaccgaacagtggacaattctatggtggaaattacaataatttcgaaagctcccctatttttggggagaaaattgtgtgtcagcaaatggataccctacttggtttcttagacaatagcaatgatgcaaataactcaagttctaggcaaaaatttgacgacccttcgcaacatgtcaacgcctttgatatgggcaattacgttattgccaggccacaagctttaatctccaggccacctgctttgtcacttgatgagagaatgctgaaagccttgtccttctttaaagaatcagctggtgggggaatattggcacaagtttgggtacccataaagcatgatggtcaagtactcttaagcaccagcgagcaaccttatttactagatcaaatgcttgcagggtatcgtgaagtttcaaggacatttagattttctacagaagggaaaccaggttgtataccgggtcttcctggccgtgtgtttatctccaaagttcctgagtggacttccaatgttggttattacaatccaaaggagtacttgagggctgagcatgcaagaaatcacgaggttcgtggatcgattgcttttcccatatttgatctgcactctggactgccatgttctgctgtcttggaacttgtcactacaaaggaaaagcttgattttgacagagagttggaaataatttgtcggtcacttcaggacttagatgtctcaatacaaagatatcacggagaattttgtagtttggccagcaaagtatcttatgtgttcgttggtgattggtcgcttgtaaatttaaggactactgcgtcttctcggctgcttcctgagtgtctttcgaccaataaaagagctgctttaacagagatagtagatgtgttacgatctgtgtgttatgcacatagattgccattggcactaacatggattccctgtttttatactgacggcacaagagacgaaactactagaatacaaattaaagagggtaattcaagttctagagaaaaaaacatactgtgtattgaagaatcagcttgctatataactgatagagtgatggaaggatttgtgcatgcatgcattgaacatcctcttgaggaagggaatggtgtagctgggaaagcacttcaatcaaaccatcctttcttctattctgacgtgaaaacatatgatattagcgagtatccgcttgttcatcatgcacgcaagttcaatttgggtgctgcagttgcaatcaggctaaggagtatttataccaataatgatgattacatattggaattctttcttcctatcaatatgaaagggagttcagaacagcaactcttattagacaacctctcaggtaccatgcagaaaatttgtaagagtttgaggacagtttcaggcgctgaaatatcaggaatggaaagctcagtggtggggtttggaaagaaaaatgtcccaagtttcccctccacatctacgaggaactctcaggtatcattaataaatgaaaaggatggttctgttcagaagctatcattggatacttctaacctgagaaacaatggaaacaagccttcttgtaatcaggaaaataatggatcgagaaggcgagttgagaaaaaaagaaacacatcagagaagaatgttagcttgagtgttcttcagcaatacttttctggtagtctgaaggatgctgcaaaaagcattggtgtttgcccgacaactctgaaaaggatatgcaggcatcacggaatttcaagatggccatcccgcaagattaataaagtgaatcgttctttgaagaaaattcagactgtgctggactctgttcagggagttgaaggcgggttgaagtttgatccttcctcgggagcatttgtggcaggagggacaaccacagaagaaatcaatgaaaataaaagtctccttttccctgagagaagtactacacaagactctgagcctatgtcacaaaatgctgtatcggttcctagtgaagatgagaatttggaaaataagtgggagggaaaattgaaggaaaccaatacttgttcgatcgattgcagtgaagattcaaaatcatttgcaatggatgattgtcctgaacaagcttatattggttccgttcttgcaaaatgtgatgaatgggttctaaacaatggcggtttgagagaagaaaaacgtaaacatagtactattggccagaggacaagttcctttgctgttgatgagatggacactggtgcggatggggatgatgatgatgttgttgaacacaaccatcctacttcttcaagcttgacagattcgtctaatggctctggttcaatgatacatggcagttcatcaggttatcagaactttaagaaccagaagccgtccaaaggcaaatcaaccatagttgatagcgggtctaaaatcgttgtgaaagctacctatggagaagacaccattcgtttcaagtttgatccatccacaggttattataaactatatgaagaagttgcagcaagattcaaactacaagacggatcattccagctcaaatatctagatgatgaagaagaatgggtgatgttagtgaacgactcagatttgcaagtgtgtttggaaatattgaatgacatggggacacataatgccaggtttcttgttcgcgatattccttgtacttttggcagctctggcagtagcagttgctac ttgggaggcagctcatag

蒺藜苜蓿NIT3的氨基酸序列如下(SEQ ID NO:6)：

MEYPYYSKGGGIGYWQSPGTQFEGPTSLDGGINNLVSEDMPNSFSELMNFDTYAGLCSGPSTTDQIMTNELPSLASALYQLPDGFNPVEPNSGQFYGGNYNNFESSPIFGEKIVCQQMDTLLGFLDNSNDANNSSSRQKFDDPSQHVNAFDMGNYVIARPQALISRPPALSLDERMLKALSFFKESAGGGILAQVWVPIKHDGQVLLSTSEQPYLLDQMLAGYREVSRTFRFSTEGKPGCIPGLPGRVFISKVPEWTSNVGYYNPKEYLRAEHARNHEVRGSIAFPIFDLHSGLPCSAVLELVTTKEKLDFDRELEIICRSLQDLDVSIQRYHGEFCSLASKVSYVFVGDWSLVNLRTTASSRLLPECLSTNKRAALTEIVDVLRSVCYAHRLPLALTWIPCFYTDGTRDETTRIQIKEGNSSSREKNILCIEESACYITDRVMEGFVHACIEHPLEEGNGVAGKALQSNHPFFYSDVKTYDISEYPLVHHARKFNLGAAVAIRLRSIYTNNDDYILEFFLPINMKGSSEQQLLLDNLSGTMQKICKSLRTVSGAEISGMESSVVGFGKKNVPSFPSTSTRNSQVSLINEKDGSVQKLSLDTSNLRNNGNKPSCNQENNGSRRRVEKKRNTSEKNVSLSVLQQYFSGSLKDAAKSIGVCPTTLKRICRHHGISRWPSRKINKVNRSLKKIQTVLDSVQGVEGGLKFDPSSGAFVAGGTTTEEINENKSLLFPERSTTQDSEPMSQNAVSVPSEDENLENKWEGKLKETNTCSIDCSEDSKSFAMDDCPEQAYIGSVLAKCDEWVLNNGGLREEKRKHSTIGQRTSSFAVDEMDTGADGDDDDVVEHNHPTSSSLTDSSNGSGSMIHGSSSGYQNFKNQKPSKGKSTIVDSGSKIVVKATYGEDTIRFKFDPSTGYYKLYEEVAARFKLQDGSFQLKYLDDEEEWVMLVNDSDLQVCLEILNDMGTHNARFLVRDIPCTFGSSGSSSCYLGGSS-

蒺藜苜蓿NIT4的核苷酸序列如下(SEQ ID NO:7)：

atgtcagaacctgaagaagaaaatcaagactttcctcccaagacaaaaacatcattagaagaacatggttgttctatggattttgacctagatttagaaacatcatggcctttggatcacatgtcctttatcaccaatcccatgtcaccttttttattttcaaacatctctgatcaaccttcttctcctctttggacttttactgatggagaagatggcaaacttgcagcttcagctttatctgattgccacaagatcttctcttgtgattcaaattcaataactgagaagctggtggagaaagacgacaacaaaacacttttgccacctcttttgccaccaatagagaatttggatggatattgtgtaatcaaggaaaagatgacacaagcgcttcgttactttaaagagtggactgaactgaatgttctggctcaggtttgggcacctgtgaggaatggtaatcggtatgtacttacaacttcaggtcaaccctttgtccttgatccgcatagtaatggactcaatcagtatagaacggtctccctgatgtacatgttttctgtggatggagagaacgatggaactctaggacttcctggtcgagtttttcagcagaaactaccagaatggtctcccaatgttctgtactattctaataaagagtatccccgccgagatcatgctcaacattacaacgttcgtggaaccttggctttgcctgtatttgaaccttcgttgcagtcgtgtatcggtgtgatagagttgatcatgacttcactaaagattaactatgctcctgaggttgaaaaaatctgcaaagccctagaggcagtaaatttgaggagctcagagtttttggaccatccattcactcagatttgcaatgaagggcgtcaaaatgcattatcggagatcttagagatattgacagtggtgtgtgaaactcataatctacctctagcccaaacatgggttccctgtaggcataggagtgttttggctcatggtggcggtttcaagaaaagttgttcgagttttgatggtagttgcatggggcaagtatgcatgtcgacaactgaggcagcagcctatattgtagatgctcatttatggggcttcagagaggcatgtgtcgagcatcacttacaacaaggtcaaggtgttgcgggtagggcgtttttgtctcaaaccatgagcttctgcacaaacattacccagttctgcaagacagattaccctttggttcattatgctctcatgtttgggttaacaagctgttttgcaatctgtttgcggagttttcatacaggaaatgacgattatgtattagagttttttctgcctcctgggatcactgaatttcatgaacagaagacgctgttgggatccatattttcaacaatgaaacagcattttcagagtcttaacattgctgctggtgttgaactcgaggaaaatggttcaattgaaattattgaagcaactgatgaaggcattcgtcttagaaccgaatctattcctattgctcaatctattaaatcaccacctagacccgatgcctcaccaaatatggaggacgaagaggagggagtaccacaggatccatcagaggttcgtggtgaaaatgtaggtggaagtgttgatccgatgtctaccttagggaataaaaacataaagaaaccctcagagaggaaacgtggaaaaactgagaaatcaattagtcttgaagttctacaacgttattttgctgggagtcttaaagatgctgcaaagagccttggtgtttgccctactacaatgaagcgtatctgcaggcagcatgggatatctcgttggccatctcgaaagatcaacaaggttaaccgttccctatccaagctcaaacgtgttattgaatctgtccaaggcgctgaaggagcgtttgatttgaattctcttggtaataatcaacttccaattgttagttcatttcctgagccttctactctgaataagtccagccagcaaggctcgttaagcaataggccgtcagagcctcagatgaaagagaatgaatttgatgcctctaaagtatcagaaacaaacttacagattgtaatggaaaatcaattgctaggaggaaggaaacatagtcttgagaaagaagtgattaatggtaaaggcgtgactattcaggaaattggaaaggaccgaaaaaggaatagaactaggagtggctcgagcgaagatagcacaaaccctacttctcatggttcatgccacggtagtcccccaattgaaattccaaccataaaagatctgttcattccatccaacaatgaacaacatgttgtgttgaggagatcgccagagccaggaatgcagccgactaatgctttaaactctccaactgctcaccgtatggtggacaatgtgatagcagaacttcaagagccatttggaggattgctaatagaggacgctggaagttcgaaagacttgagaaatttgtgtccttcagtagctgaggccattttggaggatatggctccagaagcttgtggtaacaactttccaggttcatcacatctggctcctcctaaacaatgcatagatactatcaataattcagcgacgccttttgcagctagaaaagaaatgaagactgtaactattaaggcaacatatagagaagatatcataaggtttagggtctctttgaactgtggcattgtggaattgaaagaagaagtttccaaaagattgaaacttgaggttggcacatttgatatcaagtacatggacgatgataatgaatgggttttgatagcatgtgatgcagaccttcaggagtgcatgtatctttcaagatcatccggaggaagcaacataatccgggttttagtgcatgacataacatcgaatcttggaagctcctgtgagagttcaggggagtga

蒺藜苜蓿NIT4的氨基酸序列如下(SEQ ID NO:8)：

MSEPEEENQDFPPKTKTSLEEHGCSMDFDLDLETSWPLDHMSFITNPMSPFLFSNISDQPSSPLWTFTDGEDGKLAASALSDCHKIFSCDSNSITEKLVEKDDNKTLLPPLLPPIENLDGYCVIKEKMTQALRYFKEWTELNVLAQVWAPVRNGNRYVLTTSGQPFVLDPHSNGLNQYRTVSLMYMFSVDGENDGTLGLPGRVFQQKLPEWSPNVLYYSNKEYPRRDHAQHYNVRGTLALPVFEPSLQSCIGVIELIMTSLKINYAPEVEKICKALEAVNLRSSEFLDHPFTQICNEGRQNALSEILEILTVVCETHNLPLAQTWVPCRHRSVLAHGGGFKKSCSSFDGSCMGQVCMSTTEAAAYIVDAHLWGFREACVEHHLQQGQGVAGRAFLSQTMSFCTNITQFCKTDYPLVHYALMFGLTSCFAICLRSFHTGNDDYVLEFFLPPGITEFHEQKTLLGSIFSTMKQHFQSLNIAAGVELEENGSIEIIEATDEGIRLRTESIPIAQSIKSPPRPDASPNMEDEEEGVPQDPSEVRGENVGGSVDPMSTLGNKNIKKPSERKRGKTEKSISLEVLQRYFAGSLKDAAKSLGVCPTTMKRICRQHGISRWPSRKINKVNRSLSKLKRVIESVQGAEGAFDLNSLGNNQLPIVSSFPEPSTLNKSSQQGSLSNRPSEPQMKENEFDASKVSETNLQIVMENQLLGGRKHSLEKEVINGKGVTIQEIGKDRKRNRTRSGSSEDSTNPTSHGSCHGSPPIEIPTIKDLFIPSNNEQHVVLRRSPEPGMQPTNALNSPTAHRMVDNVIAELQEPFGGLLIEDAGSSKDLRNLCPSVAEAILEDMAPEACGNNFPGSSHLAPPKQCIDTINNSATPFAARKEMKTVTIKATYREDIIRFRVSLNCGIVELKEEVSKRLKLEVGTFDIKYMDDDNEWVLIACDADLQECMYLSRSSGGSNIIRVLVHDITSNLGSSCESSGE-

蒺藜苜蓿NIT5的核苷酸序列如下(SEQ ID NO:9)：

atgcaaaagtcagaagaagaaaatcatgaccttcctcaaaagtcaaaaccactagatgaaaatgtgttttccatggattatgatattgactttgaaacttcatggcctttggatcatatatctaactccatgcatccttttttcttgcaaaatatctctgaacaacctttttcacctatttggactttttctgatgatgatcacaacattgcagcttcaggtaacaacaaaaacataataactgaaaaccgagtcgaaaatgatgacaagcataaacgtgtgacaccccatataggtctaccacctttacaaaatccacatggttattgcctaatcaaggaaagaatgacacaagctcttagaaacttcaaagagttaactgaactgaatgttcttgctcaagtttgggcgcccgtgaggaatggaagtcggtataaactcacaacttcaggccaaccatttgttctcgatgcacatagtaatggacttcatcagtacagaacagtttctttgatgtatatgttttctgttgacggagaaaacgacgaagttttaggacttcctggaagagtttttcagcagaagttacctgaatggactcctaatgttcagtattattctagtaaagagtattcaaggctaaatcatgctctacattataatgttcgcggaactttggctttgccggtgtttgaacctccaggacaatcatgtgttgctgtgttggaattgattatgacttcacagaagattaactatgctcctgaagtggataaagtctgcaaagcacttgaggcagtaaatttgaggagttcagaaattttggagcatccatacagtcagatatgtaacgaagatagacagaatgcattatccgagattttggagatattgacagtggtgtgtgaaactcataatttacctttggcacaaacatgggttccatgcaggcatagaagtgttttggctcatggtggtggtctaaagaaaaattgctcaagttttgatggttattgtatgggacaagtttgcatgtcaataaccgaggtagcattctatatcatagattctcacacatggggtttccatgatgcatgtgttgaacatcacttacaacaaggtcaaggagttgccggaagagcttttttgtctcaaaacatgtgtttctgtagaaacattactcaattctgcaaaaccgattaccctttagtacactatgctctcatgtttgatttaacaagctctttttcaatatgtttacaaagttctcataccggaggtgatgattatgtactagagttttttcttcctcctagtatcaataaattttgtgaacaaaagggtttgttaggatcaatattggcaacaatgaaacaaaatttccaaagtcttaaggttgcttctggcgttgaacttgaggaagatggatcagttgaaattgttgaaataataaatggaacagttcattcgaggcttgaatcagttccgattattcaatctactaaattatcagctagacatgatgatgcctcgccggatatggaggagggagtgccactagatcaatcacgacagaaaataatcacaaattttgatgacataaatgatataggaaatcttgatgattatgcaggtggaagcattgatcagatccattccttgaagactgaaaccaaaaagaaaccgtcgttgagaaaacgcggaaaagctgagaaatcaattagtcttgaagtcttgcaagattatttcagtgggagtctaaaggatgctgcaaagagccttggagtttgtccaactacaatgaagcgaatctgcaggcagcacggaatatcccgttggccttctcgaaagatcaaaaaggttaaccgttcgctgtccaagctcaaatgtgtgattgaatcggtccacggtgttgaaggagcatttggtttggattctccaagtacaagcacaatccctattgctgctggttcctttaatgaaccttctacttcgaacaagtttgaacaccatacctcattaagcataatgccatcagaacctaagaagaacgaaaattatttagatgcatctaaatcagaacctcaaaaaccattaggaggaatgctaatcgaaggtgctgatagttctaaagacttgaaaaatctgtgtccttcaacagatgttgttttggaggatcaggtcctagaagcttcaaggattcatcctccatgttctgattttgttcatatgcaaatgcagcacatggatactcttaattttgcagctcagaaagagatgaagattgtgactataaaggcaacatatagagatgatatcataaggtttagggtttcttggaactgtggcattgtggaattgagagaagaaattgctaaaagactgaaactagaggtagggacatttgatatcaagtatttggatgatgatcaagagtggatattggtagcttgtgatgcagatttacaggagtgcatggacattttaacattatcaggaagcaacattatccggcttgttgtgcatgatattttgtccat tcttggaagctcggttgagagctcaggggaatga

蒺藜苜蓿NIT5的氨基酸序列如下(SEQ ID NO:10)：

MQKSEEENHDLPQKSKPLDENVFSMDYDIDFETSWPLDHISNSMHPFFLQNISEQPFSPIWTFSDDDHNIAASGNNKNIITENRVENDDKHKRVTPHIGLPPLQNPHGYCLIKERMTQALRNFKELTELNVLAQVWAPVRNGSRYKLTTSGQPFVLDAHSNGLHQYRTVSLMYMFSVDGENDEVLGLPGRVFQQKLPEWTPNVQYYSSKEYSRLNHALHYNVRGTLALPVFEPPGQSCVAVLELIMTSQKINYAPEVDKVCKALEAVNLRSSEILEHPYSQICNEDRQNALSEILEILTVVCETHNLPLAQTWVPCRHRSVLAHGGGLKKNCSSFDGYCMGQVCMSITEVAFYIIDSHTWGFHDACVEHHLQQGQGVAGRAFLSQNMCFCRNITQFCKTDYPLVHYALMFDLTSSFSICLQSSHTGGDDYVLEFFLPPSINKFCEQKGLLGSILATMKQNFQSLKVASGVELEEDGSVEIVEIINGTVHSRLESVPIIQSTKLSARHDDASPDMEEGVPLDQSRQKIITNFDDINDIGNLDDYAGGSIDQIHSLKTETKKKPSLRKRGKAEKSISLEVLQDYFSGSLKDAAKSLGVCPTTMKRICRQHGISRWPSRKIKKVNRSLSKLKCVIESVHGVEGAFGLDSPSTSTIPIAAGSFNEPSTSNKFEHHTSLSIMPSEPKKNENYLDASKSEPQKPLGGMLIEGADSSKDLKNLCPSTDVVLEDQVLEASRIHPPCSDFVHMQMQHMDTLNFAAQKEMKIVTIKATYRDDIIRFRVSWNCGIVELREEIAKRLKLEVGTFDIKYLDDDQEWILVACDADLQECMDILTLSGSNIIRLVVHDILSILGSSVESSGE-

实施例2、RNAi下调蒺藜苜蓿NIT的表达：增强了根瘤形成及提高对 硝酸盐的耐受性

1、RNAi结果

为了探索NIT多肽是否调控硝酸盐抑制根瘤形成的过程，本发明人在蒺 藜苜蓿中确定了五个NIT特异区域，对这五个NIT特异区域进行RNA干扰。 通过发根转化获得含有转化根系的复合植株。

蒺藜苜蓿NIT1的核苷酸干扰序列如下(SEQ ID NO:13)：

GAGATGGTGCTGCAGTGACATCATCTGCAACCAATACCATGATGGAAGCTCCACCACAAGATGAAAATTTAATGGATTTTGATTACATGAGTGAACTTTTGTTGGATGGTTGTTGGTTGGAAGCTTCTGCTGATGGATCTGAGTTCTTGCTGCAAAGTTCTCCTTTTTCCAATCCAATCTTTGACCCTTCATTCTCTTGGC CTGTC

蒺藜苜蓿NIT2的核苷酸干扰序列如下(SEQ ID NO:14)：

GTTGGTGCAATGGTTCATCATCAATAACTGATCAAACTTTAACTAATGATCTTTCATCATTTGCATATGATGGATTGAATTTATCTGAACACATAAATGGTCCATTTTTTATGACAGAAATTGGTGGAAATTACAATGTTATGGATAGTTA TG

蒺藜苜蓿NIT3的核苷酸干扰序列如下(SEQ ID NO:15)：

CCATCCACGACCGATCAGATTATGACTAATGAGCTTCCATCTCTTGCCTCAGCATTGTATCAATTGCCTGATGGATTCAATCCAGTCGAACCGAACAGTGGACAATTCTATGGTGGAAATTACAATAATTTCGAAAGCTCCCCTATTTTTG

蒺藜苜蓿NIT4的核苷酸干扰序列如下(SEQ ID NO:16)：

GAGATATTGACAGTGGTGTGTGAAACTCATAATCTACCTCTAGCCCAAACATGGGTTCCCTGTAGGCATAGGAGTGTTTTGGCTCATGGTGGCGGTTTCAAGAAAAGTTGTTCGAGTTTTGATGGTAGTTGCATGGGGCAAGTATGCATGTCGACAACTGAGGCAGCAGCCTATATTGTAG

蒺藜苜蓿NIT5的核苷酸干扰序列如下(SEQ ID NO:17)：

ATGCAAAAGTCAGAAGAAGAAAATCATGACCTTCCTCAAAAGTCAAAACCACTAGATGAAAATGTGTTTTCCATGGATTATGATATTGACTTTGAAACTTCATGGCCTTTGGATCATATATCTAACTCCATGCATCCTTTTTTCTTGCAAA ATATCTCTGAACAAC

2、结瘤实验结果

为了研究NIT多肽是否抑制根瘤形成的过程，本发明人进一步进行了结 瘤实验。

结瘤实验表明，这些转化植株在低氮时(7.5mM KCl)能形成红色根瘤， 结瘤没有任何异常(图1A，B)。在处理7.5mM硝酸盐(7.5mM KNO₃)后对照 组只能形成少量白色根瘤、不能形成有固氮能力的红瘤，但NIT1，NIT3，NIT4， NIT5RNAi的转基因根系中却能形成粉色根瘤及较大的白瘤，且形成的总根 瘤数较对照多，NIT2RNAi的转基因根系虽然未形成粉红色的根瘤，但是其 形成的根瘤数较对照多，形成的根瘤也较对照组大(图1A，C)。

3、qRT-PCR结果

本发明人通过qRT-PCR研究NIT2RNAi的转基因植株中NIT表达是否 发生变化。

结果如图1D所示，qRT-PCR的结果表明，转化根系中的NIT表达量确 实下调。

由上述实验的结果表明，苜蓿中的五个NIT RNAi根系都在不同程度提 高植物的结瘤的硝酸盐耐受性。

实施例3、蒺藜苜蓿MtNIT1突变体根瘤形成对硝酸盐的耐受能力增强 1、反向筛选

通过反向筛选蒺藜苜蓿Tnt1插入突变体库，得到两个NIT1的插入突变 体，分别命名为NIT1-1(苜蓿NIT1核苷酸的第3700bp处插入大片段导致功 能缺失)和NIT1-2(苜蓿NIT1核苷酸的第3610bp处插入大片段导致功能缺 失)。

蛋白分析表明，两个突变体植株nit1-1和nit1-2中，都没有NIT1蛋白 的表达。

2、结瘤实验

结瘤实验发现，nit1-1和nit1-2在不存在硝酸盐的条件下，根瘤形态和 野生型基本一致(图2A)。

并且，在土壤中随着硝酸盐的浓度增加，NIT1突变体还能形成可以固氮 的粉色根瘤，表现出较高的硝酸盐耐受性(图2A)。

3、根瘤菌侵染、根瘤器官发育和根瘤中固氮酶活性

观测野生型蒺藜苜蓿(R108)和nit1-1突变体的侵染事件，发现nit1突变 体对于根瘤菌的侵染有着较强的耐受性。

不同浓度硝酸盐处理时野生型(R108)和nit1突变体的结瘤数如图2B，可 见随着硝酸盐浓度的增加，NIT1突变体对于根瘤菌的侵染仍有着比野生型显 著更强的耐受性。

本发明人应用乙炔还原法测定野生型(R108)和nit1-1浇KCl或不同浓度 KNO₃时固氮酶活性。结果如图2C，随着硝酸盐浓度的增加，nit1突变体的 固氮酶活性显著强于野生型。

上述实验表明，NIT1在根瘤菌侵染、根瘤器官发育和根瘤中固氮酶活性 方面，对硝酸盐都有着较强的耐受性。

4、NIT突变体的RNAi

同时，在野生型和nit1突变体背景下再干扰NIT4，来观察结瘤表型。采 用前述同样的方法，本发明人将NIT4RNAi构建表达在nit1突变体和野生型 中，获得野生型及突变体nit1背景下干扰NIT4的转化植株(EV)，观察对nit1 突变体进行NIT4RNAi后的植物性状。

结果发现，与野生型以及nit1突变体相比，NIT4RNAi的nit1突变体转 基因植物能形成更多的粉色固氮根瘤(图3)。

该结果表明，NIT1在调控根瘤形成中的“氮阻遏”过程中有功能冗余的 情形。

实施例4、MtNIT1参与硝酸盐信号转导

本发明人观察了NIT1突变体的表型，在有氮的条件下，表现出氮素缺 乏的表型，主要包括：(1)成株植物略矮小：在营养丰富的土壤中生长6周后， 与野生型相比nit1-1和nit1-2均表现出植株矮小，地上部分侧枝少和叶片较 小等表型(图4)。(2)主根长，侧根少：在种子萌发10天后测量野生型、NIT1-1 和NIT1-2主根时发现，nit1-1和nit1-2的主根均显著长于野生型。这与蒺藜 苜蓿缺少硝酸盐生长发育的表型较为相似。结合拟南芥中NIT1参与植物硝 酸盐信号转导，同时控制上百个与硝酸盐同化吸收和转运相关基因的表达， 因此，NIT1很可能参与蒺藜苜蓿硝酸盐信号转导。

为了验证NIT1参与硝酸盐信号转导过程，本发明人通过实时荧光定量 PCR(Q-RT-PCR)技术检测了硝酸盐信号的报告基因NiR和NRT2.1的表达模 式。研究发现，野生型蒺藜苜蓿在处理20mM KNO₃ 15min后，NiR1和NRT2.1 的表达显著上升(图5)；在nit1-1和nit1-2中NiR1和NRT2.1的表达在未处 理硝酸盐时均显著低于野生型，虽然在硝酸盐处理之后略有上调，但是其表 达水平相对野生型仍有显著差异(图5，A和B)。分别处理KNO₃ 1小时和5小时后，在野生型中硝酸盐响应基因NiR1和NRT2.1能够被硝酸盐诱导，但 在nit1中两者的表达量均维持在较低水平(图5A和B)。

结果表明，豆科植物中的NIT1多肽不仅具有调控硝酸盐信号转导的功 能，还在根瘤形成过程中的“氮阻遏”现象中起着重要作用。

实施例5、大豆中用Cas9技术敲除NIT1后植物表现出结瘤耐氮的表型 大豆NIT1的核苷酸序列如SEQ ID NO:11，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:12。

大豆NIT1核苷酸序列(SEQ ID NO:11)：

atgggagatagtggtgtgacatcatctgctgctaccatgatggaagctccaccacctgatggaacaacaacaacagcaacttcaatggattttgattacatgggtgagtttttcttagatgggtgctggttggaagcctctgccgatgtatctgacttcttgctgcaaagtccttccttttccaatcccctctttgacccttcattatcctggcctgccttggagaccaaccacaataaatcccaggatgctgcttttgggactcaacaagaaagtcataacaacatcgttagtgttgttgctggtggtggttatagtcagcagtttcagtctgagactcattcagttgaaggtgtatctgaaggtgtcagaaggtggtggtttgcaccctcacccatacctagtcctggacctgggccttctataatggagaagctaataagggccctcatgtggatcaaagattacaacaggaacaaagatatgcttatacagatttgggtgccaattcataaagagggtaggccgattcttgcggctgatgaccttctgttctcacttgaatccaagtctctgaatcttgcaaagtaccgcgaaatctctgtgacatatgagttctctgcagaggagagtgactccaaggagttggcgcggggattgcctggtcgagtgtttaggtacaaggttcctgagtggactcctgatgttagattctttaggagtgatgagtatccaagagttgaccatgctcaagagtatgatgtgcgtggaacggtggcggttccaatctttgaacaaggaagcaagacgtgcttgggggttattgaggttgtgatgactactcagcagatcaactatggtcctgaacttgagagtgtttgcaaagcacttgaggctgttgatcttagaagctcaaaacaattaagtattcagaatgtgaaggcatgcaataggacctatgaagctgcactacctgagatttatgaggtgttgagatctgcttgtgaaatgcacagattacctttagctcaaacttgggtcccatgtgtccaacaaggcaaagaggggtgccggcactctgaagataattatctactctgcatatctcctgtggagcatgcttgctatgttggtgatccctctattaggtcttttcatgaggcttgcactgagcatcacttgttaaaaggtgaaggtgttgctgggggagcttttatgacaaaccagccgtgcttctcagatgacataacttccttaagcaagaaagactatccactgtctcattatgcaagattgtttggattgcacgctgctgttgccatacgccttcgaagcatctataatagcacagatgactttgttctagagttcttcttgcctgtagattgcaatgacagtgaagagcagagaaagatgcttactgcactgtccatcattatacaaagggtttgtcgcagcctgcgcgttataagagacaaggaattagaggaagctaacttgtcagttgatgaagtgatagcccttgcagatagtggatttgctaggaatgcaattttttcggaaccccaatacaaagggatggtcgcctcattggatgctgaagaaaaatcaagtgaaacaatgggtagaaaattctctgacctaaggcagcaacaagaaagtcctattttaaaaggaaaccttgactgtgttaaggagtgttctacgtctgttgagggtaacttatcaagtttgggaacaaataaaactggagagagaagacgtgccaaagcagagaaaactatcactttgcaagttcttagacaatattttgctggaagcctaaaagatgctgccaagaatattggtgtttgtactacaactttgaaaaggatctgccggcaacatgggataaagcgttggccttctcgaaagatcaaaaaggttggtcactctctacaaaaacttcaacttgtcatcaactcagttcaaggtgcctctggtgcatttcaaatcggttccttctattcaaacttcccggatctagcttctccaaatttatcaggaactggcttcttctcaactttgaatcaaagtgattatccaaactcaacaagcacacagccagatcatggctcattgagcccagaaggtgcatcaaaatcgccatcttcatcgtgcagtcagagttccatttcaagccattcctgctccagcatgtcagagctacaacagcatcgcacagctaacggtgctggtaacaaagtttccaccacggttagtgaagattctgctggtgttgtgttgaagaggatcagtagcgaggcagagcttaaaagccttagtcaagatagagcaaagctcttgccaagatcacaaagccaggaaacacttggtgaacaccctaaaactcagtatcaacagcctttattgaaaaccagtagcagcaaggtggattctcacagagtaaaagtcgcatatggagatgagaaaacccggtttcggatgccgaagagttggggctatgaagatcttctgcaggaaattgcaaggagatttaatgtgagtgacatgagcaaatttgatgtcaaatacttggatgatgactgtgagtgggtactactcacttgtgatgctgatttagaggagtgcattgatgtttgtcaatcttccgagagtggtaccatcaaacttagtctacaaccttctagtcatagtatgagaagttctttagaatttagataa

大豆NIT1氨基酸序列(SEQ ID NO:12)：

MGDSGVTSSAATMMEAPPPDGTTTTATSMDFDYMGEFFLDGCWLEASADVSDFLLQSPSFSNPLFDPSLSWPALETNHNKSQDAAFGTQQESHNNIVSVVAGGGYSQQFQSETHSVEGVSEGVRRWWFAPSPIPSPGPGPSIMEKLIRALMWIKDYNRNKDMLIQIWVPIHKEGRPILAADDLLFSLESKSLNLAKYREISVTYEFSAEESDSKELARGLPGRVFRYKVPEWTPDVRFFRSDEYPRVDHAQEYDVRGTVAVPIFEQGSKTCLGVIEVVMTTQQINYGPELESVCKALEAVDLRSSKQLSIQNVKACNRTYEAALPEIYEVLRSACEMHRLPLAQTWVPCVQQGKEGCRHSEDNYLLCISPVEHACYVGDPSIRSFHEACTEHHLLKGEGVAGGAFMTNQPCFSDDITSLSKKDYPLSHYARLFGLHAAVAIRLRSIYNSTDDFVLEFFLPVDCNDSEEQRKMLTALSIIIQRVCRSLRVIRDKELEEANLSVDEVIALADSGFARNAIFSEPQYKGMVASLDAEEKSSETMGRKFSDLRQQQESPILKGNLDCVKECSTSVEGNLSSLGTNKTGERRRAKAEKTITLQVLRQYFAGSLKDAAKNIGVCTTTLKRICRQHGIKRWPSRKIKKVGHSLQKLQLVINSVQGASGAFQIGSFYSNFPDLASPNLSGTGFFSTLNQSDYPNSTSTQPDHGSLSPEGASKSPSSSCSQSSISSHSCSSMSELQQHRTANGAGNKVSTTVSEDSAGVVLKRISSEAELKSLSQDRAKLLPRSQSQETLGEHPKTQYQQPLLKTSSSKVDSHRVKVAYGDEKTRFRMPKSWGYEDLLQEIARRFNVSDMSKFDVKYLDDDCEWVLLTCDADLEECIDVCQSSESGTIKLSLQPSSHSMRSSLEFR-

靶标序列引物设计及退火：

针对目标基因设计并合成Crispr cas9的靶标序列：

sgRNA：ATCATCTGCTGCTACCATGATGG(SEQ ID NO:18)；

线性化该片段，构建到Cas9载体pGEL101，然后表达于根癌农杆菌K599 中。通过发根转化将此构建表达在大豆根部。

大豆结瘤：

将发根转化植株转移到蛭石珍珠岩(1：1)中，同时浇10mM KNO₃，3天 后接种根瘤菌OD600≈0.02。在此期间每3天均匀浇一次10mM KNO₃溶液， 接菌后3周观察植物结瘤表型，对有表型的植物取样提取DNA并通过PCR 测序确定其靶基因的编辑情况。

结果发现，与野生型相比，Cas9技术敲除NIT1后植物能形成更多的粉 色固氮根瘤，表现出显著更高的硝酸盐耐受性，如图6。

上述各个结果表明，豆科植物中的NIT多肽不仅具有调控硝酸盐信号转 导的功能，还在根瘤形成过程中的“氮阻遏”现象中起着重要作用。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文 献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容 之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样 落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国科学院上海生命科学研究院

<120> 调控豆科植物根瘤固氮能力的方法

<130> 176555

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2730

<212> DNA

<213> 蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)

<400> 1

atgggagatg gtgctgcagt gacatcatct gcaaccaata ccatgatgga agctccacca 60

caagatgaaa atttaatgga ttttgattac atgagtgaac ttttgttgga tggttgttgg 120

ttggaagctt ctgctgatgg atctgagttc ttgctgcaaa gttctccttt ttccaatcca 180

atctttgacc cttcattctc ttggcctgtc ttggagaaca acgagcaacc cggcaatgat 240

gttcggcatg agtctcaaga tgttcctctt ggtactgagc aggaaagccg gattatagtt 300

aataatgctg gtagtagcga cctgcagcag tgtgagttta agactcattt gggtgaaggg 360

gttagtaggt tgtggattcc accgacgcct aatccaggac ctggtggatc ttccataaca 420

gaaaagctga taagggccct caagtggatc aaagatttca ataggaacaa agatatgctt 480

atacaaatat gggtgccggt taatagaggg gatgataggc caattctgag agctaatgat 540

cttccttttt cacttgaatc aaggtcttta aaccttgcaa agtaccgaga aatctctgtg 600

agatatcagt tttctgcaga ggtggaggac tcaaaggagt tggtggcggg tttgcctggt 660

cgagtttata gggataagat tcctgagtgg acacctgatg ttcgattctt caggagtgat 720

gagtatccac gagttgacca tgctcaagag tgtgatgtac acggaacatt agcggttcca 780

gtgtttgaac aagggagcag gacatgtttg ggagttattg aagtggtgat gacgacacaa 840

cagagcaact atggccgtga acttgagact gtttgcaaag cgctagaggt tgttgatctc 900

agcagctctg gacattcaag tcctcagaat gtgaaggcat gtgtcaagtc ctatgaaacc 960

gcactacccg agattcaaga ggttttgaga tctgcatgtg aaatgcacaa attaccttta 1020

gctcagacgt gggtctcttg catccaacag ggaaaagatg gctgccggca ctctgatgat 1080

aattacacac actgtatatc tccggtggag tatgcttgct atgttggtga ttcctcggtc 1140

aggtttttcc atgaggcttg catggagcat cacttattaa taggtcaagg tgttgccggg 1200

ggtgctttta tgacaaatca accgtgcttc tcaaccgaca taacttcttt aagcaagaca 1260

gactatccac tgtctcatca tgccaggttg tttggattgc gtgctgcagt tgccattcga 1320

ctccgaagca tctatagtat ctcagacgac tatgttcttg agttcttctt gcctgtagat 1380

tgcaatgacg gtgaagaaca gaaaaagatg ctcacatcat tgtccatgat tattcaaagg 1440

gtttgccgca gcttgcgagt tataacagat aaggaattgg agaaaaataa cttatcatct 1500

aatgaagtga tggccgttgc tgatattgga tttgctaccg atgcagttca gtcgggactc 1560

caacacaaga ggatggctgt ctcattggac ggcgaagaaa agtttaatga aacaatgtct 1620

agcaagttct cggaacaaag gcggcaacaa gaaagtctta ctttaagagg agatgctgac 1680

tgtggtaggg agtgttctcc ttctgtcgag ggtaacttct tgtcaagttt gggagtaaat 1740

agaacaggag agaaaagacg ggccaaggca gagaaaacca tcactcttca agtccttaga 1800

caatatttcg ctggaagtct aaaagatgct gcaaagaata ttggcgtctg tactacaact 1860

ctgaaaagga tatgcaggca acatggtata aagcgttggc cttctcggaa gataaaaaag 1920

gttggtcatt ccttgcagaa acttcaactc gtcattgact cggttcaagg tgcctctggg 1980

tcatttcaaa ttgattcctt ctattcaaaa ttctcggatc tatcgtctcc aaatttatca 2040

ggaagcaccc taatctcaac tctgaatcaa gttgataatc cagtctcatt aagcatacag 2100

ccagatcccg actcgttgag tccagaaggt gcatcgaaat caccttcctc ttcatgtagt 2160

cagagttcct attcaagcca ttcctgttcc agcttgtcag agcaacaaca ccacacaaac 2220

aatgttgctg ctggcaacaa agattcattg gttggtgaag actctgtcga tgttgtgttg 2280

aagagaatca gaagtgaagc agaacttaaa agcctgattc cagataataa atcaaaactc 2340

atgccaagat cacaaagcca ggaaacactt ggtgaacacc cgaaaaccga gtatcgcaag 2400

tccttattaa aaaccactcg caaagcgtct caaaaggagg atgctcatag agtaaaagtt 2460

acatttggag atgagaaaac ccggtttagg ttgccaaaga tctggtgtta tgaagatctt 2520

gtgcaggaaa ttgctaggag atttaatgta agtgaaatga gcaaatttga tatcaaatat 2580

ttggacgatg attatgaatg ggtattacta acttgtgatg cagatttaga ggagtgcatc 2640

gatgtttctc aatcttctga gactagtacc atcaaacttt gtctgcaacc ctccagtaat 2700

tttatcagga gttctttaga atttagatag 2730

<210> 2

<211> 909

<212> PRT

<213> 蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)

<400> 2

Met Gly Asp Gly Ala Ala Val Thr Ser Ser Ala Thr Asn Thr Met Met

1 5 10 15

Glu Ala Pro Pro Gln Asp Glu Asn Leu Met Asp Phe Asp Tyr Met Ser

20 25 30

Glu Leu Leu Leu Asp Gly Cys Trp Leu Glu Ala Ser Ala Asp Gly Ser

35 40 45

Glu Phe Leu Leu Gln Ser Ser Pro Phe Ser Asn Pro Ile Phe Asp Pro

50 55 60

Ser Phe Ser Trp Pro Val Leu Glu Asn Asn Glu Gln Pro Gly Asn Asp

65 70 75 80

Val Arg His Glu Ser Gln Asp Val Pro Leu Gly Thr Glu Gln Glu Ser

85 90 95

Arg Ile Ile Val Asn Asn Ala Gly Ser Ser Asp Leu Gln Gln Cys Glu

100 105 110

Phe Lys Thr His Leu Gly Glu Gly Val Ser Arg Leu Trp Ile Pro Pro

115 120 125

Thr Pro Asn Pro Gly Pro Gly Gly Ser Ser Ile Thr Glu Lys Leu Ile

130 135 140

Arg Ala Leu Lys Trp Ile Lys Asp Phe Asn Arg Asn Lys Asp Met Leu

145 150 155 160

Ile Gln Ile Trp Val Pro Val Asn Arg Gly Asp Asp Arg Pro Ile Leu

165 170 175

Arg Ala Asn Asp Leu Pro Phe Ser Leu Glu Ser Arg Ser Leu Asn Leu

180 185 190

Ala Lys Tyr Arg Glu Ile Ser Val Arg Tyr Gln Phe Ser Ala Glu Val

195 200 205

Glu Asp Ser Lys Glu Leu Val Ala Gly Leu Pro Gly Arg Val Tyr Arg

210 215 220

Asp Lys Ile Pro Glu Trp Thr Pro Asp Val Arg Phe Phe Arg Ser Asp

225 230 235 240

Glu Tyr Pro Arg Val Asp His Ala Gln Glu Cys Asp Val His Gly Thr

245 250 255

Leu Ala Val Pro Val Phe Glu Gln Gly Ser Arg Thr Cys Leu Gly Val

260 265 270

Ile Glu Val Val Met Thr Thr Gln Gln Ser Asn Tyr Gly Arg Glu Leu

275 280 285

Glu Thr Val Cys Lys Ala Leu Glu Val Val Asp Leu Ser Ser Ser Gly

290 295 300

His Ser Ser Pro Gln Asn Val Lys Ala Cys Val Lys Ser Tyr Glu Thr

305 310 315 320

Ala Leu Pro Glu Ile Gln Glu Val Leu Arg Ser Ala Cys Glu Met His

325 330 335

Lys Leu Pro Leu Ala Gln Thr Trp Val Ser Cys Ile Gln Gln Gly Lys

340 345 350

Asp Gly Cys Arg His Ser Asp Asp Asn Tyr Thr His Cys Ile Ser Pro

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Val Glu Tyr Ala Cys Tyr Val Gly Asp Ser Ser Val Arg Phe Phe His

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Glu Ala Cys Met Glu His His Leu Leu Ile Gly Gln Gly Val Ala Gly

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Leu Ser Lys Thr Asp Tyr Pro Leu Ser His His Ala Arg Leu Phe Gly

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Leu Arg Ala Ala Val Ala Ile Arg Leu Arg Ser Ile Tyr Ser Ile Ser

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Asp Asp Tyr Val Leu Glu Phe Phe Leu Pro Val Asp Cys Asn Asp Gly

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Glu Glu Gln Lys Lys Met Leu Thr Ser Leu Ser Met Ile Ile Gln Arg

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Val Cys Arg Ser Leu Arg Val Ile Thr Asp Lys Glu Leu Glu Lys Asn

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Asn Leu Ser Ser Asn Glu Val Met Ala Val Ala Asp Ile Gly Phe Ala

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Thr Asp Ala Val Gln Ser Gly Leu Gln His Lys Arg Met Ala Val Ser

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Leu Asp Gly Glu Glu Lys Phe Asn Glu Thr Met Ser Ser Lys Phe Ser

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Glu Asp Ser Val Asp Val Val Leu Lys Arg Ile Arg Ser Glu Ala Glu

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Pro Thr Ser Ser Ser Leu Thr Asp Ser Ser Asn Gly Ser Gly Ser Met

850 855 860

Ile His Gly Ser Ser Ser Gly Tyr Gln Asn Phe Lys Asn Gln Lys Pro

865 870 875 880

Ser Lys Gly Lys Ser Thr Ile Val Asp Ser Gly Ser Lys Ile Val Val

885 890 895

Lys Ala Thr Tyr Gly Glu Asp Thr Ile Arg Phe Lys Phe Asp Pro Ser

900 905 910

Thr Gly Tyr Tyr Lys Leu Tyr Glu Glu Val Ala Ala Arg Phe Lys Leu

915 920 925

Gln Asp Gly Ser Phe Gln Leu Lys Tyr Leu Asp Asp Glu Glu Glu Trp

930 935 940

Val Met Leu Val Asn Asp Ser Asp Leu Gln Val Cys Leu Glu Ile Leu

945 950 955 960

Asn Asp Met Gly Thr His Asn Ala Arg Phe Leu Val Arg Asp Ile Pro

965 970 975

Cys Thr Phe Gly Ser Ser Gly Ser Ser Ser Cys Tyr Leu Gly Gly Ser

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Ser

<210> 7

<211> 2940

<212> DNA

<213> 蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)

<400> 7

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gaacatggtt gttctatgga ttttgaccta gatttagaaa catcatggcc tttggatcac 120

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tcttctcctc tttggacttt tactgatgga gaagatggca aacttgcagc ttcagcttta 240

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tattgtgtaa tcaaggaaaa gatgacacaa gcgcttcgtt actttaaaga gtggactgaa 420

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gtctccctga tgtacatgtt ttctgtggat ggagagaacg atggaactct aggacttcct 600

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aagaaaagtt gttcgagttt tgatggtagt tgcatggggc aagtatgcat gtcgacaact 1080

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catcacttac aacaaggtca aggtgttgcg ggtagggcgt ttttgtctca aaccatgagc 1200

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gattatgtat tagagttttt tctgcctcct gggatcactg aatttcatga acagaagacg 1380

ctgttgggat ccatattttc aacaatgaaa cagcattttc agagtcttaa cattgctgct 1440

ggtgttgaac tcgaggaaaa tggttcaatt gaaattattg aagcaactga tgaaggcatt 1500

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gcgtttgatt tgaattctct tggtaataat caacttccaa ttgttagttc atttcctgag 1980

ccttctactc tgaataagtc cagccagcaa ggctcgttaa gcaataggcc gtcagagcct 2040

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<210> 8

<211> 979

<212> PRT

<213> 蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)

<400> 8

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Trp Thr Phe Thr Asp Gly Glu Asp Gly Lys Leu Ala Ala Ser Ala Leu

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Ser Asp Cys His Lys Ile Phe Ser Cys Asp Ser Asn Ser Ile Thr Glu

85 90 95

Lys Leu Val Glu Lys Asp Asp Asn Lys Thr Leu Leu Pro Pro Leu Leu

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Pro Pro Ile Glu Asn Leu Asp Gly Tyr Cys Val Ile Lys Glu Lys Met

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Gln Gly Gln Gly Val Ala Gly Arg Ala Phe Leu Ser Gln Thr Met Ser

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Phe Cys Thr Asn Ile Thr Gln Phe Cys Lys Thr Asp Tyr Pro Leu Val

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His Tyr Ala Leu Met Phe Gly Leu Thr Ser Cys Phe Ala Ile Cys Leu

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Arg Ser Phe His Thr Gly Asn Asp Asp Tyr Val Leu Glu Phe Phe Leu

435 440 445

Pro Pro Gly Ile Thr Glu Phe His Glu Gln Lys Thr Leu Leu Gly Ser

450 455 460

Ile Phe Ser Thr Met Lys Gln His Phe Gln Ser Leu Asn Ile Ala Ala

465 470 475 480

Gly Val Glu Leu Glu Glu Asn Gly Ser Ile Glu Ile Ile Glu Ala Thr

485 490 495

Asp Glu Gly Ile Arg Leu Arg Thr Glu Ser Ile Pro Ile Ala Gln Ser

500 505 510

Ile Lys Ser Pro Pro Arg Pro Asp Ala Ser Pro Asn Met Glu Asp Glu

515 520 525

Glu Glu Gly Val Pro Gln Asp Pro Ser Glu Val Arg Gly Glu Asn Val

530 535 540

Gly Gly Ser Val Asp Pro Met Ser Thr Leu Gly Asn Lys Asn Ile Lys

545 550 555 560

Lys Pro Ser Glu Arg Lys Arg Gly Lys Thr Glu Lys Ser Ile Ser Leu

565 570 575

Glu Val Leu Gln Arg Tyr Phe Ala Gly Ser Leu Lys Asp Ala Ala Lys

580 585 590

Ser Leu Gly Val Cys Pro Thr Thr Met Lys Arg Ile Cys Arg Gln His

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805 810 815

Leu Leu Ile Glu Asp Ala Gly Ser Ser Lys Asp Leu Arg Asn Leu Cys

820 825 830

Pro Ser Val Ala Glu Ala Ile Leu Glu Asp Met Ala Pro Glu Ala Cys

835 840 845

Gly Asn Asn Phe Pro Gly Ser Ser His Leu Ala Pro Pro Lys Gln Cys

850 855 860

Ile Asp Thr Ile Asn Asn Ser Ala Thr Pro Phe Ala Ala Arg Lys Glu

865 870 875 880

Met Lys Thr Val Thr Ile Lys Ala Thr Tyr Arg Glu Asp Ile Ile Arg

885 890 895

Phe Arg Val Ser Leu Asn Cys Gly Ile Val Glu Leu Lys Glu Glu Val

900 905 910

Ser Lys Arg Leu Lys Leu Glu Val Gly Thr Phe Asp Ile Lys Tyr Met

915 920 925

Asp Asp Asp Asn Glu Trp Val Leu Ile Ala Cys Asp Ala Asp Leu Gln

930 935 940

Glu Cys Met Tyr Leu Ser Arg Ser Ser Gly Gly Ser Asn Ile Ile Arg

945 950 955 960

Val Leu Val His Asp Ile Thr Ser Asn Leu Gly Ser Ser Cys Glu Ser

965 970 975

Ser Gly Glu

<210> 9

<211> 2574

<212> DNA

<213> 蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)

<400> 9

atgcaaaagt cagaagaaga aaatcatgac cttcctcaaa agtcaaaacc actagatgaa 60

aatgtgtttt ccatggatta tgatattgac tttgaaactt catggccttt ggatcatata 120

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aatggaagtc ggtataaact cacaacttca ggccaaccat ttgttctcga tgcacatagt 480

aatggacttc atcagtacag aacagtttct ttgatgtata tgttttctgt tgacggagaa 540

aacgacgaag ttttaggact tcctggaaga gtttttcagc agaagttacc tgaatggact 600

cctaatgttc agtattattc tagtaaagag tattcaaggc taaatcatgc tctacattat 660

aatgttcgcg gaactttggc tttgccggtg tttgaacctc caggacaatc atgtgttgct 720

gtgttggaat tgattatgac ttcacagaag attaactatg ctcctgaagt ggataaagtc 780

tgcaaagcac ttgaggcagt aaatttgagg agttcagaaa ttttggagca tccatacagt 840

cagatatgta acgaagatag acagaatgca ttatccgaga ttttggagat attgacagtg 900

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gcatttggtt tggattctcc aagtacaagc acaatcccta ttgctgctgg ttcctttaat 1980

gaaccttcta cttcgaacaa gtttgaacac catacctcat taagcataat gccatcagaa 2040

cctaagaaga acgaaaatta tttagatgca tctaaatcag aacctcaaaa accattagga 2100

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gatgttgttt tggaggatca ggtcctagaa gcttcaagga ttcatcctcc atgttctgat 2220

tttgttcata tgcaaatgca gcacatggat actcttaatt ttgcagctca gaaagagatg 2280

aagattgtga ctataaaggc aacatataga gatgatatca taaggtttag ggtttcttgg 2340

aactgtggca ttgtggaatt gagagaagaa attgctaaaa gactgaaact agaggtaggg 2400

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gtgcatgata ttttgtccat tcttggaagc tcggttgaga gctcagggga atga 2574

<210> 10

<211> 857

<212> PRT

<213> 蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)

<400> 10

Met Gln Lys Ser Glu Glu Glu Asn His Asp Leu Pro Gln Lys Ser Lys

1 5 10 15

Pro Leu Asp Glu Asn Val Phe Ser Met Asp Tyr Asp Ile Asp Phe Glu

20 25 30

Thr Ser Trp Pro Leu Asp His Ile Ser Asn Ser Met His Pro Phe Phe

35 40 45

Leu Gln Asn Ile Ser Glu Gln Pro Phe Ser Pro Ile Trp Thr Phe Ser

50 55 60

Asp Asp Asp His Asn Ile Ala Ala Ser Gly Asn Asn Lys Asn Ile Ile

65 70 75 80

Thr Glu Asn Arg Val Glu Asn Asp Asp Lys His Lys Arg Val Thr Pro

85 90 95

His Ile Gly Leu Pro Pro Leu Gln Asn Pro His Gly Tyr Cys Leu Ile

100 105 110

Lys Glu Arg Met Thr Gln Ala Leu Arg Asn Phe Lys Glu Leu Thr Glu

115 120 125

Leu Asn Val Leu Ala Gln Val Trp Ala Pro Val Arg Asn Gly Ser Arg

130 135 140

Tyr Lys Leu Thr Thr Ser Gly Gln Pro Phe Val Leu Asp Ala His Ser

145 150 155 160

Asn Gly Leu His Gln Tyr Arg Thr Val Ser Leu Met Tyr Met Phe Ser

165 170 175

Val Asp Gly Glu Asn Asp Glu Val Leu Gly Leu Pro Gly Arg Val Phe

180 185 190

Gln Gln Lys Leu Pro Glu Trp Thr Pro Asn Val Gln Tyr Tyr Ser Ser

195 200 205

Lys Glu Tyr Ser Arg Leu Asn His Ala Leu His Tyr Asn Val Arg Gly

210 215 220

Thr Leu Ala Leu Pro Val Phe Glu Pro Pro Gly Gln Ser Cys Val Ala

225 230 235 240

Val Leu Glu Leu Ile Met Thr Ser Gln Lys Ile Asn Tyr Ala Pro Glu

245 250 255

Val Asp Lys Val Cys Lys Ala Leu Glu Ala Val Asn Leu Arg Ser Ser

260 265 270

Glu Ile Leu Glu His Pro Tyr Ser Gln Ile Cys Asn Glu Asp Arg Gln

275 280 285

Asn Ala Leu Ser Glu Ile Leu Glu Ile Leu Thr Val Val Cys Glu Thr

290 295 300

His Asn Leu Pro Leu Ala Gln Thr Trp Val Pro Cys Arg His Arg Ser

305 310 315 320

Val Leu Ala His Gly Gly Gly Leu Lys Lys Asn Cys Ser Ser Phe Asp

325 330 335

Gly Tyr Cys Met Gly Gln Val Cys Met Ser Ile Thr Glu Val Ala Phe

340 345 350

Tyr Ile Ile Asp Ser His Thr Trp Gly Phe His Asp Ala Cys Val Glu

355 360 365

His His Leu Gln Gln Gly Gln Gly Val Ala Gly Arg Ala Phe Leu Ser

370 375 380

Gln Asn Met Cys Phe Cys Arg Asn Ile Thr Gln Phe Cys Lys Thr Asp

385 390 395 400

Tyr Pro Leu Val His Tyr Ala Leu Met Phe Asp Leu Thr Ser Ser Phe

405 410 415

Ser Ile Cys Leu Gln Ser Ser His Thr Gly Gly Asp Asp Tyr Val Leu

420 425 430

Glu Phe Phe Leu Pro Pro Ser Ile Asn Lys Phe Cys Glu Gln Lys Gly

435 440 445

Leu Leu Gly Ser Ile Leu Ala Thr Met Lys Gln Asn Phe Gln Ser Leu

450 455 460

Lys Val Ala Ser Gly Val Glu Leu Glu Glu Asp Gly Ser Val Glu Ile

465 470 475 480

Val Glu Ile Ile Asn Gly Thr Val His Ser Arg Leu Glu Ser Val Pro

485 490 495

Ile Ile Gln Ser Thr Lys Leu Ser Ala Arg His Asp Asp Ala Ser Pro

500 505 510

Asp Met Glu Glu Gly Val Pro Leu Asp Gln Ser Arg Gln Lys Ile Ile

515 520 525

Thr Asn Phe Asp Asp Ile Asn Asp Ile Gly Asn Leu Asp Asp Tyr Ala

530 535 540

Gly Gly Ser Ile Asp Gln Ile His Ser Leu Lys Thr Glu Thr Lys Lys

545 550 555 560

Lys Pro Ser Leu Arg Lys Arg Gly Lys Ala Glu Lys Ser Ile Ser Leu

565 570 575

Glu Val Leu Gln Asp Tyr Phe Ser Gly Ser Leu Lys Asp Ala Ala Lys

580 585 590

Ser Leu Gly Val Cys Pro Thr Thr Met Lys Arg Ile Cys Arg Gln His

595 600 605

Gly Ile Ser Arg Trp Pro Ser Arg Lys Ile Lys Lys Val Asn Arg Ser

610 615 620

Leu Ser Lys Leu Lys Cys Val Ile Glu Ser Val His Gly Val Glu Gly

625 630 635 640

Ala Phe Gly Leu Asp Ser Pro Ser Thr Ser Thr Ile Pro Ile Ala Ala

645 650 655

Gly Ser Phe Asn Glu Pro Ser Thr Ser Asn Lys Phe Glu His His Thr

660 665 670

Ser Leu Ser Ile Met Pro Ser Glu Pro Lys Lys Asn Glu Asn Tyr Leu

675 680 685

Asp Ala Ser Lys Ser Glu Pro Gln Lys Pro Leu Gly Gly Met Leu Ile

690 695 700

Glu Gly Ala Asp Ser Ser Lys Asp Leu Lys Asn Leu Cys Pro Ser Thr

705 710 715 720

Asp Val Val Leu Glu Asp Gln Val Leu Glu Ala Ser Arg Ile His Pro

725 730 735

Pro Cys Ser Asp Phe Val His Met Gln Met Gln His Met Asp Thr Leu

740 745 750

Asn Phe Ala Ala Gln Lys Glu Met Lys Ile Val Thr Ile Lys Ala Thr

755 760 765

Tyr Arg Asp Asp Ile Ile Arg Phe Arg Val Ser Trp Asn Cys Gly Ile

770 775 780

Val Glu Leu Arg Glu Glu Ile Ala Lys Arg Leu Lys Leu Glu Val Gly

785 790 795 800

Thr Phe Asp Ile Lys Tyr Leu Asp Asp Asp Gln Glu Trp Ile Leu Val

805 810 815

Ala Cys Asp Ala Asp Leu Gln Glu Cys Met Asp Ile Leu Thr Leu Ser

820 825 830

Gly Ser Asn Ile Ile Arg Leu Val Val His Asp Ile Leu Ser Ile Leu

835 840 845

Gly Ser Ser Val Glu Ser Ser Gly Glu

850 855

<210> 11

<211> 2724

<212> DNA

<213> 大豆(Glycine max)

<400> 11

atgggagata gtggtgtgac atcatctgct gctaccatga tggaagctcc accacctgat 60

ggaacaacaa caacagcaac ttcaatggat tttgattaca tgggtgagtt tttcttagat 120

gggtgctggt tggaagcctc tgccgatgta tctgacttct tgctgcaaag tccttccttt 180

tccaatcccc tctttgaccc ttcattatcc tggcctgcct tggagaccaa ccacaataaa 240

tcccaggatg ctgcttttgg gactcaacaa gaaagtcata acaacatcgt tagtgttgtt 300

gctggtggtg gttatagtca gcagtttcag tctgagactc attcagttga aggtgtatct 360

gaaggtgtca gaaggtggtg gtttgcaccc tcacccatac ctagtcctgg acctgggcct 420

tctataatgg agaagctaat aagggccctc atgtggatca aagattacaa caggaacaaa 480

gatatgctta tacagatttg ggtgccaatt cataaagagg gtaggccgat tcttgcggct 540

gatgaccttc tgttctcact tgaatccaag tctctgaatc ttgcaaagta ccgcgaaatc 600

tctgtgacat atgagttctc tgcagaggag agtgactcca aggagttggc gcggggattg 660

cctggtcgag tgtttaggta caaggttcct gagtggactc ctgatgttag attctttagg 720

agtgatgagt atccaagagt tgaccatgct caagagtatg atgtgcgtgg aacggtggcg 780

gttccaatct ttgaacaagg aagcaagacg tgcttggggg ttattgaggt tgtgatgact 840

actcagcaga tcaactatgg tcctgaactt gagagtgttt gcaaagcact tgaggctgtt 900

gatcttagaa gctcaaaaca attaagtatt cagaatgtga aggcatgcaa taggacctat 960

gaagctgcac tacctgagat ttatgaggtg ttgagatctg cttgtgaaat gcacagatta 1020

cctttagctc aaacttgggt cccatgtgtc caacaaggca aagaggggtg ccggcactct 1080

gaagataatt atctactctg catatctcct gtggagcatg cttgctatgt tggtgatccc 1140

tctattaggt cttttcatga ggcttgcact gagcatcact tgttaaaagg tgaaggtgtt 1200

gctgggggag cttttatgac aaaccagccg tgcttctcag atgacataac ttccttaagc 1260

aagaaagact atccactgtc tcattatgca agattgtttg gattgcacgc tgctgttgcc 1320

atacgccttc gaagcatcta taatagcaca gatgactttg ttctagagtt cttcttgcct 1380

gtagattgca atgacagtga agagcagaga aagatgctta ctgcactgtc catcattata 1440

caaagggttt gtcgcagcct gcgcgttata agagacaagg aattagagga agctaacttg 1500

tcagttgatg aagtgatagc ccttgcagat agtggatttg ctaggaatgc aattttttcg 1560

gaaccccaat acaaagggat ggtcgcctca ttggatgctg aagaaaaatc aagtgaaaca 1620

atgggtagaa aattctctga cctaaggcag caacaagaaa gtcctatttt aaaaggaaac 1680

cttgactgtg ttaaggagtg ttctacgtct gttgagggta acttatcaag tttgggaaca 1740

aataaaactg gagagagaag acgtgccaaa gcagagaaaa ctatcacttt gcaagttctt 1800

agacaatatt ttgctggaag cctaaaagat gctgccaaga atattggtgt ttgtactaca 1860

actttgaaaa ggatctgccg gcaacatggg ataaagcgtt ggccttctcg aaagatcaaa 1920

aaggttggtc actctctaca aaaacttcaa cttgtcatca actcagttca aggtgcctct 1980

ggtgcatttc aaatcggttc cttctattca aacttcccgg atctagcttc tccaaattta 2040

tcaggaactg gcttcttctc aactttgaat caaagtgatt atccaaactc aacaagcaca 2100

cagccagatc atggctcatt gagcccagaa ggtgcatcaa aatcgccatc ttcatcgtgc 2160

agtcagagtt ccatttcaag ccattcctgc tccagcatgt cagagctaca acagcatcgc 2220

acagctaacg gtgctggtaa caaagtttcc accacggtta gtgaagattc tgctggtgtt 2280

gtgttgaaga ggatcagtag cgaggcagag cttaaaagcc ttagtcaaga tagagcaaag 2340

ctcttgccaa gatcacaaag ccaggaaaca cttggtgaac accctaaaac tcagtatcaa 2400

cagcctttat tgaaaaccag tagcagcaag gtggattctc acagagtaaa agtcgcatat 2460

ggagatgaga aaacccggtt tcggatgccg aagagttggg gctatgaaga tcttctgcag 2520

gaaattgcaa ggagatttaa tgtgagtgac atgagcaaat ttgatgtcaa atacttggat 2580

gatgactgtg agtgggtact actcacttgt gatgctgatt tagaggagtg cattgatgtt 2640

tgtcaatctt ccgagagtgg taccatcaaa cttagtctac aaccttctag tcatagtatg 2700

agaagttctt tagaatttag ataa 2724

<210> 12

<211> 907

<212> PRT

<213> 大豆(Glycine max)

<400> 12

Met Gly Asp Ser Gly Val Thr Ser Ser Ala Ala Thr Met Met Glu Ala

1 5 10 15

Pro Pro Pro Asp Gly Thr Thr Thr Thr Ala Thr Ser Met Asp Phe Asp

20 25 30

Tyr Met Gly Glu Phe Phe Leu Asp Gly Cys Trp Leu Glu Ala Ser Ala

35 40 45

Asp Val Ser Asp Phe Leu Leu Gln Ser Pro Ser Phe Ser Asn Pro Leu

50 55 60

Phe Asp Pro Ser Leu Ser Trp Pro Ala Leu Glu Thr Asn His Asn Lys

65 70 75 80

Ser Gln Asp Ala Ala Phe Gly Thr Gln Gln Glu Ser His Asn Asn Ile

85 90 95

Val Ser Val Val Ala Gly Gly Gly Tyr Ser Gln Gln Phe Gln Ser Glu

100 105 110

Thr His Ser Val Glu Gly Val Ser Glu Gly Val Arg Arg Trp Trp Phe

115 120 125

Ala Pro Ser Pro Ile Pro Ser Pro Gly Pro Gly Pro Ser Ile Met Glu

130 135 140

Lys Leu Ile Arg Ala Leu Met Trp Ile Lys Asp Tyr Asn Arg Asn Lys

145 150 155 160

Asp Met Leu Ile Gln Ile Trp Val Pro Ile His Lys Glu Gly Arg Pro

165 170 175

Ile Leu Ala Ala Asp Asp Leu Leu Phe Ser Leu Glu Ser Lys Ser Leu

180 185 190

Asn Leu Ala Lys Tyr Arg Glu Ile Ser Val Thr Tyr Glu Phe Ser Ala

195 200 205

Glu Glu Ser Asp Ser Lys Glu Leu Ala Arg Gly Leu Pro Gly Arg Val

210 215 220

Phe Arg Tyr Lys Val Pro Glu Trp Thr Pro Asp Val Arg Phe Phe Arg

225 230 235 240

Ser Asp Glu Tyr Pro Arg Val Asp His Ala Gln Glu Tyr Asp Val Arg

245 250 255

Gly Thr Val Ala Val Pro Ile Phe Glu Gln Gly Ser Lys Thr Cys Leu

260 265 270

Gly Val Ile Glu Val Val Met Thr Thr Gln Gln Ile Asn Tyr Gly Pro

275 280 285

Glu Leu Glu Ser Val Cys Lys Ala Leu Glu Ala Val Asp Leu Arg Ser

290 295 300

Ser Lys Gln Leu Ser Ile Gln Asn Val Lys Ala Cys Asn Arg Thr Tyr

305 310 315 320

Glu Ala Ala Leu Pro Glu Ile Tyr Glu Val Leu Arg Ser Ala Cys Glu

325 330 335

Met His Arg Leu Pro Leu Ala Gln Thr Trp Val Pro Cys Val Gln Gln

340 345 350

Gly Lys Glu Gly Cys Arg His Ser Glu Asp Asn Tyr Leu Leu Cys Ile

355 360 365

Ser Pro Val Glu His Ala Cys Tyr Val Gly Asp Pro Ser Ile Arg Ser

370 375 380

Phe His Glu Ala Cys Thr Glu His His Leu Leu Lys Gly Glu Gly Val

385 390 395 400

Ala Gly Gly Ala Phe Met Thr Asn Gln Pro Cys Phe Ser Asp Asp Ile

405 410 415

Thr Ser Leu Ser Lys Lys Asp Tyr Pro Leu Ser His Tyr Ala Arg Leu

420 425 430

Phe Gly Leu His Ala Ala Val Ala Ile Arg Leu Arg Ser Ile Tyr Asn

435 440 445

Ser Thr Asp Asp Phe Val Leu Glu Phe Phe Leu Pro Val Asp Cys Asn

450 455 460

Asp Ser Glu Glu Gln Arg Lys Met Leu Thr Ala Leu Ser Ile Ile Ile

465 470 475 480

Gln Arg Val Cys Arg Ser Leu Arg Val Ile Arg Asp Lys Glu Leu Glu

485 490 495

Glu Ala Asn Leu Ser Val Asp Glu Val Ile Ala Leu Ala Asp Ser Gly

500 505 510

Phe Ala Arg Asn Ala Ile Phe Ser Glu Pro Gln Tyr Lys Gly Met Val

515 520 525

Ala Ser Leu Asp Ala Glu Glu Lys Ser Ser Glu Thr Met Gly Arg Lys

530 535 540

Phe Ser Asp Leu Arg Gln Gln Gln Glu Ser Pro Ile Leu Lys Gly Asn

545 550 555 560

Leu Asp Cys Val Lys Glu Cys Ser Thr Ser Val Glu Gly Asn Leu Ser

565 570 575

Ser Leu Gly Thr Asn Lys Thr Gly Glu Arg Arg Arg Ala Lys Ala Glu

580 585 590

Lys Thr Ile Thr Leu Gln Val Leu Arg Gln Tyr Phe Ala Gly Ser Leu

595 600 605

Lys Asp Ala Ala Lys Asn Ile Gly Val Cys Thr Thr Thr Leu Lys Arg

610 615 620

Ile Cys Arg Gln His Gly Ile Lys Arg Trp Pro Ser Arg Lys Ile Lys

625 630 635 640

Lys Val Gly His Ser Leu Gln Lys Leu Gln Leu Val Ile Asn Ser Val

645 650 655

Gln Gly Ala Ser Gly Ala Phe Gln Ile Gly Ser Phe Tyr Ser Asn Phe

660 665 670

Pro Asp Leu Ala Ser Pro Asn Leu Ser Gly Thr Gly Phe Phe Ser Thr

675 680 685

Leu Asn Gln Ser Asp Tyr Pro Asn Ser Thr Ser Thr Gln Pro Asp His

690 695 700

Gly Ser Leu Ser Pro Glu Gly Ala Ser Lys Ser Pro Ser Ser Ser Cys

705 710 715 720

Ser Gln Ser Ser Ile Ser Ser His Ser Cys Ser Ser Met Ser Glu Leu

725 730 735

Gln Gln His Arg Thr Ala Asn Gly Ala Gly Asn Lys Val Ser Thr Thr

740 745 750

Val Ser Glu Asp Ser Ala Gly Val Val Leu Lys Arg Ile Ser Ser Glu

755 760 765

Ala Glu Leu Lys Ser Leu Ser Gln Asp Arg Ala Lys Leu Leu Pro Arg

770 775 780

Ser Gln Ser Gln Glu Thr Leu Gly Glu His Pro Lys Thr Gln Tyr Gln

785 790 795 800

Gln Pro Leu Leu Lys Thr Ser Ser Ser Lys Val Asp Ser His Arg Val

805 810 815

Lys Val Ala Tyr Gly Asp Glu Lys Thr Arg Phe Arg Met Pro Lys Ser

820 825 830

Trp Gly Tyr Glu Asp Leu Leu Gln Glu Ile Ala Arg Arg Phe Asn Val

835 840 845

Ser Asp Met Ser Lys Phe Asp Val Lys Tyr Leu Asp Asp Asp Cys Glu

850 855 860

Trp Val Leu Leu Thr Cys Asp Ala Asp Leu Glu Glu Cys Ile Asp Val

865 870 875 880

Cys Gln Ser Ser Glu Ser Gly Thr Ile Lys Leu Ser Leu Gln Pro Ser

885 890 895

Ser His Ser Met Arg Ser Ser Leu Glu Phe Arg

900 905

<210> 13

<211> 206

<212> DNA

<213> 核苷酸干扰序列(RNAi sequence)

<400> 13

gagatggtgc tgcagtgaca tcatctgcaa ccaataccat gatggaagct ccaccacaag 60

atgaaaattt aatggatttt gattacatga gtgaactttt gttggatggt tgttggttgg 120

aagcttctgc tgatggatct gagttcttgc tgcaaagttc tcctttttcc aatccaatct 180

ttgacccttc attctcttgg cctgtc 206

<210> 14

<211> 153

<212> DNA

<213> 核苷酸干扰序列(RNAi sequence)

<400> 14

gttggtgcaa tggttcatca tcaataactg atcaaacttt aactaatgat ctttcatcat 60

ttgcatatga tggattgaat ttatctgaac acataaatgg tccatttttt atgacagaaa 120

ttggtggaaa ttacaatgtt atggatagtt atg 153

<210> 15

<211> 151

<212> DNA

<213> 核苷酸干扰序列(RNAi sequence)

<400> 15

ccatccacga ccgatcagat tatgactaat gagcttccat ctcttgcctc agcattgtat 60

caattgcctg atggattcaa tccagtcgaa ccgaacagtg gacaattcta tggtggaaat 120

tacaataatt tcgaaagctc ccctattttt g 151

<210> 16

<211> 181

<212> DNA

<213> 核苷酸干扰序列(RNAi sequence)

<400> 16

gagatattga cagtggtgtg tgaaactcat aatctacctc tagcccaaac atgggttccc 60

tgtaggcata ggagtgtttt ggctcatggt ggcggtttca agaaaagttg ttcgagtttt 120

gatggtagtt gcatggggca agtatgcatg tcgacaactg aggcagcagc ctatattgta 180

g 181

<210> 17

<211> 166

<212> DNA

<213> 核苷酸干扰序列(RNAi sequence)

<400> 17

atgcaaaagt cagaagaaga aaatcatgac cttcctcaaa agtcaaaacc actagatgaa 60

aatgtgtttt ccatggatta tgatattgac tttgaaactt catggccttt ggatcatata 120

tctaactcca tgcatccttt tttcttgcaa aatatctctg aacaac 166

<210> 18

<211> 23

<212> DNA

<213> 基因编辑序列(sgRNA)

<400> 18

atcatctgct gctaccatga tgg 23

Claims (18)

1.一种调节根瘤植物的根瘤形成或固氮能力的方法，其特征在于，所述方法包括：调节根瘤植物中NIT多肽的表达。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括：下调根瘤植物中NIT多肽的表达，从而促进根瘤形成、增加根瘤数、提高植物的固氮能力。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的根瘤是有固氮能力的根瘤。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的下调植物中NIT多肽的表达包括：下调或敲除植物中NIT基因，或下调植物中NIT多肽的表达或活性。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，以NIT基因的核苷酸序列中的保守性区域为靶点抑制NIT基因的表达；或通过采用CRISPR/Cas9系统进行基因编辑，从而敲除NIT基因。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括：上调根瘤植物中NIT多肽的表达，从而抑制根瘤形成、减少根瘤数、下调植物的固氮能力。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的根瘤植物是NIT多肽表达不足的植物。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的根瘤植物是豆科植物。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的NIT多肽是豆科植物来源的NIT多肽。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的NIT多肽是苜蓿的NIT多肽，选自NIT1、NIT2、NIT3、NIT4、NIT5；或

所述的NIT多肽是大豆的NIT多肽，选自NIT1、NIT2、NIT3、NIT4、NIT5、NIT6、NIT7、NIT8、NIT9、NIT10。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述的NIT多肽选自下组：

(a)如SEQ ID NO:2、4、6、8或10氨基酸序列的蛋白；

(b)将SEQ ID NO:2、4、6、8或10氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)蛋白功能的由(a)衍生的蛋白；或

(c)与(a)限定的蛋白序列有70％以上同源性且具有(a)蛋白功能的由(a)衍生的蛋白。

12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的NIT多肽通过调节豆科植物的“氮阻遏”现象发挥作用。

13.用于促进根瘤形成、增加根瘤数、提高植物的固氮能力的构建物，含有式(I)所示的结构：

Seq_正向-X-Seq_反向 式(I)，

式(I)中，

Seq_正向具有SEQ ID NO:13～17所示核苷酸序列；

Seq_反向具有与Seq_正向互补的核苷酸序列；

X为位于Seq_正向和Seq_反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq_正向和Seq_反向不互补。

14.一种用于促进根瘤形成、增加根瘤数、提高植物的固氮能力的sgRNA，其具有SEQ IDNO:18所示核苷酸序列。

15.权利要求13所述的构建物或权利要求14所述的sgRNA的用途，用于促进根瘤形成、增加根瘤数、提高植物的固氮能力。

16.一种NIT多肽或其编码基因用途，用于制备调节根瘤植物的根瘤形成、根瘤数、固氮能力的试剂。

17.一种NIT多肽或其编码基因用途，用于作为鉴定根瘤植物的根瘤形成能力或固氮能力的分子标记。

18.如权利要求16或17所述的用途，其特征在于，所述的NIT多肽是根瘤植物，较佳地豆科植物来源的NIT多肽。