CN108586592B

CN108586592B - 调控根瘤植物的根瘤数目的基因及其在高效固氮方面的应用

Info

Publication number: CN108586592B
Application number: CN201810366919.0A
Authority: CN
Inventors: 王二涛; 高锦鹏; 张晓伟; 杨军
Original assignee: Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Current assignee: Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Priority date: 2018-04-23
Filing date: 2018-04-23
Publication date: 2022-08-02
Anticipated expiration: 2038-04-23
Also published as: CN108586592A

Abstract

本发明涉及调控根瘤植物的根瘤数目的基因及其在高效固氮方面的应用。本发明人首次克隆到一种新的基因：Rac1基因。功能分析显示，该基因或其调控分子与根瘤植物的根瘤的数量密切相关。籍此，该基因可应用于植物改良，获得根瘤性状、固氮性状发生改变的植物。

Description

调控根瘤植物的根瘤数目的基因及其在高效固氮方面的应用

技术领域

本发明属于生物技术和植物学领域；更具体地，本发明涉及调控根瘤植物的根瘤数目的基因及其在高效固氮方面的应用。

背景技术

氮是植物生长所必需的大量元素，也是农业生产的限制因素。目前世界上超过一半的食物是通过施用化肥(尤其是氮肥)获得的，而作物40～60％(热带土壤甚至高达90％)的产量也都归因于氮肥的使用，过度使用氮肥不仅提高了生产成本，同时对环境也造成了沉重的负担。每年约有40％未被植物利用氮肥直接脱氨形成N₂回归大气之中，造成了严重的能源和资源浪费；其次，氮肥代谢产生的N₂O是一种重要的“温室效应”气体，其GWP(100-year Average Global-Warming Potential)是CO₂的296倍。再者，随着灌溉和雨水流入江河湖海的氮肥也会造成水体富营养化等危害。因此，在农业生产上引入根瘤共生系统对减少氮肥使用和农业可持续发展都有重要意义。

根瘤共生(Root Nodule Symbiosis，RNS)是豆科植物与根瘤菌之间形成的另一种互利互惠的共生形式。根瘤菌可以侵入植物皮层，刺激皮层细胞分裂形成膨大器官根瘤。在根瘤的厌氧微环境中，根瘤菌可以利用固氮酶将空气中的N₂还原成NH⁴⁺被植物所利用，从而减少植物对氮肥的依赖。

大豆(Glycine max(Linn.)Merr.)是一种在全球都广泛栽培种植的经济作物。作为豆科植物，大豆可以与土壤中根瘤菌互作从而产生特异的器官根瘤，通过共生固氮作用将空气中不能被植物利用的氮气转化为可被自身利用的铵态氮。氮元素是大豆生长发育过程中所需的主要元素，大豆的产量水平也取决于氮的供应状况。相对于其他粮食作物，每生产100kg大豆籽粒所摄取的氮元素是其他作物的2-4倍。大豆生育过程中获取的氮主要有三个来源，土壤氮、肥料氮和共生固氮。土壤氮是大豆生长的基本氮源。土壤氮中95％以上的是有机氮，必须经过矿化作用转化为无机氮才能被植物吸收利用。肥料氮是人工施用的补充氮源，通过土壤和叶面施用各种无机氮化物和有机氮化物来供给大豆氮源。共生固氮可以提供大豆的主要氮源。共生固氮是指固氮微生物在固氮酶的催化作用下将空气中游离的氮还原为植物能吸收的氮的过程。共生固氮对增加大豆产量，改善品质，减少化肥施用量，节省能源，减少污染以及维持自然界中氮素的平衡都具有十分重要的意义。大豆的共生固氮主要依赖于与土壤中的根瘤菌(Rhizobium japonicum)互作而形成特异的侧生器官根瘤。根瘤的形成对大豆生长发育和产量具有重要影响，正常的根瘤发生发育对保证大豆品质产量有利，而过多的根瘤则会消耗大豆光合产物，对大豆生长发育产生不利影响。因此，大豆的根瘤发生过程在植物与根瘤菌互作的过程中会受到复杂而精细的调控，二者之间存在着大量、有序的信息交流。然而，早期结瘤因子信号转导途径中还有很多新的功能组分尚未被发现。中国大豆种植主要依赖于外界施加氮肥。过量施用氮肥已经造成了地表、地下水污染和土壤酸化等严重的环境问题，成为破坏生态平衡的重要原因之一，严重地威胁着我国农业的可持续发展。如何来解决这些问题，除了合理施用化肥以及无机、有机肥配合施用外，一个更重要的途径是充分发挥豆科作物根瘤菌共生固氮的作用。

综上，本领域需要对调控根瘤植物高效固氮的基因进行深入开发和研究，以使得借助基因工程技术来改变根瘤植物数量来控制其高效固氮成为可能。

发明内容

本发明的目的在于提供调控根瘤植物的根瘤数目的基因及其在高效固氮方面的应用。

在本发明的另一方面，提供一种分离的多肽，该多肽选自下组：

(a)SEQ ID NO:3或4所示氨基酸序列的多肽；

(b)将SEQ ID NO:3或4所示氨基酸序列经过一个或多个(如1-50个，较佳地1-20个，更佳地1-10个，更佳地1-8个，更佳地1-5个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)的多肽相同功能的由(a)衍生的多肽；

(c)与(a)限定的序列在具有85％以上(如90％以上，较佳地95％以上，更佳地98％或99％以上)的序列相同性的，且具有抑制鳞翅目昆虫RNA干扰效率的功能的由(a)衍生的多肽。

在本发明的另一方面，提供一种分离的多核苷酸，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列选自下组：

(a)编码所述多肽的多核苷酸；或

(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。

在一个优选例中，该多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示。

在本发明的另一方面，提供一种载体，它含有所述的多核苷酸。

在本发明的另一方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，它含有所述的载体，或其基因组中整合有所述的多核苷酸。

在本发明的另一方面，提供所述的多肽或编码所述多肽的多核苷酸的用途，用于：调控根瘤植物的根瘤数目。

在一个优选例中，所述的调控为精细调控。

在另一优选例中，所述的根瘤植物为豆科植物；较佳地所述的豆科植物包括：大豆、苜蓿、百脉根、豌豆、花生、菜豆、绿豆、赤豆、蚕豆、豇豆、紫云英、甘草或黄芪。

在本发明的另一方面，提供一种调控根瘤植物的根瘤数量的方法，包括：调节大豆中所述的多肽或其编码基因的表达或活性。

在一个优选例中，所述方法包括：下调根瘤植物中所述的多肽或其编码基因的表达或活性，从而降低根瘤植物的根瘤数量。

在另一优选例中，所述的下调根瘤植物中所述的多肽或其编码基因的表达或活性包括：敲除(如同源重组技术或Crispr/Cas9技术)所述的多肽的编码基因，以干扰分子干扰所述的多肽的编码基因的表达。

在另一优选例中，所述的干扰分子是以所述的多肽的编码基因或其转录本为抑制或沉默靶标的dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA，或能表达或形成所述dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA的构建物。

在另一优选例中，通过RNAi方法下调根瘤植物中所述的多肽或其编码基因的表达或活性。

在另一优选例中，所述方法包括：

(a)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有干扰所述的多肽的编码基因表达的干扰分子；

(b)将植物细胞或组织或器官与(a)中的农杆菌接触，从而使所述干扰分子转入根瘤植物中。

在另一优选例中，所述方法包括：上调根瘤植物中所述的多肽或其编码基因的表达或活性，从而增加根瘤植物的根瘤数量。

在另一优选例中，所述的上调包括：增强所述的多肽或其编码基因的表达或稳定性；较佳地，所述上调包括：将所述的多肽或其编码基因转入根瘤植物(如将表达所述的多肽的表达构建物转入植物)。

在本发明的另一方面，提供一种制备根瘤植物的方法，将所述的多肽或其编码基因或其干扰分子引入到根瘤植物中，获得转基因的根瘤植物。

在一个优选例中，还包括：将所述的转基因的根瘤植物与未引入所述的多肽或其编码基因或其干扰分子的根瘤植物(如非转基因植物，或转入所述的多肽或其编码基因以外的其它基因的植物)进行杂交，获得杂交后代，该后代在根瘤数量方面呈现与原所述未引入所述的多肽或其编码基因或其干扰分子的根瘤植物不同的表型。

在本发明的另一方面，提供所述的多肽的制备方法，该方法包含：

(a)在适合表达的条件下，培养所述的宿主细胞；

(b)从培养物中分离出所述的多肽。

在本发明的另一方面，提供一种所述的多肽或其编码基因的调节剂，其是上调剂或下调剂；较佳地，所述的下调剂是特异性干扰所述的多肽的编码基因表达的干扰分子；更佳地，所述的干扰分子靶向于所述的多肽的编码基因的第135～472位。

在本发明的另一方面，提供一种所述的多肽或其编码基因的用途，用作鉴定大豆根瘤数量的分子标记物。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、Rac1-RNAi的表型，以转入空载体的植株作为对照。

A、接种根瘤菌USDA110的转入空载体对照(天隆一号)植株表型；

B、接种根瘤菌USDA110的Rac1-RNAi的表型。

图2、对于图1A、B植株的根的根瘤数量进行统计的结果。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，首次从豆科植物中克隆到一种新的基因：Rac1基因。功能分析显示，该基因或其调控分子与根瘤植物的根瘤的数量密切相关。籍此，该基因可应用于植物改良，获得根瘤性状、固氮性状发生改变的植物。

如本文所用，所述的“根瘤植物(作物)”是指具有根瘤或能够产生根瘤的植物。较佳的，所述的根瘤植物是豆科植物。例如，所述的豆科植物包括：大豆、百脉根，苜蓿、豌豆、花生、菜豆、绿豆、赤豆、蚕豆、豇豆、紫云英、甘草、黄芪等。

Rac1及其预测的参与调控豆科植物根瘤数目的分子机制

Rac1包括两种高度同源的蛋白Rac1a和Rac1b。由于大豆是古四倍体演变而来的二倍体作物，所以其大部分基因都有一个同源度极高的重复。本领域中，也可以理解为有Rac1a和Rac1b都是Rac1。除非另外说明，本发明中所述的Rac1选自Rac1a和Rac1b之一，或两者。

本发明所述的Rac1多肽(蛋白)还包括Rac1多肽的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的Rac1多肽相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个(如1-50个；较佳地1-20个；更佳地1-10个；更佳地1-8个；如5个，3个)保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的蛋白，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个(如1-30个；较佳地1-20个；更佳地1-10个；如5个，3个)氨基酸残基中具有取代基团的蛋白，或(iii)附加的氨基酸序列融合到此蛋白序列而形成的蛋白等。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

任何一种Rac1多肽的生物活性片段都可以应用到本发明中。在这里，Rac1多肽的生物活性片段的含义是指作为一种多肽，其仍然能保持全长的Rac1多肽的全部或部分功能。通常情况下，所述的生物活性片段至少保持50％的全长Rac1多肽的活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持全长Rac1多肽的60％、70％、80％、90％、95％、99％、或100％的活性。

在本发明中，术语“Rac1多肽”指具有Rac1多肽活性的SEQ ID NO:3或4序列的多肽。该术语还包括具有与Rac1多肽相同功能的、SEQ ID NO:3或4序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(如1-50个；较佳地1-20个；更佳地1-10个；如5个，3个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。

编码Rac1多肽或其保守性变异多肽的多核苷酸序列(编码序列)也可以应用到本发明中。编码成熟Rac1多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO:1或2所示的序列基本上相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO:3或4的蛋白质，但与SEQ ID NO:1或2所示的编码区序列有差别的核酸序列。

术语“编码基因”可以是包括编码所述多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

上述多核苷酸的变异体也是可用的，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

应理解，虽然本发明的Rac1基因优选获自豆科植物，但是获自其它植物的与该Rac1基因高度同源(如具有80％以上，如85％、90％、95％、甚至98％序列相同性)的其它基因也在本发明考虑的范围之内。比对序列相同性的方法和工具也是本领域周知的，例如BLAST。

包含所述编码序列的载体，以及用所述的载体或Rac1多肽编码序列经基因工程产生的宿主细胞也包括在本发明中。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含Rac1多肽编码序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。包含上述的适当编码序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞通常是植物细胞。转化植物一般可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法、幼胚转化法等；优选的是农杆菌法。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得相对于野生型而言性状发生改变的植物。

本发明还涉及Rac1多肽或其编码基因的上调剂或下调剂(如shRNA，反义的Rac1基因或如miRNA)及其用途。由于Rac1的上调剂或下调剂可调节Rac1的表达和/或调节Rac1的活性等，因此，所述的Rac1的上调剂或下调剂也可通过对Rac1的影响来调节植物性状，从而达到改良植物的目的。

任何可调节Rac1多肽的活性、调节Rac1多肽的稳定性、促进或抑制Rac1多肽的表达、延长或减少Rac1多肽有效作用时间、或促进或降低Rac1基因的转录和翻译的物质均可用于本发明，作为可用于调节植物的根瘤数目及植物固氮能力的有效物质。

Rac1基因在控制豆科植物根瘤数目中的应用

Rac1属于植物中特有的一类小G蛋白，在植物众多的生理及发育过程中均发挥着重要作用。本发明人通过酵母双杂交、荧光素酶片段互补和免疫共沉淀实验发现Rac1可以与结瘤因子受体NFR1，NFR5互作。同时，结瘤因子受体NFR1可以与Rac1上游的激活因子鸟苷酸交换因子(guanine nucleotide exchang factor，GEF)互作并磷酸化GEF。结合遗传表型，本发明人推测，在根瘤植物根瘤共生的早期信号传递中，NFR1-GEF-Rac1作为一个关键组件发挥着不可或缺的作用。结瘤因子受体NFR1，NFR5在感知到结瘤因子后，具有激酶活性的NFR1通过磷酸化来激活GEF，GEF通过GDP/GTP的置换，将与GDP结合的非活性状态的Rac1转变成与GTP结合的活性状态，进而将共生信号向下游传递，调控根瘤的发生。在转基因实验中，下调Rac1的表达，降低了根瘤的产生数量。

基于本发明人的新发现，本发明提供了所述的Rac1多肽或其编码基因的用途，用于调控根瘤植物的根瘤数目，从而实现植物固氮能力的调节(包括上调或下调)。在一种方式下，上调根瘤植物中Rac1多肽的表达，从而提高植物的根瘤数目，促进根瘤植物的固氮能力。在另一种方式下，下调根瘤植物中Rac1多肽的表达，从而降低植物的根瘤数目，抑制根瘤植物的固氮能力。因此，可基于Rac1多肽对于植物性状的影响作用来改变植物，达到根据实际生产需要改良植物品质的目的。

可以采用本领域人员熟知的多种方法来调节所述的Rac1蛋白的表达。比如可通过一定的途径将携带Rac1编码基因的表达单位(比如表达载体或病毒等)递送到靶点上，并使之表达活性的Rac1蛋白。作为本发明的一种实施方式，将Rac1蛋白的编码基因通过常规的方法克隆到适当的载体中，将所述的带有外源基因的重组载体导入到可表达所述Rac1蛋白的植物细胞中，使所述的植物细胞表达Rac1蛋白。可通过将所述植物细胞再生成植物，获得过量表达Rac1蛋白的植物。

此外，也可以采用本领域人员熟知的多种方法来降低Rac1蛋白的表达或使之缺失表达，比如将携带反义Rac1基因的表达单位(比如表达载体或病毒等)递送到靶点上，使得细胞或植物组织不表达或降低表达Rac1蛋白；或将Rac1基因进行敲除。

可以采用本领域人员熟知的多种方法来降低Rac1蛋白的表达或使之缺失表达，比例利用基因编辑技术来敲除Rac1基因，又比如将携带反义Rac1基因的表达单位(比如表达载体或病毒等)递送到靶点上，使得植物不表达或降低表达Rac1蛋白。或将下调Rac1基因转录、蛋白表达或蛋白活性的下调剂转入宿主菌中。

为本发明的一种实施方式，利用特异性干扰Rac1基因转录的干扰分子来下调基因的表达。小分子干扰的方式包括但不限于：miRNA调控的基因沉默，正义RNA引起的共抑制(Cosuppression)，反义RNA抑制，病毒介导的基因沉默(Virus Induced Gene Silencing，VIGS)，shRNA，dsRNA，小干扰RNA，发卡式RNA(hairpinRNA，hpRNA)介导的基因沉默等，这些也可被应用于本发明中。在一种优选例中，所述的干扰分子靶向于权利要求1所述的多肽的编码基因的第135～472位。

作为本发明的一种实施方式，通过敲除Rac1基因，从而敲除Rac1的编码基因。例如，采用CRISPR/Cas9系统进行基因编辑，从而敲除Rac1基因。作为本发明的另一种实施方式，通过采用同源重组的方法，从而敲除Rac1的编码基因。

本发明还涉及利用Rac1蛋白或其编码基因作为一种基因转化植株后代的追踪标记。本发明还涉及利用Rac1蛋白或其编码基因作为一种分子标记，通过检测植物中Rac1蛋白的表达情况，早期确定植物的根瘤形成数量，预期其固氮能力。

本发明的主要优点在于：

本发明人克隆了控制根瘤植物根瘤数目多少的基因Rac1，并探讨该基因控制根瘤器官数目的分子机制，为根瘤植物高效固氮和高产的分子设计提供理论依据。本发明为后续创造适用于根瘤植物高效固氮的育种材料提供技术支持。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

I.材料和方法

1.实验材料

1.1.植物材料

大豆(Glycine max(Linn.)Merr.)材料：野生型大豆生态型天隆一号。挑取种皮完整的饱满大豆种子，放于70％的乙醇溶液中短暂浸泡30s，用吸水纸擦干后，放入培养皿中并将培养皿置于真空干燥器中，采用氯气消毒法处理8小时(NaClO：浓HCl＝96：4)后，放入超净台中通风2小时，吹去残余的氯气后播种于灭菌土1-2厘米深处，种植于上海植物生理生态研究所人工气候室。培养条件为：26℃，光强200μmol·m^-2s^-1，光培养14h，暗培养10h，湿度60％。

1.2.菌株和克隆载体

大肠杆菌菌株：DH5α；

农杆菌菌株：K599；

基因克隆载体：pENTR(Invitrogen)；

转基因构建载体：pK7GWIWG2R。

2.实验方法

2.1.重组质粒的构建

利用引物GmRac1a-F/GmRac1a-R和KOD酶(一种高保真DNA聚合酶，购自Toyobo)扩增大豆cDNA，PCR产物回收后经过BamHI，EcoRI酶切连接到pENTR载体，转化大肠杆菌鉴定阳性克隆，抽提质粒DNA，测序验证获得重组质粒。

利用引物GmRac1-RNAi-F/GmRac1-RNAi-R和KOD酶扩增沉默基因用的片段，PCR产物回收后经过BamHI，EcoRI酶切连接到pENTR载体，转化大肠杆菌鉴定阳性克隆，抽提质粒DNA，经过测序验证后经过LR酶(购自Invitrogen)连接到pK7GWIWG2R转基因载体，转化大肠杆菌鉴定阳性克隆，抽提质粒DNA备用。

上述获得的这些重组质粒分别称为：pENTR-GmRac1a(GmRac1a插入pENTR中)，pENTR-GmRac1-RNAi(GmRac1-RNAi插入pENTR中)和pK7GWIWG2R-GmRac1-RNAi(GmRac1-RNAi插入pK7GWIWG2R中)。该RNAi同时沉默Rac1a和Rac1b。

引物序列如下：

GmRac1a-F：CGCGGATCCATGATGAATGCTTCAAAGTTCA(SEQ ID NO:5)；

GmRac1a-R：CCGGAATTCTTAAGCAGCACAGCCTCCACACATG(SEQ ID NO:6)；

GmRac1-RNAi-F：CGCGGATCCTGCCAATGTTGCTGTGGAT(SEQ ID NO:7)；

GmRac1-RNAi-R：CCGGAATTCCTATGTAAGCTACTGCACC(SEQ ID NO:8)。

2.2.发根农杆菌转化

发根农杆菌感受态细胞的制备

(1)从-70℃冰箱取发根农杆菌K599划在YEB固体培养基(100mg/L Str)上，28℃培养2天，挑单克隆接种在5ml YEB+100mg/L Str液体培养基中，28℃摇菌过夜(220r/min，12h-8h)。

(2)取1mL菌液加入到新的100mL YEB+100mg/L Str液体培养基中，28℃摇菌培养至OD₆₀₀＝0.5-0.6。

(3)冰浴30分钟后，4000r/min离心15分钟(4℃)，弃上清，倒置离心管1分钟流尽最后残液。

(4)加入10mL预冷的0.1M CaCl₂垂悬，4000r/min离心15分钟(4℃)，弃去上清。

(5)重复步骤(4)。

(6)加入2mL预冷的0.1M CaCl₂垂悬。100μL分装，可以用于转化(冰浴12-24h后效果最佳)，或加入等体积30％灭菌甘油，混匀后液氮速冻，-70℃储存。

表达载体转入发根农杆菌K599中

(1)取制备好的发根农杆菌K599感受态细胞冰水助融。加入DNA轻柔混匀后冰浴30分钟。

(2)液氮速冻2-5分钟后37℃水浴5分钟。

(3)加1mL YEB液体培养基，28℃摇菌(220r/min)3-5h。

(4)取适量菌液均匀涂抹在YEB固体培养基(含相应抗生素)上，28℃培养2-3天，挑单克隆PCR鉴定。

获得大豆转基因组合苗

(1)取-70℃发根农杆菌(含相应质粒)划平板，28℃培养36-48h，挑单克隆在5mLYEB液体培养基(含相应抗生素)中28℃震荡培养12-16h(220r/min)。

(2)取1m L到新的100mL YEB液体培养基(含相应抗生素)中28℃震荡培养12-16h(220r/min)。

(3)用无菌的1/4MS液体培养基垂悬K599菌液(OD₆₀₀＝0.2～0.5)并准备生长至V1期豆苗。

(4)在2cm见方的无菌岩棉块上，用200μL枪头戳一个小孔，放入无菌培养皿中，每9cm直径的培养皿中放4块岩棉。在每个岩棉上滴加4-7mL步骤3得到的垂悬菌液，浸透岩棉块。

(5)将豆苗从子叶节下2-3cm处斜切下来，保证切面全部插入并接触岩棉块。

(6)将装有豆苗的培养皿放入洁净的保湿盒中过夜保湿，第二天除去上盖直到豆苗全部出现萎蔫。

(7)加入无菌1/4MS液体，盖上保湿盒，豆苗恢复生机。

(8)保持岩棉块湿润，2周后用除去岩棉块，可以看到切口处生长出毛状根。

(9)进行鉴定，除去非阳性根，放入盛有灭菌蛭石的小花盆中。

(10)用根瘤菌B.japonicum USDA110侵染大豆植株，之后培养3周，取出豆苗进行根瘤统计。

2.3.数据分析平台与软件

序列BLAST分析：NCBI在线分析平台。

序列Alignment分析：SerialCloner 2.6.1软件。

引物设计：Primer Premier 5.0软件。

II.实施例

实施例1、Rac1基因的克隆

为了获得对于豆科植物的根瘤具有调控作用的基因，本发明人筛选了大量的基因，经过反复研究和试验，发现Rac1基因对于控制大豆植物根瘤数目多少具有调控作用。

Rac1a基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其编码的氨基酸如SEQ ID NO:3。Rac1b基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，其编码的氨基酸如SEQ ID NO:4。两者具有高度的序列同一性。

SEQ ID NO:1

ATGATGAATGCTTCAAAGTTCATTAAATGTGTTACTGTTGGAGATGGAGCTGTTGGGAAAACCTGCATGCTCATTTGCTACACCAGCAACAAGTTCCCCACTGATTACATACCAACAGTATTTGATAATTTTAGTGCCAATGTTGCTGTGGATGGAAGCATTGTCAATTTGGGGCTATGGGACACAGCAGGCCAGGAAGACTACAGCAGGTTGAGGCCATTGAGTTATAGAGGAGCAGACATTTTTGTCTTAGCATTCTCACTGATTAGCAGAGCTAGCTATGAAAATGTTCTCAAGAAGTGGATGCCGGAATTGCGTAGATTTGCACCTAATGTTCCAATTGTTCTTGTTGGTACAAAGTTAGATCTTCGTGAAGACCGGGGTTATGTAGCTGATCACATGGGATCTAGCGTCATAACATCTGCTGAGGGGGAAGAACTGAGGAAACAAATTGGTGCAGTAGCTTACATAGAGTGCAGTTCAAAGACTCAACAGAATGTCAAAGCAGTGTTTGACACTGCAATTAAGGTTGTTCTCCAACCTCCAAGGAGGAAAGAAATGGCTAGGAAGAAAAGGCATAGGAGGTCTGGTTGCTCATTTGTAAGTATCATGTGTGGAGGCTGTGCTGCTTAA

SEQ ID NO:2

ATGATGAATGCTTCAAAGTTCATTAAATGTGTTACTGTTGGAGATGGAGCTGTTGGGAAAACCTGCATGCTCATTTGCTACACCAGCAACAAGTTCCCCACTGATTACATACCAACAGTATTTGACAATTTCAGTGCCAATGTAGCTGTGGATGGAAGCATTGTCAATTTGGGGCTATGGGACACAGCAGGCCAGGAAGACTATAGCAGGTTGAGGCCACTGAGCTATAGAGGAGCAGACATTTTTGTCTTAGCATTCTCACTGATTAGCAGAGCTAGCTATGAAAATGTTCTCAAGAAGTGGATGCCGGAATTGCGTAGATTTGCACCTAATGTTCCAATTGTTCTTGTTGGTACGAAGTTAGATCTTCGTGAAGACCGGGGTTATGTAGCTGATCACATGGGATCTAATGTCATAACATCTGCTGAGGGGGAAGAACTGAGGAAACAAATTGGTGCAGCAGCTTACATTGAGTGCAGTTCAAAGACTCAACAGAATGTCAAAGCAGTGTTTGACACTGCAATTAAGGTTGTTCTCCAACCTCAACCTCCAAGGAGGAAAGAAATGGCAAGGAAGAAAAGGCATAGAAGGTCTGGTTGCTCATTTGTAAGTATTATGTGCGGAGGCTGTGCTGCTTAA

SEQ ID NO:3

MMNASKFIKCVTVGDGAVGKTCMLICYTSNKFPTDYIPTVFDNFSANVAVDGSIVNLGLWDTAGQEDYSRLRPLSYRGADIFVLAFSLISRASYENVLKKWMPELRRFAPNVPIVLVGTKLDLREDRGYVADHMGSSVITSAEGEELRKQIGAVAYIECSSKTQQNVKAVFDTAIKVVLQPPRRKEMARKKRHRRSGCSFVSIMCGGCAA

SEQ ID NO:4

MMNASKFIKCVTVGDGAVGKTCMLICYTSNKFPTDYIPTVFDNFSANVAVDGSIVNLGLWDTAGQEDYSRLRPLSYRGADIFVLAFSLISRASYENVLKKWMPELRRFAPNVPIVLVGTKLDLREDRGYVADHMGSNVITSAEGEELRKQIGAAAYIECSSKTQQNVKAVFDTAIKVVLQPQPPRRKEMARKKRHRRSGCSFVSIMCGGCAA

实施例2、沉默Rac1基因后的根瘤表型分析

由于Rac1a和Rac1b核苷酸序列同源度极高，所以设计RNAi引物时，本发明人获得了同时将Rac1a和Rac1b都沉默的靶向位置。

将构建好的重组质粒载体转入发根农杆菌A.rhizogenes K599中，转化大豆毛状根，将完成共培养的大豆植株移入灭菌蛭石中进行生根生长7天后，用根瘤菌B.japonicumUSDA110侵染大豆植株，对接菌后21天的大豆毛状根结瘤状况进行根瘤数目统计，并采用Microsoft Excel 2010软件选择Student T-test方法对结瘤数目差异性进行检验。

根瘤菌B.japonicum USDA110侵染后，Rac1-RNAi以及空载体植株的表型如图1所示，A为接种根瘤菌的转入空载体对照(天隆一号)植株的根，B为接种根瘤菌的Rac1-RNAi的植株的根。

对于图1A、B植株的根的根瘤数量进行统计，结果如图2所示，相对于转空载体对照，对Rac1进行沉默后，植株的毛状根根瘤数目显著下降，根瘤数目减少约40％。

RNAi转基因植株中检测到Rac1a和Rac1b的mRNA都有下降。所以根瘤数目下降为Rac1a和Rac1b同时都被沉默的效果。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国科学院上海生命科学研究院

<120> 调控根瘤植物的根瘤数目的基因及其在高效固氮方面的应用

<130> 180432

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 633

<212> DNA

<213> 大豆(Glycine maxLinn.Merr.)

<400> 1

atgatgaatg cttcaaagtt cattaaatgt gttactgttg gagatggagc tgttgggaaa 60

acctgcatgc tcatttgcta caccagcaac aagttcccca ctgattacat accaacagta 120

tttgataatt ttagtgccaa tgttgctgtg gatggaagca ttgtcaattt ggggctatgg 180

gacacagcag gccaggaaga ctacagcagg ttgaggccat tgagttatag aggagcagac 240

atttttgtct tagcattctc actgattagc agagctagct atgaaaatgt tctcaagaag 300

tggatgccgg aattgcgtag atttgcacct aatgttccaa ttgttcttgt tggtacaaag 360

ttagatcttc gtgaagaccg gggttatgta gctgatcaca tgggatctag cgtcataaca 420

tctgctgagg gggaagaact gaggaaacaa attggtgcag tagcttacat agagtgcagt 480

tcaaagactc aacagaatgt caaagcagtg tttgacactg caattaaggt tgttctccaa 540

cctccaagga ggaaagaaat ggctaggaag aaaaggcata ggaggtctgg ttgctcattt 600

gtaagtatca tgtgtggagg ctgtgctgct taa 633

<210> 2

<211> 639

<212> DNA

<213> 大豆(Glycine maxLinn.Merr.)

<400> 2

atgatgaatg cttcaaagtt cattaaatgt gttactgttg gagatggagc tgttgggaaa 60

acctgcatgc tcatttgcta caccagcaac aagttcccca ctgattacat accaacagta 120

tttgacaatt tcagtgccaa tgtagctgtg gatggaagca ttgtcaattt ggggctatgg 180

gacacagcag gccaggaaga ctatagcagg ttgaggccac tgagctatag aggagcagac 240

atttttgtct tagcattctc actgattagc agagctagct atgaaaatgt tctcaagaag 300

tggatgccgg aattgcgtag atttgcacct aatgttccaa ttgttcttgt tggtacgaag 360

ttagatcttc gtgaagaccg gggttatgta gctgatcaca tgggatctaa tgtcataaca 420

tctgctgagg gggaagaact gaggaaacaa attggtgcag cagcttacat tgagtgcagt 480

tcaaagactc aacagaatgt caaagcagtg tttgacactg caattaaggt tgttctccaa 540

cctcaacctc caaggaggaa agaaatggca aggaagaaaa ggcatagaag gtctggttgc 600

tcatttgtaa gtattatgtg cggaggctgt gctgcttaa 639

<210> 3

<211> 210

<212> PRT

<213> 大豆(Glycine maxLinn.Merr.)

<400> 3

Met Met Asn Ala Ser Lys Phe Ile Lys Cys Val Thr Val Gly Asp Gly

1 5 10 15

Ala Val Gly Lys Thr Cys Met Leu Ile Cys Tyr Thr Ser Asn Lys Phe

20 25 30

Pro Thr Asp Tyr Ile Pro Thr Val Phe Asp Asn Phe Ser Ala Asn Val

35 40 45

Ala Val Asp Gly Ser Ile Val Asn Leu Gly Leu Trp Asp Thr Ala Gly

50 55 60

Gln Glu Asp Tyr Ser Arg Leu Arg Pro Leu Ser Tyr Arg Gly Ala Asp

65 70 75 80

Ile Phe Val Leu Ala Phe Ser Leu Ile Ser Arg Ala Ser Tyr Glu Asn

85 90 95

Val Leu Lys Lys Trp Met Pro Glu Leu Arg Arg Phe Ala Pro Asn Val

100 105 110

Pro Ile Val Leu Val Gly Thr Lys Leu Asp Leu Arg Glu Asp Arg Gly

115 120 125

Tyr Val Ala Asp His Met Gly Ser Ser Val Ile Thr Ser Ala Glu Gly

130 135 140

Glu Glu Leu Arg Lys Gln Ile Gly Ala Val Ala Tyr Ile Glu Cys Ser

145 150 155 160

Ser Lys Thr Gln Gln Asn Val Lys Ala Val Phe Asp Thr Ala Ile Lys

165 170 175

Val Val Leu Gln Pro Pro Arg Arg Lys Glu Met Ala Arg Lys Lys Arg

180 185 190

His Arg Arg Ser Gly Cys Ser Phe Val Ser Ile Met Cys Gly Gly Cys

195 200 205

Ala Ala

210

<210> 4

<211> 212

<212> PRT

<213> 大豆(Glycine maxLinn.Merr.)

<400> 4

Met Met Asn Ala Ser Lys Phe Ile Lys Cys Val Thr Val Gly Asp Gly

1 5 10 15

Ala Val Gly Lys Thr Cys Met Leu Ile Cys Tyr Thr Ser Asn Lys Phe

20 25 30

Pro Thr Asp Tyr Ile Pro Thr Val Phe Asp Asn Phe Ser Ala Asn Val

35 40 45

Ala Val Asp Gly Ser Ile Val Asn Leu Gly Leu Trp Asp Thr Ala Gly

50 55 60

Gln Glu Asp Tyr Ser Arg Leu Arg Pro Leu Ser Tyr Arg Gly Ala Asp

65 70 75 80

Ile Phe Val Leu Ala Phe Ser Leu Ile Ser Arg Ala Ser Tyr Glu Asn

85 90 95

Val Leu Lys Lys Trp Met Pro Glu Leu Arg Arg Phe Ala Pro Asn Val

100 105 110

Pro Ile Val Leu Val Gly Thr Lys Leu Asp Leu Arg Glu Asp Arg Gly

115 120 125

Tyr Val Ala Asp His Met Gly Ser Asn Val Ile Thr Ser Ala Glu Gly

130 135 140

Glu Glu Leu Arg Lys Gln Ile Gly Ala Ala Ala Tyr Ile Glu Cys Ser

145 150 155 160

Ser Lys Thr Gln Gln Asn Val Lys Ala Val Phe Asp Thr Ala Ile Lys

165 170 175

Val Val Leu Gln Pro Gln Pro Pro Arg Arg Lys Glu Met Ala Arg Lys

180 185 190

Lys Arg His Arg Arg Ser Gly Cys Ser Phe Val Ser Ile Met Cys Gly

195 200 205

Gly Cys Ala Ala

210

<210> 5

<211> 31

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 5

cgcggatcca tgatgaatgc ttcaaagttc a 31

<210> 6

<211> 34

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 6

ccggaattct taagcagcac agcctccaca catg 34

<210> 7

<211> 28

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 7

cgcggatcct gccaatgttg ctgtggat 28

<210> 8

<211> 28

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 8

ccggaattcc tatgtaagct actgcacc 28

Claims

1.大豆来源的Rac1多肽或编码所述多肽的多核苷酸用于调控根瘤植物的根瘤数目的用途，所述Rac1包括Rac1a和Rac1b，通过下调根瘤植物中所述多肽或编码所述多肽的多核苷酸的表达量从而降低根瘤植物的根瘤数量；所述根瘤植物为大豆；所述Rac1a多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 3所示，所述Rac1b多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 4所示；

其中，通过RNAi方法下调根瘤植物中所述的多肽或编码所述多肽的多核苷酸的表达量，所述RNAi同时沉默Rac1a和Rac1b的表达，从而下调根瘤植物中所述多肽或编码所述多肽的多核苷酸的表达量；利用引物GmRac1-RNAi-F和GmRac1-RNAi-R以及KOD酶扩增沉默基因用的片段；所述GmRac1-RNAi-F的核苷酸序列如SEQ ID NO: 7所示，所述GmRac1-RNAi-R的核苷酸序列如SEQ ID NO: 8所示。

2.一种调控根瘤植物的根瘤数量的方法，包括：下调根瘤植物中Rac1多肽或编码所述多肽的多核苷酸的表达量，从而降低根瘤植物的根瘤数量；所述根瘤植物为大豆；所述Rac1包括Rac1a和Rac1b，所述Rac1a多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 3所示，所述Rac1b多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 4所示；其中，通过RNAi方法下调根瘤植物中所述多肽或编码所述多肽的多核苷酸的表达量，所述RNAi同时沉默Rac1a和Rac1b的表达，从而下调根瘤植物中所述多肽或其编码所述多肽的多核苷酸的表达量；利用引物GmRac1-RNAi-F和GmRac1-RNAi-R以及KOD酶扩增沉默基因用的片段；所述GmRac1-RNAi-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，所述GmRac1-RNAi-R的核苷酸序列如SEQ ID NO: 8所示。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法包括：

(a) 提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有干扰编码所述多肽的多核苷酸表达的干扰分子；

(b) 将植物细胞或组织或器官与(a)中的农杆菌接触，从而使所述干扰分子转入根瘤植物中。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，利用引物GmRac1-RNAi-F和GmRac1-RNAi-R以及KOD酶扩增沉默基因用的片段；所述GmRac1-RNAi-F的核苷酸序列如SEQ ID NO: 7所示，所述GmRac1-RNAi-R的核苷酸序列如SEQ ID NO: 8所示。

5.一种制备根瘤植物的方法，其特征在于，将编码大豆来源的Rac1多肽的多核苷酸的干扰分子引入到根瘤植物中，获得转基因的根瘤植物；所述根瘤植物为大豆；所述Rac1包括Rac1a和Rac1b，所述Rac1a多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 3所示，所述Rac1b多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 4所示；利用引物GmRac1-RNAi-F和GmRac1-RNAi-R以及KOD酶扩增沉默基因用的片段，从而下调根瘤植物中所述多肽或编码所述多肽的多核苷酸的表达量；所述GmRac1-RNAi-F的核苷酸序列如SEQ ID NO: 7所示，所述GmRac1-RNAi-R的核苷酸序列如SEQ ID NO: 8。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，还包括：将所述的转基因根瘤植物与未引入编码大豆来源的Rac1多肽的多核苷酸的干扰分子的根瘤植物进行杂交，获得杂交后代，该后代在根瘤数量方面呈现与原所述未引入编码大豆来源的Rac1多肽的多核苷酸的干扰分子的根瘤植物不同的表型。