CN113373160A - 烟草bHLH转录因子基因NtFAMA及其应用 - Google Patents

烟草bHLH转录因子基因NtFAMA及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于烟草基因工程领域，具体涉及烟草转录因子基因NtFAMA及其应用专利申请。该基因碱基序列如SEQ ID NO.1所示。烟草转录因子基因NtFAMA由287个氨基酸残基组成，其中第91‑142位氨基酸保守的氨基酸转运蛋白结构域。该蛋白与植物叶片中绿原酸含量相关，降低该蛋白表达后，叶片中绿原酸含量明显升高。本发明通过对特定烟草转录因子NtFAMA的初步研究，发现其与烟草绿原酸含量高度相关，在将该基因沉默后，烟草中绿原酸含量发生了明显升高。基于这一特性，可为合理绿原酸含量烟草新品种培育一定的应用基础和参考借鉴。

Description

烟草bHLH转录因子基因NtFAMA及其应用
技术领域
本发明属于烟草基因工程领域，具体涉及烟草转录因子基因NtFAMA及其应用。
背景技术
苯酚被国家烟草专卖局列为重点控制的7种代表性有害成分之一，其随烟气吸入后会快速分布到所有组织中，具有显著的黏膜渗透性，导致组织坏死和腐蚀脱落。长期吸入含苯酚气体会导致上呼吸道哮鸣、呼吸窘迫甚至衰竭，另外还会导致头痛、晕眩、肾脏损伤和心脏系统疾病、以及癌症等[1]。苯酚还具有致突变和基因毒性等毒性作用，被列入EPA有害成分名单(US.EPA, 2002)。
国外研究者已经证明多酚类化合物（绿原酸：chlorogenic acid, CGA和芸香苷）对烤烟烟气中二羟基的挥发酚成分（邻、间、对-苯二酚）以及苯酚的生成有较大贡献，烟草中多酚类化合物以及木质素是卷烟烟气中二羟基挥发酚类的主要来源（Schlotzhauer，1981）[2]。多酚类代谢途径是植物中研究较多的，因此，应用生物技术调控关键基因表达，进而调控多酚类物质含量是降低卷烟烟气苯酚含量的有效策略。
CGA是一类咖啡酰奎尼酸，是茄科植物中一类主要可溶性性苯丙烷物质（Clifford，1999）[3]，CGA是由苯并氨酸代谢途径和结氨酸途径首先生成绿原酸基本结构对香豆酸，研究发现该代谢途径的多个酶都参与CGA的合成。苯丙氨酸解氨酶（L-phenylalanin ammonia-lyase，PAL）催化苯丙氨酸生成肉桂酸，然后经由肉桂酸和香豆素最终形成CGA。
植物中CGA的生物合成路线尚未完全清楚，苯丙烷途径控制木质素、花绿原酸、信号分子的合成，以及与植物防御病原体和紫外光有关的大量化合物。因此对苯丙烷物质的调控可以对CGA进行调控，研究发现很多转录因子能够通过结合苯丙烷途径中关键合成酶基因的启动子去对苯丙烷类物质进行调控（穆红梅等，2015）[4]，在番茄中表达金鱼草bHLH基因会提高花青素积累，在烟草中表达该基因也会诱导花青素基因表达，造成花青素含量提高（Mooney et al., 1995）[5]，然而bHLH对绿原酸类物质调控效果研究尚未见报道，我们在前期研究中发现一个bHLH转录因子基因与绿原酸含量显著相关性，通过调控该基因表达可以实现对烟草CGA含量的有效调控，可以实现从源头调控烟草CGA含量，进而实现降低苯酚前体物的目标，为低苯酚含量烟叶生产提供参考和基础。
参考文献：
[1].Smith CJ, Perfetti TA, Morton MJ, Rodgman A, Garg R, Selassie CD,Hansch C: The relative toxicity of substituted phenols reported in cigarettemainstream smoke. Toxicological sciences : an official journal of the Societyof Toxicology 2002, 69(1):265-278.
[2].Schlotzhauer, W. S.,R. M.Martin, M. E. Snook, and R. E.Williamson. Pyrolytic studies ont obacco leaf constituents to the formationof smoke catechols. Tob. Sci 1981，X：6-10.
[3].Clifford M N. Chlorogenic acids and other cinnamates-nature,occurrence and dietary burden.
J. Sci. Food. Agr, 1999, 79(3): 362-372.
[4].穆红梅, 杜秀菊, 张秀省等. 植物MYB转录因子调控苯丙烷类生物合成研究. 北方园艺,2015(24): 171-174.
[5].Mooney M, Desnos T, Harrison K, Jones J, Carpenter R, Coen E.Altered regulation of tomatoand tobacco pigmentation genes caused by thedelila gene of Antirrhinum. Plant J, 1995,7(2): 333-339。
发明内容
基于烟草绿原酸含量调控基因的研究，本发明的第一目的在于提供一种bHLH转录因子基因NtFAMA。
本发明的第二目的在于提供一种bHLH转录因子基因NtFAMA的应用，具体是在烟草绿原酸物质含量调节方面的应用，从而为低苯酚烟气释放量烟草品种培育提供基础。
本申请所采取的技术方案详述如下：
烟草bHLH转录因子基因NtFAMA，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示，其中特异性核酸片段为271-426位碱基。
烟草bHLH转录因子基因NtFAMA，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，其由287个氨基酸残基组成，其中第91-142位氨基酸是保守的bHLH结构域。
具体地，烟草bHLH转录因子基因NtFAMA体现在如下几个方面：
1.所述烟草bHLH转录因子基因NtFAMA在叶片黄酮类物质含量调控中的应用。
2.所述烟草bHLH转录因子基因NtFAMA在叶片绿原酸含量调控中的应用，利用基因沉默技术、或者基因超表达方法，通过调节烟草NtFAMA蛋白表达量，来调节控制烟叶中绿原酸物质含量。该蛋白与植物叶片中绿原酸含量相关，降低该蛋白表达后，叶片中绿原酸含量明显升高。
3.所述烟草bHLH转录因子基因NtFAMA在低苯酚含量烟草新品种培育中的应用。
利用所述基因NtFAMA的烟草新品种培育方法，通过转基因技术、瞬时表达技术或基因组编辑技术，构建含有NtFAMA基因的病毒诱导沉默载体、RNAi干涉载体、超表达载体或基因组编辑载体，转化烟草，筛选获得绿原酸含量降低的烟草新品种。
具体例如：利用病毒诱导的基因沉默（VIGS）的技术，干扰NtFAMA基因的表达使其沉默，NtFAMA基因沉默植株中绿原酸含量显著升高，进而获得绿原酸含量变化的植物新品种。
本发明通过对特定烟草bHLH转录因子基因NtFAMA的初步研究，发现其与烟草绿原酸含量高度相关，在将该基因沉默后，烟草中绿原酸含量发生了明显提高。基于这一特性，可为烟草低苯酚含量烟叶新品种培育提供一定的应用基础和参考借鉴。
附图说明
图1为本发明烟草TRV2-PDS、TRV2-GFP及TRV2-NtFAMA载体转化组的表型对比图；
图2 为与对照植株相比NtFAMA基因沉默植株中该基因的相对表达量；
图3 为病毒诱导基因沉默的烟叶及对照烟叶中的主要绿原酸含量比较。
具体实施方式
下面结合实施例对本申请做进一步解释说明，在介绍具体实施例前，就下述实施例中具体实验背景资料情况简要介绍如下。
生物材料：
本氏烟草，一种常用烟草材料，下述实施例中烟草种植于郑州烟草院种植基地，育苗钵中育苗，待发芽后两周进行分苗，种于塑料钵（10cm×10cm）中，22℃、16h光/8h暗条件下进行日常肥水管理等；
下述实施例中所采用的VIGS载体是一种来自烟草脆裂病毒的病毒载体（Tobaccorattle virus，TRV)，所具体利用的TRV2由郑州烟草研究院基因中心保存，其带有卡那霉素筛选标记和35S启动子，同时TRV2带有EcoR I和BamH I等多克隆位点，可以用来携带和转化外源基因。
实验试剂：
LB液体培养基，1 L含量中含有：10 g细菌蛋白胨（bacteriological peptone）；10g氯化钠（NaCl）；5 g酵母抽提物（yeast extract），高温高压灭菌；
YEB液体培养基，1 L含量中含有：5 g 牛肉浸膏（beef extract）；5 g 细菌蛋白胨（bacteriological peptone）；5 g 蔗糖（sucrose）；1 g酵母抽提物（yeast extract）；2 mL1 M硫酸镁（MgSO4），高温高压灭菌；
1 M 2-(N-吗啉)乙磺酸（MES）储备液：ddH2O溶解，过滤灭菌，-20℃储存备用；
200 mM乙酰丁香酮（Acetosyringone，As）储备液：二甲基亚砜（DSMO）溶解，-20℃储存备用；
MMA（100 mL）：1 mL（1 M）MgCl2；1 mL（1 M,pH5.6）MES；75 μL（200 mM）As。
实施例1
本实施例就烟草NtFAMA基因克隆及沉默载体的构建过程简要介绍如下。
（1）烟草NtFAMA基因克隆
根据前期对于烟草基因组及相关NtFAMA基因研究，选择特异编码序列为目标片段，设计PCR扩增用引物序列如下：
NtFAMA-F：5’-TTTGCCTACAATTTCCCCAA- 3’，
NtFAMA-R：5’-CTTGGCATGAGAGACCTCAA- 3’；
以烟草K326叶片的cDNA为模板，进行PCR扩增获得NtFAMA基因；
PCR扩增程序为：95℃预变性3 min；95℃变性15 s，55℃退火15 s，72℃延伸30 s，34个循环后，72℃彻底延伸 5 min；
对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，并回收电泳产物备用。
（2）构建重组TRV2-NtFAMA载体
将步骤（1）中的PCR扩增产物进行EcoR I、BamH I双酶切，同时对空载体TRV2进行EcoR I、BamH I双酶切，分别回收酶切产物，利用T4 DNA连接酶进行连接；
将连接产物转化大肠杆菌感受态DH5α，转化操作结束后将转化产物涂布在含50mg/L Kan的LB固体培养基上，在37℃过培养夜；
挑选阳性单菌落扩增后进一步进行PCR鉴定， 并结合测序验证，确保获得构建正确的重组载体TRV2-NtFAMA。
烟草NtFAMA基因，包括864个碱基，碱基序列如SEQ ID NO.1所示，具体如下：
ATGTTGTTTCACTTTGAACATGAAATATTTCTGCAGCCTTATTTGCCTACAATTTCCCCAAGTCTTAACCATCAAAATCCAGAGATGGTTAATGAAGAAGCTATGATGGTGTCACAAATTGAAGAGAAGTTTATAGAGTTTAGTGATAAAGTAGAGAATGCTACACAACTTAAGTTTCTTATTGGTGAAAATCTTGAAAATAGCCAAGCAAATGAAAGCAAGAAGAAGAGGAAAAGAACAAGAATCAAGAGTAGTGAGGAAGTTGAGAATCAAAGAATGACACATATTGAAGTGGAGAGGAATAGAAGGAAGCAAATGAATGAGCATCTTCTTGTCTTGAGGTCTCTCATGCCAAGTTCCTATGTACAAAGGGGAGATCAAGCTTCAATTATTGGTGGAGCAATAGAATTTGTGAGAGAATTGGAGCAACTTTTACAATGCCTTGAATCACAAAAGAGAAGGAAACTATATGGAGATGATTCATTATTAATGGAAATTCAAAATCCTTCACATCCACCATTCTTTGATCCTTTGCCACTTGCAAATGAATTATATGAAGGTGGAATTCAAGAAGAAATAGCAGAGAGCAAATCATGTTTGGCTGATGTTGAAGTGAAGCTTCTAGGTTTTAATGCAATGATCAAGATATTGTCAAAAAGAAGGCCAGGCCAACTCATTACCACCATTTCTGCTTTAGAAGATTTGCAGCTTAATATTATTCATACAAATATTACCACCATTGAACAAACTGTTCTATATTCTTTCAATGTTAAGATTGCTGGTGAAACAAAGTTTACAGCTGATGGTATAGCAAATTTGGTCCAGCAAATATTCAGTTTTATTCATGCAAACAATGCCATATGA
烟草转录因子基因NtFAMA，包括287个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体如下：
MLFHFEHEIFLQPYLPTISPSLNHQNPEMVNEEAMMVSQIEEKFIEFSDKVENATQLKFLIGENLENSQANESKKKRKRTRIKSSEEVENQRMTHIEVERNRRKQMNEHLLVLRSLMPSSYVQRGDQASIIGGAIEFVRELEQLLQCLESQKRRKLYGDDSLLMEIQNPSHPPFFDPLPLANELYEGGIQEEIAESKSCLADVEVKLLGFNAMIKILSKRRPGQLITTISALEDLQLNIIHTNITTIEQTVLYSFNVKIAGETKFTADGIANLVQQIFSFIHANNAI
实施例2
在实施例1基础上，利用农杆菌介导的VIGS技术，发明人进一步将所构建的重组TRV2-NtFAMA载体转化了烟草植株，并就相关植物表型变化情况做了验证分析，具体实验过程简介如下。
（1）转化农杆菌
需要说明的是，参考实施例1操作及现有技术，发明人同时制备了TRV2-GFP、TRV2-PDS重组载体作为转基因正负对照，具体转化过程为：
将TRV2-GFP（载体对照）、TRV2-PDS（VIGS效率对照）及TRV2-NtFAMA的阳性克隆质粒，分别通过电击转化方式转化进入农杆菌GV3101感受态细胞中，利用含50 mg/L Kan 和50 mg/L Rif的YEB平板进行培养筛选，在28℃倒置培养2 d后，利用菌落PCR筛选带有目的基因的农杆菌。
（2）制备转染用菌液
将步骤（1）中筛选所得阳性农杆菌克隆在5 mL的YEB液体培养基（含50 mg/L Kan和50 mg/L Rif）中，28℃、250 rpm条件下培养过夜；
取50 μL 过夜培养物接种至50 mL的YEB液体培养基（含50 mg/L Kan）中，培养至OD600 =1.0 ~ 1.5左右，然后4000 g 离心5 min，收集菌体，再用MMA(1 mL（1 M）MgCl2；1 mL（1 M, pH5.6）MES；75 μL（200 mM）As)重悬，调节OD600 =1.0 左右；
最后室温放置3 h左右后，作为转染用菌液。
（3）瞬时转化
以3~4 w苗龄的本氏烟草叶片为实验材料，利用1 mL规格注射器，将步骤（2）中所制备转染用菌液注射至烟草叶片中，注射后的烟草继续在人工培养箱内培养，观察表型变化。
注射3周后的烟草表型变化情况如图1所示。可以看出，含TRV2-PDS的农杆菌浸染植株新生叶有漂白现象，说明侵染成功；而TRV2-GFP组则无明显变化，相对应的TRV2-NtFAMA组烟草植株无显著变化，表明NtFAMA基因对烟草其他基本生理状态无明显影响。
进一步通过qRT-PCR对NtFAMA基因表达情况进行了检测，结果如图2所示，可以看出，TRV2- NtFAMA的侵染植株中，NtFAMA的表达量显著降低。
进一步地，发明人对实验组（TRV2- NtFAMA浸染植株）和对照组（TRV2-GFP浸染植株）中的植物绿原酸含量情况进行了检测，结果如图3，结果可以看出，沉默植株的生长表型正常；基因表达量下降20%；绿原酸含量升高为对照的2倍左右，这一结果表明NtFAMA基因是一个很好的调控绿原酸靶标基因，可以在不影响烟株表型的情况下有效调控烟叶中苯酚前体物绿原酸含量。
序列表
<110> 云南中烟工业有限责任公司
<120> 烟草bHLH转录因子基因NtFAMA及其应用
<141> 2021-07-12
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 864
<212> DNA
<213> Nicotiana benthamiana
<220>
<221> iDNA
<222> (1)..(864)
<223> NtFAMA碱基序列
<400> 1
atgttgtttc actttgaaca tgaaatattt ctgcagcctt atttgcctac aatttcccca 60
agtcttaacc atcaaaatcc agagatggtt aatgaagaag ctatgatggt gtcacaaatt 120
gaagagaagt ttatagagtt tagtgataaa gtagagaatg ctacacaact taagtttctt 180
attggtgaaa atcttgaaaa tagccaagca aatgaaagca agaagaagag gaaaagaaca 240
agaatcaaga gtagtgagga agttgagaat caaagaatga cacatattga agtggagagg 300
aatagaagga agcaaatgaa tgagcatctt cttgtcttga ggtctctcat gccaagttcc 360
tatgtacaaa ggggagatca agcttcaatt attggtggag caatagaatt tgtgagagaa 420
ttggagcaac ttttacaatg ccttgaatca caaaagagaa ggaaactata tggagatgat 480
tcattattaa tggaaattca aaatccttca catccaccat tctttgatcc tttgccactt 540
gcaaatgaat tatatgaagg tggaattcaa gaagaaatag cagagagcaa atcatgtttg 600
gctgatgttg aagtgaagct tctaggtttt aatgcaatga tcaagatatt gtcaaaaaga 660
aggccaggcc aactcattac caccatttct gctttagaag atttgcagct taatattatt 720
catacaaata ttaccaccat tgaacaaact gttctatatt ctttcaatgt taagattgct 780
ggtgaaacaa agtttacagc tgatggtata gcaaatttgg tccagcaaat attcagtttt 840
attcatgcaa acaatgccat atga 864
<210> 2
<211> 287
<212> PRT
<213> Nicotiana benthamiana
<400> 2
Met Leu Phe His Phe Glu His Glu Ile Phe Leu Gln Pro Tyr Leu Pro
1 5 10 15
Thr Ile Ser Pro Ser Leu Asn His Gln Asn Pro Glu Met Val Asn Glu
20 25 30
Glu Ala Met Met Val Ser Gln Ile Glu Glu Lys Phe Ile Glu Phe Ser
35 40 45
Asp Lys Val Glu Asn Ala Thr Gln Leu Lys Phe Leu Ile Gly Glu Asn
50 55 60
Leu Glu Asn Ser Gln Ala Asn Glu Ser Lys Lys Lys Arg Lys Arg Thr
65 70 75 80
Arg Ile Lys Ser Ser Glu Glu Val Glu Asn Gln Arg Met Thr His Ile
85 90 95
Glu Val Glu Arg Asn Arg Arg Lys Gln Met Asn Glu His Leu Leu Val
100 105 110
Leu Arg Ser Leu Met Pro Ser Ser Tyr Val Gln Arg Gly Asp Gln Ala
115 120 125
Ser Ile Ile Gly Gly Ala Ile Glu Phe Val Arg Glu Leu Glu Gln Leu
130 135 140
Leu Gln Cys Leu Glu Ser Gln Lys Arg Arg Lys Leu Tyr Gly Asp Asp
145 150 155 160
Ser Leu Leu Met Glu Ile Gln Asn Pro Ser His Pro Pro Phe Phe Asp
165 170 175
Pro Leu Pro Leu Ala Asn Glu Leu Tyr Glu Gly Gly Ile Gln Glu Glu
180 185 190
Ile Ala Glu Ser Lys Ser Cys Leu Ala Asp Val Glu Val Lys Leu Leu
195 200 205
Gly Phe Asn Ala Met Ile Lys Ile Leu Ser Lys Arg Arg Pro Gly Gln
210 215 220
Leu Ile Thr Thr Ile Ser Ala Leu Glu Asp Leu Gln Leu Asn Ile Ile
225 230 235 240
His Thr Asn Ile Thr Thr Ile Glu Gln Thr Val Leu Tyr Ser Phe Asn
245 250 255
Val Lys Ile Ala Gly Glu Thr Lys Phe Thr Ala Asp Gly Ile Ala Asn
260 265 270
Leu Val Gln Gln Ile Phe Ser Phe Ile His Ala Asn Asn Ala Ile
275 280 285

Claims (7)

1.烟草bHLH转录因子基因NtFAMA，其特征在于，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示，其中特异性核酸片段为91-142位碱基。
2.根据权利要求1所述的烟草bHLH转录因子基因NtFAMA，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，其由287个氨基酸残基组成，其中第91-142位氨基酸保守的bHLH结构域。
3.如权利要求1或2所述的烟草bHLH转录因子基因NtFAMA在叶片黄酮类物质含量调控中的应用。
4.如权利要求1或2所述的烟草bHLH转录因子基因NtFAMA在叶片绿原酸含量调控中的应用。
5.如权利要求1或2所述的烟草bHLH转录因子基因NtFAMA在绿原酸含量变化的烟草新品种培育中的应用。
6.如权利要求1或2所述的烟草bHLH转录因子基因NtFAMA在低苯酚含量烟草新品种培育中的应用。
7.一种烟草新品种培育方法，其特征在于，利用病毒诱导的基因沉默技术，干扰如权利要求1或2所述的烟草bHLH转录因子基因NtFAMA的表达使其沉默，NtFAMA基因沉默植株中绿原酸含量显著下降，进而获得绿原酸含量下降的植物新品种。
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